Để xác định loại tương tác của -glucosidase và TT02, phân tích phổ phát huỳnh quang của phức [enzyme − ANS] khi không có và có chất ức chế TT02.. Kết quả thu được cường độ phát huỳnh qu
TỔNG QUAN
Bệnh đái tháo đường
Đái tháo đường là một rối loạn chuyển hóa, biểu hiện qua nồng độ glucose trong máu bất thường do thiếu insulin hoặc kháng insulin Thiếu hụt insulin làm giảm khả năng đáp ứng của cơ quan, dẫn đến tăng lượng đường huyết trong máu và gây tổn thương cho các bộ phận như mạch máu và dây thần kinh.
Bệnh đái tháo đường có ba loại chính: loại I, loại II và đái tháo đường thai kỳ Đái tháo đường loại I xảy ra do hệ thống miễn dịch tấn công các tế bào β trong tuyến tụy, dẫn đến thiếu hụt insulin, và hiện tại chưa có phương pháp điều trị triệt để, buộc bệnh nhân phải tiêm insulin suốt đời Trong khi đó, đái tháo đường loại II là một căn bệnh phổ biến, ảnh hưởng đến hơn 400 triệu người trên toàn thế giới, chủ yếu do tình trạng kháng insulin Ở người bình thường, insulin được giải phóng để hỗ trợ hấp thu glucose và amino acid, trong khi các mô cung cấp thông tin cho tế bào β về lượng insulin cần thiết.
Kháng insulin xảy ra khi cơ thể không phản ứng đúng với insulin, khiến tế bào β phải sản xuất nhiều insulin hơn để kiểm soát lượng glucose Nếu tế bào β không cung cấp đủ insulin, nồng độ glucose trong máu sẽ tăng cao.
Bệnh đái tháo đường loại II phát triển chủ yếu do béo phì, chế độ ăn uống không hợp lý và lười vận động Phương pháp điều trị hiệu quả bao gồm việc sử dụng thuốc kết hợp với lối sống lành mạnh và chế độ dinh dưỡng cân bằng Ngoài ra, bệnh đái tháo đường thai kỳ thường xảy ra trong thời gian mang thai, do sự thay đổi hormone gây tăng cân và ảnh hưởng đến hoạt động của insulin, điều này có thể gây hại cho cả mẹ và bé Tuy nhiên, bệnh thường thuyên giảm hoặc biến mất sau khi sinh.
α-Glucosidase là một loại carbohydrate exo phổ biến, có mặt trong nhiều vi sinh vật, mô động vật và thực vật Các phản ứng được xúc tác bởi α-glucosidase diễn ra một cách hiệu quả, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate.
2 qua cơ chế xúc tác acid-base, thường gồm các bước sau:
Chất nền như maltose hoặc p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside gắn vào vị trí hoạt động của enzyme, nơi chứa các amino acid quan trọng cho quá trình xúc tác.
Hoạt hóa nước là quá trình trong đó một phân tử nước được kích hoạt tại vị trí hoạt động của enzyme, nhằm tấn công liên kết glycosidic giữa các đơn vị glucose Trong quá trình này, một amino acid ở vị trí hoạt động thường đóng vai trò như một base để kích hoạt phân tử nước này.
Nước hoạt hóa tấn công carbon của liên kết glycosidic, dẫn đến việc phá vỡ liên kết và giải phóng glucose Có hai loại liên kết glycosidic: -1,4-glycosidic và -1,6-glycosidic Liên kết -1,4-glycosidic là loại chính mà enzyme -glucosidase thủy phân, có mặt trong các carbohydrate như maltose, maltotriose và chuỗi dài hơn như amylose, thành phần của tinh bột Quá trình thủy phân này tạo ra các phân tử glucose đơn lẻ Ngoài ra, một số enzyme khác cũng có khả năng thủy phân liên kết -1,6-glycosidic, nhưng với hiệu quả thấp hơn; liên kết này chủ yếu xuất hiện tại các điểm phân nhánh của amylopectin và glycogen.
Sau khi liên kết giữa enzyme và substrate bị phá vỡ, glucose hoặc một phân tử nhỏ hơn sẽ được giải phóng, cho phép enzyme sẵn sàng tham gia vào một chu kỳ xúc tác mới.
Enzyme -glucosidase đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy carbohydrate phức tạp thành glucose, giúp cải thiện quá trình tiêu hóa và hấp thu năng lượng cho cơ thể.
Hình 1.1 Chuyển đổi oligosaccharide thành glucose
Một trong những phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả hiện nay là giảm sản xuất và hấp thu glucose bằng cách ức chế các enzyme phân giải carbohydrate như α-glucosidase Các loại thuốc ức chế α-glucosidase phổ biến bao gồm acarbose, miglitol và voglibose Ngoài ra, nghiên cứu dịch tễ học cho thấy flavonoid cũng có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh đái tháo đường.
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của acarbose, miglitol, voglibose
Acarbose
Acarbose là một oligosaccharide phức tạp (hình 1.3), bao gồm một nửa acarviosine và đơn vị maltose được phân lập từ Actinoplanes sp [9] và Streptomyces sp [10]
Acarbose ức chế cạnh tranh -glucosidase ở ruột non, làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrate và sucrose, từ đó giảm nồng độ glucose trong máu Tuy nhiên, thuốc này có thể gây ra tác dụng phụ như đầy hơi, chướng bụng, khó tiêu, tiêu chảy nhẹ, và trong trường hợp nặng có thể gây đau bụng dữ dội, táo bón ra máu, cùng với các vấn đề về gan.
[12] Do vậy, việc nghiên cứu, tổng hợp và tìm ra một loại chất ức chế khác có tác dụng phụ ít hơn acarbose là điều cần thiết
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học acarbose
Flavonoid
Flavonoid là hợp chất tự nhiên quan trọng thuộc nhóm chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm nhiều hợp chất polyphenolic chứa dẫn xuất -benzopyrone Chúng được tìm thấy phổ biến trong trái cây, thảo mộc, rau, hoa, hạt và thân Dựa vào cấu trúc hóa học và quá trình oxy hóa vòng carbon, flavonoid được phân loại thành nhiều loại khác nhau, mỗi loại đều mang lại giá trị y học và hoạt động sinh học riêng biệt.
