Đồ án tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học: Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất: Đồ án tốt nghiệp ngành Công nghệ kỹ thuật hóa học

Để xác định loại tương tác của -glucosidase và TT02, phân tích phổ phát huỳnh quang của phức [enzyme − ANS] khi không có và có chất ức chế TT02.. Kết quả thu được cường độ phát huỳnh qu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

GVHD: PGS TS HOÀNG MINH HẢO SVTH: HÀ THỊ TRÚC NHI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ

7-FLUOROFLAVONOL, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ

7-FLUOROFLAVONOL, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ

TÓM TẮT

Đái tháo đường là một trong những loại bệnh phổ biến nhất hiện nay, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người Nguyên nhân do sự thiếu hụt insulin hoặc tình trạng kháng insulin làm giảm khả năng đáp ứng của các cơ quan với insulin tiết ra Sự thiếu hụt này dẫn đến lượng đường huyết trong máu tăng gây tổn thương các bộ phận của cơ thể như mạch máu và dây thần kinh -Glucosidase có vai trò thủy phân carbohydrate thành các monome chẳng hạn glucose, do đó làm tăng nồng độ glucose trong máu Hiện nay, ức chế -glucosidase để làm giảm lượng glucose sinh ra là một trong các phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả Flavonol là một trong những phân nhóm quan trọng của flavonoid, có khả năng kháng -glucosidase, kháng

oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng ung thư Vì vậy, khóa luận này đã sử dụng

06 cấu trúc thuộc nhóm flavonol làm tác nhân kháng hoạt tính -glucosidase Kết quả sàng lọc hoạt tính thông qua IC50, chỉ có TT02 có khả năng ức chế -glucosidase với

IC50 = 264,58 M (77,27 g/mL), nhưng thấp hơn so với chất đối chứng acarbose với

IC50 = 69,71 M (69,71 g/mL) Xác định khả năng dập tắt huỳnh quang của

-glucosidase bởi TT02 bằng cách đo phổ phát huỳnh quang của enzyme cho thấy dập tắt theo hai cơ chế bao gồm: dập tắt động (dynamic quenching) và dập tắt tĩnh (static quenching), trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế với hằng số dập tắt lưỡng phân tử

k q = 7,63  1011 (M-1s-1), hằng số kết hợp Ka = 0,0057  106 (M-1) và tỷ lệ phản ứng giữa enzyme:TT02 là 1:1 Nghiên cứu động học và cơ chế ức chế cho kết quả TT02 ức chế

-glucosidase theo cơ chế ức chế không cạnh tranh, hằng số Michaelis-Menten

K M = 0,39 (mM) và hằng số ức chế Ki = 49,47  10-6 (M) Để xác định loại tương tác của

-glucosidase và TT02, phân tích phổ phát huỳnh quang của phức [enzyme − ANS] khi không có và có chất ức chế TT02 Kết quả thu được cường độ phát huỳnh quang của phức chất này giảm khi có chất ức chế TT02 nên có thể kết luận TT02 tương tác kỵ nước với -glucosidase

LỜI CẢM ƠN

Kết quả trình bày trong khóa luận là sự nỗ lực của bản thân, bên cạnh đó là sự hỗ trợ

của Thầy, Cô, người thân và bạn bè Chính vì vậy, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến với

những người hỗ trợ tôi để có thể hoàn thành khóa luận

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ

Chí Minh, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm nói chung và Thầy, Cô ngành Công

nghệ Kỹ thuật Hóa học nói riêng, đã tạo điều kiện về trang thiết bị, hóa chất để tôi có

thể hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy PGS.TS Hoàng Minh Hảo Người đã giúp

tôi giải đáp mọi thắc mắc, mọi khó khăn trong quá trình làm khóa luận Bên cạnh đó,

Thầy còn chia sẻ những kinh nghiệm, kiến thức về cuộc sống, phân tích các lĩnh vực mà

tôi có thể làm sau khi ra trường, giúp tôi biết mình cần trang bị những gì trước khi bước

vào môi trường làm việc

Trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Thị Mỹ Lệ đã luôn kịp thời hỗ trợ các dụng cụ, thiết bị

và chỉ dẫn sử dụng máy móc, thiết bị Cô luôn nhiệt tình hỗ trợ để sinh viên hoàn thành

tốt khóa luận

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè xung quanh luôn động viên, tận

tình giúp đỡ lúc tôi gặp khó khăn Cảm ơn những bạn làm khóa luận tốt nghiệp ở B314

đã luôn nhường tủ sấy cho tôi dù mọi người cũng rất cần

Xin chân thành cảm ơn!

