Đồ án tốt nghiệp Công nghệ kỹ thuật hóa học: Sàng lọc hoạt tính ức chế α-Glucosidase của các dẫn xuất 3',4'-Difluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất

Hồ Chí Minh, tháng 8/2024 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT 3',4'-DIFLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀM NĂNG NHẤT

TỔNG QUAN

Khái quát về enzyme α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase còn có tên gọi khác là maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosido-invertase, α-D-glucosidase, α- glycosidehydrolase, α-1,4-glucosidase, hoặc α-D-glucosideglucohydrolase [1]

Enzyme α-glucosidase là một exohydrolase quan trọng, có khả năng xúc tác quá trình thủy phân nhanh chóng các liên kết 1,4-α glucoside và oligosacaride, giải phóng α-glucose Tính chọn lọc của enzyme này đối với chất nền phụ thuộc vào ái lực của chất nền với khoang gắn kết của nó.

Enzyme α-glucosidase thuộc nhóm glycoside hydrolase (GH), có khả năng phân giải các liên kết glycoside trong polysaccharide phức tạp Các enzyme trong lớp này thường được đặt tên theo chất nền mà chúng tác động, chẳng hạn như lactase tác dụng với lactose, chitinase tác động với chitin, và sucrase tác động với sucrose.

Enzyme α-glucosidase là một enzyme quan trọng có mặt trong hầu hết các sinh vật Ở người, enzyme này được tìm thấy trên bề mặt niêm mạc ruột và đóng vai trò thiết yếu trong giai đoạn cuối của quá trình thủy phân.

1.1.2 Cấu trúc của enzyme α-glucosidase

Các α-glucosidase (AGase) thuộc glycoside họ hydrolase Có năm họ glycoside hydrolase (GH) trong đó α-glucosidase được phân bố: GH4, GH13, GH31, GH63 và

GH97 Họ GH13 và GH31 bao gồm hai loại α-glucosidase chính với các đặc điểm về cấu trúc, chức năng khác nhau

Cấu trúc ba chiều và khả năng nhận biết carbohydrate của các enzyme thuộc họ GH13 đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, như thể hiện trong [Hình 1.1] [5] Enzyme GH13 có cấu trúc tương tự oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10; O16G) và dextran glucosidase (glucan 1,6-α-glucosidase; EC 3.2.1.70; DG) [2] Trong khi đó, các enzyme trong họ GH31 chủ yếu bao gồm α-xylosidase, 6-α-glucosyltransferase và 3-α-glucosidase.

Isomaltosyltransferase và α-glucosidase thuộc enzyme GH31, có chức năng xúc tác chung là thủy phân một phần carbohydrate cuối cùng Tuy nhiên, chúng có khả năng xúc tác cho nhiều hoạt động thủy phân khác nhau, do ưa thích các chất nền có kích thước từ disaccharide đến các polymer lớn như tinh bột và glycogen.

Cấu trúc không gian ba chiều của các GH13 Agase được thể hiện qua hai ví dụ: A Phức hợp Halomonas sp α-glucosidase và maltose (PDB, 3WY4) cho thấy cấu trúc tổng thể của enzyme; B Phức hợp Streptococcus mutans DG và isomaltotriose (PDB, 2ZID) cũng minh họa cấu trúc tổng thể tương tự.

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3D của các GH31 Agase: A Mô hình cấu trúc của N- terminal maltase-glucoamylase; B Vùng hoạt động của N-terminal maltase-glucoamy

1.1.3 Cơ chế hoạt động của enzyme α-glucosidase

Tinh bột là nguồn dinh dưỡng quan trọng, cung cấp carbohydrate chính trong chế độ ăn của con người Trong quá trình tiêu hóa, tinh bột được thủy phân thành đường đơn trong ruột non nhờ các enzyme tiêu hóa Enzyme α-amylase trong nước bọt và dịch tiêu hóa phá vỡ liên kết α-1,4-glucoside, chuyển đổi tinh bột thành maltose và maltotriose Sau đó, enzyme α-glucosidase tiếp tục thủy phân các đường này thành glucose, cho phép glucose thẩm thấu qua màng tế bào ruột non vào máu, nơi nó được vận chuyển đến các tế bào để cung cấp năng lượng hoặc được lưu trữ dưới dạng glycogen trong gan và cơ bắp.

Việc ức chế enzyme α-glucosidase giúp giảm tốc độ thủy phân carbohydrate, từ đó làm chậm quá trình hấp thụ glucose vào máu.

Khái quát về chalcone và hoạt tính sinh học

1.2.1 Danh pháp hoá học và cấu trúc chalcone

Chalcone là một hợp chất ketone thơm, được hình thành từ hai vòng thơm kết nối qua chuỗi ba carbon, bao gồm nhóm carbonyl và liên kết đôi tại vị trí α, β.

Chalcone là một lớp hợp chất màu tự nhiên được tạo thành từ benzylideneacetophenone Thuật ngữ "chalcone" được giới thiệu lần đầu bởi Kostanecki và Tambor, những người đã đóng góp quan trọng vào việc tổng hợp các hợp chất màu tự nhiên.

Chalcone là một nhóm hợp chất tự nhiên phong phú có trong rau, trái cây và thực phẩm tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe Ngoài ra, chalcone còn là tiền chất chính cho quá trình tổng hợp flavonoid và isoflavonoid, góp phần vào nhiều lợi ích dinh dưỡng và sinh học.

Công thức khung phân tử cơ bản: C 15 H 12 O

Tên gọi theo danh pháp IUPAC: 1,3-diphenyl-2-propen-1-one

Chalcone có công thức tổng quát như sau:

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học cơ bản của chalcone

Một số tên thay thế của các chalcone: phenyl styryl ketone, benzalacetophenone, α- phenyl-β-benzoylethylene

Chalcone trong tự nhiên thường xuất hiện dưới dạng rắn kết tinh với nhiều màu sắc khác nhau, phụ thuộc vào các nhóm thế gắn liền với hệ thống vòng Chúng tan tốt trong nhiều dung môi hữu cơ như alcohol, acetone, chloroform và dichloromethane, cũng như trong dung dịch kiềm và acid, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng trong các phản ứng hóa học và phân tích Chalcone có thể tồn tại ở cả dạng đồng phân trans và cis, trong đó đồng phân trans ổn định hơn do đồng phân cis thường kém ổn định do sự chèn ép không gian giữa vòng A và nhóm carbonyl gần nhau.

1.2.2 Giới thiệu dẫn xuất của chalcone

Chalconoid là nhóm dẫn xuất của chalcone, một hợp chất tự nhiên phổ biến trong thực vật, có mặt ở nhiều bộ phận như hoa, lá, quả, rễ và thân Cấu trúc chalconoid bao gồm hai vòng benzene liên kết qua hệ thống carbonyl không bão hòa tại vị trí α, β, và thường chứa các nhóm thế phổ biến như -OH, -OCH3 Ngoài ra, chalconoid cũng có thể tồn tại dưới dạng glycoside trên hai vòng benzene.

Các nhóm thế trong các vòng benzene của chalconoid được đánh số theo thứ tự và gọi tên theo danh pháp quốc tế được biểu diễn ở [Hình 1.4] [9]

Hình 1.4: Cấu trúc chung các dẫn xuất của chalconoid

Khung cơ bản của chalconoid là khung sườn chalcone, cho phép tổng hợp các dẫn xuất thông qua việc thay đổi các nhóm thế trên acetophenone và aryl aldehyde Sự đa dạng trong cấu trúc này giúp chalconoid tạo ra nhiều dạng phân tử khác nhau, mang lại nhiều hoạt tính sinh học và ứng dụng tiềm năng trong y học, dược phẩm và nông nghiệp Nghiên cứu chalconoid đang phát triển mạnh mẽ, với nhiều nỗ lực nhằm khám phá tính chất và ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khoa học và công nghệ.

Chalcone đã thu hút sự chú ý trong nhiều năm nhờ vào cấu trúc đơn giản và khả năng tổng hợp dễ dàng, cùng với nhiều dẫn xuất đa dạng Các hợp chất này không chỉ an toàn mà còn mang lại nhiều hoạt tính sinh học và dược học quý giá, bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn Đặc biệt, một số dẫn xuất chalcone tổng hợp đã được chứng minh có hiệu quả mạnh mẽ trong việc ức chế béo phì và kháng đái tháo đường.

Nghiên cứu về các chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGI) cho thấy chúng đóng vai trò quan trọng trong việc làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate và hấp thụ glucose Nhờ đó, AGI giúp ổn định mức đường huyết và ngăn ngừa tình trạng tăng đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường.

Cấu trúc của các AGI tương tự như phân tử carbohydrate tự nhiên, cho phép chúng gắn kết mạnh mẽ vào α-glucosidase Qua việc hình thành phức hợp ức chế cạnh tranh, AGI giảm hoạt động của enzyme này, từ đó hạn chế lượng glucose vào máu Hơn nữa, carbohydrate chưa được thủy phân trong ruột có thể tiếp tục được phân giải ở các phần khác của hệ tiêu hóa như tá tràng, hồi tràng, giúp duy trì mức đường huyết ổn định sau bữa ăn.