Flavonoid mang lại nhiều lợi ích cho cả thực vật và động vật Trong thực vật, flavonoid tạo ra màu sắc và mùi thơm của hoa, thu hút côn trùng thụ phấn và giúp phát tán quả, từ đó mở rộng diện tích phân bố Đối với con người, flavonoid có tác dụng kháng bệnh Cam thảo, chứa hơn 300 flavonoid, được sử dụng để giảm đau dạ dày, loại bỏ đờm và giảm ho Các loài thực vật thuộc chi Peganum cũng chứa alkaloid và flavonoid, có tác dụng ức chế cholinesterase và monoamine oxidase, kháng ung thư, kháng đông máu, kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng viêm Ngoài việc phân lập flavonoid từ thực vật, chúng còn có thể được tổng hợp trong phòng thí nghiệm bằng các phương pháp như hỗ trợ vi sóng, nhằm tạo ra bioflavonoid có khả năng kháng lại các tế bào ung thư gan và ung thư vú.
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học các nhóm thuộc flavonoid
Flavonoid nổi tiếng với khả năng ức chế -glucosidase, trong đó một flavonol glycoside mới từ cây Dendrobium devonianum cho thấy hiệu quả ức chế tốt hơn acarbose Anthocyanin chiết xuất từ đậu đen có tác dụng kiểm soát bệnh béo phì, từ đó ngăn ngừa bệnh đái tháo đường loại II Nghiên cứu về flavonoid từ lá Warionia saharae trên chuột mắc bệnh đái tháo đường cho thấy nồng độ glucose giảm và cải thiện tình trạng tổn thương gan, tuyến tụy, chứng tỏ flavonoid có tiềm năng lớn trong điều trị bệnh đái tháo đường Ngoài ra, các nhóm thế fluoro cũng đã được xác nhận có hoạt tính kháng đái tháo đường.
Cải thiện lực liên kết của các dẫn xuất flavonol với -glucosidase có thể đạt được nhờ sự tham gia của nhóm thế fluoro, giúp tăng cường ái lực liên kết thông qua liên kết hydro và các tương tác khác với vị trí hoạt động của enzyme Điều này dẫn đến khả năng ức chế enzyme hiệu quả hơn.
Nhóm fluoro có độ âm điện cao có thể ảnh hưởng đến sự phân bố điện tử trong phân tử flavonoid, từ đó cải thiện tương tác với vị trí hoạt động của -glucosidase.
Việc thêm nhóm fluoro vào các vị trí khác nhau trên khung flavonoid tạo ra nhiều dẫn xuất với hoạt tính ức chế riêng biệt Sự đa dạng cấu trúc này giúp tối ưu hóa khả năng ức chế -glucosidase thông qua nghiên cứu cấu trúc-hoạt tính.
Trong nghiên cứu này, các dẫn xuất 7-fluoroflavonol thuộc nhóm flavonol được sử dụng làm chất thử để xác định khả năng ức chế -glucosidase Mục tiêu là tìm hiểu loại tương tác, cơ chế ức chế và phương trình động học thông qua phương pháp đo phổ phát huỳnh quang, với acarbose được sử dụng làm chất đối chứng.
Phương pháp đánh giá khả năng ức chế -glucosidase
Hiện nay, nhiều phương pháp đánh giá khả năng ức chế -glucosidase in vitro, trong đó phương pháp phổ biến nhất là sử dụng p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (pNPG) làm chất nền Phương pháp này hoạt động bằng cách thủy phân pNPG không màu bởi -glucosidase, dẫn đến sự giải phóng p-nitrophenol màu vàng Độ hấp thu của p-nitrophenol được đo ở bước sóng 405 nm để xác định mức độ ức chế.
Hình 1.5 Phản ứng giữa -glucosidase và pNPG
Từ đó, xác định phần trăm ức chế của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol bằng công thức (1):
% Ức chế -glucosidase = (1 − A mẫu thử − A mẫu chứng trắng
A mẫu chứng − A mẫu trắng ) 100 (%) (1) Trong đó:
Amẫu thử là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm, enzyme và pNPG
Amẫu chứng trắng là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm và pNPG
Amẫu chứng là độ hấp thu của mẫu gồm enzyme, dung dịch đệm và pNPG
Amẫu trắng là độ hấp thu của mẫu gồm dung dịch đệm và pNPG
Sau khi xác định phần trăm ức chế ở các nồng độ khác nhau, tiến hành xây dựng đồ thị và tìm IC50 theo phương trình đồ thị.
Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang
Khi phân tử fluorophore (F) bị chiếu xạ liên tục, nó sẽ chuyển từ trạng thái cơ bản (F) lên trạng thái kích thích (F*) Từ trạng thái kích thích, F* có khả năng quay về trạng thái cơ bản thông qua quá trình phát xạ và phi phát xạ.
Hình 1.6 Hiện tượng phát huỳnh quang
Tốc độ quá trình phát xạ được xác định theo phương trình (2):
Trong đó: k f là hằng số tốc độ quá trình phát xạ
Tốc độ quá trình phi phát xạ được xác định theo phương trình (3):
Trong đó: k f là tổng các hằng số tốc độ quá trình phi phát xạ
Khi kích thích liên tục thì tốc độ phát xạ và phi phát xạ là như nhau Nồng độ F * được xác định bởi phương trình (4):
Trong đó: Ia là tốc độ hình thành F *
Hình 1.7 Cơ chế dập tắt động và dập tắt tĩnh
Trong dung dịch chứa phân tử dập tắt huỳnh quang Q, ngoài hai quá trình phát xạ và phi phát xạ, phân tử F* còn có khả năng trở về trạng thái cơ bản.
F thông qua quá trình dập tắt huỳnh quang Quá trình dập tắt huỳnh quang có thể là kết
Dập tắt động và dập tắt tĩnh là hai quá trình chính ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang của các phân tử Dập tắt động xảy ra khi chất dập tắt Q khuếch tán đến fluorophore F* trong thời gian tồn tại ở trạng thái kích thích, khiến phân tử fluorophore trở về trạng thái cơ bản mà không phát huỳnh quang Ngược lại, dập tắt tĩnh xảy ra khi fluorophore tạo phức với phân tử Q ở trạng thái cơ bản, hình thành phức hợp [FQ] không phát huỳnh quang.
Nồng độ F khi có phân tử Q được xác định bởi phương trình (5):
Hiệu suất lượng tử huỳnh quang Φ là một đại lượng quan trọng để xác định các hằng số tốc độ khác nhau, được tính bằng công thức: Φ = số photon phát xạ / số photon hấp thu = tốc độ phát xạ / tốc độ hấp thu.