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Hà Thị Trúc Nhi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi, Hà Thị Trúc Nhi, mã số sinh viên 20128139, sinh viên ngành Công nghệ Kỹ thuật

hóa học, chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa hữu cơ xin cam đoan kết quả khóa luận

này đều do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy PGS.TS Hoàng Minh Hảo, hoàn

toàn không sao chép của bất kì ai Các thử nghiệm, kết quả đều là trung thực, không có

sự gian dối Các tài liệu tham khảo đều có trích dẫn rõ ràng và chi tiết

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Hà Thị Trúc Nhi

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Bệnh đái tháo đường 1

1.2  -Glucosidase 1

1.3 Acarbose 3

1.4 Flavonoid 4

1.5 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế -glucosidase 6

1.6 Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang 7

1.7 Hiện tượng phát huỳnh quang của -glucosidase 10

1.8 Động học và cơ chế ức chế enzyme 11

1.8.1 Động học enzyme 11

1.8.2 Cơ chế ức chế enzyme 14

1.9 Hiện tượng phát huỳnh quang của phức chất [enzyme − ANS] 18

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 20

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 20

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 21

2.2 Thực nghiệm 22

2.2.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol 22

2.2.2 Hiện tượng dập tắt huỳnh quang của -glucosidase bởi chất ức chế 25

2.2.3 Động học và cơ chế ức chế -glucosidase bởi chất ức chế 26

2.2.4 Hiện tượng dập tắt huỳnh quang phức chất [enzyme-ANS] bởi chất ức chế 27

2.3 Xử lý kết quả 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol 29

3.2 Hiện tượng dập tắt huỳnh quang -glucosidase bởi TT02 31

3.3 Động học và cơ chế ức chế -glucosidase bởi TT02 34

3.3.1 Chất đối chứng acarbose 34

3.3.2 Chất ức chế TT02 36

3.4 Hiện tượng dập tắt huỳnh quang phức chất [enzyme-ANS] bởi TT02 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

PHỤ LỤC 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 20

Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị 21

Bảng 3.1 Tác dụng ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol và acarbose 30

Bảng 3.2 Các thông số dập tắt huỳnh quang -glucosidase bởi TT02 33

Bảng 3.3 Giá trị KM khi nồng độ acarbose tăng dần 35

Bảng 3.4 Thông số động học và loại ức chế của acarbose 35

Bảng 3.5 Giá trị Vmax khi nồng độ TT02 tăng dần 37

Bảng 3.6 Thông số động học và loại ức chế của TT02 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chuyển đổi oligosaccharide thành glucose 2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của acarbose, miglitol, voglibose 3

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học acarbose 4

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các nhóm thuộc flavonoid 5

Hình 1.5 Phản ứng giữa -glucosidase và pNPG 6

Hình 1.6 Hiện tượng phát huỳnh quang 7

Hình 1.7 Cơ chế dập tắt động và dập tắt tĩnh 8

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của Tryptophan, Tyrosine và Phenylalanine 11

Hình 1.9 Phổ hấp thu (a); Phổ phát xạ (n) của Tryptophan, Tyrosine và Phenylalaine11 Hình 1.10 Phản ứng enzyme và chất nền 12

Hình 1.11 Đồ thị biểu diễn mô hình động học Michaelis-Menten 13

Hình 1.12 Đồ thị Lineweaver-Burk 13

Hình 1.13 Đồ thị Dixon 14

Hình 1.14 Quá trình ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) 15

Hình 1.15 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế cạnh tranh 15

Hình 1.16 Quá trình ức chế không cạnh tranh (non-competive inhibition) 16

Hình 1.17 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế không cạnh tranh 16

Hình 1.18 Quá trình ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitve inhibition) 17

Hình 1.19 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế kháng cạnh tranh 17

Hình 1.20 Đồ thị Lineweaver-Burk của ức chế hỗn tạp 18

Hình 1.21 Cấu trúc hóa học của 8-anilino-1-napthalenesulfonic acid (ANS) 19

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol được sử dụng 21

Hình 3.1 Phần trăm ức chế -glucosidase tại các nồng độ acarbose khác nhau 29

Hình 3.2 Phần trăm ức chế -glucosidase tại các nồng độ TT02 khác nhau 30

Hình 3.3 Phổ phát huỳnh quang -glucosidase khi không có và có chất ức chế TT02 31Hình 3.4 Đồ thị phương trình Stern-Volmer cơ chế dập tắt động 32Hình 3.5 Đồ thị log của cơ chế dập tắt tĩnh 33Hình 3.6 Đồ thị Lineweaver-Burk của -glucosidase khi không có và có acarbose 34Hình 3.7 Đồ thị Dixon của -glucosidase khi không có và có acarbose 35Hình 3.8 Đồ thi Lineweaver-Burk của -glucosidase khi không có và có TT02 36Hình 3.9 Đồ thị Dixon của -glucosidase khi không có và có TT02 37Hình 3.10 Phổ phát huỳnh quang của phức [-glucosidase−ANS] khi không có và có TT02 38

