Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme β-1,3-glucanase và khả năng đối kháng với nấm Fusarium solani của các chủng xạ khuẩn

TÓM TẮTNghiên cứu này được tiền hành với mục tiêu xác định khả năng sinh enzyme glucanase của một số chủng xạ khuẩn Streptomyces và đánh giá khả năng đối kháng vớinam Fusarium solani thô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỎNG HỢP ENZYME p-1,3-GLUCANASE VÀ KHẢ NĂNG DOI KHÁNG VỚI

NAM Fusarium solani CUA CÁC CHUNG XA KHUAN

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : TRAM VIỆT TRUNG

Mã số sinh viên : 19126206

Niên khóa : 2019 -2023

TP Thu Đúc, tháng 03 năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TONG HỢP ENZYME

ÿ-1.3-GLUCANASE VÀ KHẢ NĂNG DOI KHÁNG VỚI NAM Fusarium solani CUA CAC CHUNG XA KHUAN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiệnPGS TS NGUYÊN VŨ PHONG TRAM VIỆT TRUNGThS TRAN THI THANH HUONG

TP Thủ Đức, thang 03 năm 2024

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thay PGS TS Nguyễn

Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại họcNông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm qua Vớivốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học tập không chỉ là nền tảng cho quá trìnhnghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quý báu đề em bước vào cuộc sông một cách

tự tin và vững chắc

Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Huỳnh Thúy Vy đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ

em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài, em luôn nhận được sự động viên của bạn

bẻ và người thân trong gia đình Em xin chân thành cảm on.

Cuối cùng em kính chúc quý thầy cô đồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệpCao quý.

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Trầm Việt Trung, MSSV: 19126206, Lớp: DH19SHB thuộc ngành Côngnghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa

luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn trách nhiệm trước Hội

đồng về những cam kết này

Tp Thu Đức, ngày 31 tháng 03 năm 2024

Người viét cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên)

ii

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được tiền hành với mục tiêu xác định khả năng sinh enzyme glucanase của một số chủng xạ khuẩn Streptomyces và đánh giá khả năng đối kháng vớinam Fusarium solani thông qua dịch nuôi cay của các chủng xạ khuẩn này ở điều kiệnphòng thí nghiệm Dé xác định khả năng sinh enzyme, phương pháp định tính trên môitrường thạch Mannitol Soya Flour cùng với phương pháp định lượng đường khử bằng

-l,3-thuốc thử DNS đã được thực hiện Khả năng đối kháng với nam Fusarium solani được

đánh giá qua phương pháp khuếch tán giếng thạch Các kết quả cho thấy, sau 3 ngày thí

nghiệm, chủng xạ khuân BT3, BT13 và BT11 biểu hiện khả năng phân giải cao nhất,

với bán kính vòng phân giải B-glucan lần lượt là 5,4 mm, 5,2 mm và 4,5 mm Đặc biệt,chủng xạ khuân BT13 có hàm lượng enzyme B-1,3-glucanase cao nhất là 1,8 IU/mL,

tiếp theo là BT3 với 1,6 IU/mL và BT11 với 1,2 IU/mL Trong khi đó, chủng xạ khuan

BT16 có bán kính vòng phân giải thấp nhất là 1,2 mm và hoạt độ enzyme thấp nhất là0,3 IU/mL Đến ngày thứ 5 sau thí nghiệm, chủng xạ khuẩn BT3, BT7 va BT13 đạt bánkính vòng phân giải cao nhất là 7,5 mm, trong đó hàm lượng enzyme của BT13 và BT7lần lượt là 3,3 [U/mL và 3,0 IU/mL Đến ngày thứ 7, chủng BT13 và BT7 tiếp tục danđầu với bán kính vòng phân giải lần lượt là 9,6 mm và 9,4 mm, và hàm lượng enzyme

cao nhất thuộc về chủng BT13 (4,1 IU/mL) Ching BT16 vẫn có bán kính vòng phân

giải thấp nhất là 3,7 mm Ching BT13 cho thấy khả năng đôi kháng với nam Fusariumsolani tốt nhất, với bán kính tan nam là 12,64 mm và hiệu suất đối kháng là 30,57% ởthời điểm 72 giờ sau cấy Kết quả nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của chủng xạkhuan BT13 trong việc phát triển chế pham trừ nam sinh học Cần tiếp tục nghiên cứu

dé tôi ưu hóa điều kiện nuôi cay và đánh giá khả năng đối kháng với các nắm bệnh ởđiều kiện nhà lưới và thực địa

