Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát sự nhân nhanh chồi và tạo rễ của cây vạn lộc (Aglaonema rotundum Pink)

Nghiên cứu này được tiến hành được tiến hành nhằm khảo sát nồng độ khử trùngdung dịch javel tối ưu cho mẫu đốt thân sống sạch, khảo sát ảnh hưởng nồng độ thích hợp của các chất điều hoà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ NHÂN NHANH CHOI VA TAO RE CUA CÂY VAN LỘC (Aglaonema rotundum Pink)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : TRƯỢNG THI MỸ TRIEU

Mã số sinh viên : 19126281

Niên khóa : 2019 - 2023

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

KHAO SAT SỰ NHÂN NHANH CHOI VÀ TẠO RE CỦA CÂY VAN LOC (Aglaonema rotundum Pink)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TÔ THỊ NHÃ TRÀM TRƯỢNG THỊ MỸ TRIỆU

KS HUỲNH TAN PHÁT

Thành phố Thủ Đức, 03/2024

LOI CAM ON

Em xin gửi cảm on Ban Giám Hiệu trường Dai hoc Nông Lâm thành phố Hồ Chí

Minh, cảm ơn thầy Đinh Xuân Phát Trưởng Khoa Khoa học Sinh học, thầy Phan Hữu

Tín có van học tập lớp DH19SHD cùng tat cả quý thầy cô đã tan tình day bảo, giúp đỡ,truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian học tại trường

Em xin tran trong gửi lời cảm ơn đến cô Tô Thị Nhã Trầm đã luôn nhắc nhở, địnhhướng, tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức vô cùng quý báu và tạo mọi điều

kiện tốt nhất có thé dé em hoàn thành dé tài tốt nghiệp

Cảm ơn chân thành đến anh Huỳnh Tan Phát, các anh chị và các bạn làm việc tại

Chi nhánh Công ty Cổ phan Công nghệ Sinh học TPECO đã hỗ trợ và giúp đỡ, động

viên, chia sẻ những kinh nghiệm, khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Con xm gửi lời cảm ơn chân thành đến ba mẹ luôn ủng hộ và động viên và tạomọi điều kiện thuận lợi cho con được học tập

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên là Truong Thị Mỹ Triệu, MSSV: 19126281, lớp: DH19SHD thuộc ngành Công

nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thành Phó Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây

là khoá luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi hoan toàn chịu trách nhiệm trước

hội đồng về những cam kết này

Thành pho Thủ Đức, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người viet cam đoan

Trượng Thị Mỹ Triệu

TÓM TẮT

Cây vạn lộc (4glaonema rotundum Pink) thuộc họ Araceae, là loài cây cảnh thânthảo, có tác dụng thanh lọc không khí và hấp thụ các chất hữu cơ gây bệnh cho conngười Nghiên cứu này được tiến hành được tiến hành nhằm khảo sát nồng độ khử trùngdung dịch javel tối ưu cho mẫu đốt thân sống sạch, khảo sát ảnh hưởng nồng độ thích

hợp của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật cho quá trình phát triển chồi từ mẫu đốt

thân, nhân nhanh chdi và tạo rễ của cây vạn lộc bằng phương pháp nuôi cấy mô Các

mau đót thân cây vạn lộc được lắc trong 20 phút với các nồng độ dung dịch javel khác

nhau và được nuôi cấy trong môi trường MS Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy, nồng độ dungđịch Javel 20% là tối ưu với tỉ lệ sống sạch đạt 80,95% Mẫu đốt thân sống sạch được

nuôi cấy trong môi trường MS bồ sung chất điều hoà sinh trưởng kinetin ở các nồng độ

khác nhau Sau 4 tuần nuôi cấy, môi trường MS có bồ sung 0,6 mg/l kinetin cho sự phát

triển chéi tốt nhất với tỉ lệ tạo chồi đạt được là 76,19% và chiều cao chéi trung bình là2,52 cm Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy, môi trường MS có bồ sung 0,2 mg/l kinetin kếthợp với 2,0 mg/l BA cho sự nhân nhanh chồi cao nhất với số chéi trung bình là 9,86chỗi và 8,14 lá Sau 6 tuần, môi trường MS có bồ sung 0,4 mg/l NAA thích hợp cho sựtạo rễ của cây vạn lộc với số rễ trung bình đạt được là 13,71 rễ, số lá trung bình là 4,48

lá và chiêu cao cây là 4,51 cm.

Aglaonema rotundum Pink belongs to the Araceae family and is an ornamental herbaceous plant, it has the effect of purifying the air and absorbing organic substances that cause disease in humans This study was conducted to investigate the optimal

concentration of javel for node explant, to investigate the effects of Appropriate

concentrations of plant growth regulators for shoot development from stem node explants, rapid shoot multiplication, and root formation of Aglaonema rotundum pink

by tissue culture method Node explant is shaken in twenty minutes with javel at

different concentrations After two weeks of cultured, the concentration of javel 20% is optimal with a survival rate of 80.95% The stem segment explants are cultured on MS medium supplemented with kinetin at different concentrations After 4 weeks of culture,

MS medium supplemented with 0.6 mg/l kinetin gave the best shoot growth with a shoot formation rate of 76.19% and an average shoot height of 2.52 cm After 6 weeks of culture, MS medium supplemented with 0.2 mg/l kinetin combined with 2.0 mg/l BA gave the highest shoot multiplication with an average number of 9.86 shoots and 8.14 leaves After 6 weeks, MS medium supplemented with 0.4 mg/l NAA was suitable for root formation of Aglaonema rotundum pink with the number of identical roots reaching 13.71 roots, an average number of 4.48 leaves and an average height of 4.51 cm.

Keywords: Aglaonema rotundum, javel, kinetin, BA, NAA.

MỤC LỤC

Trang

CO, ằ———=ằ———ằ- iXÁC NHAN VA CAM DOAN sscssessessessessessessessecsessessessessessessessessesiessessessessessesaeeseess ii

¡90v —— Ô Ô Ô,Ô iiiFBS TRACT eeseez ergo ivectrsyeersieenewarernerenseesecerates veered 1V

DANH MỤC TU VIET TẮTT - 2 2 2SE+SE2E£EE£EE2EEE9E121212212112121211211112 21220 viiDANH SACH CÁC BANG sunssrssenensadeiindioirenDg601210101000300000353001010900000016 viiiDANH SÁCH CÁC HÌNH -22-222+2222+2E2E+22EEE222212221122E 2E ix

0208019600895 |

1.1 Đặt vấn đề - + 2s 21221 2122121121121121111211111122112121212121211 21a 11.2 Mục tiêu đề tai see cecccceccccccccsccsecscsessesecsesscescsessesessecsessescsessssessesetsseeseceeeesesaeseeeeeess 215:.Nðt,GiTØ THÍG THỊ HácsenssanstiosetiesgBIEEHONI93DM0đ6giVqđ03303G5HESH08GESREJSEQG8BGG03809003H08g0Y-Si9088 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIBU -22- 2222222ES222++2EE2EE22EE2Ezzzzzzrez 3

2.1 Giới thiệu về cây vạn lỘC 2- 2 2+SS+SE22E+EE£EE2EE2EE921271571212171712171 21212 cce 32.1.1 Nguồn gốc của cây vạn lộc -2- 2 s+S2+SSSEE9EE92122127127111212111111111 212cc 3

Dill eo PNA /| đÏLxsossgztetrtSENGEOEETE-GIGLSSLSEEEERGUEGDEHDNGPHIRGEGGUDNGIEEDEORSIEGLEIGGIIRNHEGESRSOURURSSm 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây vạn lộc -2- ¿2 2+22+E£2E2E2E£2E2EE2E2E22x2Eczkerres 32.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật -2- 2 2 ©2222++2+22z+£x+zzzzzzeex 5