LỜI MỞ ĐẦU

Đái tháo đường là một trong những bệnh mãn tính phổ biến nhất hiện nay, không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới Theo số liệu của Hiệp hội phòng, kháng bệnh đái tháo đường trên thế giới, năm 2021 cứ 10 người trưởng thành sẽ có một người mắc bệnh Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng hơn 7 triệu người mắc bệnh đái tháo đường Một con số đáng sợ, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, gia tăng gánh nặng kinh tế đất nước và là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Vì vậy, đối với những người chưa mắc bệnh, cần phải có chế độ ăn uống hợp lí, vận động thể lực hàng ngày và thường xuyên kiểm tra lượng đường trong máu để hạn chế nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường Đối với những người đã mắc bệnh, trách nhiệm của người bệnh là phải có phác đồ điều trị hiệu quả cùng chế độ sinh hoạt lành mạnh Còn các nhà khoa học có trách nhiệm cấp thiết là nghiên cứu và tìm ra các loại thuốc để điều trị bệnh

Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh đái tháo đường là do -glucosidase xúc tác quá trình thủy phân carbohydrate thành đường glucose, lượng glucose sinh ra quá nhiều dẫn đến chỉ số đường huyết tăng vượt mức cho phép Hậu quả làm tổn thương nhiều cơ quan như tim, hệ thần kinh, thận và gây nhiều biến chứng nguy hiểm Vì vậy, việc nghiên cứu ra các chất ức chế hoạt động của -glucosidase là một trong những hướng đi mang lại hiệu quả cao trong điều trị bệnh đái tháo đường Trong khóa luận này, dựa trên các chất thuộc nhóm flavonol được nhận trực tiếp từ nhóm nghiên cứu của Thầy PGS.TS Hoàng Minh Hảo và những nghiên cứu về ứng dụng flavonol để tiến hành khảo sát khả năng ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol Đồng thời, tìm hiểu cơ chế dập tắt huỳnh quang, quá trình ức chế, loại tương tác giữa -glucosidase và các dẫn xuất 7-fluoroflavonol

Chính vì thế, tôi chọn đề tài “Sàng lọc hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất”

Điểm mới của đề tài:

Các kết quả nghiên cứu về hoạt tính, động học và cơ chế ức chế -glucosidase lần đầu tiên được nghiên cứu trên các dẫn xuất 7-fluoroflavonol

Mục tiêu nghiên cứu:

Xác định IC50 của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol

Xác định cơ chế dập tắt phổ phát huỳnh quang của -glucosidase bởi hợp chất có hoạt

tính tiềm năng nhất

Xác định loại ức chế và các thông số động học của quá trình ức chế

Xác định tương tác của -glucosidase và chất ức chế thông qua hiện tượng dập tắt huỳnh

quang của phức [-glucosidase/8-anilino-1-naphthalenesulfonic (ANS)]

Đối tượng nghiên cứu:

-Glucosidase, acarbose, các dẫn xuất 7-fluoroflavonol được nhận trực tiếp từ nhóm

nghiên cứu của Thầy PGS.TS Hoàng Minh Hảo

Phạm vi nghiên cứu:

Sàng lọc khả năng ức chế của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol đối với -glucosidase

Nghiên cứu khả năng dập tắt huỳnh quang của -glucosidase bởi chất ức chế tốt nhất

Nghiên cứu cơ chế ức chế và các thông số quá trình động học của -glucosidase bởi

chất ức chế tốt nhất

Xác định tương tác kỵ nước giữa -glucosidase và chất ức chế tốt nhất thông qua khả

năng dập tắt huỳnh quang phức chất [enzyme−ANS]