Từ khóa: B-1,3-glucanase, DNS, đối kháng, Fusarium solani, Streptomyces

11

capabilities, qualitative methods on Mannitol Soya Flour agar medium, as well as

quantitative methods for reducing sugars using DNS reagent, were performed The antagonistic ability against Fusarium solani was assessed through the well diffusion

method Results indicated that, after 3 days of inoculation, strains BT3, BT13, and BT11 exhibited the highest degradation capability, with B-glucan clearance zone radius of 5.4

mm, 5.2 mm, and 4.5 mm, respectively Notably, strain BT13 had the highest glucanase enzyme content at 1.8 IU/mL, followed by BT3 at 1.6 IU/mL and BTII at 1.2

B-1,3-IU/mL Meanwhile, strain BT 16 showed the lowest clearance zone radius at 1.2 mm and

the lowest enzyme activity at 0.3 IU/mL By the 5" day post-inoculation, strains BT3,

BT7, and BT13 achieved the highest clearance zone radius at 7.5 mm, with BT13 and

BT7 having enzyme contents of 3.3 IU/mL and 3.0 IU/mL, respectively By the 7" day,

strains BT13 and BT7 continued to lead with clearance zone radius of 9.6 mm and 9.4

mm, respectively, and the highest enzyme content belonging to strain BT 13 (4.1 IU/mL).

Strain BT16 still had the lowest clearance zone radius at 3.7 mm Strain BT13 demonstrated the best antagonistic ability against Fusarium solani, with a fungal spread radius of 12,64 mmand an antagonistic efficiency of 30,57% at the time point 72 hoursafter inoculation These findings highlight the potential of the Streptomyces strain BT13 in the development of biofungicide Further research is required to optimise culturing conditions and evaluate the antagonistic ability against pathogenic fungi under

greenhouse and field conditions.

Keywords: B-1,3-glucanase, antagonism, DNS, Fusarium solani, Streptomyces.

iv

MỤC LỤC

090990900 — Ô iXÁC NHẬN VA GAM DOAN coscsscsecssscassssosnessnssinnasossnsandansavnsdansannasnesianndacianassaaninnnnenss ii

1.2 Mục tiêu của đề tài che 21/3 Nội đụng thực NMED san se nanoaiostinneidotsosg9ECERGSSGSSBL2SG0388SSSHG-S/4SISESG023GEGGGS0/305E483903/468 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU - 252 S2S2E2SE+E£E2EE£EE£ESEE+EErEzrxrrxee 3

2.1 Tổng quan về xạ khuẩn Streptomyces -2+©22-©22©2+22++cz2c+erxrcresrrrrrerrcee 32.1.1 Một số đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 22 22222E+2E2E22E22E2222E.2zzzxe 3OCR he 321.1.3 KIUAN ty ắaâẼẻ+' Ả 4

AN biệt: TB OS sca ci re alle Pa 5

2.1.2 Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của xạ khuẩn -. - 62.1.3 Kha năng sinh enzyme của xạ khuân 2-22 222222E2E+2E22E2ZE2ZE2ZEzEzxze 62.1.4 Vai trò của xạ khuân - + 22-52 SE SEE2E2E2121E21212112121112121111211111211112111 1E xe 72,14;l: Trong tự NCR ssessssesessoireinliEtid tioSootix91505975585151593ESS1805080000919854303561103003884912 7

2.1.4.2 Trong phòng trừ sinh HỌC - - 522 + ***E*EvEvkErkrrkrrkrxkrtrhnrnrhrr a 2.2 HỆ SHZYME [3-GIMCANAGE: 0. nrecnanecrrenionenenernscenedinncninesensesnanthsinsardeseesnesnstndestundesensonnes 7

2.2.1 Cau trite Be glUcan 8n 7

22,2), EnzyrmG = glu@anase tecncsacssceomaracuemama ama nesse aU 8

2.2.3 Sự phân bố enzyme j-1,3-glucanase trong tự nhiên -2 2- 255255522 92.2.4 Tinh chất hóa lý của enzyme B-1,3-glucanase -2¿2¿52¿2s2z+2zzzzz>s2 9

2.2.5 Ứng dụng của enzyme j-1,3-glucanse 2- 222 +2+222222E+222E22E22222222zzxze, 102.3 Một số đặc điểm của nắm Fusarium SOLANA - - 5522 ESt+E‡ES2EEESEEzEcErkrrrrees 11