DT Ebrfr fuuanlii cỉ AN cee ssc cscs acess 5

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cay mô tế bào thực vật -. - 2 s+2sszxcrxerxerrerrered 5

2.2.3 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống - 2-22 ©2222+22222z+2xz2zzcrxez 57.3, Cie ghỉ kiÄỆn hôn ginHh:HUNBicseeeseoeieskordodggthoeptgoiBoôNediti0-08010/4E00:300 21010000 gi 72.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thé giới liên quan -2-2z 9

P SN i0 0000020211 951/7, Nghiên øữu trên THỂ BÌỜ ee 11CHUONG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP -©22+2222+cstvxeerrre 133.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu -2 2222+2++2E2EE+EE2EEzEEtErerxrrrrrrrees 13

SD Vat LIễU MENTS (GỮU ác sbos6eszneiteeclessbesEostleasdobtteisgoeslicsiBusllisslgisgtssuEaoereziifposEkeeseioe 13

3.2.1 Đối tượng va cách thực hiỆn eee cee 22 2-2 2213252221323 123 125115311211 21 11811211 11 xe re, 13

3.2.2 Trang thiết bị và đụng cụ -s- 2-55 S22x22E22121212112121212111111121 11 xe 13

EU o0 0‹ 0000.) n4 14

3.3 Phương pháp:nghiẾn:GỨNH:¿:ssxccssácssxci6612660300461354661051356353954950E3595966385666GS486.301033813388g5% 153.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch javel trong quy trình xử lí mẫusirshan enone eae eer eran eee ee ee ee 153.3.2 Khảo sát nồng độ kinetin đến quá trình phát triển chồi từ đốt thân 163.3.3 Khao sát nồng độ BA cho kha năng nhân nhanh cum chồi - 173.3.4 Khảo sát nồng độ NAA cho khả năng tạo rễ của cây vạn lộc - 173.4 Phương pháp xử lí số liệu - - 2-2 22+22+2E+2EE+EES2EE2EESEEEEEEEEEEErrrrrrrrrrrree 18

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 52 522E22E22E22ECEE2E2E2Ezxerree 19

4.1 Nồng độ khử trùng javel xử lí mẫu đốt thân cây vạn lộc -2-5- 194.2 Sự phát triển chồi từ mẫu đốt thân - 2 2+222+EEZ+EE2EEZ+EE22EE227222222222.e 35

eR THẢ trăng: thâm ñhtguấh GHỦI eecsecchieCkLcahgt,o.2Egg ưggaEuGUEnESCrGUEiCv.0g0730 3001000000460 25

4.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến kha năng tạo rễ . -c -30

CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 2+s2+s+EzEerserrerserrerrserreeeee.e 3Ô

"` ——===————————————.e e == 35

ee.TÀI LIEU THAM KHAO 0.o occcccccsecessesssessessvessessesssessessvetsesenessessessiesstetsessesssesesssesess 36PHU LUC

vi

DANH MỤC TỪ VIET TAT

IAA indole-3-acetic acid

IBA acid indole - 3-butyric

KT Kinetin

mg/l milligram/liter

MS Murashige va Skoog (1962)

NAA a-Naphthaleneacetic acid

NaClO sodium hypochloride

DANH SÁCH CÁC BANG

TrangBảng 3.1 Thành phan hóa chất môi trường MS 2-22- 2¿222++22+22z+zcszz 14Bảng 3.2 Nong độ dung dịch javel (%) đến quá trình khử trùng mẫu 15Bang 3.3 Nong độ kinetin (mg/l) đến quá trình phát triển chồi từ đốt thân l6Bảng 3.4 Nong độ BA (mg/l) cho khả năng nhân nhanh chồi -. - 17Bang 3.5 Nồng độ NAA (mg/l) cho khả năng tạo rễ -2-©2: 552552 2222222222225+2 18Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ khử trùng sau 2 tuần nuôi cấy - 19Bang 4.2 Tình trạng mẫu sau 2 tuần nuôi cấy 2: 22©222222+22z+2E+z2xzzzrzzrcree 21Bang 4.3 Sự phat triển chồi sau 4 tuần nuôi CY cece ccceec ese eessesseesesseeetesseeseesseees 22,

Bang 4.4 Tình trạng mẫu phát triển chồi sau 4 tuần nuôi cấy -. - 24

Bang 4.5 Số chồi hình thành sau 4 tuần nuôi cấy 2-©22©22222222222z222z22zzz 25Bang 4.6 Tình trang mẫu nhân nhanh chồi sau 4 tuần nuôi CAY - 2 - 26Bang 4.7 Kha năng nhân nhanh chồi sau 6 tuần nuôi cấy -2- 5z: 27Bảng 4.8 Tình trạng mẫu nhân nhanh chồi sau 6 tuần nuôi cấy . - 29Bang 4.9 Khả năng tạo rễ sau 4 tuần nuôi cấy -2225255s5csczsczcsszsc-sc - 30Bang 4.10 Tình trạng mẫu tạo rễ sau 4 tuần nuôi cấy -2 2c-55c-cs-c. 32Bảng 4.11 Khả năng tạo rễ sau 6 tuần nuôi cấy -2-2255s5cscsscscscsersc . 3

viii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, đời sống con người ngày một phát triển nên nhu cầu vui chơi giải tríngày một gia tăng và phong phú, đặc biệt là cây cảnh lá Bộ lá của các cây cảnh lá rất

dep, nhiều màu sắc khác nhau, tuôi tho dai, trồng được quanh năm Những loại cây cảnh

này rất phù hợp cho việc trang trí trong nhà và văn phòng làm việc

Một số cây cảnh trên thé giới đã có giá trị lịch sử, được sử dung làm vật phongthuỷ về sự an lành và vẻ đẹp cảnh quan Như ở Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ Latinh

sử dụng cây cảnh dé trang trí truyền thống vào ngày lễ quốc khánh, ngày lễ kỷ niệm, délàm tăng tính trang trí, sự phố biến của thực vật Hiện nay, tốc độ mở rộng nhanh nhấtcây cảnh là loại cây trồng dé trong nhà và cây trồng trong vườn (Mariani va ctv, 2011).Agleonema có đầy đủ tat cả những yêu tổ quan trọng đó và là giống cây có hình dang

đẹp, đầy màu sắc, chịu hạn và độ ầm tương đối thấp (Yeh va ctv, 2007) San xuat

Aglaonema thương mai hau như chỉ bắt đầu từ việc giâm cành Tuy nhiên, nhân giống

bằng phương pháp cắt cảnh có thé truyền mầm bệnh từ cây gốc sang cây giâm Nuôi cay

mô thích hợp hon dé nhân nhanh cây khoẻ mạnh Phần lớn nuôi cấy mô không thànhcông với Aglaonema là do nhiễm vi sinh vật nội sinh (Chen va ctv, 2003).

Trong thời gian gần đây, vạn lộc là loại cây rất được ưa chuộng bởi lá của nó rất

bat mắt, lá hình trứng rộng, màu đỏ hồng với các đốm xanh trên mặt lá và phần viền cómàu xanh Lá non của cây vạn lộc có màu hồng nhạt và cảng già yếu càng chuyển sang

màu đỏ hồng Cuống lá xanh, đây là đặc điểm riêng biệt phân biệt cây vạn lộc với những

cây gần giống nó Chúng thuộc thân cỏ, mọc thành khóm, cao khoảng 20 - 30 cm trồngđược trong chậu đất hoặc thủy canh trong bình thủy tinh, cây phù hợp trang trí dé bànhoặc trong phòng khách, phòng làm việc trông rất đẹp

Cây vạn lộc ngoài ý nghĩa phong thủy còn có tác dụng thanh lọc không khí, hấpthụ những chất hữu cơ gây bệnh cho con người Vẻ đẹp quyến rũ, mang nhiều ý nghĩa

và lợi ích cho đời sông của chúng ta, nên cây vạn lộc đang là mặt hàng thu hút trên thị

trường cây cảnh.