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

Ý nghĩa khoa học: khóa luận này góp phần làm sáng tỏ tiềm năng ức chế -glucosidase

bởi các dẫn xuất 7-fluoroflavonol nói riêng và nhóm flavonoid nói chung

Ý nghĩa thực tiễn: kết quả khóa luận giúp bổ sung thêm các dẫn xuất

7-fluoroflavonol có khả năng ức chế -glucosidase vào nghiên cứu điều trị bệnh đái

tháo đường Bên cạnh đó, việc xác định thông số động học, cơ chế ức chế, loại tương

tác thuận lợi cho các nghiên cứu ở mức độ in-vivo

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Bệnh đái tháo đường

Đái tháo đường là một loại bệnh rối loạn chuyển hóa, thể hiện qua nồng độ glucose trong máu bất thường [1] Nguyên nhân là do sự thiếu hụt insulin hoặc tình trạng kháng insulin làm giảm khả năng đáp ứng của các cơ quan với insulin tiết ra Sự thiếu hụt này dẫn đến lượng đường huyết trong máu tăng, gây tổn thương các bộ phận của cơ thể như mạch máu và dây thần kinh [2]

Bệnh đái tháo đường bao gồm 3 loại: đái tháo đường loại I, đái tháo đường loại II và đái tháo đường thai kỳ Bệnh đái tháo đường loại I là do sự phá hủy hệ thống miễn dịch của

cơ thể thông qua tế bào  − tuyến tụy sản xuất insulin dẫn đến sự thiếu hụt insulin [3] Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị triệt để, bệnh nhân phải phụ thuộc vào việc tiêm insulin suốt đời [4] Bệnh đái tháo đường loại II là một căn bệnh rất phổ biến, ảnh hưởng đến hơn 400 triệu người trên thế giới Nguyên nhân của căn bệnh này là tình trạng kháng insulin Đối với người bình thường, insulin được giải phóng để đáp ứng kích thích của tế bào  – trung gian cho sự hấp thu glucose, amino acid của các mô Ngược lại, các mô này cung cấp thông tin cho tế bào đảo  về lượng insulin cần thiết

Khi có hiện tượng kháng insulin chính là hiện tượng cơ thể người bệnh không phản ứng đúng với insulin, tế bào  phải tăng tiết insulin để dung hòa lượng glucose đã nạp Khi

tế bào  không cung cấp đủ insulin cần thiết dẫn đến tăng nồng độ glucose trong máu [5] Bên cạnh đó, các yếu tố dẫn đến sự phát triển và nguy hiểm của bệnh đái tháo đường loại II bao gồm béo phì, chế độ ăn uống không hợp lí, lười vận động [6] Phương pháp điều trị bệnh nhân đái tháo đường loại II là sử dụng thuốc kết hợp với lối sống lành mạnh, cân bằng dinh dưỡng Cuối cùng, bệnh đái tháo đường thai kỳ xuất hiện chủ yếu trong quá trình mang thai ở nữ giới, nguyên nhân chính là do hormone phát triển trong thời kỳ này gây ra tình trạng tăng cân và thay đổi nội tiết tố, ngăn chặn hoạt động của insulin, dẫn đến tác động tiêu cực cho mẹ và bé Bệnh sẽ thuyên giảm hoặc biến mất sau khi sinh con

1.2  -Glucosidase

-Glucosidase là carbohydrate loại exo phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật, mô động vật và thực vật [7] Các phản ứng có sự xúc tác của -glucosidase được thực hiện thông

qua cơ chế xúc tác acid-base, thường gồm các bước sau:

Gắn kết chất nền: Chất nền (ví dụ, maltose hoặc p-nitrophenyl--D-glucopyranoside) gắn vào vị trí hoạt động của enzyme Vị trí hoạt động có chứa các amino acid có chức năng quan trọng trong quá trình xúc tác

Hoạt hóa nước: Một phân tử nước được kích hoạt trong vị trí hoạt động của enzyme và tấn công liên kết glycosidic giữa các đơn vị glucose Một amino acid trong vị trí hoạt động thường hoạt động như một base để kích hoạt nước này

Phá vỡ liên kết glycosidic: Nước được hoạt hóa sẽ tấn công carbon của liên kết glycosidic, dẫn đến sự phá vỡ liên kết này và giải phóng glucose Có 2 loại liên kết gồm: liên kết -1,4-glycosidic và liên kết -1,6-glycosidic Liên kết -1,4-glycosidic là loại liên kết chính mà -glucosidase thủy phân, có mặt trong các carbohydrate như maltose, maltotriose, và các chuỗi dài hơn như amylose, một thành phần của tinh bột Quá trình thủy phân này thủy phân các phân tử glucose đơn lẻ Ngoài ra, một số dạng enzyme khác có khả năng thủy phân liên kết -1,6-glycosidic với hiệu quả thấp hơn Liên kết này xuất hiện chủ yếu tại các điểm phân nhánh của amylopectin, một loại tinh bột phân nhánh và glycogen