2.3.1 Vị trí phân loại nắm Fusarium sỌani 2-©22©2222222222EE22E222E22222222222zxee 112.3.2 Phố kí chủ của nắm Fusarium soÏani cccccccccterrrtrriirrrrrriirrrrrreee H1

2.3.3 Đặc điểm hình thái, sinh học của nắm Fusarium soÏani - 112.3.4 Đặc điểm sinh lý của nấm Fusarium sỌani 22©22-522552222c2222sc2zzczsce 12

2.3.5 Triệu chứng bệnh do nam Fusarium soÏani ©2+©22-522222222+2222z+2s2csze 152.3.6 Biện pháp phịng trừ bệnh do nam Fusarium soÏai - 2 22-552-5522-: 13

2.4 Tình hình nghiên cứu về enzyme j-1,3-glucanase trong phịng trừ sinh học 142.4.1 Tình hình nghiên cứu trong NGC - + 25+ +2 *+2*+2E+2E+zEv re rkt 14

2.4.2 Tình Hình nđphiện cứu NEO HƯIẾ ::‹csxesesessasnoiioisdindiioibisiiikiSE0616140484815934008165 15

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 222-255sccccccrrrreerrrrrree 163.1 Thời gian va địa điểm nghiên CU cccccccceccecsseeseesessessecsessessessessessessessesseeeeseees 163.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - - ¿2+ ++k 2+ #sEveeerrererrrrrrrrree 16

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 2 2+22222+22E+2E22EE22E122122112212212211271221122121.2 2e l6

3.2.2 Hĩa chat, trang thiết bị và đụng cụ - 2-2 5222222E22E+2E22E22E22E2E2EzEzrze, 183.23 Phirone phap MeN SN Oil sos geoscesesacssarcanetnnnsct fEgEAdlcSgovketkBaostQGixigtaitvdsibetgRed8S46661xse« 183.2.3.1 Khảo sát khả năng phân giải B — 1,3 -glucan của các chủng xạ khuan 183.2.3.2 Xác định hoạt độ enzyme ƒ - 1,3 — glucanase do các chủng xạ khuẩn tiết ra 193.2.3.3 Khảo sát khả năng đơi khang nam Fusarium solani với dịch nuơi cây của cácchiing Xa 84 a5 21

CR | 22CHUONG 4 KET QUA VA THẢO LUẬN -2¿©22+2+2E22E22E2E2E2Ezrerree 23

ee 23

4.1.1 Kha năng phân giải B — 1, 3 — glucan của 11 chủng xa khuân - 234.1.2 Kha năng sinh enzyme ÿ -1,3 — glucanase của 11 chủng xạ khuan 264.1.3 Khả năng đơi kháng nam Fusarium solani với dịch nuơi cây của các chủng xa

CC —————— 29

44:2 THảO WIAD os scscscdssacesacsvonssatencedssineunsontianehwentianes nenibesineaesianionnuticenmabseeascunnekenansatibeunnenatennen 32

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, 22-2 2+2222EE2EE22E222E22E2222222z2rxee 33

Le LH ngessarsaaeeesrauegagraryryyrrdgotrrattietaurrggtroodornouuszse 33

5.2 DS n4 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LỤC

Vii

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

BVTV : Bảo vệ thực vật

DNS : 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic

HSDK : Hiệu xuất đối khang

MSF : Mannitol Soya Flour

NSTN : Ngay sau thi nghiém

Viii

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của 11 chủng xạ khuẩn sau 7 ngày trên Gause I 16Bang 3.2 Xây dựng đường chuẩn cho thí nghiệm định lượng ÿ — 1,3 - glucanase 20Bảng 4.1 Bán kính vòng phân giải B — 1,3 — glucan của 11 chủng xạ khuẩn qua các thời

DANH SÁCH CÁC HÌNH

;)).).0900831//22/2/2 2.289) 4

Hình 2.2 Câu trúc hóa học của Behance scncssasaraesianasnnsannacansransdaancanadsanssarioentnaniansns §Hình 2.2 Cấu trúc laminarinase từ Diosma đichotoma -2- 22 52222222z22222+2 §Hình 4.1 Khả năng phân giải B-1,3-glucan của 11 chủng xạ khuẩn 3 NSTN 24Hình 4.2 Khả năng phân giải B-1,3-glucan của 11 chủng xạ khuẩn 5 NSTN 35Hình 4.3 Khả năng phân giải B-1,3-glucan của 11 chủng xạ khuẩn 7 NSTN 25Hình 4.4 Khả năng tiết enzyme B-1,3-glucanase của BT13 A) rửa bang nước cất và B)rửa bang NaCl 1M ở thời điểm 3, 5 và 7 NSTN 2-©2¿ 2222222222222 zEzxee 26Hình 4.5 Kết quả đo nồng độ đường khử của 11 chủng xạ khuẩn ở bước sóng 530 nm