Các nghiên cứu trước đây cho thấy các loại thuốc AGI như miglitol, acarbose và voglibose có khả năng tăng cường tiết GLP-1, một hormone tiêu hóa được giải phóng sau bữa ăn GLP-1 không chỉ thúc đẩy tiết insulin từ tuyến tụy mà còn giảm tiết glucagon và làm chậm quá trình rỗng dạ dày Việc tăng cường GLP-1 giúp kiểm soát đường huyết hiệu quả và có thể hạn chế cảm giác thèm ăn Acarbose là một trong những loại thuốc được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường loại 2, mang lại lợi ích rõ rệt cho bệnh nhân.

Acarbose ức chế enzyme α-glucosidase trên bề mặt tế bào niêm mạc ruột non, giúp làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thụ carbohydrate, từ đó giảm lượng đường huyết sau bữa ăn Tuy nhiên, thuốc này có thể gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng như đau dạ dày, tiêu chảy và đầy hơi.

Việc nghiên cứu và phát triển các thuốc ức chế alpha-glucosidase (AGI) tự nhiên từ nguồn tài nguyên thiên nhiên, đặc biệt là thực phẩm, đang mở ra hướng tiếp cận mới trong điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 Những nghiên cứu này nhằm tìm kiếm các lựa chọn điều trị hiệu quả hơn với ít tác dụng phụ so với các AGI tổng hợp như acarbose, miglitol và voglibose Các chất ức chế tự nhiên không chỉ giúp kiểm soát lượng đường huyết sau bữa ăn mà còn mang lại nhiều lợi ích sức khỏe tổng thể nhờ vào các hoạt chất bổ sung có trong nguồn gốc thiên nhiên của chúng.

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của acarbose, miglitol và voglibose

Tổng quan về phổ phát huỳnh quang

1.3.1 Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang

Hiện tượng phát huỳnh quang xảy ra khi phân tử fluorophore hấp thụ năng lượng từ ánh sáng kích thích, dẫn đến sự chuyển đổi từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích thích F* ở mức năng lượng cao S2 Tại mức năng lượng cao này, phân tử trở nên không bền và có xu hướng hồi phục về trạng thái năng lượng thấp hơn S1, giải phóng năng lượng dưới dạng nhiệt qua dao động nội phân tử và tương tác với các phân tử lân cận Từ trạng thái F* với năng lượng S1, phân tử có thể trở về trạng thái cơ bản F (S0) thông qua phát xạ huỳnh quang hoặc quá trình phi phát xạ.

Khi trong dung dịch xuất hiện phân tử dập tắt huỳnh quang Q, trạng thái kích thích F* có thể trở về trạng thái cơ bản F thông qua quá trình dập tắt huỳnh quang, bên cạnh các quá trình phát xạ và phi phát xạ Hiện tượng này được thể hiện rõ qua hình ảnh so sánh giữa phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang trong trường hợp không có và có sự hiện diện của Q.

Hình 1.6: Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang khi không có và có Q

Tốc độ quá trình phát xạ được xác định bởi phương trình (1):

𝒗 𝒇 = 𝒌 𝒇 [𝐅 ∗ ] (1) k f là hằng số tốc độ quá trình phát xạ

Tốc độ quá trình phi phát xạ được xác định bởi phương trình (2):

k t là tổng các hằng số tốc độ của các quá trình phi phát xạ

Trong điều kiện kích thích liên tục thì tốc độ hình thành F * và tốc độ giảm hoạt F *  F là như nhau Nồng độ F * được xác định bởi phương trình (3):

Trong đó: I a là tốc độ hình thành (F*)

Khi phân tử dập tắt huỳnh quang (quencher, Q) có mặt trong dung dịch, hiện tượng dập tắt huỳnh quang lưỡng phân tử xảy ra, khiến F* trở về trạng thái nền F mà không cần quá trình phát xạ hay phi phát xạ Quá trình này được mô tả bằng phương trình v = k q [F*][Q].

Nồng độ của [F*] khi có Q là:

Hiệu suất lượng tử (tỷ số giữa tốc độ phát huỳnh quang F * F và tốc độ hình thành F * ) khi không có Q được biểu diễn bởi phương trình (6):

Hiệu suất lượng tử khi có Q được biểu diễn bởi phương trình (7):

Tỷ lệ của hai hiệu suất lượng tử là:

𝑘 𝑓 +𝑘 𝑡 là thời gian sống của F* khi không có Q o = 10 -8 s

Hằng số Stern-Volmer (K sv) là tỷ lệ giữa hằng số dập tắt lưỡng phân tử và hằng số dập tắt đơn phân tử, với đơn vị đo là L.mol⁻¹.

Hiệu suất lượng tử tỉ lệ thuận với cường độ phát huỳnh quang Đặt F0 là cường độ phát huỳnh quang trong dung dịch không có chất Q, và F là cường độ phát huỳnh quang khi có chất Q trong dung dịch.

Phương trình (9) được gọi là phương trình Stern-Volmer Như vậy, hằng số Stern- Volmer K sv là hệ số góc của phương trình (9)

Dựa vào giá trị K SV thu được từ thực nghiệm, có thể xác định hằng số tốc độ dập tắt lưỡng phân tử k q

Trong cơ chế dập tắt huỳnh quang động học, giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng là sự hình thành phức chất trung gian [FQ] * với hằng số tốc độ k d, thuộc giới hạn kiểm soát khuếch tán.

𝐅 ∗ + 𝐐 𝒌 → 𝐅 + 𝐐 , 𝒗 = 𝒌 𝒅 𝒒 [𝐅 ∗ ][𝐐] (9) Đối với một chất dập tắt hiệu quả là khi giá trị K sv ≈ 10 2 – 10 3 M -1 và nếu  ≈ 10 -8 s, thì k q ≈ 10 10 – 10 11 M -1 s -1 [17]

1.3.2 Cơ chế dập tắt huỳnh quang động và tĩnh

Khi chất dập tắt huỳnh quang Q xuất hiện, quá trình dập tắt huỳnh quang F* của phân tử fluorophore có thể diễn ra qua hai cơ chế: dập tắt huỳnh quang động và dập tắt huỳnh quang tĩnh, hoặc sự kết hợp của cả hai Cả hai cơ chế này đều làm giảm cường độ phát quang của F, nhưng chúng có những đặc điểm và cách tương tác riêng biệt với F* theo phương trình động học.

∆: năng lượng kích thích dạng nhiệt

Cơ chế dập tắt huỳnh quang động xảy ra khi phân tử dập tắt (Q) tương tác với phân tử fluorophore kích thích (F*) thông qua quá trình khuếch tán và va chạm.

Trong quá trình dập tắt huỳnh quang động, năng lượng từ trạng thái kích thích F* được truyền trực tiếp sang trạng thái nền F thông qua va chạm mà không phát xạ photon Để quá trình này diễn ra hiệu quả, chất dập tắt cần có khả năng khuếch tán và va chạm với F* trong suốt thời gian sống của nó, dẫn đến sự thay đổi thời gian sống của F*.

Cơ chế dập tắt huỳnh quang tĩnh: xảy ra khi phân tử fluorophore (F) và chất dập tắt

Tương tác giữa các thành phần tạo thành phức hợp [FQ] ở trạng thái nền trước khi phân tử được kích thích, điều này cho thấy quá trình này không ảnh hưởng đến thời gian sống của trạng thái F*.

Nếu quá trình dập tắt huỳnh quang tĩnh diễn ra, thông tin về sự tạo phức chất giữa F và Q sẽ được thể hiện qua phương trình (11) [18] [19].

Trong đó, n là tỉ lệ phản ứng giữa F và Q và 𝐾 a , M −1 là hằng số kết hợp giữa F và Q để tạo phức chất [FQ]:

Ứng dụng của phổ huỳnh quang trong hóa dược

Phổ phát huỳnh quang là công cụ quan trọng trong nghiên cứu khoa học, đặc biệt trong Hóa học, Môi trường, Y học, Dược học, Vật lý và Công nghệ Vật liệu Trong ngành Dược, nó cung cấp phương pháp nhạy và đặc hiệu để nghiên cứu tương tác giữa thuốc và protein hoặc enzyme mục tiêu, góp phần phát triển liệu pháp điều trị mới và hiểu biết về bệnh lý Ngoài ra, hiện tượng dập tắt huỳnh quang của protein/enzyme bởi chất ức chế cho phép xác định vị trí của amino acid như tryptophan, tyrosin, phenylalanine tương tác với chất ức chế trong cấu trúc bậc 4 của protein/enzyme.

Hiện tượng phát huỳnh quang của protein và enzyme phụ thuộc chủ yếu vào các amino acid có khả năng phát quang, trong đó tryptophan (Trp), tyrosin (Tyr) và phenylalanine (Phe) đóng vai trò quan trọng nhất.