Giải phóng sản phẩm: Sau khi liên kết bị phá vỡ, glucose hoặc một phân tử nhỏ hơn được giải phóng khỏi enzyme và enzyme sẵn sàng tham gia vào một chu kì xúc tác mới

Do đó, -glucosidase là một loại enzyme rất quan trọng trong việc thủy phân các carbohydrate phức tạp thành đơn vị glucose, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa và hấp thu năng lượg của cơ thể (hình 1.1)

Hình 1.1 Chuyển đổi oligosaccharide thành glucose

Vì vậy, một trong những phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả nhất hiện nay là làm giảm việc sản xuất và hấp thu glucose bằng cách ức chế các enzyme thực hiện chức năng phân giải carbohydrate như -glucosidase Thuốc ức chế -glucosidase được sử dụng phổ biến ở người gồm 3 loại: acarbose, miglitol và voglibose (hình 1.2) Ngoài ra, theo các nghiên cứu dịch tễ học, flavonoid có hiệu quả trong việc điều trị bệnh đái tháo đường [8]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của acarbose, miglitol, voglibose

1.3 Acarbose

Acarbose là một oligosaccharide phức tạp (hình 1.3), bao gồm một nửa acarviosine và

đơn vị maltose được phân lập từ Actinoplanes sp [9] và Streptomyces sp [10]

Acarbose gây ức chế cạnh tranh đối với -glucosidase ở ruột non, giúp làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrate và sucrose (một disaccharide cấu tạo từ glucose và fructose) Điều này, dẫn đến nồng độ glucose trong máu tăng ít hơn [11] Tuy nhiên, acarbose có thể gây ra tác dụng phụ thường gặp như đầy hơi, chướng bụng, khó tiêu hóa

ở dạ dày, tiêu chảy nhẹ, nặng hơn là đau bụng dữ dội, táo bón ra máu và các bệnh về gan [12] Do vậy, việc nghiên cứu, tổng hợp và tìm ra một loại chất ức chế khác có tác dụng phụ ít hơn acarbose là điều cần thiết

dụng để kháng lại bệnh tật Cam thảo (rễ của Glycyrrhiza uralensis) chứa hơn 300

flavonoid, dùng để giảm đau dạ dày, loại bỏ đờm và giảm ho Các loài thực vật thuộc

chi Peganum có chứa một số alkaloid, flavonoid, v.v Nó có tác dụng ức chế

cholinesterase và monoamine oxidase, kháng ung thư, kháng đông máu, kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng viêm [17] Bên cạnh việc phân lập các flavonoid từ thực vật, còn có thể được tổng hợp trong phòng thí nghiệm bằng các kỹ thuật khác nhau như sử dụng phương pháp hỗ trợ vi sóng để tổng hợp bioflavonoid kháng lại các tế bào ung thư gan, ung thư vú [18]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các nhóm thuộc flavonoid

Ngoài ra, flavonoid còn nổi tiếng là hợp chất có khả năng ức chế tốt -glucosidase Điển

hình như một loại flavonol glycoside mới được phân lập từ cây Dendrobium devonianum

cho thấy khả năng ức chế -glucosidase tốt hơn acarbose [19] Anthocyanin phân lập từ đậu đen có khả năng kiểm soát bệnh béo phì nên giúp ngăn ngừa bệnh đái tháo đường

loại II [20] Thử nghiệm tác động của flavonoid được chiết xuất từ lá Warionia saharae

đối với chuột bị mắc bệnh đái tháo đường, kết quả cho thấy nồng độ glucose ở chuột bị bệnh có sử dụng chiết xuất giảm hơn so với chuột bị bệnh mà không sử dụng Hơn nữa, việc đó còn cải thiện tình trạng tổn thương ở gan, tuyến tụy của chuột bị bệnh và có khả năng hoạt động như một chất kháng đái tháo đường hiệu quả [21] Từ đó, cho thấy các nhóm thuộc flavonoid có tiềm năng rất lớn trong điều trị bệnh đái tháo đường Bên cạnh

đó, các nhóm thế fluoro cũng đã được chứng minh góp phần hoạt tính kháng

-glucosidase [22]:

Cải thiện lực liên kết: Nhóm thế fluoro có thể tham gia vào liên kết hydro và các tương tác khác với vị trí hoạt động của enzyme, làm tăng ái lực liên kết của các dẫn xuất flavonol đối với -glucosidase Điều này có thể dẫn đến khả năng ức chế tốt hơn Hiệu ứng điện tử: Nhóm fluoro có độ âm điện cao và sự hiện diện của chúng có thể ảnh hưởng đến sự phân bố điện tử trong phân tử flavonoid, giúp cải thiện tương tác với vị trí hoạt động của -glucosidase