Hiệu suất lượng tử huỳnh quang khi không có phân tử Q và khi có phân tử Q được biểu diễn bởi phương trình (7) và (8): Φ Q o = k f k f + ∑k t (7) Φ Q = k f k f + ∑k t + k q × [Q] (8)
Tỷ lệ hiệu suất lượng tử bằng tỷ lệ cường độ phát xạ quan sát được khi không có và có phân tử Q:
Mặt khác, thời gian sống của fluorophore ( o ) khi không có phân tử Q được biểu diễn bởi phương trình (10): k f + ∑k t = 1 τ o (10)
Phương trình (11) được gọi là phương trình Stern-Volmer
Fo và F là cường độ phát huỳnh quang trước và sau khi tương tác giữa -glucosidase và chất dập tắt
[Q] là nồng độ chất dập tắt
o là thời gian sống của fluorophore khi không có chất dập tắt Q ( o = 10 -8 s) [24]
Hằng số Stern-Volmer (K SV) là tỷ lệ giữa hằng số dập tắt lưỡng phân tử và hằng số phân rã đơn phân tử, được đo bằng đơn vị L.mol^-1.
Trong cơ chế dập tắt huỳnh quang động, giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng là quá trình hình thành phức chất trung gian [FQ] * với hằng số tốc độ k d, nằm trong giới hạn kiểm soát khuếch tán.
F * + Q ⇌ [FQ] * → F + Q + ∆ Trong trường hợp này K SV ≈ 10 2 - 10 3 M -1 , k d ≈ 10 10 M -1 s -1 [25]
Trong quá trình dập tắt huỳnh quang, khi hệ số dập tắt k q không lớn hơn 10^10 M^-1 s^-1, cơ chế dập tắt bao gồm cả dập tắt động và tĩnh, trong đó dập tắt tĩnh là chủ yếu Chất dập tắt Q tương tác với phân tử fluorophore (F) ở trạng thái cơ bản, tạo thành phức hợp không có khả năng phát huỳnh quang.
Do đó, quá trình dập tắt huỳnh quang tĩnh được phân tích theo phương trình (12) [27]: log F o − F F = logK a + n× log [Q] (12)
Trong đó: K a là hằng số kết hợp giữa F và Q (M -1 ), K a = [FQ]
[F] × [Q] (13) n là tỉ lệ phản ứng giữa F và Q.
Hiện tượng phát huỳnh quang của -glucosidase
-Glucosidase có khả năng phát huỳnh quang là do trong enzyme có chứa 3 loại amino k d
11 acid có khả năng phát huỳnh quang: tryptophan (TRP), tyrosin (TYS) và phenylalanine (PHE) (hình 1.8)
Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của Tryptophan, Tyrosine và Phenylalanine
Khi được kích thích ở bước sóng phù hợp, ba amino acid này tạo ra phổ hấp thu và phát xạ đặc trưng Để xác định loại tương tác giữa α-glucosidase và chất ức chế, cần phân tích sự thay đổi trong phổ phát huỳnh quang Từ đó, có thể xác định các thông số liên quan đến quá trình dập tắt huỳnh quang của enzyme do tác động của các chất ức chế.
Hình 1.9 Phổ hấp thu (a); Phổ phát xạ (n) của Tryptophan, Tyrosine và Phenylalaine
Động học và cơ chế ức chế enzyme
1.8.1 Động học enzyme Động học enzyme là nghiên cứu về các phản ứng hóa học xảy ra có sự xúc tác bởi enzyme Hiện nay, có rất nhiều mô hình dùng để nghiên cứu động học enzyme Tuy nhiên, mô hình động học Michaelis-Menten là một trong mô hình đơn giản và hiệu quả nhất giải thích sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền
Phản ứng xúc tác bởi enzyme diễn ra qua hai bước chính: đầu tiên, chất nền (S) kết hợp với enzyme (E) để tạo thành phức hợp [enzyme – chất nền] (ES) Tiếp theo, phức hợp này trải qua quá trình phân hủy không thuận nghịch, giải phóng enzyme và sản phẩm cuối cùng.
Hình 1.10 Phản ứng enzyme và chất nền
Phương trình Michaelis-Menten cho phản ứng trên: v= V max [S]
Trong đó: v: tốc độ phản ứng
Vmax : tốc độ cực đại của phản ứng
K M (còn được gọi là hằng số Michaelis-Menten): nồng độ chất nền mà tại đó tốc độ phản ứng bằng một nửa tốc độ phản ứng cực đại (v = V max
2 ) K M thể hiện ái lực giữa enzyme và chất nền, giá trị K M càng thấp thì enzyme liên kết với chất nền càng tốt
Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền cho thấy rằng tốc độ phản ứng tăng theo dạng tuyến tính khi nồng độ chất nền gia tăng, đặc trưng cho phản ứng bậc 1 Tuy nhiên, sau một mức nồng độ nhất định, tốc độ phản ứng ổn định và không còn tăng thêm, do tất cả các khoang gắn kết của enzyme đã bão hòa với chất nền, thể hiện đặc điểm của phản ứng bậc 0.
Vmax là giá trị tiệm cận khó xác định ở nồng độ cao Để giải quyết vấn đề này, hai nhà hóa học H Lineweaver và Dean Burk đã sử dụng đồ thị nghịch đảo của tốc độ phản ứng (1/v) so với nghịch đảo của nồng độ chất nền (1/[S]) Phương pháp này giúp dễ dàng xác định giá trị Vmax thông qua giao điểm với trục hoành.
Mô hình động học Michaelis-Menten được thể hiện qua đồ thị (Hình 1.11), trong khi đồ thị Lineweaver-Burk (Hình 1.12) được sử dụng để xác định cơ chế ức chế enzyme, cho thấy ảnh hưởng của chất ức chế lên giá trị K M và Vmax.
Để đánh giá hiệu quả ức chế bằng hằng số ức chế K i, cần sử dụng đồ thị Dixon, thể hiện mối quan hệ giữa nghịch đảo tốc độ phản ứng và nồng độ chất ức chế Giao điểm giữa các đường gióng xuống trục hoành cho biết giá trị hằng số ức chế K i (hình 1.13).
Hình 1.12 Đồ thị Lineweaver-Burk
1.8.2 Cơ chế ức chế enzyme
Chất ức chế là những hợp chất làm giảm tốc độ phản ứng enzyme, với cơ chế tác động có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong cơ chế thuận nghịch, enzyme và chất ức chế duy trì trạng thái cân bằng, trong khi ở cơ chế không thuận nghịch, mức độ ức chế tăng dần theo thời gian Sự ức chế sẽ hoàn toàn xảy ra khi nồng độ chất ức chế không thuận nghịch vượt quá nồng độ enzyme.