Mỗi amino acid có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng cụ thể và phát lại ánh sáng ở bước sóng dài hơn, tạo ra phổ phát huỳnh quang đặc trưng.

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của tryptophan, tyrosine và phenylalanine

Dựa vào phổ hấp thụ của ba amino acid, tại bước sóng 295 nm chỉ có tryptophan hấp thụ, do đó đây là bước sóng thích hợp để chọn làm kích thích Tương tự, trong phổ phát huỳnh quang, khoảng bước sóng từ 300 đến 450 nm chỉ có tryptophan phát huỳnh quang, vì vậy khoảng này được chọn để nghiên cứu, như được thể hiện trong [Hình 1.8] [17].

Tryptophan là một amino acid quan trọng thường được sử dụng trong nghiên cứu động học ức chế, giúp phân tích mối quan hệ giữa chất ức chế (thuốc) và protein/enzyme mục tiêu thông qua sự phát huỳnh quang của nó Việc theo dõi sự phát huỳnh quang này diễn ra trong hai trạng thái: không có và có chất ức chế, cung cấp thông tin quý giá về cơ chế ức chế.

Hình 1.8: Phổ hấp thụ (a) và phổ huỳnh quang (b) của 03 amino acid tryptophan, tyrosine và phenylalanine

Hệ số tắt ε (M -1 s -1) cho biết mức độ hấp thụ ánh sáng của một chất tại một bước sóng cụ thể Giá trị ε càng cao, chất đó càng hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng đó.

Enzyme α-glucosidase là mục tiêu chính trong điều trị bệnh tiểu đường Acarbose, một chất ức chế α-glucosidase hiệu quả qua cơ chế ức chế cạnh tranh, đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi cho bệnh tiểu đường loại 2 Khóa luận này sử dụng acarbose làm chất đối chứng dương để xác nhận hiệu quả thí nghiệm và so sánh hoạt tính của các chất ức chế mới, từ đó đảm bảo độ tin cậy cho phương pháp thí nghiệm.

Cơ chế ức chế enzyme

Chất ức chế có khả năng tác động lên enzyme qua ba cơ chế chính: ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh Tuy nhiên, nhiều tài liệu chỉ công nhận hai loại ức chế chủ yếu là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh (hoặc hỗn hợp).

Khi không có chất ức chế, chất nền sẽ kết nối với khoang gắn kết của enzyme Sự tương tác giữa chất nền và enzyme cần đạt được sự cân bằng, vừa đủ mạnh để giữ chất nền trong khoang gắn kết cho phản ứng diễn ra, vừa đủ yếu để cho phép giải phóng sản phẩm.

Hình 1.9 mô tả phản ứng của enzyme khi không có chất ức chế Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, chất ức chế là một phân tử tương tự như chất nền, có khả năng liên kết vào cùng khoang gắn kết của enzyme nhưng với lực liên kết mạnh hơn Khi chất ức chế gắn vào enzyme, nó không tham gia vào phản ứng mà chỉ cạnh tranh với chất nền, ngăn cản sự gắn kết của chất nền vào enzyme Chất ức chế này được gọi là chất ức chế cạnh tranh, như thể hiện trong Hình 1.10.

Hình 1.10: Mô hình ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition)

Chất ức chế không cạnh tranh là loại chất ức chế không có cấu trúc tương đồng với chất nền tự nhiên, cho phép chúng gắn vào enzyme ở vị trí khác, không phải khoang gắn kết với chất nền Sự gắn kết này làm thay đổi hình dạng của enzyme, dẫn đến biến dạng khoang gắn kết và ngăn cản chất nền gắn vào, từ đó làm giảm hiệu suất hoạt động của enzyme.

Hình 1.11: Mô hình ức chế không cạnh tranh (Non-Competitive inhibition)

Chất ức chế kháng cạnh tranh (Un-Competitive inhibition) là một hình thức ức chế enzyme, trong đó chất ức chế chỉ kết hợp với phức hợp enzyme-chất nền sau khi chất nền đã liên kết với enzyme Điểm nổi bật của loại ức chế này là chất ức chế không gắn vào vị trí hoạt động của enzyme mà liên kết với một vị trí khác, không làm thay đổi hình dạng của khoang gắn kết Sự kết hợp này tạo thành phức hợp enzyme-chất nền-chất ức chế, dẫn đến việc giảm tốc độ phản ứng tiếp theo và ngăn cản sự hình thành sản phẩm.

Hình 1.12: Mô hình ức chế kháng cạnh tranh (Un-Competitive inhibition)

Bằng cách áp dụng đồ thị Lineweaver-Burk từ phương trình (13), chúng ta có thể xác định cơ chế ức chế của α-glucosidase Phương trình này được thể hiện dưới dạng cụ thể.

𝑣 𝑚𝑎𝑥 (13) Trong đó: v là vận tốc của phản ứng enzyme, v max là tốc độ phản ứng tối đa

K m = [S] khi v = v max/2 Như vậy K m là nồng độ của chất nền mà tại đó v = v max/2 với v max là tốc độ tối đa (cực đại)

Hằng số Michaelis (K m) là một chỉ số quan trọng trong việc xác định ái lực giữa enzyme và chất nền Một giá trị K m cao cho thấy enzyme có ái lực yếu đối với chất nền, trong khi giá trị K m thấp cho thấy ái lực mạnh hơn.

Trên đồ thị Lineweaver-Burk (1/v so với 1/[S]), mỗi nồng độ chất ức chế sẽ được biểu diễn bằng một đường thẳng riêng biệt, từ đó cho phép xác định giá trị K m.

Đồ thị Lineweaver-Burk được sử dụng để xác định cơ chế ức chế của các chất ức chế đối với enzyme Qua các thí nghiệm, nồng độ của chất nền và chất ức chế được thay đổi, từ đó xây dựng đồ thị giúp phân tích ảnh hưởng của chất ức chế lên hoạt động của enzyme.

(a) Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition):

Hình 1.14: Đồ thị Lineweaver-Burk biểu diễn ức chế cạnh tranh

Trên đồ thị Lineweaver-Burk, khi nồng độ chất ức chế tăng, điểm cắt trục tung (1/Vmax) giữ nguyên, nhưng độ dốc của đường thẳng tăng lên do giá trị Km tăng Điều này cho thấy ái lực giữa chất nền và enzyme giảm, dẫn đến việc Vmax không thay đổi trong khi Km tăng.

(b) Ức chế không cạnh tranh (Non-competitive inhibition):

Hình 1.15: Đồ thị Lineweaver-Burk biểu diễn ức chế không cạnh tranh

Trên đồ thị Lineweaver-Burk, sự xuất hiện của chất ức chế không cạnh tranh làm thay đổi giá trị Vmax, ngăn cản sự hình thành sản phẩm, trong khi giá trị Km không thay đổi, vì loại ức chế này không ảnh hưởng đến ái lực của enzyme đối với chất nền.

(c) Ức chế kháng cạnh tranh (Un-Competitive inhibition):

Hình 1.16: Đồ thị Lineweaver-Burk biểu diễn ức chế kháng cạnh tranh

Trong ức chế kháng cạnh tranh, chất ức chế gắn vào phức hợp enzyme-chất nền, làm thay đổi cấu trúc enzyme và giảm tốc độ phản ứng tối đa (Vmax) Đồng thời, chất ức chế cũng ổn định phức hợp enzyme-chất nền, dẫn đến việc giảm hằng số Michaelis-Menten (Km), thể hiện sự tăng khả năng liên kết giữa enzyme và chất nền.

(d) Ức chế hỗn hợp (Mixed inhibition):

Ức chế hỗn hợp là một dạng ức chế enzyme, trong đó chất ức chế có khả năng liên kết với cả enzyme tự do và phức chất enzyme-chất nền, gây ra các tác động riêng biệt lên hoạt động xúc tác và ái lực của enzyme đối với chất nền Chất ức chế có thể tương tác tại khoang gắn kết hoặc vị trí allosteric, dẫn đến sự thay đổi giá trị K m và Vmax Cụ thể, trong ức chế hỗn hợp, Vmax thường giảm do chất ức chế làm giảm hiệu quả xúc tác tổng thể của enzyme, bất kể nó liên kết với enzyme ở trạng thái tự do hay phức chất enzyme-chất nền.

Sự thay đổi của hằng số K m trong ức chế hỗn hợp phụ thuộc vào mức độ ưu tiên liên kết của chất ức chế với enzyme tự do so với phức hợp enzyme-chất nền, như được thể hiện trong Hình 1.17.

Biểu đồ Dixon là công cụ quan trọng trong việc xác định hằng số phân ly (K i) của chất ức chế Phương pháp này thực hiện bằng cách vẽ các đường thẳng động học tại các nồng độ chất ức chế khác nhau, mỗi đường thể hiện mối quan hệ giữa 1/v và nồng độ chất ức chế [I], như được minh họa trong [Hình 1.18] [24].