Sự đa dạng cấu trúc: Việc thêm nhóm fluoro tại các vị trí khác nhau trên khung flavonoid

có thể tạo ra nhiều dẫn xuất khác nhau, mỗi loại có hoạt tính ức chế riêng biệt Sự đa dạng cấu trúc này cho phép tối ưu hóa khả năng ức chế -glucosidase thông qua nghiên cứu cấu trúc-hoạt tính

Vì vậy, trong nghiên cứu này, tôi sử dụng các dẫn xuất 7-fluoroflavonol thuộc nhóm flavonol làm chất thử Mục tiêu là xác định khả năng ức chế -glucosidase của các dẫn xuất, đồng thời tìm hiểu loại tương tác, cơ chế ức chế và phương trình động học bằng phương pháp đo phổ phát huỳnh quang Chất đối chứng được sử dụng là acarbose

1.5 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế -glucosidase

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để đánh giá khả năng ức chế -glucosidase ở giai

đoạn in vitro Tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp tạo

màu sử dụng chất nền tổng hợp p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (pNPG) Trong phương pháp này, chất nền pNPG không màu bị thủy phân bởi -glucosidase, giải phóng

p-nitrophenol có màu vàng (hình 1.5) Lượng p-nitrophenol giải phóng sẽ được đo độ

hấp thu ở bước sóng 405 nm

Hình 1.5 Phản ứng giữa -glucosidase và pNPG

Từ đó, xác định phần trăm ức chế của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol bằng công thức (1):

% Ức chế -glucosidase = (1 − Amẫu thử − Amẫu chứng trắng

Amẫu chứng − Amẫu trắng )  100 (%) (1) Trong đó:

Amẫu thử là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm, enzyme và pNPG

Amẫu chứng trắng là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm và pNPG

Amẫu chứng là độ hấp thu của mẫu gồm enzyme, dung dịch đệm và pNPG

Amẫu trắng là độ hấp thu của mẫu gồm dung dịch đệm và pNPG

Sau khi xác định phần trăm ức chế ở các nồng độ khác nhau, tiến hành xây dựng đồ thị

và tìm IC50 theo phương trình đồ thị

1.6 Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang

Khi chiếu xạ liên tục vào phân tử có khả năng phát huỳnh quang F (fluorophore), phân

tử sẽ chuyển từ trạng thái cơ bản (F) lên trạng thái kích thích (F) (hình 1.6) Từ trạng thái kích thích, F có thể quay về trạng thái cơ bản thông qua quá trình phát xạ và phi phát xạ

Hình 1.6 Hiện tượng phát huỳnh quang

Trong đó: kf là tổng các hằng số tốc độ quá trình phi phát xạ

Khi kích thích liên tục thì tốc độ phát xạ và phi phát xạ là như nhau Nồng độ F* được xác định bởi phương trình (4):

[F] = Ia

Trong đó: Ia là tốc độ hình thành F*

Hình 1.7 Cơ chế dập tắt động và dập tắt tĩnh

Nếu trong dung dịch có phân tử dập tắt huỳnh quang Q thì ngoài hai quá trình phát xạ

và phi phát xạ để trở về trạng thái cơ bản, phân tử F còn có thể trở về trạng thái cơ bản

F thông qua quá trình dập tắt huỳnh quang Quá trình dập tắt huỳnh quang có thể là kết

quả của nhiều quá trình khác nhau bao gồm dập tắt động, dập tắt tĩnh và sự kết hợp của chúng (hình 1.7) Dập tắt động là do chất dập tắt Q khuếch tán đến chất phát huỳnh quang F trong suốt thời gian tồn tại ở trạng thái kích thích làm cho phân tử fluorophore trở về trạng thái cơ bản mà không phát huỳnh quang Dập tắt tĩnh là do sự tạo phức giữa fluorophore và phân tử Q ở trạng thái cơ bản, tạo phức hợp [FQ] không phát huỳnh quang [23]

Nồng độ F khi có phân tử Q được xác định bởi phương trình (5):

[F] = Ia

k f + ∑k t + k q  [Q] (5) Một đại lượng quan trọng để xác định các hằng số tốc độ khác nhau là hiệu suất lượng

o là thời gian sống của fluorophore khi không có chất dập tắt Q (o = 10-8 s) [24]

K SV là hằng số Stern-Volmer Hằng số KSV là tỷ lệ của hằng số dập tắt lưỡng phân tử so

với hằng số phân rã đơn phân tử (L.mol-1)