Khóa luận này nghiên cứu cơ chế ức chế thuận nghịch đối với enzyme, bao gồm bốn loại chính: ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh, ức chế kháng cạnh tranh và ức chế hỗn tạp.
1.8.2.1 Quá trình ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) Ức chế cạnh tranh là sự ức chế hoạt động của enzyme (E) bằng cách cạnh tranh với chất nền (S) để liên kết với khoang gắn kết (hình 1.14) Chất ức chế (I) có cấu trúc hóa học gần giống với chất nền nên cạnh tranh kết hợp với enzyme tạo thành phức hợp [enzyme−chất ức chế] (EI) thay vì phức hợp [enzyme−chất nền] (ES)
Hình 1.14 Quá trình ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
Trong đó: K i là hằng số ức chế, K i = [E] ×[I]
Khi chất ức chế cạnh tranh liên kết vào khoang gắn kết của enzyme, ái lực giữa enzyme và chất nền giảm, dẫn đến sự gia tăng giá trị K M trong đồ thị Lineweaver-Burk mà không làm thay đổi Vmax Đồ thị Dixon cho thấy khi nồng độ chất nền tăng, các đường nồng độ hội tụ về góc phần tư thứ hai, cho phép xác định hằng số ức chế bằng cách kéo xuống trục hoành.
Hình 1.15 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế cạnh tranh
1.8.2.2 Quá trình ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition) Ức chế không cạnh tranh là sự ức chế hoạt động của enzyme bằng cách liên kết tại vị trí hoạt động khác trên enzyme (vị trí allosteric), không phải khoang gắn kết (hình 1.16)
Chất ức chế có khả năng làm biến đổi hình dạng của khoang gắn kết, từ đó ngăn cản sự liên kết giữa enzyme và chất nền Do không có sự tương đồng về cấu trúc, chất ức chế không cạnh tranh với chất nền trong việc liên kết vào khoang gắn kết của enzyme.
Quá trình ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition) được thể hiện qua đồ thị Lineweaver-Burk, như mô tả trong hình 1.17 Khi nồng độ chất ức chế tăng, ái lực giữa enzyme và chất nền vẫn giữ nguyên, dẫn đến giá trị K M không thay đổi.
Giá trị K i xác định trong đồ thị Dixon là giao điểm các đường nồng độ chất nền giao nhau tại trục hoành
Hình 1.17 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế không cạnh tranh
1.8.2.3 Quá trình ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)
Trong loại ức chế không cạnh tranh, chất ức chế không liên kết tại khoang gắn kết của enzyme và không cạnh tranh với chất nền, khác biệt hoàn toàn so với các loại ức chế khác Quá trình ức chế này xảy ra khi chất ức chế tương tác với phức hợp [enzyme – chất nền] (ES), dẫn đến giảm tốc độ hình thành phức hợp này.
Quá trình ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) làm tăng ái lực giữa enzyme và chất nền, dẫn đến việc giảm giá trị K M và Vmax Kết quả từ đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon cho thấy các đường song song với đường enzyme – chất nền ban đầu, gây khó khăn trong việc xác định giá trị K i.
Hình 1.19 Đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon của ức chế kháng cạnh tranh
Hiện tượng phát huỳnh quang của phức chất [enzyme − ANS]
Từ những năm 1950, nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc thay thế nhóm anilin tại các vị trí khác nhau của dẫn xuất napthalene, như 8-anilino-1-napthalenesulfonic acid (ANS), dẫn đến việc tạo ra một phân tử không phát huỳnh quang trong môi trường nước nhưng lại có khả năng phát huỳnh quang cao và tương tác kỵ nước với các protein.
Khi ANS tương tác với -glucosidase, nó tạo ra phức có khả năng phát huỳnh quang nhờ vào tính kỵ nước Nếu chất ức chế cũng tương tác kỵ nước với -glucosidase, nó sẽ cạnh tranh với ANS, dẫn đến việc ngăn chặn quá trình tạo phức và giảm cường độ phát huỳnh quang so với khi không có chất ức chế Qua đó, có thể xác định loại tương tác giữa chất ức chế và -glucosidase.
Hình 1.21 Cấu trúc hóa học của 8-anilino-1-napthalenesulfonic acid (ANS)
THỰC NGHIỆM
Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất
Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất CAS Nguồn gốc
3 8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) 82-76-8 Acros Organics, Bỉ
4 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 67-68-5 Fisher Scientific,
Nhóm nghiên cứu của Thầy PGS.TS Hoàng Minh Hảo
Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol được sử dụng
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị
STT Dụng cụ Thiết bị
1 Cốc thủy tinh 250 mL Cân phân tích 4 số OHAUS PX224/E
2 Bình định mức 10 mL Máy đo pH HI2210 - 02
3 Pipet 10 mL Tủ sấy nhiệt đối lưu MemMert UN110
5 Ống đong 1000 mL Máy Elisa
Thực nghiệm
2.2.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol
Trong nghiên cứu này, khảo sát IC50 của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol đối với
Phản ứng của -glucosidase được xác định bằng cách đo độ hấp thu của sản phẩm từ phản ứng giữa chất nền pNPG không màu và -glucosidase, dẫn đến sự giải phóng p-nitrophenol có màu vàng Nếu không có chất ức chế, sản phẩm sẽ có màu vàng đậm, trong khi nếu có chất ức chế hiệu quả, lượng p-nitrophenol giải phóng sẽ ít hơn, làm cho sản phẩm có màu vàng nhạt hơn Acarbose được sử dụng làm chất đối chứng trong thí nghiệm này.
Để chuẩn bị dung dịch đệm phosphate 50 mM, pH = 6,9, cần cân 5,667 g muối K2HPO4.3H2O và 3,425 g muối KH2PO4, sau đó cho vào cốc thủy tinh 250 mL Khuấy đều dung dịch cho đến khi tan hoàn toàn rồi lọc Sau khi lọc, đổ dung dịch vào ống đong 1000 mL và thêm nước cất đến 950 mL Kiểm tra pH và sử dụng acid HCl để điều chỉnh nếu cần Nếu pH đạt yêu cầu, tiếp tục thêm nước cất cho đến khi đạt 1000 mL Cuối cùng, thu được 1000 mL dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM, pH = 6,9.
Để chuẩn bị dung dịch α-glucosidase 10 U/mL, cho 10,4 mg α-glucosidase vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 8 mL dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM và thực hiện quá trình siêu âm cho đến khi chất rắn tan hoàn toàn và không còn bọt khí Cuối cùng, định mức dung dịch bằng dung dịch đệm lên 10 mL.