Hình 1.18: Đồ thị Dixon xác định hằng số ức chế (K i) của các loại ức chế phổ biến

Phức chất phát huỳnh quang giữa enzyme và ANS (8-anilinonaphthalene-1-

ANS (8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid) là một chất sonda phát quang quan trọng trong nghiên cứu protein và enzyme, giúp xác định vị trí liên kết và đặc điểm cấu trúc Với cấu trúc kỵ nước mạnh nhờ liên kết phẳng 𝜋 − 𝜋 ở vòng thơm naphtalen, ANS có khả năng tương tác với các vùng kỵ nước của enzyme Khi thêm ANS vào dung dịch enzyme, các phần kỵ nước của nó gắn kết với các vùng kỵ nước trên enzyme, tạo thành phức hợp có khả năng phát huỳnh quang khi được kích thích ở bước sóng 375 nm, trong khi bước sóng quét có thể thay đổi trong khoảng từ 400 nm trở đi.

ANS có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, cho phép nó trở thành một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu sự tương tác giữa enzyme và các chất khác, bao gồm cả các chất ức chế.

Hình 1.19: Cấu trúc của 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS)

Khi chất ức chế tương tác với enzyme thông qua liên kết kỵ nước, nó có khả năng cạnh tranh với ANS để tạo phức với enzyme Sự hiện diện của chất ức chế làm giảm cường độ phát huỳnh quang của phức enzyme-ANS, do chất ức chế chiếm chỗ của ANS tại các vị trí liên kết kỵ nước trên enzyme Việc đo lường sự giảm cường độ phát huỳnh quang này cho phép phân tích loại liên kết của chất ức chế với enzyme, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế tương tác và ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme.

ANS được lựa chọn không chỉ vì khả năng phát hiện sự thay đổi trong cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của enzyme, mà còn vì tính dễ sử dụng và khả năng hòa tan tốt trong dung dịch đệm Khi enzyme thay đổi cấu trúc, vùng kỵ nước sẽ lộ ra và tương tác với ANS Đặc biệt, ANS không gây hại hay làm thay đổi cấu trúc của chất thử, cho phép thêm vào dung dịch chứa enzyme một cách đơn giản mà không cần chuẩn bị phức tạp.

Hình 1.20: Phổ kích thích của phức chất enzyme-ANS

THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.1: Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng

STT Tên hóa chất Ký hiệu Hàm lượng Nguồn gốc

(10,35 mg solid; 9,6 units/mg solid;

5 Sodium carbonate anhydrous Na2CO3  99,8% Xilong Scientific,

6 Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate K2HPO4.3H2O 99% Xilong Scientific,

7 Potassium dihydrogen phosphate KH2PO4 99,5% Xilong Scientific,

(E)-1-(3,4- difluorophenyl)-3-(3- fluoro-4- hydroxyphenyl)prop-2- en-1-one (*)

(E)-1-(3,4- difluorophenyl)-3-(4- hydroxyphenyl)prop-2- en-1-one (*)

(E)-1-(3,4- difluorophenyl)-3-(4- hydroxy-3- methoxyphenyl)prop-2- en-1-one (*)

(E)-1-(3,4- difluorophenyl)-3-(4- methoxyphenyl)prop-2- en-1-one (*)

Các dẫn xuất được nghiên cứu và tổng hợp bởi sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Anh và sinh viên Phạm Thị Ngọc Uyên, thuộc khóa K19 của Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị

Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị

STT Dụng cụ Thiết bị

Cân phân tích 4 số PX224/E, OHAUS, Trung Quốc

2 Ống đong 1000 mL Máy đo pH để bàn HI2210-02, HANNA, La

3 Giấy lọc, giấy cân Bể siêu âm

4 Phiễu lọc Máy đo UV-Vis 2 chùm tia UH5300,

5 Đĩa 96 giếng Tủ sấy nhiệt đối lưu UN110, MemMert, Đức

6 Bình định mức 5 mL, 10 mL,

Máy đo quang phổ huỳnh quang FluoroMax-

7 Cuvet thạch anh 3,5 mL Máy đọc vi bản Elisa (JP Selecta, 2100C,

9 Cùng một số dụng cụ khác

Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 3  4  - difluorochalconoid

Phương pháp nghiên cứu để khảo sát khả năng ức chế α-glucosidase của chất thử được thực hiện in-vitro theo quy trình đã công bố trước đó Nghiên cứu dựa trên việc đo lượng p-nitrophenol (pNP), sản phẩm phụ màu vàng sinh ra từ phản ứng giữa α-glucosidase và chất nền cụ thể Lượng pNP sinh ra tỷ lệ thuận với glucose sản xuất từ phản ứng, do đó, độ hấp thu quang của pNP ở bước sóng 400 - 415 nm được sử dụng để xác định lượng glucose sinh ra.

Khi một chất ức chế α-glucosidase được thêm vào mẫu thử, hoạt tính enzyme giảm, dẫn đến giảm lượng pNP và glucose sinh ra, làm màu vàng của dung dịch nhạt dần So sánh lượng glucose giữa mẫu có và không có chất ức chế giúp xác định phần trăm ức chế (% ức chế) và sàng lọc hoạt chất tiềm năng Phần mềm OriginPro được sử dụng để dựng đường cong biểu thị % ức chế theo nồng độ chất ức chế và tính giá trị IC50 Acarbose được sử dụng làm chất đối chứng dương.

Việc thực hiện thí nghiệm trong đĩa 96 giếng giúp xử lý nhiều mẫu thử đồng thời, từ đó nâng cao hiệu quả và giảm thiểu sai số Chất thử được pha loãng bằng DMSO và đệm phosphate để đảm bảo độ chính xác trong quá trình thí nghiệm.

(50 mM, pH = 6,9) để tạo thành dãy nồng độ khác nhau và từ đó đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất thử đến hoạt động của α-glucosidase

Để chuẩn bị dung dịch Pha đệm kali phosphate 50 mM với pH = 6,9, cần cân 5,667 g muối K2HPO4.3H2O và 3,425 g KH2PO4 vào cốc beaker 500 mL Tiếp theo, thêm nước cất và khuấy đều cho đến khi muối tan hoàn toàn Sau đó, đổ dung dịch qua giấy lọc vào bình định mức 1000 mL và thêm nước cất đến vạch 950 mL Cuối cùng, kiểm tra pH bằng máy đo pH và điều chỉnh bằng dung dịch acid HCl nếu cần, rồi thêm nước còn lại để hoàn thành dung dịch.

1 L dung dịch đệm kali phosphate 50 mM, pH = 6,9

Để chuẩn bị dung dịch enzyme α-glucosidase 10 U/mL, cạo lấy 10,4 mg enzyme (9,66 đơn vị/mg) và cho vào bình định mức 10 mL Tráng hũ đựng và muỗng cạo bằng đệm phosphate nhiều lần, sau đó đổ từ từ dung dịch vào bình Đậy nắp và lắc đều, kiểm tra xem dung dịch có tan hoàn toàn hay không; nếu không, tiến hành hòa tan bằng bể đánh sóng siêu âm Sau khi đánh siêu âm và loại bỏ bọt khí, định mức dung dịch đến vạch 10 mL bằng dung dịch đệm phosphate 50 mM, pH = 6,9.

- Pha enzyme α -glucosidase 0,3 U/mL: Hỳt 36 àL dung dịch enzyme α-glucosidase

10 U/mL bằng micropipette 1000 àL vào hủ bi sạch Thờm 1164 àL dung dịch đệm phosphate Đậy nắp và lắc đều, ta thu được 1,2 mL dung dịch enzyme α-glucosidase 0,3 U/mL

Để pha dung dịch pNPG 1,0 mM, đầu tiên cân 0,0030 g 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) và cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm dung dịch đệm phosphate và định mức lên 10 mL, lắc đều cho đến khi pNPG hoàn toàn hòa tan Cuối cùng, đổ dung dịch vào hủ bi sạch để thu được dung dịch pNPG với nồng độ 1,0 mM.

Để pha dung dịch Na2CO3 125 mM, cân 0,1324 g Na2CO3 và cho vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm dung dịch đệm phosphate đến vạch 10 mL, lắc đều cho đến khi Na2CO3 hòa tan hoàn toàn Cuối cùng, đổ dung dịch vào hũ bi sạch để thu được 10 mL dung dịch Na2CO3 125 mM.

Để pha dung dịch acarbose 0,6 mM, cân 3,8 mg acarbose (M = 645,60 g/mol) vào bình định mức 10 mL bằng cân phân tích 4 số Tiếp theo, thêm 2,0 mL dung dịch DMSO (20% DMSO v/v) để hòa tan hoàn toàn acarbose Sau đó, bổ sung 8 mL dung dịch đệm phosphate, đậy nắp và lắc đều Cuối cùng, đổ dung dịch acarbose vào hủ bi sạch để thu được 10 mL dung dịch acarbose với nồng độ 0,6 mM.