Vì vậy, dé tài: khảo sát sự nhân nhanh chdi và tạo rễ của cây vạn lộc được nghiên

cứu dé tạo ra nguồn mẫu có tỉ lệ sống cao với hệ số nhân chổi nhiều góp phần hoàn thiện

quá trình nhân giống tao cây vạn lộc hoàn chỉnh in vitro

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định được nồng độ dung dịch javel thích hợp dé xử lí mẫu đốt thân cây vanlộc, tạo được nguồn mẫu sống sạch dé làm vật liệu tiến hành thí nghiệm khảo sát chấtđiều hòa sinh trưởng, từ đó tìm ra nồng độ kinetin cho sự phát sinh chồi từ đốt thân,nồng độ BA tối ưu cho khả năng nhân nhanh chéi và nồng độ NAA tối ưu cho kha năng

tạo rễ của cây vạn lộc

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dich javel trong quy trình xử

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây vạn lộc

2.1.1 Nguồn gốc của cây vạn lộc

Nguồn gốc và lịch sử cụ thể của vạn lộc có thể không được ghi chép cụ thé nhưmột số loại cây được trồng rộng rãi khác Ag/aonema (Araceae) chứa nhiều giống câytrồng có tán lá nhiệt đới quan trọng trong thực vật do khả năng chịu hạn hán và ánh sángyếu và độ 4m tương đối thấp (Chen va ctv, 2002) Chi Aglaonema, mà Aglaonemarotundum pink thuộc về, có nguồn gốc từ các khu rừng mưa nhiệt đới ở Đông Nam A,bao gồm các quốc gia như Malaysia, Indonesia và Thái Lan Những loài thực vật nàythường được tìm thay ở tầng dưới của rừng nhiệt đới Aglaonema rotundum pink có thé

là giống được trồng hoặc giống lai được phát triển dé có tán lá màu hồng đặc biệt Quátrình canh tác các giống cụ thé bao gồm nhân giống và nhân giống chọn lọc dé tạo ra vanhân mạnh những đặc điểm mong muốn Việc trồng trot và lai tạo các loài Aglaonema,bao gồm cả việc phát triển các giống như bài viết đang nghiên cứu (Aglaonemarotundum pink), thường được thực hiện bởi những người làm vườn, vườn ươm và những người đam mê cây trông.

2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây vạn lộc

Cây vạn lộc thuộc loài cây thảo mộc lâu năm có thân thắng đứng và thân cây rụng,

có thể mọc đọc theo mặt đất Đây là một trong những loài cây chứa đựng sắc tố và hình

dạng hoa văn lá đẹp nhất trên thế giới, sự kết hợp màu sắc hài hòa và tươi sáng, chẳnghạn như màu xanh lá cây và màu cam, xanh lá cây và đỏ, xanh lá cây và vàng, xanh lácây và trắng, xanh lá cây và hồng Hau hết các loại cây vạn lộc có rễ màu xanh, thân day

1 - 5 cm, có thể vươn cao tới 50 cm, kiểu phát hoa Spadix (Mariani va ctv, 2011), hoachủ yếu có màu trang va thường nở vào tháng 3 đến tháng 7 Van lộc cũng chứa một sốchất độc hại gọi là canxi tỉnh thể oxalate để bảo vệ thân khỏi kẻ thù, điều này chính làtác nhân gây ra một số kích ứng trên da

Đặc điểm nỗi bật là có màu hồng trên lá Các sắc thái của màu hồng có thé khác

nhau và thường được pha trộn với các màu khác như màu xanh lá cây Hình trứng rộng,

có kích thước vừa phải Loại cây này có thói quen sinh trưởng rậm rạp, tạo ra nhiều thânhoặc chồi từ gốc Vạn lộc thích ánh sáng gián tiếp hoặc ánh sáng lọc, chịu được điềukiện ánh sáng yếu nên phù hợp với môi trường trong nhà Là loài cây ưa âm, phát triển

mạnh ở nhiệt độ từ 18 - 27 °C và có xu hướng ưa độ âm cao Các loài vạn lộc được coi

Hình 2.2 Lá cây vạn lộc Hình 2.3 Hoa cây vạn lộc

2.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô tế bảo thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loạinuôi cay nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡngnhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Ngô Xuân Bình, 2009)

Nuôi cay mô, tê bảo thực vật còn gọi là nuôi cây thực vật in vitro (trong ôngnghiệm) dé phân biệt với các quá trình nuôi cấy cây trong điều kiện tự nhiên ngoài ốngnghiệm (Ngô Xuân Bình, 2009).

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy tế bào thựcvật dé chứng minh tính toàn thé của chúng Theo ông, mỗi tế bào từ một co thé da bao

đều chứa đủ thông tin di truyền dé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh Do đó, mỗi

tế bảo riêng lẻ của một cơ thé da bào đều mang trong mình toàn bộ lượng thông tin ditruyền cần thiết của sinh vật đó Điều nay có ý nghĩa là néu được đặt trong điều kiệnthích hợp, mỗi tế bao có khả năng phát triển thành một cơ thé sinh vật đây đủ Hơn

50 năm sau, các nghiên cứu nuôi cây mô và tế bào thực vật đã đạt được những thànhtựu đang kể, chứng minh rằng tế bào có khả năng tồn tại và phát triển độc lập Côngtrình nổi bật bao gồm việc tạo rễ từ mảnh mô cây thuốc lá (Miller và Skoog, 1953),tạo phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy, tách tế bảo trần và tái sinhcây hoàn chỉnh từ tế bào trần lá cây thuốc lá (Takebe, 1971) Kỹ thuật tạo dòng(cloning) tế bào don lập trong điều kiện in vitro đã làm rõ rằng các tế bao soma, khi

đặt trong điều kiện thích hợp, có khả năng phân hoá và phát triển thành một cơ thể

thực vật đầy đủ

2.2.3 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống

Vi nhân giống là kỹ thuật nuôi cay mô ứng dụng nhân giống cây trồng trong điềukiện vô trùng Kỹ thuật này được thực hiện dé sản xuất số lượng lớn cay ghép đồng đều

và không có mầm bệnh trong thời gian ngắn và không gian nhỏ (Chen và ctv, 2013)

Theo Nguyễn Đức Lượng va ctv (2002), quá trình nhân giống in vitro được chiathành các giai đoạn sau

Giai đoạn 1 là chuẩn bị cây mẹ Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng câycần nhân giống Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kínhhoặc trong phòng tăng trưởng Cây mẹ phải được bón phân và phun thuốc trừ sâu bệnhchu đáo.

Giai đoạn 2 là khử trùng mẫu cấy Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có

thé sử dụng dé nuôi cây nhưng mức độ thành công phụ thuộc vào hệ thống môi trường

sử dụng, loài thực vật được nuôi cấy và sự khử trùng mẫu cấy thành công Mục tiêu củagiai đoạn này là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả năng tăngtrưởng Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu, tiếp theo là khử trùng mẫu cấy

Giai đoạn 3 là giai đoạn tang sinh mô

Tạo phôi soma: việc tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòngthực vật một cách nhanh chóng Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể được cảmứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành một cây nguyên vẹn Các phôi soma lànhững tổ chức đơn giản được tạo ra từ tế bào soma nhưng sự phát sinh hình thái lại

tương tự như phôi hữu tính Việc sinh phôi từ tế bào soma hiện nay đã được thực hiện

thành công ở một số loài trong đó có cà rốt, Pentunia và một số loài khác Phôi somathường được sinh ra từ mô sẹo hơn là từ huyền phù tế bào

Tăng cường sự phát triển chồi bên: chồi bên và chéi ngọn có thể được cảm ứngphát triển in vitro bằng cách làm tăng sự phát triển của những chỗi dạng hiện hữu Mộtmẫu cấy có mang một chéi đơn sẽ phát triển thành một chỗi hay thành một cụm chồi tùythuộc vào loài thực vật và môi trường cấy Chỗi bên sẽ được hình thành trên chồi ban