Để chuẩn bị dung dịch -glucosidase 0,3 U/mL, lấy 36 L dung dịch -glucosidase 10 U/mL cho vào hũ bi, sau đó thêm 1164 L dung dịch đệm và lắc đều Đối với dung dịch pNPG 1 mM, cân 0,0030 g p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (M = 301,25 g/mol) cho vào bình định mức 10 mL, sau đó định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM và lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn.
Để chuẩn bị dung dịch Na2CO3 125 mM, cân 0,1324 g muối Na2CO3 (M = 105,9888 g/mol) và cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM và lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn.
Acarbose 0,6 mM: Cân 0,0038 g acarbose (M = 645,60 g/mol) cho vào bình định mức
10 mL Sau đó, cho 2 mL DMSO (99%) vào hòa tan lượng acarbose và tiến hành định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm Lắc đều đến khi tan hoàn toàn
Để chuẩn bị dung dịch KP04 0,8 mM, cân 0,0021 g KP04 (M = 256,05 g/mol) và cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 2 mL DMSO (99%) vào để hòa tan, sau đó định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm Lắc đều cho đến khi dung dịch tan hoàn toàn.
Để chuẩn bị dung dịch KP05 0,8 mM, cân 0,0022 g KP05 (M = 274,04 g/mol) cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 2 mL DMSO (99%) vào bình để hòa tan, sau đó tiến hành định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm Lắc đều cho đến khi KP05 tan hoàn toàn.
Để chuẩn bị dung dịch NT04 0,8 mM, cân 0,0023 g NT04 (M = 286,06 g/mol) và cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 2 mL DMSO (99%) để hòa tan, sau đó định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm Lắc đều cho đến khi NT04 tan hoàn toàn.
Để chuẩn bị dung dịch NT06 0,8 mM, cân 0,0023 g NT06 (M = 286,06 g/mol) và cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 2 mL DMSO (99%) để hòa tan, sau đó định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm Lắc đều cho đến khi NT06 tan hoàn toàn.
Để chuẩn bị dung dịch NT08 0,8 mM, cân 0,0022 g NT08 (M = 274,04 g/mol) vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 2 mL DMSO (99%) vào để hòa tan, sau đó định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm Lắc đều cho đến khi NT08 tan hoàn toàn.
Để chuẩn bị dung dịch TT02 0,8 mM, cân 0,0024 g TT02 (M = 292,03 g/mol) cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 2 mL DMSO (99%) vào để hòa tan, sau đó định mức đến 10 mL bằng dung dịch đệm Lắc đều cho đến khi TT02 tan hoàn toàn.
Trước khi cho mẫu thử nghiệm vào tủ sấy phải lau tủ sạch sẽ, ổn định ở 37 C trong khoảng 30 phút.
Bố trí đĩa 96 giếng được mô tả trong bảng phụ lục 1, bao gồm các mẫu: mẫu trắng (MTr), mẫu chứng (MCh), mẫu thử (MTh) và mẫu chứng trắng (MCt) Mỗi nồng độ thử sẽ được đo ở 3 giếng và lặp lại 3 lần, với các nồng độ được ký hiệu là a, b, c, d.
Mẫu trắng (MTr) chỉ chứa đệm phosphate và pNPG
Mẫu chứng (MCh) gồm enzyme, dung dịch đệm phosphate và pNPG
Mẫu thử (MTh) gồm chất thử, dung dịch đệm phosphate, enzyme và pNPG
Mẫu chứng trắng (MCt) gồm chất thử, dung dịch đệm phosphate và pNPG
Lặp lại 3 lần đo với cách bố trí như bảng 2.3 Kết quả sau đó xử lí bằng phần mềm Excel Phân bố hóa chất trong các giếng:
Cho vào mỗi giếng chứa mẫu trắng (MTr): 180 L dung dịch đệm (50 mM, pH = 6,9)
Cho vào mỗi giếng chứa mẫu chứng (MCh): 20 L -glucosidase (0,3 U/mL) và
Sử dụng 160 L dung dịch đệm cho các giếng chứa mẫu chứng trắng (MCt) và mẫu thử (MTh) theo hướng dẫn trong các bảng phụ lục 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8.
Phản ứng được thực hiện trong đĩa 96 giếng với -glucosidase được ủ ở 37 C cùng với chất ức chế trong 30 phút Sau đó, 20 L pNPG (1 mM) được thêm vào và tiếp tục ủ trong 30 phút Phản ứng được kết thúc bằng cách thêm 20 L Na2CO3 (125 mM) và ủ thêm 5 phút Cuối cùng, độ hấp thu quang được đo bằng máy Elisa (JP Selecta, 2100C, Tây Ban Nha) ở bước sóng 405 nm.
Sau khi đo độ hấp thu quang của đĩa 96 giếng bằng máy Elisa, dữ liệu thu được sẽ được sử dụng để tính toán phần trăm ức chế theo công thức (1) Từ đó, IC50 cho từng chất thử sẽ được xác định thông qua phương trình đồ thị phù hợp.
% Ức chế -glucosidase = (1 − A mẫu thử − A mẫu chứng trắng
Xử lý kết quả
Các kết quả phần trăm ức chế -glucosidase, cường độ phát huỳnh quang được xử lí bằng phần mềm Excel 2019, Oringin2024b và GraphPad Prism 10 Mỗi kết quả đều đo
3 lần và trình bày theo giá trị trung bình độ lệch chuẩn
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Sàng lọc hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol
Khi sử dụng acarbose làm chất đối chứng, nồng độ acarbose tăng lên dẫn đến phần trăm ức chế cũng gia tăng, tạo thành đồ thị đường cong như hình 3.1 Dựa trên phương trình đồ thị, giá trị IC50 được xác định là 69,71 1,91 M (tương đương 45,01 1,23 g/mL), từ đó xác định khoảng nồng độ phù hợp cho nghiên cứu.
0 – 500 M của chất đối chứng acarbose để sử dụng khảo sát khả năng ức chế
-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol
Hình 3.1 Phần trăm ức chế -glucosidase tại các nồng độ acarbose khác nhau
Sau khi khảo sát khả năng ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol trong khoảng nồng độ 0 – 500 M, kết quả cho thấy chỉ có chất thử TT02 thể hiện khả năng ức chế tốt nhất với IC50 là 264,58 3,43 M (77,26 1,00 g/mL), với đồ thị phần trăm ức chế là đường thẳng tiếp tuyến.