Để pha mẫu thử trong dung dịch đệm và DMSO (20% DMSO v/v), đầu tiên cân mg chất thử vào bình định mức 10 mL Tiếp theo, thêm 2 mL dung dịch DMSO (20% DMSO v/v) để hòa tan hoàn toàn chất thử Sau đó, bổ sung 8 mL dung dịch đệm phosphate, đậy nắp và lắc đều Cuối cùng, đổ dung dịch mẫu thử vào hủ bi sạch, thu được 10 mL dung dịch mẫu thử với nồng độ mong muốn, chi tiết cách pha từng mẫu được trình bày trong [Bảng 2.3].

Bảng 2.3: Bảng số liệu cách pha cho từng mẫu

Thể tích dung dịch đệm (mL)

NA08 0,1 mM 0,625 mL NA08 0,8 mM 4,375 mL 5 mL

NU01 1,0 mM 2,5 mL NU01 2,0 mM 2,5 mL 5 mL

NU02 0,9 mM 2,5 mL NU02 1,8 mM 2,5 mL 5 mL

Để tiến hành thí nghiệm, trước tiên khởi động tủ sấy và điều chỉnh nhiệt độ lên 37 ℃, sau đó để tủ sấy ổn định trong khoảng 30 phút Tiếp theo, rửa đĩa 96 giếng bằng nước cất và cồn, rồi để chúng khô tự nhiên.

Enzyme 0,3 U/mL và dung dịch pNPG 1,0 mM sẽ được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh

Trước khi tiến hành thí nghiệm, enzyme cần được ổn định ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút đến 2 tiếng Để kiểm tra hoạt động của enzyme, chúng ta sẽ thực hiện phép thử với pNPG Sau khi hút 160 μL đệm phosphate và 20 μL enzyme 0,3 U/mL vào đĩa 96, chúng ta sẽ để trong tủ sấy 30 phút, sau đó thêm 20 μL pNPG và tiếp tục sấy thêm 30 phút để phản ứng hoàn toàn Khi dung dịch chuyển sang màu vàng, chúng ta sẽ bắt đầu thí nghiệm với các hoạt chất khác nhau Đĩa 96 sẽ chứa các mẫu như mẫu trắng (Mtr), mẫu chứng (MCh), mẫu chứng trắng (MCt) và mẫu thử (MTh), với mỗi nồng độ chất thử được thử nghiệm trong ba giếng riêng biệt và lặp lại ba lần (n = 3×3) để lấy giá trị trung bình Nồng độ được ký hiệu là a, b, c và nồng độ mẫu thử trong giếng dao động từ 5 - 515 μM.

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm trên dĩa 96 giếng

A MTr MTr MTr MCh MCh MCh

B MCta MCta’ MCta’’ MTha MTha’ MTha’’

C MTr MTr MTr MCh MCh MCh

D MCtb MCtb’ MCtb’’ MThb MThb’ MThb’’

E MTr MTr MTr MCh MCh MCh

F MCtc MCtc’ MCtc’’ MThc MThc’ MThc’’

G MTr MTr MTr MCh MCh MCh

H MCtd MCtd’ MCtd’’ MThd MThd’ MThd’’

- Cho vào mỗi giếng của mẫu trắng 180 μL đệm phosphate

- Cho vào mỗi giếng của mẫu chứng 20 μL enzyme (0,3 U/mL); 160 μL đệm phosphate

- Đối với các giếng ở mẫu chứng trắng thì tiến hành hút lần lượt theo thứ tự: Đệm phosphate 50 mM, pH = 6,9; mẫu thử

- Đối với các giếng ở mẫu thử thì tiến hành hút lần lượt theo thứ tự: Đệm phosphate 50 mM, pH = 6,9; α-glucosidase 0,3 U/mL, mẫu thử

Sau khi thực hiện hút mẫu theo trình tự, ủ trong tủ sấy ở 37 ℃ trong 30 phút Tiếp theo, thêm 20 μL pNPG (1,0 mM) và ủ thêm 30 phút để pNPG tác dụng với enzyme còn lại Sau đó, thêm 20 μL Na2CO3 125 mM vào tất cả các giếng mẫu và ủ thêm 5 phút để kết thúc phản ứng Hoạt tính enzyme được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch bằng máy Elisa ở bước sóng quy định.

Phép thử bao gồm bốn thành phần mẫu cơ bản: Độ hấp thu mẫu trắng (Amẫu trắng) được xác định bằng cách kết hợp Đệm, pNPG và Na2CO3; Độ hấp thu mẫu chứng (Amẫu chứng) bao gồm Đệm, Enzyme, pNPG và Na2CO3; Độ hấp thu mẫu chứng trắng (Amẫu chứng trắng) được tính từ Đệm, Chất thử, pNPG và Na2CO3; cuối cùng, Độ hấp thu mẫu thử (Amẫu thử) được xác định bằng Đệm, Enzyme, Chất thử, pNPG và Na2CO3.

Khả năng ức chế α-glucosidase bởi chất ức chế được đánh giá theo phương trình (14) [27]:

% ức chế α-glucosidase = (1 − 𝐴 mẫu thử −𝐴 mẫu chứng trắng

Sau khi tính toán phần trăm ức chế enzyme, chúng ta có thể sàng lọc hoạt chất tiềm năng cao nhất Phần mềm OriginPro sẽ được sử dụng để dựng đường cong biểu thị phần trăm ức chế theo nồng độ chất ức chế, từ đó tính giá trị IC50 để xác định khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Hợp chất có khả năng ức chế tốt nhất sẽ được lựa chọn để khảo sát động học và cơ chế ức chế enzyme α-glucosidase trong các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2 Quá trình dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi NA08 Để xác định cơ chế tương tác và động học dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase thì hợp chất NA08 được chọn làm chất thử Dựa vào các khoảng nồng độ được khảo sát để tìm IC50 của hợp chất, có thể đề xuất các nồng độ để thực hiện các thí nghiệm đo cường độ phát huỳnh quang của enzyme khi không có và có NA08 Sau khi đo, phổ phát huỳnh quang sẽ được vẽ bằng phần mềm OriginPro 9,0

- Dung dịch đệm kali phosphate 50 mM, pH = 6,9 đã pha ở mục 2.2.1

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Hoạt tính của acarbose và các dẫn xuất 3,4-difluorochalconoid đối với α-

Kết quả thí nghiệm in vitro cho thấy các dẫn xuất 3,4-difluorochalconoid có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Enzyme α-glucosidase được xử lý với nồng độ 0,03 U/mL và các dẫn xuất được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau từ 5 đến 515,20 àM trong 30 phút Sau đó, chất nền pNPG được ủ ở 37℃ trong 30 phút để enzyme còn lại phản ứng với pNPG, giải phóng p-nitrophenol, hợp chất màu vàng dễ đo độ hấp thu quang ở bước sóng 405 nm Kết quả chi tiết được trình bày trong [Bảng 3.1].

Bảng 3.1: Phần trăm ức chế của các dẫn xuất 3,4-difluorochalconoid

Phần trăm ức chế α -glucosidase (%) IC 50

Hợp chất NA08 thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase tốt trong điều kiện in vitro, theo Bảng 3.1 Tuy nhiên, các dẫn xuất 3,4-difluorochalconoid còn lại không cho thấy khả năng ức chế enzyme này, cho thấy sự ức chế phụ thuộc vào nhóm thế và vị trí của chúng Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất này có thể không phù hợp để liên kết hiệu quả với khoang gắn kết enzyme, dẫn đến phần trăm ức chế thấp mặc dù nồng độ chất ức chế tăng lên Do đó, bảy chalconoid còn lại chưa được xem là chất ức chế tiềm năng cho enzyme α-glucosidase.

Hình 3.1: Phần trăm ức chế enzyme ở các nồng độ khác nhau của acarbose

Kết quả thí nghiệm cho thấy acarbose ức chế enzyme α-glucosidase hiệu quả trong điều kiện in vitro với giá trị IC50 là 69,53 ± 1,44 àM Giá trị IC50 thấp cho thấy acarbose là một chất ức chế mạnh Phần trăm ức chế tăng khi nồng độ acarbose tăng, phản ánh mối quan hệ định lượng giữa nồng độ và hiệu quả ức chế, chứng minh tính chất phụ thuộc nồng độ của acarbose đối với enzyme này Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng acarbose là một thuốc điển hình giúp giảm cơn đói và kiểm soát lượng đường trong máu.

Hình 3.2: Phần trăm ức chế enzyme ở các nồng độ khác nhau của NA08

Kết quả thí nghiệm cho thấy NA08 có giá trị IC50 là 5,34 ± 0,11 àM, thấp hơn khoảng 20 lần so với acarbose, chứng tỏ NA08 là chất ức chế enzyme α-glucosidase mạnh trong điều kiện in vitro Sự hiện diện của hai nhóm fluoro ở vị trí meta và para cùng với hai nhóm hydroxyl (-OH) ở vị trí ortho và meta có thể nâng cao hoạt tính kháng α-glucosidase của NA08 Phần trăm ức chế tăng theo nồng độ NA08, cho thấy mối quan hệ định lượng giữa nồng độ chất ức chế và hiệu quả ức chế, phản ánh tính chất phụ thuộc nồng độ của NA08 đối với enzyme α-glucosidase Điều này khẳng định tiềm năng của NA08 như một chất ức chế enzyme α-glucosidase, một mục tiêu quan trọng trong điều trị và quản lý bệnh tiểu đường.