đầu, qua nhưng lần cấy chuyên quá trình này sẽ được lặp lại một cách chính xác Sự

hình thành mô sẹo có thể xảy ra cùng với sự phát triển chdi, và những chồi bất định cónguồn gốc từ vùng phân sinh ở trong mô sẹo sẽ phát triển thành cây con Cytokinin nồng

độ 1 + 30 mg/l có thé sử dụng đề kích thích sự tăng sinh chồi bên Sau vài lần cay chuyền

các cây con được tạo ra và được chuyên sang giai đoạn 4 để cảm ứng ra rễ

Giai đoạn 4 là sự ra rễ in vitro và điều kiện ra rễ Ở một số loài thực vật, dé có

thể cảm ứng sự ra rễ nhất thiết phải chuyển chéi sang môi trường hoàn toàn không cócytokinin Tuy nhiên, cũng có những loài sự ra rễ nhất thiết phải có sự hiện diện của

auxin Những loại auxin thường được bổ sung vào môi trường để cảm ứng sự ra rễ là

IAA (0,1 + 10 mg/l), NAA (0,05 + 1,0 mg/l) va IBA (0,5 + 3,0 mg/l) Sự dap ứng củachổi với auxin và sự hình thành rễ hoàn toàn phụ thuộc vào loai thực vật Đôi khi chínhcytokinin còn tồn tai trong môi trường nhân giống đã can sự ra rễ của chi trong giai

đoạn ra rễ.

Giai đọan 5 là giai đoạn ra rễ ex vitro Khi được chuyển ra khỏi bình nuôi cấy,

chỗồi được cấy vao trong một hỗn hợp cơ chất âm dé giúp cho sự ra rễ Hỗn hợp cơ chất

có thé là than bùn, vỏ cây, chất khoáng, đá nhỏ, đá bot, cát đất và có thé trộn thêm mộtlượng nhỏ phân bón Ghi nhận những loại co chất nao thích hợp cho nhưng loại thựcvật Than bùn có thể quá acid đối với một số loài xác định, trong khi đó khoáng chất thìquá kiềm Môi trường lí tưởng cho sự ra rễ là có pH trung tính hoặc là hơi acid, có khả

năng giữ nước nhưng mà hơi thông thoáng.

2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng

Trong nuôi cấy mô in vitro cần phải cung cấp đầy đủ cho bình nuôi cấy cả về yếu

tố hóa học lẫn yếu té vật lý Môi trường nuôi cấy phải đầy đủ các ion khoáng cần thiết,

bồ sung các chất hữu cơ như: amino acid và vitamin; nguồn cacbon và nước Ngoài các

yếu tô hóa học trên thì các yếu tố vật lý bao gồm: nhiệt độ, pH, ánh sáng, áp suất thẩm

thấu, đồ 4m cũng phải được duy trì

Cacbon, nitrogen và phospho có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy Cácnguyên tố vi lượng và các chất điều tiết sinh trưởng đóng vai trò quan trọng không kém

trong qua trình trao đôi chất mặc dù có môi trường rất thấp (Vũ Van Vu, 1999)

Trong nuôi cay mô in vitro yếu tố quan trọng nhất dé tác động đến sự phát triểncủa tế bào thực vật đó là các chất điều tiết sinh trưởng Các chất được dử dụng thôngthường là các phytphormone hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng.Trong 5 nhóm chấtđiều tiết sinh trưởng của thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, ethyle, acid absixic thì

auxin và cytokinin được sử dụng nhiêu trong nuôi cây in vitro.

Nhóm auxin trong nuôi cấy mô có tác dụng thúc day sinh trưởng của mẫu do hoạthóa sự phân chia và giãn nở của tế bảo, kích thích quá trình tổng hợp và trao đổi chat,tham gia điều chỉnh sự phân hóa rễ, chồi (Hoàng Minh Tấn va ctv, 2006) Phương thức

hoạt động của auxin (NAA) cũng có tác động sâu sắc nội sinh hoặc ngoại sinh trên các

mô nuôi cây và có khả năng kiêm soát các quá trình đặc biệt khác nhau như sự phát triên

và kéo đài tế bao (Trigiano va Gray, 2005)

Auxin được chia thành hai nhóm đo có nguồn gốc khác nhau Trong đó IAA là

Auxin tự nhiên quan trong nhat nhưng nó chỉ được sử dung ở một số môi trường nuôicấy vì IAA không 6n định ở nhiệt độ và ánh sáng Nhóm auxin tổng hợp và tương tựIAA là: 2,4-D; IBA; aNAA (Vũ Văn Vu, 1999) Nong độ auxin dùng trong nuôi cấygiao động tùy từng chất và đối tượng nối cấy nhưng thường là 107! - 10 5M

Nhóm cytokinin có tác dụng tích cực trong việc kích thích sự phân chia va ảnhhưởng đến sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi cây và loại bỏ ưu thế ngọn

(Hoàng Minh Tan và ctv, 2006)

Trong nuôi cay mô in vitro, cytokinin được dùng dé kích thích sự phát triển chồi vàkết hợp với auxin kích thích phân chia tế bao Nong độ cytokinin cao kìm hãm sự hìnhthành và phát triển của rễ (Vũ Quang Sáng, 2005)

Trong cây có sự cân bằng hormone (Vũ Văn Vụ, 1999) Do đó, cần phải lưu ý

đến tỷ lệ auxin/cytokinin, nếu tỷ lệ nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ,

nếu nghiêng về phía cytokinin thì sẽ thúc day sự hình thành chdi; Ở tỷ lệ trung gian sẽhình thành mô sẹo ( Nguyễn Văn Uyên, 1985)

Cytokinine là những hợp chất ademi được thay thế, kết hợp với auxin gây ra sựphân chia tế bào thực vật

Benzyl adenine (BA) hoặc 6-benzy lamino purine (BAP) đây là cytokinin tổng

hợp có công thức hóa học là Ci2Hi1Ns (Duong Công Kiên, 2002), đóng vai trò chínhtrong sự thành lập chồi và cơ quan nuôi cay mô, kích thích sự tăng chdi

Benzyl adenine (BA) là một loại cytokinine có hiệu qua cao trong sự cảm ứngtạo chồi ở nhiều loại thực vat Các loại cytokinine khác (kinetine, 2-iP và zeatin) cũng

có sử dụng nhưng ít hơn BA Ngoài tác dung tạo chéi, cytokinine cũng cảm ứng tạo rễ

hoặc tác động lên sự tăng trưởng của rễ (N guyén Duc Luong va ctv, 2002).

Các loai cytokinin tự nhiên: ngày nay, kinetin không phải là chất tự nhiên mađược tạo thành do sự tái sắp xếp lại cấu trúc của một hợp chất khác (Hecht, 1980) Có

ít nhất hai loại cytokinin tự nhiên có cấu trúc tương tự như cau trúc của kinetin đã được

xác định, đó là những hợp chất tự do hay những hop chất có gắn với nhóm glucosidehoặc riboside (Entsch và ctv, 1980).

Kinetin là thành phần của nhóm hợp chất được gọi là cytokinin, một lớp nhân tố

điều hòa sinh trưởng ở thực vật Ở các loài thực vật, kinetin thúc đây phân chia tế bào

và hoạt động trong các quy trình sinh trưởng và biệt hóa tế bào Chức năng của nó cũngnhư một chat kháng oxi hóa, ngăn chặn tổn thương oxi hóa gây ra bởi các gốc tự đo

Kinetin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật để kích ứng sự hìnhthành của mô sẹo (kết hợp với auxin) và dé tái tạo chỗồi từ mô sẹo (với nồng độ auxin

thấp) Trong một khoảng thời gian dai, người ta tin rằng kinetin là vật liệu được tạo ra

từ deoxyadenosine trong DNA, nó bị phân hủy nếu lưu trữ lâu đài hoặc khi được làmnóng lên trong quá trình phân lập Bởi vậy, người ta cho rằng kinetin không xuất hiện

tự nhiên, nhưng từ năm 1966, một số nhà nghiên cứu chỉ ra rằng kinetin tồn tại tự nhiên

trong ADN của tế bào của hầu hết sinh vật đã được kiểm tra cho tới nay, bao gồm con

người và nhiêu loài thực vật.