Các dẫn xuất còn lại vẫn có khả năng ức chế, nhưng IC50 vượt qua khoảng nồng độ khảo sát
Hình 3.2 Phần trăm ức chế -glucosidase tại các nồng độ TT02 khác nhau
Tác dụng ức chế của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol và acarbose thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Tác dụng ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol và acarbose
Bảng 3.1 chỉ ra rằng khả năng ức chế phụ thuộc vào sự thay đổi nhóm thế và vị trí nhóm thế Mặc dù khả năng ức chế của TT02 không đạt hiệu quả tốt như acarbose, nhưng nó lại vượt trội hơn so với 5 dẫn xuất 7-fluoroflavonol khác Nguyên nhân có thể là do sự hiện diện của 3 nhóm thế fluoro cùng với nhóm hydroxyl, giúp tăng cường hoạt tính kháng.
-glucosidase Tuy nhiên, ở một nghiên cứu khác khi sử dụng các nhóm thế hydroxyl thay vì nhóm thế fluoro cho kết quả kháng -glucosidase tốt hơn với IC50 = 13 M
[34] Những kết quả này cho thấy, nhóm thế fluoro ở vị trí 7, 3 và 4 làm suy yếu tác dụng ức chế so với khi sử dụng nhóm thế hyroxyl
Khóa luận này tập trung vào TT02, dẫn xuất có khả năng ức chế tốt nhất trong số 6 dẫn xuất, nhằm khảo sát cơ chế ức chế, động học và loại tương tác với enzyme -glucosidase.
Hiện tượng dập tắt huỳnh quang -glucosidase bởi TT02
Để tìm hiểu sâu về sự tương tác giữa -glucosidase và TT02, chúng tôi đã thực hiện phương pháp đo phổ phát huỳnh quang Hình 3.3 minh họa phổ phát huỳnh quang của hệ thống này.
-glucosidase khi không có và có mặt TT02 Khi kích thích tại bước sóng 295 nm,
Trong nghiên cứu về -glucosidase, không có sự hiện diện của TT02 dẫn đến đỉnh phát xạ mạnh tại bước sóng 340 nm, trong khi TT02 không phát huỳnh quang Điều này cho thấy phổ phát huỳnh quang chỉ đến từ -glucosidase Hơn nữa, cường độ phát huỳnh quang của -glucosidase giảm dần khi nồng độ TT02 tăng, mà không có sự dịch chuyển rõ ràng của đỉnh phát xạ Hiện tượng này chứng minh rằng TT02 có khả năng dập tắt huỳnh quang của -glucosidase, mặc dù cơ chế dập tắt vẫn chưa được làm sáng tỏ.
Hình 3.3 Phổ phát huỳnh quang -glucosidase khi không có và có chất ức chế TT02
Để làm rõ cơ chế dập tắt của TT02, chúng ta sử dụng phương trình đồ thị Stern-Volmer để phân tích dữ liệu tại bước sóng 340 nm Hằng số Stern-Volmer K SV là yếu tố quan trọng trong quá trình này.
Hằng số lưỡng phân tử \( k_q \) được xác định qua công thức \( K_{SV} = k_q \times \tau_0 \), với \( \tau_0 = 10^{-8} \) s Khi \( k_q \) khoảng \( 10^{10} \) M\(^{-1}\) s\(^{-1}\), cơ chế dập tắt là dập tắt động (dynamic quenching) Tuy nhiên, nếu \( k_q \) lớn hơn nhiều so với \( 10^{10} \) M\(^{-1}\) s\(^{-1}\), cơ chế dập tắt sẽ bao gồm cả dập tắt động và dập tắt tĩnh (static quenching), trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế.
Hình 3.4 Đồ thị phương trình Stern-Volmer cơ chế dập tắt động
Sử dụng dữ liệu cường độ phát huỳnh quang và phần mềm OriginPro, chúng tôi đã vẽ đồ thị phương trình Stern-Volmer để phân tích hiện tượng dập tắt huỳnh quang của -glucosidase bởi TT02 Kết quả này cho phép xác định các thông số quan trọng liên quan đến quá trình dập tắt huỳnh quang.
F = 1 + k q × τ × [Q] = 1 + K SV × [Q] (11) log F F − F =logK a + n× log [Q] (12) Căn cứ vào phương trình (11), (12) và đồ thị Stern-Volmer ta xác định được các giá trị bảng 3.2
Bảng 3.2 Các thông số dập tắt huỳnh quang -glucosidase bởi TT02 Đại lượng Giá trị
Cơ chế dập tắt Dập tắt động và tĩnh
Hình 3.5 Đồ thị log của cơ chế dập tắt tĩnh
Sau khi xây dựng phương trình đồ thị Stern-Volmer, hằng số Stern-Volmer K SV được xác định là 7630 (M -1), từ đó tính được hằng số dập tắt lưỡng phân tử k q = 7,63 × 10 11 (M -1 s -1) Với k q lớn hơn 10 10 (M -1 s -1), quá trình dập tắt huỳnh quang bao gồm cả dập tắt động và dập tắt tĩnh, trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế Để xác định hằng số kết hợp K a và tỷ lệ phản ứng giữa enzyme và TT02 trong dập tắt tĩnh, cần xây dựng đồ thị log(F − F)/F phụ thuộc.
34 log(TT02) (hình 3.5) Giá trị K a = 5700 (M -1 ) khá lớn cho thấy TT02 có ái lực tốt với
-glucosidase, hay nói cách khác -glucosidase bị ức chế tốt bởi TT02 Bên cạnh đó, giá trị n = 1,06 chứng tỏ tỷ lệ phản ứng giữa TT02 và -glucosidase là 1:1.
Động học và cơ chế ức chế -glucosidase bởi TT02
Để xác định các thông số động học và hiểu cơ chế ức chế -glucosidase của TT02, nghiên cứu sử dụng phương trình đồ thị Lineweaver-Burk để thể hiện mối quan hệ giữa 1/v và 1/[S] Đồng thời, phương trình đồ thị Dixon được áp dụng để phân tích sự phụ thuộc của 1/v theo nồng độ chất ức chế [I] Chất đối chứng trong nghiên cứu là acarbose.
Xây dựng đồ thị Lineweaver-Burk và đồ thị Dixon cho chất đối chứng acarbose theo các dãy nồng độ Khi nồng độ chất ức chế acarbose tăng, đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy các đường giao nhau tại trục tung, dẫn đến giá trị 1/v không đổi và giá trị K M tăng lên Điều này chứng tỏ acarbose hoạt động theo cơ chế ức chế cạnh tranh, cạnh tranh với chất nền trong quá trình liên kết.