Trong cơ chế dập tắt huỳnh quang động, giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng là giai đoạn hình thành phức chất trung gian [FQ]* với hằng số tốc độ kd (diffusion controlled

limit)

F*+ Q ⇌ [FQ]*→ F + Q + ∆

Trong trường hợp này KSV ≈ 102 - 103 M-1, kd ≈ 1010 M-1s-1 [25]

Trong quá trình dập tắt huỳnh quang, nếu kq ≫ 1010 M-1s-1 thì cơ chế dập tắt huỳnh quang xảy ra quá trình dập tắt động kết hợp với dập tắt tĩnh, trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế Chất dập tắt Q tạo phức với phân tử fluorophore (F) tại trạng thái cơ bản và phức này không có khả năng phát huỳnh quang [26]

1.7 Hiện tượng phát huỳnh quang của -glucosidase

-Glucosidase có khả năng phát huỳnh quang là do trong enzyme có chứa 3 loại amino

k d

acid có khả năng phát huỳnh quang: tryptophan (TRP), tyrosin (TYS) và phenylalanine (PHE) (hình 1.8)

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của Tryptophan, Tyrosine và Phenylalanine

Khi kích thích ở bước sóng thích hợp, ba amino acid này cho phổ hấp thu và phổ phát

xạ như hình 1.9 Vì vậy, để biết loại tương tác giữa -glucosidase và chất ức chế cần dựa vào sự thay đổi phổ phát huỳnh quang, từ đó xác định thông số quá trình dập tắt huỳnh quang của enzyme bởi các chất ức chế

Hình 1.9 Phổ hấp thu (a); Phổ phát xạ (n) của Tryptophan, Tyrosine và Phenylalaine

1.8 Động học và cơ chế ức chế enzyme

1.8.1 Động học enzyme

Động học enzyme là nghiên cứu về các phản ứng hóa học xảy ra có sự xúc tác bởi enzyme Hiện nay, có rất nhiều mô hình dùng để nghiên cứu động học enzyme Tuy nhiên, mô hình động học Michaelis-Menten là một trong mô hình đơn giản và hiệu quả nhất giải thích sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền

Phản ứng xúc tác bởi enzyme là một quá trình gồm hai bước: chất nền (S) liên kết với enzyme (E) và hình thành phức hợp [enzyme – chất nền] (ES), sau đó là sự phân hủy không thuận nghịch của phức hợp [enzyme – chất nền] (ES) để giải phóng enzyme và sản phẩm (hình 1.10)

Hình 1.10 Phản ứng enzyme và chất nền

Phương trình Michaelis-Menten cho phản ứng trên:

v= Vmax  [S]

K M + [S] (14) Trong đó:

v: tốc độ phản ứng

Vmax: tốc độ cực đại của phản ứng

K M (còn được gọi là hằng số Michaelis-Menten): nồng độ chất nền mà tại đó tốc độ phản

ứng bằng một nửa tốc độ phản ứng cực đại (v = Vmax

2 ) KM thể hiện ái lực giữa enzyme

và chất nền, giá trị KM càng thấp thì enzyme liên kết với chất nền càng tốt

[S]: nồng độ chất nền

Xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền (hình 1.11) Ban đầu tốc độ phản ứng tăng theo dạng tuyến tính khi nồng độ chất nền tăng (phản ứng bậc 1) Tốc độ sau đó ổn định và việc tăng nồng độ chất nền không ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng, nguyên nhân do tất cả khoang gắn kết của enzyme đã bão hòa với chất nền (phản ứng bậc 0)

Tuy nhiên, Vmax là một giá trị tiệm cận nên rất khó để xác định ở nồng độ cao Vì vậy, hai nhà hóa học người Mỹ H.Lineweaver và Dean Burk sử dụng đồ thị nghịch đảo của tốc độ phản ứng (1/v) theo nghịch đảo của nồng độ chất nền (1/[S]) để có thể dễ dàng xác định giá trị Vmax qua giao điểm với trục hoành

Hình 1.11 Đồ thị biểu diễn mô hình động học Michaelis-Menten

Đồ thị Lineweaver-Burk còn được sử dụng xác định cơ chế ức chế enzyme bằng cách

thể hiện sự ảnh hưởng của chất ức chế lên giá trị KM và Vmax (hình 1.12)

Bên cạnh đó, để đánh giá hiệu quả ức chế thông qua hằng số ức chế Ki, sử dụng đồ thị Dixon biểu diễn mối quan hệ giữa nghịch đảo tốc độ phản ứng và nồng độ chất ức chế,

giao điểm giữa các đường gióng xuống trục hoành là giá trị hằng số ức chế Ki (hình

1.13)