Các nghiên cứu cho thấy, chất điều tiết sinh trưởng có ảnh hưởng lớn đến tốc độsinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chat của mô thực vật trong nuôi cấy in vitro

cũng như trong cây hoàn chỉnh (Võ Châu Tắn, 2014)

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan

2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 2015, Vũ Hồng Thúy Uyên và cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu “Nhân

giống cây cây Bay kẹp” trên tạp chí Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Kếtquả nghiên cứu trên môi trường MS với hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa

bổ sung kinetin 0,5 mg/1 cho hiệu quả nhân chồi cao nhất là 20,44 chéi và sử dụngNAA 0,5 mgil giúp tạo rễ tốt nhất là 5,33 rễ

Năm 2017, Tran Văn Tiến và cộng tác viên đã công bồ bài báo “Nghiên cứu nhân

giống in vitro loài Nua konjac” trên tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trìnhbày kết quả nhân giống in vitro loài Nua konjac ở Việt Nam dé bảo tồn và phục vụ sảnxuất Kết quả nghiên cứu cho thấy, chỗi đỉnh được khử trùng tốt nhất khi sử dụng dungdich javel 60% (NaC1O) trong 12 phút, tỷ lệ mẫu sạch 100%, sau 15 ngày thì mẫu phátsinh chồi Môi trường thích hợp dé tái sinh chồi Nưa tốt nhất là 1⁄24MS + 8,0 mg/1 agar

9

+14,0 g/l sucrose + 0,4 mg/l IBA + 1,0 g/l than hoạt tính, tỷ lệ chỗồi ra rễ đạt 100%, số

rễ trung bình là 4,98 rễ, chiều dài trung bình của rễ đạt 2,67 cm, sau 7 ngày nuôi chéi

bắt đầu ra rễ

Năm 2017, Nguyễn Thị Thúy Diễm đã công bố bài báo “Ảnh hưởng của các chất

điều hòa sinh trưởng lên sự sinh chi, rễ và loại giá thể phù hợp cho sự sinh trưởng củacây Gừng đen ở vườn ươm” trên tạp chí khoa học Trường đại học An Giang Kết quảcho thấy, chéi cây Gừng đen nhân nhanh trong môi trường MS bồ sung 1,5 mg/l BAkết hợp 0,5 mg/l TDZ dat 4,2 chồi sau 8 tuần nuôi cấy Môi trường ra rễ thích hợp nhất

là môi trường MS có bồ sung 1,0 mg/l NAA hoặc 1,5 mg/l NAA, cho tỷ lệ chồi ra rễđạt 100%, 19,71 - 20,57 rễ, 2,71 - 2,86 lá sau 6 tuần nuôi cấy Thuần dưỡng cây Gừng

đen nuôi cấy mô với giá thé đất kết hợp mụn dita (1:1) đạt kết quả tốt nhất

Năm 2017, Nguyễn Thị Lệ Hà và cộng tác viên đã công bố bài báo “Nghiên cứu

kỹ thuật vi nhân giống Lan kim tuyến” trên Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Kếtquả nghiên cứu cho thấy, chồi được khử trùng đạt kết quả tốt nhất ở nồng độ dung dịch

javel 30% trong thời gian 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống sạch là 50% Sau đó được chuyển

sang môi trường MS có bé sung BA dé cảm ứng tao chi Tỷ lệ nhân chổi cao nhất trên

môi trường MS có bồ sung 1 mg/1 BA với số chỗi và chiều cao chéi tương ứng là 23,9chổi, 1,1 em Môi trường MS có bồ sung 0,3 mg/1 BA và 0,3 mg/l NAA cho kết quảvươn chồi tốt nhất với chiều cao trung bình chéi là 3,9 cm Chỗồi được ra rễ trong môi

trường MS có bồ sung 1 mg/l IBA chiều dài trung bình là 4,4 rễ và 2,8 cm

Năm 2018, Nguyễn Thị Mỹ Duyên đã công bố bài báo “Nghiên cứu nhân giốngcây khoai môn” trên tạp chí khoa học Trường đại học An Giang đã trình bày kết quảnghiên cứu nhân giống khoai môn để cung cấp nguồn cây giống cho người dân AnGiang Kết qua nghiên cứu cho thấy, môi trường tái sinh tối tốt nhất là MS + 2,0 mg/l

BA với tỉ lệ tái sinh chồi 100% đạt 5,2 chỗi sau 6 tuần nuôi cấy Trong nghiên cứu tổhợp BA + a-NAA của cây khoai môn, thực hiện song song trên môi trường MS bồ sung2,0 mg/l BA + 0,0 mg/l; 0,5 mg/l ø-NAA va 3,0 mg/l BA + 0,0 mg/l; 0,5 mg/l a-NAA.Môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chéi là MS + 3,0 mg/l BA + 0,5 mg/l

a-NAA dat 3,6 chồi và chiều cao chéi 4,37 cm Theo Nguyễn Thị Mỹ Duyên, kiểu cay

chẻ đôi và cắt ngang cho hiệu quả tạo chôi tôi ưu hơn so với kiêu cây thông thường Môi

trường MS + 1,0 mg/l a-NAA cho ra rễ to đạt 20,43 rễ sau 6 tuần nuôi cấy và tỷ lệ câysống tuyệt đối 100% trên giá thé tro trau giai đoạn thuần dưỡng.

Năm 2020, Nguyễn Minh Ty và Nguyễn Vinh Hiển đã công bố bài báo “Ảnhhưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi và cụm chéi Lan kim tuyến nuôicấy in vitro” trên tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Trong nghiên cứu này, quytrình nhân giống in vitro cây lan Kim tuyến sử dụng từ đốt thân chứa chồi ngủ, nuôi cấytrên môi trường nên tối ưu là MS + 0,3 mg/l kinetin + 1 mg/l BA + 0,1 mg/l TDZ, bổsung các chat dinh dưỡng khác dé cam ứng tạo chồi Tỷ lệ mẫu tao chéi đạt 87% sau 45

ngảy nuôi cấy Tỉ lệ tạo cụm chỗi là 80,05%, số chồi trên cụm là 9,2 chất lượng chồi rất

tốt trên môi trường 1⁄2MS, bổ sung 20g/1 sucrose, kết hợp 0,4 mg/1 kinetin + Img/1 BA

+ 0,2 mg/l TDZ Chiều cao chéi đạt 8cm, số đốt là 6,5 đốt trên môi trường 1⁄2MS kết hợp

1,0 mg/l BA va 0,5 mg/l aNAA.