Quá trình dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi NA08

Kết quả thí nghiệm in vitro cho thấy NA08 có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase thông qua sự tương tác giữa chúng Để xác nhận, phổ huỳnh quang của α-glucosidase được kiểm tra với và không có NA08, cho thấy hiện tượng phát huỳnh quang chủ yếu từ tryptophan Kích thích tại bước sóng 295 nm cho phép phân biệt rõ ràng sự phát huỳnh quang của tryptophan mà không bị ảnh hưởng từ tyrosine và phenylalanine Hình 3.3 cho thấy cường độ phát huỳnh quang của α-glucosidase đạt cực đại ở 340 nm khi không có NA08, chứng minh sự phát huỳnh quang chỉ đến từ α-glucosidase Khi nồng độ NA08 tăng, cường độ huỳnh quang của α-glucosidase giảm, xác nhận NA08 có khả năng dập tắt mạnh sự phát huỳnh quang của enzyme này.

Để phân biệt cơ chế dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi NA08, nghiên cứu đã xây dựng phương trình Stern-Volmer, với hằng số Stern-Volmer (K SV = 0,22 × 10^5 M^-1) được xác định qua đồ thị F o/F theo [NA08] Giá trị K SV lớn cho thấy sự ức chế α-glucosidase là do tương tác liên kết giữa enzyme và NA08 Từ giá trị K SV, hằng số dập tắt lưỡng phân tử k q được tính toán, với giá trị k q = 0,22 × 10^13 M^-1 s^-1, vượt xa giới hạn tham khảo 1 × 10^10 M^-1 s^-1 Điều này chỉ ra rằng cơ chế dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi NA08 xảy ra theo cả hai cơ chế, trong đó cơ chế tĩnh chiếm ưu thế.

Bằng cách sử dụng các phương trình dập tắt tĩnh tương quan, chúng ta có thể tạo ra đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa log(F o/F-1) và log[NA08].

Đồ thị Stern-Volmer thể hiện quá trình dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase khi tương tác với NA08 ở các nồng độ khác nhau Đặc biệt, biểu đồ logarit kép Stern-Volmer minh họa mối quan hệ giữa log(Fo/F-1) và log[NA08].

Hằng số kết hợp (K a, M -1) và số lượng các vị trí liên kết (n) giữa α-glucosidase và NA08 được xác định thông qua công thức cân bằng phản ứng dập tắt tĩnh Giá trị K a cao cho thấy enzyme và NA08 có mối liên kết mạnh mẽ, đồng nghĩa với việc NA08 có khả năng ức chế hiệu quả hơn Cụ thể, giá trị hằng số K a được tính là 0,21 × 10^5.

M -1 cho thấy tồn tại ái lực lớn giữa NA08 và α-glucosidase Điều này phù hợp với giá trị

IC50 là 5,34 μM Đối với NA08, số vị trí liên kết của chúng với α-glucosidase là 1,016 cho thấy rằng chúng tương tác với enzyme ở tỷ lệ cân bằng hóa học 1:1.

Cơ chế ức chế giữa acarbose và α-glucosidase

Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy mối quan hệ giữa 1/v và 1/[pNPG], xác định loại ức chế và hằng số ức chế Kết quả từ [Hình 3.5] chỉ ra rằng khi nồng độ acarbose tăng, giá trị 1/v = 1/v_max không thay đổi, và các đường giao nhau tại một điểm trên trục tung, chứng tỏ acarbose là chất ức chế cạnh tranh đối với α-glucosidase, phù hợp với các nghiên cứu trước đây Sự gia tăng nồng độ acarbose dẫn đến giảm ái lực giữa chất nền và enzyme, làm tăng K_m Theo đồ thị Lineweaver-Burk, điểm cắt trên trục hoành bằng -1/K_m, với K_m là hằng số Michaelis Từ đồ thị ngoại suy tại nồng độ acarbose 300 àM (đồ thị (C) trong hình 3.5), K_m được xác định là 1,12 × 10^-3 M.

Hằng số ức chế (K i) hay hằng số phân ly cho phức chất [enzyme-chất ức chế] được sử dụng để đánh giá khả năng tương tác giữa enzyme và chất ức chế Giá trị K i thấp cho thấy ái lực liên kết cao giữa chất ức chế và enzyme Để tính giá trị K i, có thể sử dụng đồ thị Dixon (1/v theo nồng độ acarbose ở mỗi nồng độ pNPG) Giá trị K i ngoại suy từ đồ thị là 563,51 × 10 -6 M.

Hình 3.5: (C) Đồ thị Lineweaver-Burk về sự ức chế cạnh tranh của acarbose đối với α-glucosidase; (D) Đồ thị Dixon Vận tốc (v) được biểu thị bằng độ hấp thụ ởλ= 405 nm

Cơ chế ức chế giữa NA08 và α-glucosidase

Để xác định loại ức chế và hằng số ức chế, đồ thị Lineweaver-Burk thể hiện mối quan hệ giữa 1/v và 1/[pNPG] Kết quả từ [Hình 3.6] cho thấy khi nồng độ NA08 tăng, giá trị 1/v = 1/vmax không thay đổi, và các đường biểu diễn trên đồ thị phản ánh sự ổn định này.

NA08 hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh đối với α-glucosidase, với sự giao nhau tại một điểm trên trục tung cho thấy khi nồng độ NA08 tăng, ái lực giữa chất nền và enzyme giảm, dẫn đến việc K m tăng Dựa vào đồ thị Lineweaver-Burk, điểm cắt trên trục hoành được xác định bằng -1/K m Giá trị K m tại nồng độ NA08 40 µM là cao nhất, và từ đồ thị ngoại suy, K m được xác định là 1,03 × 10 -3 M, với -1/K m = -0,975 mM -1.

Giá trị K i của NA08 có thể được xác định thông qua việc vẽ đồ thị Dixon, trong đó trục hoành là 1/v và trục tung là nồng độ NA08 ở từng nồng độ pNPG, như thể hiện trong hình 3.6 [30].

Giá trị K i của hợp chất NA08 được xác định là 129,26 × 10 -6 M, thấp hơn so với acarbose với giá trị K i là 563,51 × 10 -6 M Điều này cho thấy NA08 có khả năng tương tác mạnh hơn với α-glucosidase, dẫn đến hiệu quả ức chế tốt hơn Kết quả này cũng giải thích tại sao giá trị IC50 của NA08 (5,34 àM) lại thấp hơn so với acarbose (69,53 àM).

Hình 3.6: (E) Đồ thị Lineweaver-Burk về sự ức chế cạnh tranh của NA08 đối với α- glucosidase; (F) Đồ thị Dixon Vận tốc (v) được biểu thị bằng độ hấp thụ ởλ= 405 nm

Tương tác liên kết giữa α-glucosidase và NA08

Việc sử dụng 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) làm đầu dò huỳnh quang để nghiên cứu tương tác giữa α-glucosidase và NA08 đã mang lại những kết quả đáng chú ý ANS liên kết với enzyme qua các liên kết không cộng hóa trị tại các khoang kỵ nước trên bề mặt enzyme, cho thấy tính chất tương tác kỵ nước Phân tích phát quang cho thấy phức chất [enzyme-ANS] có đỉnh phát xạ cực đại tại 480 nm khi kích thích ở bước sóng 375 nm, trong khi ANS và α-glucosidase có đỉnh phát xạ riêng biệt tại 520 nm và gần như không phát xạ trong khoảng 400 đến 600 nm Cường độ phát quang của phức [enzyme-ANS] giảm dần khi nồng độ NA08 tăng từ 4,08 μM đến 10,11 μM, cho thấy NA08 ức chế và cạnh tranh với ANS trong việc liên kết với α-glucosidase Điều này chỉ ra rằng NA08 có thể liên kết với các vị trí trên α-glucosidase mà ANS cũng muốn liên kết hoặc gây ra sự thay đổi cấu trúc trong enzyme, làm giảm khả năng liên kết của ANS, đồng thời cho thấy NA08 cũng tương tác kỵ nước với enzyme.