Hình 1.12 Đồ thị Lineweaver-Burk

ức chế không thuận nghịch vượt quá nồng độ của enzyme [28]

Khóa luận này chỉ tập trung nghiên cứu cơ chế ức chế thuận nghịch đối với enzyme Ức chế thuận nghịch gồm bốn loại ức chế: ức chế cạnh tranh (competitive inhibition), ức chế không cạnh tranh (non-competitve inhibition), ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) và ức chế hỗn tạp (mixed inhibition)

1.8.2.1 Quá trình ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Ức chế cạnh tranh là sự ức chế hoạt động của enzyme (E) bằng cách cạnh tranh với chất nền (S) để liên kết với khoang gắn kết (hình 1.14) Chất ức chế (I) có cấu trúc hóa học gần giống với chất nền nên cạnh tranh kết hợp với enzyme tạo thành phức hợp [enzyme−chất ức chế] (EI) thay vì phức hợp [enzyme−chất nền] (ES)

Hình 1.14 Quá trình ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Trong đó: Ki là hằng số ức chế, Ki = [E] ×[I]

Đối với đồ thị Dixon, nồng độ chất nền tăng dần, các đường nồng độ hội tụ về góc phần

tư thứ hai, phía trên trục x, từ đó gióng xuống trục hoành xác định được hằng số ức chế

K i

Hình 1.15 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế cạnh tranh

1.8.2.2 Quá trình ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition)

Ức chế không cạnh tranh là sự ức chế hoạt động của enzyme bằng cách liên kết tại vị trí hoạt động khác trên enzyme (vị trí allosteric), không phải khoang gắn kết (hình 1.16)

Vì vậy, chất ức chế làm thay đổi về hình dạng khoang gắn kết, ngăn cản sự liên kết của enzyme và chất nền Chất ức chế lúc này do không có sự tương đồng về cấu trúc nên không cạnh tranh với chất nền liên kết vào khoang gắn kết của enzyme

Hình 1.16 Quá trình ức chế không cạnh tranh (non-competive inhibition)

Đồ thị Lineweaver-Burk trong ức chế không cạnh tranh trình bày ở hình 1.17 Khi nồng

độ chất ức chế tăng, ái lực giữa enzyme và chất nền không đổi nên KM cố định, giá trị

Vmax giảm [29]

Giá trị Ki xác định trong đồ thị Dixon là giao điểm các đường nồng độ chất nền giao

nhau tại trục hoành

Hình 1.17 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế không cạnh tranh

1.8.2.3 Quá trình ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Trong loại ức chế này, chất ức chế không liên kết tại khoang gắn kết khác của enzyme cũng không cạnh tranh với chất nền, hoàn toàn khác biệt so với hai loại ức chế trên Quá trình ức chế diễn ra do chất ức chế tương tác với phức hợp [enzyme – chất nền] (ES) làm giảm tốc độ hình thành phức [enzyme – chất nền] (ES) [30]

Hình 1.18 Quá trình ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitve inhibition)

Điều này dẫn đến ái lực giữa enzyme và chất nền tăng, giá trị KM giảm cùng Vmax giảm Kết quả đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon là các đường song song với đường

enzyme – chất nền ban đầu và rất khó để xác định giá trị Ki [31]

Hình 1.19 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế kháng cạnh tranh

1.8.2.4 Quá trình ức chế hỗn tạp (mixed inhibition)

Ức chế hỗn tạp là một loại ức chế enzyme trong đó chất ức chế có thể liên kết với enzyme, bất kể chất nền đã liên kết với enzyme hay chưa Dạng ức chế này là sự kết hợp của ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) và ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition) hoặc ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) Vì vậy,

đồ thị Lineweaver-Burk có giá trị KM thay đổi và Vmax giảm (hình 1.20) [29]

Tuy nhiên, trong đồ thị Dixon của ức chế hỗn tạp vẫn chưa xác định rõ hình dạng đồ thị,

do thay đổi theo kiểu ức chế [31]

Hình 1.20 Đồ thị Lineweaver-Burk của ức chế hỗn tạp

1.9 Hiện tượng phát huỳnh quang của phức chất [enzyme − ANS]

Ngay từ những năm 1950, người ta đã phát hiện ra rằng khi đưa nhóm anilin thay thế vị trí khác nhau của các dẫn xuất napthalene để tạo ra phân tử như 8-anilino-1-napthalenesulfonic acid (ANS) (hình 1.21), chất này không phát huỳnh quang trong môi trường nước nhưng lại có khả năng phát huỳnh quang cao và tương tác kỵ nước đối với các protein [32]