2.4.2 Nghiên cứu trên thé giới

Năm 2004, Jianjun Chen và cộng tác viên đã thực hiện trong bài nghiên cứu

“Genetic Relationships of 4glaonema Species and Cultivars Inferred from AFLPMarkers”, đã chứng minh tính hiệu qua va dé dang của việc sử dụng các dấu hiệu AFLP

để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của cây lá cảnh, một nhóm thường được nhân giống

sinh dưỡng Các dau hiệu AFLP được phát triển sẽ giúp xác định giống Ag/aonema trong

tương lai, bảo tồn nguồn gen và phát triển giống mới

Năm 2009, Oropeza Maira và cộng tác viên thực hiện bài nghiên cứu

“Micropropagation and Organogenesis of Anthurium andreanum Lind cv Rubrun”, hat

từ các chồi cây được nảy mam trên môi trường MS bồ sung 0,5 mg/l BA, cy in vitrobốn tuần tuổi thu được từ vi cắt, cho thay sự tăng sinh mô sẹo ở gốc thân

Năm 2015, Mariani và cộng tác viên nghiên cứu về vi nhân giống Aglaonemabằng cách sử dụng mẫu chdi nách trong bai “Micropropagation of 4giaonema usingaxillary shoot explants” cho thay ty lệ nhân giống cao nhất của chéi Aglaonema đạt được

ở lần cấy chuyền thứ 5 Sau lần cay thứ 5 (10 tuần), 1000 chồi có thé thu được từ haichỗồi nách ban dau Cây con ra rễ va phát triển trên môi trường MS chứa 3 mg/1 IBA

Năm 2018, trong công trình nghiên cứu của Susana T Labasano có tên là

“Application of Kinetin and naphthalene acetic acid”, hai thí nghiệm đã được tiến hành

dé đánh giá ảnh hưởng của kinetin và NAA đến sự phát triển của chéi và sự ra rễ củacây Aglaonema tricolor.

Năm 2019, Behazd Kaviani va cộng tác viên thực hiện bai nghiên cứu “Influence

of plant growth regulators (BA, TDZ, 2-IP and NAA) on micropropagation ofAglaonema widuri”, khảo sát sự ảnh hưởng của chat điều hòa sinh trưởng đến sự vi nhângiống Aglaonema widuri, kết quả ghi nhận những nghiệm thức ở mỗi liều lượng phùhợp (BA, NAA, TDZ) sẽ cho ra những đặc điểm tốt nhất

Năm 2020, Meutia Zahara và cộng tác viên thực hiện bài nghiên cứu về sự ảnhhưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự vi nhân giống Aglaonema, “A ReviewThe effect of PGR on micropropagation of Aglaonema” cho thay ty lệ nhân chồi cao

nhất thu được trong sự kết hợp của 3,0 mg/l BA va 0,2 mg/l NAA (số chổi 6,00 và chiều

dài 7,75 em, số đốt tối đa được hình thành bởi sự kết hợp của 4,00 mg/l BA + 0,1 mg/l

NAA 0,5 mg/l TDZ là 13,25 mẫu, số lá hình thành lớn nhất trong sự kết hợp của 3,5

mg/1 BA và 0,2 mg/l NAA, trong khi sự phát trién rễ tối đa thu được từ sự kết hợp của

3,0 mg/1 BA và 0,2 mg/l, chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho 4giaonema

widuri nuôi cay mô là NAA sự kết hợp của 3,5 mg/1 BA và 0,2 mg/l NAA

Gần nhất, năm 2023, nghiên cứu của Aziza M Taj ALdeen và Mona S.Abd Aal về sự nhân giống Aglaonema Commutatum bằng cách sử dụng TDZ va NAA trongống nghiệm, bài “Enhancement of Aglaonema Commutatum Propagation usingThidiazuron and Naphthalene Acetic Acid in Vitro”, phuong phap xw ly nay dan dén sugia tăng đáng kể so với các phương pháp xử ly khác về số lượng chéi thu được trên mỗimau, sô lá trên môi chôi và sô rê trên môi cây con.

EI-CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2023 đến tháng 12/2023 tại phòng thí nghiệmnuôi cấy mô của chi nhánh Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học TPECO, số 178A

đường Nguyễn Ái Quốc, Thanh phó Biên Hòa, tinh Đồng Nai

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng và cách thực hiện

Đối tượng nghiên cứu là mẫu thân cây vạn lộc (Aglaonema rotundum pink) Vật

liệu nghiên cứu là mâu thân cây vạn lộc.

Cây vạn lộc sau khi mua tại vựa kiếng sẽ được trồng và chăm sóc tại nhà lưới củachi nhánh Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học TPECO, sau 1 tháng tiến hành chọnnhững thân cây vạn lộc khỏe mạnh, không có sâu bệnh và nam mốc, có đường kính thân1,0 - 1,5 em sau đó cắt một đoạn thân cây cách mặt đất tam 1,0 cm, loại bỏ hết các lá dé

sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm khử trùng.

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Đề tai sử dụng dụng cụ và thiết bị có san tại chi nhánh Công ty Cổ phần Côngnghệ Sinh học TPECO gồm tủ cay vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, máy khuấy từ,

cân kỹ thuật, máy đo pH, máy điều hoa nhiệt độ, đèn leb nuôi cấy kệ nuôi cấy, bình

thủy tinh, bình tam giác, ống dong, becher, pipette thủy tinh, đũa thủy tinh, muỗng, va,

bình nuôi cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, dao cấy, giấy cay, kéo, kẹp, bông gòn, găng tay.3.2.3 Hóa chất và môi trường

Quá trình khử trùng mẫu đốt thân cây vạn lộc sử dụng các hóa chất gồm javel

(chứa NaCIO 5%), dung dich sunlight, Tween 80 và cồn 70° dé tạo được nguồn mẫu vô

trùng thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo Bồ sung chất điều hòa sinh trưởng kenitincho quá trình phát sinh chồi từ mẫu đốt thân đã vô trùng giúp mẫu đốt thân đạt được tỉ

lệ mau phát sinh chồi cao, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA cho quá trình nhânnhanh chỗi từ mẫu đốt thân đã phát sinh chdi, bố sung chất điều hòa sinh trưởng NAA

từ mẫu của quá trình nhân nhanh chồi dé tạo rễ Môi trường dinh dưỡng MS (Muraskige

13

và Skoog, 1962) có bổ sung 30 g/l đường và 5 g/l agar được sử dung làm môi trườngnuôi cấy, giá tri pH của môi trường nuôi cấy trước khi hấp khử trùng khoảng 5,7 - 5,8.Thể tích dung dịch môi trường nuôi cấy trong bình nuôi cấy là 30 - 35 ml/bình Môitrường nuôi cay được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C , áp suất 1,2 atm, trong 18 phút.Bảng 3.1 Thành phần hóa chất môi trường MS

Thành phần Hóa chất Nông độ

KNO3 1900

NHuNO: 1650 Khoáng đa lượng MgSOx.7H2O 370

CaC]l›.2HzO 440 KH2PO4 170

CoCl›.6HaO 0,025 CuSO4.5H20 0,025 H3BO3 6,20

Khoáng vi lượng KI 0,83

MnSOu.4H2O 22,30 NaaMoOa.2HzO 0,25 ZnSO4.7H2O 8,60

Na;EDTA.2H2O 37,3

Fe - EDTA

FeSO4.7H20 27,8 Glycine 2,0

Myo-Inositol 10,0

Vitamin Nicotinic acid 0,5

Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine-HCl 0,1

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy phải đảm bảo nhiệt độ ôn định dé câyphát triển khỏe mạnh trong trong môi trường nuôi cấy từ 25 - 28 °C , dé duy trì nhiệt độ

6n định trong phòng nuôi cấy cần có sự hồ trở của máy điều hòa nhiệt độ Tiếp theo là

thời gian chiếu sáng, sử dung đèn huỳnh quang hoặc đèn led có ánh sáng trang, cường

độ ánh sáng là 15 W/mỷ, thời gian chiếu sáng trung bình là 16 giờ/ngày Cuối cùng, độ

am không khí tốt nhất là 70%, tránh mẫu không bị mat nước trong quá trình nuôi cấy,nếu vượt quá 80% cần sử dụng quạt hút không khí đề điều chỉnh lại độ âm ban đầu.3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch javel trong quy trình xử lí mẫu

Mẫu thân cây vạn lộc sau khi được xử lý được tia dưới vòi nước sạch, dùng bông

gòn thắm vào dung dịch sunlight 5% lau theo một chiều, tia lại với với nước sạch, sau

đó ngâm mẫu vào dung dịch sunlight 2%, lắc đều trong 15 phút, lặp lại 3 lần Mẫu đượcrửa với nước cho vào hủ vô trùng Lắc cồn 70° trong 5 phút và rửa lại với nước cất 3lần, mỗi lần 5 phút Xử lý mẫu trong tủ cấy, đầu tiên lắc cồn 70° trong 30 giây và rửavới nước cat vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút Ngâm và lắc mẫu trong vitamin C 200 mg/Itrong 20 phút và rửa lại với nước cất 3 lần, mỗi lần 5 phút Tiếp theo, ngâm và lắc mẫutrong dung dich javel với nồng độ tùy thuộc vào mỗi nghiệm thức có bé sung 0,5 mlTween 80 trong thời gian 20 phút rồi rửa lại với nước cat vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút.Sau đó, khử trùng mẫu bằng hỗn hợp kháng sinh (gồm tetracyclin, amoxycilin và

ampicillin với tỉ lệ 1:1:1) 200 mg/1 cùng với 0,5 ml Tween 80 trong 20 phút rồi rửa lại

với nước cat vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút Cuối cùng, cắt thành từng đốt dai 1 - 1,5 cmchứa mặt ngủ và cây vào môi trường MS.