Hình 3.7: Phổ phát huỳnh quang của phức chất [enzyme-ANS] khi không có và có

NA08 Phổ phát huỳnh quang của α-glucosidase và ANS riêng lẻ cũng được biểu diễn chung

Bảng 3.2: Giá trị IC50, K m, K i, cơ chế ức chế của acarbose và NA08 đối với α- glucosidase

Chất ức chế Cơ chế ức chế 𝐈𝐂 𝟓𝟎 (μM) K m (M) K i (M)

Acarbose Cạnh tranh 69,53 ± 1,44 (1,12 ± 0,01) ×10 -3 (563,51 ± 5,32) ×10 -6 NA08 Cạnh tranh 5,34 ± 0,11 (1,03 ± 0,02) ×10 -3 (129,26 ± 1,72) ×10 -6

Bảng 3.3: Các thông số động học ức chế, số vị trí liên kết và cơ chế dập tắt giữa NA08 đối với α-glucosidase Đại lượng Giá trị

Cơ chế dập tắt Dập tắt động và tĩnh

Hợp chất NA08, một dẫn xuất 3,4-difluorochalconoid, đã cho thấy khả năng ức chế α-glucosidase tốt với giá trị IC50 là 5,34 àM qua thử nghiệm in vitro Do đó, NA08 được lựa chọn để nghiên cứu cơ chế ức chế và động học thông qua việc đo độ hấp thu và phổ huỳnh quang của enzyme Kết quả huỳnh quang chỉ ra rằng NA08 tương tác với enzyme, với hằng số dập tắt lưỡng phân tử k q đạt 0,22.

Chất ức chế NA08 đã chứng minh khả năng dập tắt huỳnh quang của enzyme thông qua quá trình dập tắt động và dập tắt tĩnh, trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế Hằng số liên kết K a cao (0,21 × 10 5 M -1) cho thấy ái lực mạnh mẽ giữa enzyme và NA08, điều này được hỗ trợ bởi hằng số ức chế nhỏ K i (129,26 × 10 -6 M) Phân tích đồ thị Lineweaver-Burk và Dixon cho thấy NA08 là chất ức chế cạnh tranh Hơn nữa, sự dập tắt huỳnh quang của phức chất α-glucosidase-ANS khi có NA08 ở các nồng độ khác nhau chỉ ra rằng NA08 tương tác với enzyme qua bề mặt kỵ nước với tỉ lệ 1:1.

Các thử nghiệm cho thấy NA08 là chất ức chế tiềm năng đối với enzyme α-glucosidase

Tôi kiến nghị tiếp tục nghiên cứu in vivo trên chuột để xác định độc tính và hiệu quả kháng bệnh đái tháo đường, nhằm phát triển thuốc điều trị Bên cạnh đó, cần tổng hợp thêm các dẫn xuất mới để khảo sát thêm các hoạt tính khác.

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] H.-U Son et al., "Effects of synergistic inhibition on α-glucosidase by phytoalexins in soybeans," Biomolecules, vol 9, no 12, p 828, 2019, doi: https://doi.org/10.3390/biom9120828

[2] M Okuyama, W Saburi, H Mori, and A Kimura, "α-Glucosidases and α-1,4- glucan lyases: structures, functions, and physiological actions," Cellular and Molecular Life Sciences, vol 73, pp 2727 - 2751, 2016, doi: https://doi.org/10.1007/s00018-016-2247-5

[3] E D Kelly et al., "Glycoside hydrolase family 13 α-glucosidases encoded by

Bifidobacterium breve UCC2003; A comparative analysis of function, structure and phylogeny," International Journal of Food Microbiology, vol 224, pp 55-

65, 2016/05/02/ 2016, doi: https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2016.02.014

[4] S Shrivastava, "Introduction to Glycoside Hydrolases: Classification,

Identification and Occurrence," in Industrial Applications of Glycoside Hydrolases, S Shrivastava Ed Singapore: Springer Singapore, 2020, pp 3-84

[5] U Ghani, "Re-exploring promising α-glucosidase inhibitors for potential development into oral anti-diabetic drugs: Finding needle in the haystack,"

European Journal of Medicinal Chemistry, vol 103, pp 133-162, 2015/10/20/

2015, doi: https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2015.08.043

Insulin secretion is crucial in response to glycemic stimuli, particularly in individuals with mild diabetes mellitus A study by Seltzer et al (1967) highlights the relationship between delayed initial insulin release and carbohydrate intolerance The findings, published in The Journal of Clinical Investigation, emphasize the significance of understanding insulin dynamics to manage diabetes effectively.

[7] M Asif, "A review on recent advances and potential pharmacological activities of versatile chalchone molecule," Chemistry International, vol 2, no 1, pp 1-

[8] M Baseer and G Rahatikar, "IN-VITRO EVALUATION OF ANTIOXIDANT

[9] A Rammohan, J S Reddy, G Sravya, C N Rao, and G V Zyryanov,

"Chalcone synthesis, properties and medicinal applications: a review,"

Environmental Chemistry Letters, vol 18, pp 433-458, 2020, doi: https://doi.org/10.1007/s10311-019-00959-w

[10] P Singh, A Anand, and V Kumar, "Recent developments in biological activities of chalcones: A mini review," European journal of medicinal chemistry, vol 85, pp 758-777, 2014, doi: https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2014.08.033

The plant-derived chalcone, 2,2′,5′-trihydroxychalcone, has been shown to offer neuroprotection by combating inflammation triggered by toll-like receptor 4 in microglial cells This research highlights the potential of natural compounds in mitigating neuroinflammatory responses, contributing to cellular longevity and overall brain health.

[12] Y Murthy, K Suhasini, A Pathania, S Bhushan, and Y N Sastry, "Synthesis, structure activity relationship and mode of action of 3-substitutedphenyl-1-(2, 2,

8, 8-tetramethyl-3, 4, 9, 10-tetrahydro-2H, 8H-pyrano [2, 3-f] chromen-6-yl)- propenones as novel anticancer agents in human leukaemia HL-60 cells,"

European Journal of Medicinal Chemistry, vol 62, pp 545-555, 2013, doi: https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2013.01.027

[13] S A Khan and A M Asiri, "Green synthesis, characterization and biological evaluation of novel chalcones as anti bacterial agents," Arabian Journal of Chemistry, vol 10, pp S2890-S2895, 2017, doi: https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2013.11.018

The study by S Rocha et al investigates drug discovery aimed at managing type 2 diabetes mellitus It focuses on the inhibition of carbohydrate-hydrolyzing enzymes, specifically α-amylase and α-glucosidase, using chalcone derivatives The findings, published in *Food & Function*, highlight the potential of these compounds in controlling blood sugar levels, offering a promising avenue for diabetes treatment.

[15] Z Liu and S Ma, "Recent advances in synthetic α‐glucosidase inhibitors,"

ChemMedChem, vol 12, no 11, pp 819-829, 2017, doi: https://doi.org/10.1002/cmdc.201700216

[16] C W Choi et al., "Yeast α-glucosidase inhibition by isoflavones from plants of

Leguminosae as an in vitro alternative to acarbose," Journal of agricultural and food chemistry, vol 58, no 18, pp 9988-9993, 2010, doi: https://doi.org/10.1021/jf101926j

[17] J R Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy Springer, 2006

[18] N Cardullo et al., "C-glucosidic ellagitannins and galloylated glucoses as potential functional food ingredients with anti-diabetic properties: A study of α- glucosidase and α-amylase inhibition," Food chemistry, vol 313, p 126099,

2020, doi: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.126099

The article by J.-l Liu et al (2020) discusses the structural specificity of flavonoids in inhibiting α-glucosidase activity through spectroscopy and molecular docking analysis The research, published in the *International Journal of Biological Macromolecules*, highlights the potential of flavonoids as effective inhibitors, providing insights into their mechanisms of action This study contributes to the understanding of flavonoids' role in managing carbohydrate metabolism and their implications in dietary interventions for diabetes management.

[20] H F Gilbert, Basic concepts in biochemistry 2000

[21] A Das et al., "Chapter-1 Enzyme Inhibition," PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol 87, no 1, p 124, 2020, doi: https://doi.org/10.22271/ed.book.795

[22] H Lineweaver and D Burk, "The determination of enzyme dissociation constants," Journal of the American chemical society, vol 56, no 3, pp 658-666,

[23] J.-M G Rodriguez, N P Hux, S J Philips, and M H Towns, "Michaelis–

Menten graphs, Lineweaver–Burk plots, and reaction schemes: Investigating

48 introductory biochemistry students’ conceptions of representations in enzyme kinetics," Journal of Chemical Education, vol 96, no 9, pp 1833-1845, 2019, doi: https://doi.org/10.1021/acs.jchemed.9b00396

[24] A Cornish-Bowden, "A simple graphical method for determining the inhibition constants of mixed, uncompetitive and non-competitive inhibitors," Biochemical

[25] M Deshpande and S K Sathe, "Interactions with 8‐Anilinonaphthalene‐1‐ sulfonic Acid (ANS) and Surface Hydrophobicity of Black Gram (Vigna mungo) Phaseolin," Journal of food science, vol 83, no 7, pp 1847-1855, 2018, doi: https://doi.org/10.1111/1750-3841.14204

[26] E Tsujii, M Muroi, N Shiragami, and A Takatsuki, "Nectrisine is a potent inhibitor of α-glucosidases, demonstrating activities similarly at enzyme and cellular levels," Biochemical and biophysical research communications, vol