Sự ức chế của α-glucosidase làm giảm ái lực giữa enzyme và chất nền, trong khi tốc độ cực đại (Vmax) vẫn không thay đổi Để xác định hằng số ức chế Ki, đồ thị Dixon đã được xây dựng (hình 3.7).
Hình 3.6 Đồ thị Lineweaver-Burk của -glucosidase khi không có và có acarbose
Hình 3.7 Đồ thị Dixon của -glucosidase khi không có và có acarbose
Từ giao điểm của các đường nồng độ và trục x, giá trị -K i được xác định là 2,625 × 10^-4 (M), cho thấy hằng số ức chế nhỏ, chứng tỏ phức [enzyme−acarbose] tạo ra nhiều Acarbose có khả năng ức chế tốt đối với enzyme α-glucosidase, như được trình bày trong bảng 3.3 và bảng 3.4.
Bảng 3.3 Giá trị K M khi nồng độ acarbose tăng dần
Bảng 3.4 Thông số động học và loại ức chế của acarbose Đại lượng Giá trị
Loại ức chế Ức chế cạnh tranh
Kết quả từ việc xây dựng đồ thị Lineweaver-Burk và Dixon cho thấy khi nồng độ chất ức chế TT02 tăng, giá trị 1/v cũng tăng Tuy nhiên, khác với đồ thị của chất đối chứng acarbose, các đường nồng độ TT02 giao nhau tại trục hoành, cho phép xác định giá trị K M Hằng số Michaelis-Menten K M không thay đổi, trong khi Vmax giảm dần khi nồng độ TT02 tăng Điều này cho thấy α-glucosidase bị ức chế bởi TT02 thông qua cơ chế ức chế không cạnh tranh, khi TT02 liên kết tại vị trí allosteric trên enzyme mà không cạnh tranh với chất nền Do đó, mặc dù ái lực của enzyme với pNPG không bị ảnh hưởng, nhưng tốc độ phản ứng tạo thành phức hợp [enzyme-sản phẩm] (ES) bị chậm lại.
Đồ thị Lineweaver-Burk của -glucosidase cho thấy sự khác biệt giữa trạng thái không có và có sự hiện diện của TT02 Để xác định hằng số ức chế K i trong trường hợp ức chế không cạnh tranh, ta sử dụng đồ thị Dixon, trong đó điểm giao nhau giữa các đường nồng độ và trục hoành biểu thị giá trị −K i.
Hằng số ức chế K i = 4,78 × 10^-5 (M) cho thấy phức [α-glucosidase−TT02] có khả năng ức chế hiệu quả Trong một nghiên cứu khác, khi thay thế nhóm thế fluoro bằng nhóm thế hydroxyl, hằng số ức chế được xác định là K i = 1,06 × 10^-5 (M), chứng tỏ ái lực liên kết với enzyme.
37 không bị ảnh hưởng nhiều khi sử dụng nhóm thế fluoro hay nhóm thế hydroxyl Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và bảng 3.6
Hình 3.9 Đồ thị Dixon của -glucosidase khi không có và có TT02
Bảng 3.5 Giá trị Vmax khi nồng độ TT02 tăng dần
Nồng độ (M) V max (OD/min)
Bảng 3.6 Thông số động học và loại ức chế của TT02 Đại lượng Giá trị
Loại ức chế Ức chế không cạnh tranh
Hiện tượng dập tắt huỳnh quang phức chất [enzyme-ANS] bởi TT02
TT02 có khả năng ức chế -glucosidase thông qua cơ chế dập tắt động và dập tắt tĩnh, trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế Hơn nữa, TT02 thể hiện sự ức chế không cạnh tranh với chất nền, nhưng cơ chế tương tác với -glucosidase vẫn chưa được làm rõ Để làm sáng tỏ vấn đề này, thử nghiệm sử dụng ANS, một chất tương tác kỵ nước với enzyme, và khi thêm chất ức chế TT02, nếu TT02 có tương tác kỵ nước với enzyme, sẽ dẫn đến sự giảm cường độ phát huỳnh quang.
Hình 3.10 Phổ phát huỳnh quang của phức [-glucosidase−ANS] khi không có và có
Khi kích thích ở bước sóng 375 nm, -glucosidase gần như không phát xạ trong vùng 400 – 600 nm, trong khi ANS cho đỉnh phát xạ tại 515 nm TT02 thể hiện hai đỉnh phát xạ lần lượt tại 449 nm và 534 nm Phức [enzyme-ANS] có đỉnh phát xạ tại 471 nm, cho thấy phổ phát xạ của phức [enzyme-ANS] không giống như các mẫu khác.
Khi thêm TT02 vào phức [enzyme-ANS], cường độ phát xạ giảm và đỉnh phát xạ dịch chuyển hai bên, nhưng không phải là phổ phát xạ của TT02 do cường độ phát xạ cao hơn nhiều so với mẫu chỉ có TT02 Hình dạng phổ thay đổi và cường độ phát quang giảm là do TT02 ức chế tốt, cạnh tranh với ANS, dẫn đến giảm cường độ phát huỳnh quang và biến dạng phổ đồ.
Từ đó ta hoàn toàn kết luận rằng TT02 tương tác kỵ nước với enzyme
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Qua nghiên cứu trên, hoàn toàn có thể khẳng định 7-fluoro-2-(3,4-difluorophenyl)-3- hydroxy-4H-chromen-4-one (TT02) khả năng ức chế tốt -glucosidase với
IC50 đạt 264,58 2,86 (M) nhờ sự hỗ trợ từ ba nhóm thế fluoro và nhóm hydroxyl trong cấu trúc Nghiên cứu cũng đã khảo sát quá trình dập tắt huỳnh quang.
TT02 ức chế hoạt động của α-glucosidase thông qua hai cơ chế dập tắt huỳnh quang: dập tắt động (dynamic quenching) và dập tắt tĩnh (static quenching) Trong đó, dập tắt tĩnh chiếm ưu thế với hằng số dập tắt k q = (7,63 0,30) 10 11 (M -1 s -1 ).
Nghiên cứu động học enzyme sử dụng đồ thị Lineweaver-Burk và Dixon cho thấy rằng TT02 ức chế -glucosidase thông qua cơ chế ức chế không cạnh tranh Hơn nữa, tương tác giữa TT02 và enzyme diễn ra chủ yếu qua các lực kỵ nước, điều này được minh chứng bởi việc TT02 làm giảm phổ huỳnh quang của phức hợp [enzyme-ANS], cho thấy TT02 cạnh tranh với ANS trong việc tương tác với enzyme.