Bảng 3.2 Nồng độ dung dịch javel (%) đến quá trình khử trùng mẫu

Nghiệm thức Môi trường Dung dịch Javel (%) Mẫu/lần lặplại

Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian ghi nhận số liệu sau 2 tuần nuôi cấy

Ð số mẫu sống va không bị nhiễm

3.3.2 Bố trí khảo sát nồng độ kinetin đến quá trình phát triển chồi từ đốt thân

Cách tiến hành: mẫu đốt thân sống sạch của cây vạn lộc ở thí nghiệm 1 có hiệntượng phan ứng phát triển chồi, tiến hành cấy vào môi trường MS cơ bản có bé sungchất điều hòa sinh trưởng kinetin với các nồng độ khác nhau tùy vào mỗi nghiệm thức

Cách bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiêu đơn nhân tố với 5 nghiệm

thức B1, B2, B3, B4, B5, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 7 mẫu Tổng sốmẫu thí nghiệm là 105 mẫu.

Bang 3.3 Nong độ kinetin (mg/l) đến quá trình phát triển chồi từ đốt thân

Nghiệm thức Môi trường Kenitine (mg/1) Mau/lan lặp lại

Chi tiêu theo dõi:

Thoi gian ghi nhan số liệu sau 4 tuần nuôi cay

Ю Tổng số mau tao chồi

Tỉ lệ mẫu tạo chéi (%) = x100

3 Tổng số mẫu của thí nghiệm

3 Tổng chiều cao choi

Chiêu cao trung bình choi (cm) = —“——

3; Tổng số chồi của thí nghiệm

(Đo các mẫu chồi có kích thước từ 0,5 cm trở lên, chiều cao được tinh từ mặt thạch)Tình trạng mẫu: hình dáng và mảu sắc.

3.3.3 Bồ trí khảo sát nồng độ BA cho khả năng nhân nhanh cum chồi

Cách tiến hành: sử dụng mẫu ở thí nghiệm 2 có chiều cao tương đồng, thân màuxanh lá, chắc khoẻ, cay vào môi trường MS co bản có bố sung 0,2 mg/1 kinetin va chatđiều hoa sinh trưởng BA với nồng độ khác nhau tuỳ vào mỗi nghiệm thức

Cách bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bồ trí theo kiêu đơn nhân tố với 7 nghiệmthức C1, C2, C3, C4, C5 ,C6, C7, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 7 mẫu.Tổng số mẫu của nghiệm thức là 147 mẫu

Bang 3.4 Nong độ BA (mg/1) cho khả năng nhân nhanh chồi

Nghiệm thức Môi trường BA (mg/l) Mẫu/lân lặp lại

Chi tiêu theo dõi:

Thời gian ghi nhận số liệu sau 4,6 tuần nuôi cấy

3,Tổng số choi

Số chồi trung bình (chéi) =

3 Tổng số mau của thí nghiệm

(Chỉ tính sô chôi có kích thước từ 0,5 cm trở lên)

3› Tổng số lá

Số lá trung bình (lá) =

3 Tổng số mau của thí nghiệm

(Chỉ tính những lá mở hoàn chỉnh trên bề mặt thạch)

3.3.4 Bố trí khảo sát nồng độ NAA cho khả năng tạo rễ của cây vạn lộc

Cách tiến hành: các chồi cây in vitro từ thí nghiệm 3 được lựa chọn có chiều caotương đồng được cay chuyền sang môi trường MS có bồ sung chất điều hoà sinh trưởngNAA vớ nồng độ khác nhau tuỳ vào mỗi nghiệm thức

Cách bồ trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiêu đơn nhân tố với 7 nghiệmthức D1, D2, D3, D4, D5, Dó, D7, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 7 mẫu.Tổng số mẫu của thí nghiệm này là 147 mẫu.

Bảng 3.5 Nong độ NAA (mg/l) cho khả năng tạo rễ

Nghiệm thức Môi trường NAA (mg/l) Mẫu/ lần lặp lại

Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian ghi nhận số liệu sau 4,6 tuần nuôi cấy

Thời gian mau phát sinh rễ (ngày): ghi nhận khi mẫu bắt đầu có hiện tượng tạo rễ

> chiều cao cây

Chiều cao cây (cm) = „2“ êueao cây _= y ( ) ¥s6 mẫu thí nghiệm

Tình trạng mẫu: hình dáng và màu sắc.

3.4 Phương pháp xử lí số liệu

Số liệu thu nhập được xử lý trên máy tính bằng phần mềm Ecxel và phân tích

ANOVA đơn yếu tố bằng phần mềm MINITAB 16.2.4 Đọc kết quả dựa vào bangANOVA, phương pháp Turkey multiple range test, bảng trung bình và bảng so sánh

khác biệt giữa các nghiệm thức

CHƯƠNG 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nồng độ khử trùng javel xử lí mẫu đốt thân cây vạn lộc

Bat kỳ cây trồng nào khi nuôi cấy in vitro đều cần có quá trình vô trùng mẫu vàjavel là chat được sử dụng phổ biến trong việc khử trùng mẫu thực vật vì giá thành rẻ,mang lại hiệu quả cao, ít ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và đễ tìm thấy trên thị

trường Tuy nhiên do thành phan chính của javel là NaClO, một chat oxi hoá mạnh, khi

sử dụng ở nồng độ cao sẽ gây phá huỷ tế bào dẫn đến hiện tượng chết mẫu cần đượcnuôi cay (Nguyễn Thị Kiều Linh va ctv, 2021)

Bang 4.1 Anh hưởng của nồng độ khử trùng sau 2 tuần nuôi cay

a, Dung dich : Ti lệ nhiễm và chết

Nghiệm thức Javel (%) Tỉ lệ sông sạch (%) (%)

Trong cùng một cột và cùng yếu to ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác

nhau có sự khác biệt về mặt thông kê (P < 0,05) Các số liệu tỉ lệ được chuyên đôi theo công

thức arcsin\—— trước khi xử lý thong kê

Kết quả bảng 4.1 cho thấy, sau 2 tuần nuôi cấy, khả năng khử trùng bằng dungdịch javel với nồng độ từ 15% - 35% trong khoảng thời gian là 20 phút cho thấy hiệuquả khử trùng không giống nhau Khi tăng nồng độ dung dịch javel từ 15% - 20% khảnăng diét trùng cũng tăng theo, tỉ lệ sống sạch tăng từ 71,43% - 80,95%, đồng thời tỉ lệnhiễm giảm từ 28,57% xuống 19,05% Tăng nồng độ dung dịch javel từ 20% - 35%, ti

lệ sống sạch giảm từ 80% xuống 33,33% Tỉ lệ mẫu sống sạch cao nhất ở nghiệm thứcA2 (dung dịch javel 20%) là 80% và thấp nhất ở nghiệm thức A5 (dung dịch javel 35%)

là 33,33%, đồng thời tỉ lệ mẫu chết nhiễm cao ở nghiệm thức A5 (dung dich javel 35%)

là 66,67% và tỉ lệ mẫu chết nhiễm thấp nhất ở nghiệm thức A2 (dung dịch Javel 20%)

là 19,05% Chứng tỏ, khi dùng dung dịch javel ở nồng độ từ 25% - 35% trong thời gian