220, no 2, pp 459-466, 1996, doi: https://doi.org/10.1006/bbrc.1996.0427

[27] N T M D v N T Duy, "Đề tài: " Động học dập tắt huỳnh quang của α- glucosidase bằng genistein"," p 21, 2022

[28] L Jiang, Z Wang, X Wang, S Wang, J Cao, and Y Liu, "Exploring the inhibitory mechanism of piceatannol on α-glucosidase relevant to diabetes mellitus," RSC advances, vol 10, no 8, pp 4529-4537, 2020, doi: https://doi.org/10.1039/C9RA09028B

[29] Y Li, F Gao, F Gao, F Shan, J Bian, and C Zhao, "Study on the interaction between 3 flavonoid compounds and α‐amylase by fluorescence spectroscopy and enzymatic kinetics," Journal of Food Science, vol 74, no 3, pp C199-C203,

[30] Y Zheng, R Zhang, F Huang, L.-H Cheng, L Xu, and X Jia, "α-Glucosidase inhibitors derived from black soybean and their inhibitory mechanisms," LWT, vol 189, p 115502, 2023, doi: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2023.115502

[31] M Fu et al., "Essential moieties of myricetins, quercetins and catechins for binding and inhibitory activity against α-Glucosidase," Bioorganic Chemistry, vol 115, p 105235, 2021, doi: https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105235

The study conducted by Li et al (2009) evaluates the inhibitory effects of three compounds—quercetin, isoquercetin, and rutin—on the enzyme α-glucosidase Published in the Journal of Agricultural and Food Chemistry, the research aims to compare the effectiveness of these flavonoids as potential inhibitors, highlighting their significance in managing carbohydrate metabolism The findings suggest that these natural compounds may play a role in diabetes management by regulating blood sugar levels.

[33] O K Gasymov and B J Glasgow, "ANS fluorescence: potential to augment the identification of the external binding sites of proteins," Biochimica et Biophysica

Acta (BBA)-proteins and proteomics, vol 1774, no 3, pp 403-411, 2007, doi: https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2007.01.002

Ký hiệu MCta MCtb MCtc MCtd

Nồng độ acarbose trong giếng (àM) 6 24 96 384

Thể tớch acarbose 0,6 mM (àL) 2 8 32 128

Thể tớch đệm phosphate 50 mM (àL) 178 172 148 52

Thể tớch pNPG 1,0 mM (àL) 20 20 20 20

Phụ lục 1: Pha mẫu chứng trắng từ mẫu acarbose 0,6 mM

Ký hiệu MTha MThb MThc MThd

Nồng độ acarbose trong giếng (àM) 6 24 96 384

Thể tớch acarbose 0,6 mM (àL) 2 8 32 128

Thể tích α-glucosidase 0,3 U/mL (μL) 20 20 20 20 Thể tớch đệm phosphate 50 mM (àL) 158 152 128 32

Phụ lục 2: Pha mẫu thử từ mẫu acarbose 0,6 mM

Nồng độ NA08 trong giếng (àM) 5 10 15 20

Thể tớch NA08 0,1 mM (àL) 10 20 30 40

Phụ lục 3: Pha mẫu chứng trắng từ mẫu NA08 0,1 mM

Ký hiệu MTha MThb MThc MThd

Nồng độ NA08 trong giếng (àM) 5 10 15 20

Thể tớch NA08 0,1 mM (àL) 10 20 30 40

Phụ lục 4: Pha mẫu thử từ mẫu NA08 0,1 mM

Ký hiệu MCta MCtb MCtc

Nồng độ NA07 trong giếng (àM) 100 300 500

Thể tớch NA07 0,8 mM (àL) 25 75 125

Thể tớch đệm phosphate 50 mM (àL) 155 105 55

Thể tớch pNPG 1,0 mM (àL) 20 20 20

Phụ lục 5: Pha mẫu chứng trắng từ mẫu NA07 0,8 mM

Ký hiệu MTha MThb MThc

Nồng độ NA07 trong giếng (àM) 100 300 500

Thể tớch NA07 0,8 mM (àL) 25 75 125

Phụ lục 6: Pha mẫu thử từ mẫu NA07 0,8 mM

Nồng độ NS07 trong giếng (àM) 100 200 300 500

Thể tớch NS07 0,8 mM (àL) 25 50 75 125

Phụ lục 7: Pha mẫu chứng trắng từ mẫu NS07 0,8 mM

Ký hiệu Mtha Mthb Mthc Mthd

Thể tớch NS07 0,8 mM (àL) 25 50 75 125

Phụ lục 8: Pha mẫu thử từ mẫu NS07 0,8 mM

Thể tớch NS08 0,8 mM (àL) 25 75 100 125

Phụ lục 9: Pha mẫu chứng trắng từ mẫu NS08 0,8 mM

Thể tớch NS08 0,8 mM (àL) 25 75 100 125

Phụ lục 10: Pha mẫu thử từ mẫu NS08 0,8 mM

Ký hiệu MCta MCtb MCtc

Nồng độ NU01 trong giếng (àM) 240 400 560

Thể tớch NU01 1,0 mM (àL) 48 80 112

Phụ lục 11: Pha mẫu chứng trắng từ mẫu NU01 1,0 mM

Ký hiệu Mtha Mthb Mthc

Nồng độ NU01 trong giếng (àM) 240 400 560

Thể tớch NU01 1,0 mM (àL) 48 80 112

Phụ lục 12: Pha mẫu thử từ mẫu NU01 1,0 mM

Nồng độ NU02 trong giếng (àM) 72 216 360 504

Thể tớch NU02 0,9 mM (àL) 16 48 80 112

Nồng độ NU03 trong giếng (àM) 73,6 220,8 368 515,2

Thể tớch NU03 0,92 mM (àL) 16 48 80 112

Nồng độ NU03 trong giếng (àM) 73,6 220,8 368 515,2

Thể tớch NU03 0,92 mM (àL) 16 48 80 112

Thể tớch NU04 0,8 mM (àL) 25 50 75 125

Nồng độ pNPG trong giếng (mM) 0,05 0,1 0,15 0,2

Thể tích hút enzyme 0,3 U/mL 20 20 20 20

Thể tớch chất ức chế (àL) 0 0 0 0

Phụ lục 19: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ acarbose 0 μM và NA08 0 μM

Thể tích hút enzyme 0,3 U/mL 20 20 20 20

Phụ lục 20: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ acarbose 50 mM và NA08 10 μM

Thể tích hút Enzyme 0,3 U/mL 20 20 20 20

Phụ lục 21: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ NA08 20 μM

Phụ lục 22: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ acarbose 200 mM và NA08 40 μM

Phụ lục 23: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ acarbose 300 μM

Phần trăm ức chế enzyme (%) của acarbose

Phụ lục 24: Trung bình phần trăm ức chế enzyme ba lần đo của acarbose

Phần trăm ức chế enzyme (%) của NA07

Phụ lục 25: Trung bình phần trăm ức chế enzyme ba lần đo của NA07

Phần trăm ức chế enzyme (%) của NA08

Phụ lục 26: Trung bình phần trăm ức chế enzyme ba lần đo của NA08

Phần trăm ức chế enzyme (%) của NS07

Phụ lục 27: Trung bình phần trăm ức chế enzyme ba lần đo của NS07

Phần trăm ức chế enzyme (%) của NS08

Phụ lục 28: Trung bình phần trăm ức chế enzyme ba lần đo của NS08

Phần trăm ức chế enzyme (%) của NU01

Phụ lục 29: Trung bình phần trăm ức chế enzyme ba lần đo của NU01

Phụ lục 33: Bảng số liệu biểu hiện cho [Hình 3.4]: (A) Đồ thị Stern-Volmer về quá trình dập tắt huỳnh quang của α -glucosidase bằng NA08 ở các nồng độ khác nhau

1/OD SD 1/OD SD 1/OD SD 1/OD SD

Phụ lục 34: Bảng số liệu biểu hiện cho [Hình 3.5]: (C) Đồ thị Lineweaver-Burk về sự ức chế cạnh tranh của acarbose đối với α -glucosidase

1/OD SD 1/OD SD 1/OD SD 1/OD SD

Phụ lục 35: Bảng số liệu biểu hiện cho [Hình 3.6]: (E) Đồ thị Lineweaver-Burk về sự ức chế cạnh tranh của NA08 đối với α -glucosidase

Phụ lục 36: Đồ thị biểu diễn phổ hấp thu UV-Vis của NA08 0,1 mM

Tiêu đề	Sàng Lọc Hoạt Tính Ức Chế α-Glucosidase Của Các Dẫn Xuất 3',4'-Difluorochalconoid, Nghiên Cứu Cơ Chế Và Động Học Ức Chế Của Hợp Chất Có Hoạt Tính Tiềm Năng Nhất
Tác giả	Nguyễn Phan Tường Nhi
Người hướng dẫn	PGS.TS. Hoàng Minh Hảo
Trường học	Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học
Thể loại	Đồ án tốt nghiệp
Năm xuất bản	2024
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	8,44 MB