Tổng hợp thêm các dẫn xuất flavonol mang các nhóm thế khác nhau trên 02 vòng A và
Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính in vitro kháng α-glucosidase nhằm xác định mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính Chọn lựa cấu trúc có hoạt tính cao nhất để tiến hành nghiên cứu về động học và cơ chế tác động.
[1] C Sanna et al., "Promising inhibition of diabetes-related enzymes and antioxidant properties of Ptilostemon casabonae leaves extract," Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, vol 38, no 1, p 2274798, 2023
[2] T Matsui et al., "alpha-Glucosidase inhibitory profile of catechins and theaflavins," (in eng), J Agric Food Chem, vol 55, no 1, pp 99-105, Jan 10
[3] M A Atkinson, G S Eisenbarth, and A W Michels, "Type 1 diabetes," The
[4] A Katsarou et al., "Type 1 diabetes mellitus," Nature reviews Disease primers, vol 3, no 1, pp 1-17, 2017
[5] S E Kahn, M E Cooper, and S Del Prato, "Pathophysiology and treatment of type 2 diabetes: perspectives on the past, present, and future," The Lancet, vol
[6] Y Wu, Y Ding, Y Tanaka, and W Zhang, "Risk factors contributing to type 2 diabetes and recent advances in the treatment and prevention," International journal of medical sciences, vol 11, no 11, p 1185, 2014
[7] A Kimura, J.-H Lee, I.-S Lee, H.-S Lee, K.-H Park, S Chiba, and D Kim,
"Two potent competitive inhibitors discriminating α-glucosidase family I from family II," Carbohydrate Research, vol 339, no 6, pp 1035-1040, 2004
[8] D F Pereira et al., "Effects of flavonoids on α-glucosidase activity: potential targets for glucose homeostasis," Nutrition, vol 27, no 11-12, pp 1161-1167,
[9] U Wehmeier and W Piepersberg, "Biotechnology and molecular biology of the α-glucosidase inhibitor acarbose," Applied microbiology and biotechnology, vol 63, pp 613-625, 2004
[10] P Meng, C Xie, P Geng, X Qi, F Zheng, and F Bai, "Inhibitory effect of components from Streptomyces species on α-glucosidase and α-amilase of
42 different origin," Applied biochemistry and microbiology, vol 49, pp 160-168,
[11] R Rabasa‐Lhoret and J L Chiasson, "α‐Glucosidase inhibitors," International textbook of diabetes mellitus, 2003
[12] J A Balfour and D McTavish, "Acarbose: an update of its pharmacology and therapeutic use in diabetes mellitus," Drugs, vol 46, pp 1025-1054, 1993
[13] S Kumar and A K Pandey, "Chemistry and biological activities of flavonoids: an overview," The scientific world journal, vol 2013, 2013
[14] R P Feliciano, S Pritzel, C Heiss, and A Rodriguez-Mateos, "Flavonoid intake and cardiovascular disease risk," Current Opinion in Food Science, vol
[15] S H Thilakarathna and H V Rupasinghe, "Flavonoid bioavailability and attempts for bioavailability enhancement," Nutrients, vol 5, no 9, pp 3367-
[16] R Griesbach, "Biochemistry and genetics of flower color," Plant breeding reviews, vol 25, pp 89-114, 2005
[17] S Li, X Cheng, and C Wang, "A review on traditional uses, phytochemistry, pharmacology, pharmacokinetics and toxicology of the genus Peganum,"
Journal of Ethnopharmacology, vol 203, pp 127-162, 2017
[18] A McGown, A Ragazzon-Smith, J A Hadfield, H Potgetier, and P A
Ragazzon, "Microwave-assisted synthesis of novel bis-flavone dimers as new anticancer agents," Letters in Organic Chemistry, vol 16, no 1, pp 66-75,
[19] J Sun et al., "Isolation of α-glucosidase inhibitors including a new flavonol glycoside from Dendrobium devonianum," Natural Product Research, vol 28, no 21, pp 1900-1905, 2014/11/02 2014
[20] J He and M M Giusti, "Anthocyanins: natural colorants with health- promoting properties," Annual review of food science and technology, vol 1, pp 163-187, 2010
[21] M Ajebli and M Eddouks, "Flavonoid-enriched extract from desert plant
Warionia saharae improves glucose and cholesterol levels in diabetic rats,"
Cardiovascular & Hematological Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Cardiovascular & Hematological Agents), vol
[22] P Shah and A D Westwell, "The role of fluorine in medicinal chemistry,"
Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, vol 22, no 5, pp 527-
[23] J R Lakowicz, "Quenching of Fluorescence," in Principles of Fluorescence
Spectroscopy Boston, MA: Springer US, 1983, pp 257-301
[24] X Yu et al., "Study on the Synergism Effect of Lomefloxacin and Ofloxacin for
Bovine Serum Albumin in Solution by Spectroscopic Techniques," Journal of
Solution Chemistry, vol 40, no 3, pp 521-531, 2011/03/01 2011
[25] J H.Espenson, Chemical kinetics and reaction mechanisms McGraw-Hill,
[26] E.-H Liu, L.-W Qi, and P Li, "Structural relationship and binding mechanisms of five flavonoids with bovine serum albumin," Molecules, vol 15, no 12, pp 9092-9103, 2010
[27] M Van de Weert and L Stella, "Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology," Journal of Molecular Structure, vol 998, no 1-3, pp 144-150, 2011
[28] N Punekar, Enzymes: catalysis, kinetics and mechanisms Springer, 2018
[29] A G Marangoni, Enzyme kinetics: a modern approach John Wiley & Sons,
[30] D Sur, "Kinetics of Enzyme Inhibition," The Beats of Natural Sciences, vol 1, pp 1-10, 2014
[31] A Cornish-Bowden, "A simple graphical method for determining the inhibition constants of mixed, uncompetitive and non-competitive inhibitors,"
[32] M Cardamone and N Puri, "Spectrofluorimetric assessment of the surface hydrophobicity of proteins," Biochemical Journal, vol 282, no 2, pp 589-593,
[33] V T Nga and H M Hao, "Inhibition kinetics and mechanism of genistein against α‐glucosidase," Vietnam Journal of Chemistry, 2024
[34] D Şửhretoğlu and S Sari, "Flavonoids as alpha-glucosidase inhibitors:
Mechanistic approaches merged with enzyme kinetics and molecular modelling," Phytochemistry Reviews, vol 19, no 5, pp 1081-1092, 2020
[35] B Shen et al., "Inhibitory effect of fisetin on α-glucosidase activity: kinetic and molecular docking studies," Molecules, vol 26, no 17, p 5306, 2021