20 phút thì tỉ lệ mẫu sông sạch thấp, nhỏ hơn 50% và tao ra mẫu cấy vô trùng thấp Ởnồng độ dung dịch javel 15% (nghiệm thức A1) và 25% (nghiệm thức A3), tuy tỉ lệ mẫusống sạch lớn hơn 50% nhưng chưa tối ưu vì tỉ lệ mẫu nhiễm chết vẫn còn cao, lớn hơn30% Sau 3 tuần nuôi cấy giống cây Lan kim tuyến, khả năng khử trùng bằng Javel vớicác khoảng thời gian (10 phút, 20 phút) và nồng độ khử trùng (20%, 30%, 40%) chohiệu quả khử trùng là không giống nhau, khi dùng Javel ở nồng độ và thời gian là (20 -

20 phút, 30 - 10 phút) thì chưa đủ để tạo ra mẫu cấy vô trùng Kết quả nghiên cứu chothấy, mẫu chồi được khử trùng đạt kết quá tốt nhất ở nồng độ Javel 30% trong thời gian

20 phút cho tỷ lệ mẫu sống sạch là 50% (Nguyễn Thị Lệ Hà và ctv, 2017)

Hình 4.2 Nồng độ khử trùng khác nhau của mẫu sau 2 tuần nuôi cấy.

Quan sát hình thái của mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy (Bảng 4.2), ở nồng độdung dịch javel 15% có nhiều mẫu nhiễm khuân và nam, cho thấy nồng độ dung dichjavel còn thấp nên khử trùng mẫu chưa đạt hiệu qua cao Ở nghiệm thức A3 (dung dịch

javel 25%) đã có xuất hiện mẫu chết, cho thấy nồng độ khử trùng cao làm mẫu đốt thân

bị sốc, gây ngộ độc, phá vỡ các cấu trúc tế bào của mẫu cấy nên không thể hấp thu dinhdưỡng từ môi trường đề phát triển, làm sức sống của mẫu cấy khó phục hồi và dẫn đến

mẫu cấy bị chết Điều đó càng được làm rõ hơn ở nghiệm thức A4 và A5 khi càng tăngnồng độ khử trùng thì tỉ lệ chết của mẫu đốt thân càng nhiều

Bảng 4.2 Tình trạng mẫu sau 2 tuần nuôi cấy

; Dac diém hinh thai

thức (%) °

Al 15 Mẫu có màu xanh lá đậm mặt ở trên của mẫu có mà nâu,

xuât hiện nâm và khuânA2 20 Mẫu có màu xanh lá đậm, có hiện tượng cảm ứng chéiA3 25 Mẫu có màu xanh lá đậm, có hiện tượng cảm ứng chéi, một

sô mâu bị chêt

Mẫu có màu xanh lá đậm, một số mẫu bị đen, nhiễm khuẩnA4 30 iq, aa

va bi chêt

AS 35 Mẫu có màu xanh lá đậm, một vai mẫu bị khô bề mặt, nhiễm

khuẩn và chết

21

Nghiệm thức A2 (dung dịch javel 20%) là nồng độ thích hợp đối với mẫu câyVạn lộc với tỉ lệ sống sạch cao 80,95% Điều này cho thấy rằng nồng độ dung dịch javelảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình tạo mẫu sạch bệnh, nồng độ quá thấp thì mẫu vẫn còn

có hiện tượng nhiễm nam và khuẩn, nồng độ quá cao thì mẫu có hiện tượng bị chết Vìvậy, việc sử dụng dung địch javel ở nồng độ 20% trong thời gian 20 phút mang lại hiệuquả cao nhất Kết quả này khá tương đồng với nghiên cứu “Phát triển quy trình khửtrùng in vitro cho DO-1 (Prunus nội địa) gốc ghép” (Remzi Ugur va ctv, 2020), có hiệuqua tay trùng sử dụng NaClO (sodium hypochlorite) là cao nhất với ty lệ vào khoảng

81,66% va theo sau đó là HaO¿ (Hydrogen Peroxide) với 67,77%.

4.2 Sự phát triển chồi từ mẫu đốt thân

Trong các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, BAP và kinetin được

sử dụng rất phô biến trong nhân nhanh chồi in vitro nói chung cũng như các loài thuộc

chi Amomum (Sajina và ctv, 1997) Cytokinin là một trong những chất điều hòa sinh

trưởng thực vật Cytokinin it có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và có hiệu qua

trong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein Khi được bổ sung vào trong môi trườngnuôi cấy chồi thì những hợp chất này sẽ phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn vàkích thích sự hoạt động của các chéi bên (N guyén Duc Luong va ctv, 2002) Cytokinin

có nhiều chất, kinetin là chat được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao tạo choi đối với

nhiều loại cây Sự hình thành chồi tạo ra bằng cách IBA va kinetin (Del rosario, 1988).

Bang 4.3 Sự phát triển chồi sau 4 tuần nuôi cấy

Chiêu cao chôiNghiệm thức Kinetin (mg/]) Tỉ lệ tạo chéi (%) Corn

Bl 0,0 19,05° 1,003 + 0,07 B2 0,3 38,10 1,214+ 0,00

B3 0,6 76,192 2,52^+ 0,08

B4 0,9 42,86? 1,83°+ 0,11

%CV 10,58 4,80

Trong cùng một cột và cùng yếu tô ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác

nhau có sự khác biệt về mặt thông kê (P < 0,01) Các số liệu tỉ lệ được chuyên đôi theo công

thức arcsinN—— trước khi xử ly thong kê

Sau 4 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức B1 (0,0 mg/1 kinetin) thay rang mẫu đốt thân

có sự phát triển chồi chậm với tỉ lệ tạo chồi là 19,05% Khi tăng nồng độ kinetin lần lượt

từ 0,0 mg/1 đến 0,6 mg/I thì tỉ lệ tạo chdi tăng lên với tỉ lệ 19,05% - 76,19%, đồng thời

có chiều cao chôi tăng từ 1,00 cm - 2,52 em Nhưng nếu ta tiếp tục tăng nồng độ kinetin

lần lượt từ 0,6 mg/l đến 1,2 mg/l thì tỉ lệ chồi của mẫu đốt thân bắt đầu xuất hiện tỉ lệ

nghịch với nồng độ kinetin với từ 42,86% giảm xuống 38,10% và chiều cao chồi trungbình cũng giảm theo từ 1,83 em xuống 1,57 em Ở nghiệm thức B3 (0,6 mg/1 kinetin)

và nghiệm thức B4 (0,9 mg/l kinetin) cho thấy được tỉ lệ tạo chồi cao và chiều cao chéi

lớn nhưng nồng độ tối ưu nhất để tạo chi là 0,6 mg/1 kinetin với tỉ lệ tạo chỗi là 76,19%

và chiêu cao chôi là 2,52 cm.

Tuy nhiên, ở nghiệm thức B2 (0,3 mg/1 kinetin) và BS (0,6 mg/1 kinetin) có tỉ lệ

tạo chồi bằng nhau nhưng xét về chiều cao chồi thì ở nghiệm thức BS (0,6 mg/1 kinetin)

là 1,57 cm lớn hơn chiều cao chéi nghiệm thức B2 (0,3 mg/l kinetin) là 1,21 cm Do vậynghiệm thức BS (0,6 mg/l kinetin) tối ưu hơn nghiệm thức B2 (0,3 mg/1 kinetin)

23