Hình 4.8 Kha nang đôi kháng của dịch nuôi cây các chủng xạ khuân với nam Fusarium

poles GTN Micon TỦ BÍ VNI a ahongaghunniingDEUIAiGi101004ENSGENGGG080080400161506G80410380:38 :46 31

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt van đề

Quá trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) ở thế giới được chia làm ba giaiđoạn chính, mỗi giai đoạn có những đặc điểm và hậu quả khác nhau Giai đoạn đầu tiên

là giai đoạn cân bằng sử dụng (balance use), trong đó người nông dân sử dụng thuốc

BVTV một cach hợp lý, phù hợp với nhu cầu và điều kiện của cây trồng Giai đoạn này

thuốc BVTV mang lại hiệu quả cao, giúp tăng năng suất và chất lượng nông sản Giaiđoạn thứ hai là giai đoạn dư thừa sử dụng (excessive use), khi mà người nông dân bắtđầu sử dụng quá mức, lạm dụng thuốc BVTV dé đạt được kết quả nhanh chóng và cao

hơn Giai đoạn này thuốc BVTV gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, như

ô nhiễm nước, đất, không khí, làm giảm đa dạng sinh học, cũng như giảm hiệu quả của

chính thuốc BVTV do sự kháng thuốc của các loài dich hại cây trồng Giai đoạn cuối

cùng là giai đoạn khủng hoảng sử dung (pesticide crisis), khi ma quá trình lạm dụng

thuốc BVTV đã vượt qua giới hạn, tạo ra những nguy cơ tác hại nghiêm trọng đến câytrồng, môi trường, sức khỏe cộng đồng và hiệu quả kinh tế sản xuất nông nghiệp Giaiđoạn này thuốc BVTV không còn đáp ứng được nhu cau bảo vệ cây trồng, mà trở thành

một vấn đề cần được giải quyết gấp (Nguyễn Hữu, 2019)

Phòng trừ sinh học là một phương pháp hiện đại và bền vững để bảo vệ cây trồngkhỏi các loại dịch hại Trong số các vi sinh vật có lợi, xạ khuẩn là nhóm tiềm năng trongviệc ức chế sự phát triển của các nắm gây bệnh Xạ khuẩn là một vi sinh vật có khả năngsản xuất nhiều enzyme có tác dụng phân hủy thành phần của tế bào nắm, như glucanase,chitinase và peptidase (Yuan và Crawford, 1995) Những enzyme này có thể gây ra sự

ly giải và phân hủy tế bào của nắm bệnh, làm giảm khả năng lây lan của chúng

(Bar-Shimon và ctv, 2004) Một số loài xạ khuẩn còn có thé sản xuất các chất kháng sinh cótác dụng diệt khuẩn và nấm Vào năm 2012, Nagure va Gupta đã báo cáo rằngStreptomyces spp có thê tiết ra các enzyme như chitinase, protease, laminarinase, cùngvới các chất kháng sinh như streptomycin, tetracycline và actinomycin, để ức chế sựphát triển của các nắm bệnh Do đó, xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật có lợi và triển

vọng trong phòng trừ sinh học các bệnh hại cây trồng

Với mục tiêu nghiên cứu và tận dụng khả năng của xạ khuẩn trong phòng trừ sinhhọc các bệnh hại cây trồng, vì vậy đề tài “Khao sát khả năng sinh tổng hợp enzyme B-1,3-glucanase của các chủng xa khuân” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Khảo sát và tuyển chọn một số chủng xạ khuan Streptomyces sp có khả năng sinhtong hợp enzyme j-1,3-glucanase cao ứng dụng phát triển chế phâm sinh học

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khao sát khả năng phân giải B-1,3-glucan của 11 chủng xạ khuẩn

Nội dung 2: Xác định hoạt độ enzyme B-1,3-glucanase do các chủng xa khuẩn tiết ra

Nội dung 3: Khảo sát khả năng đối kháng nam Fusarium solani của dịch nuôi cấy các

chủng xạ khuẩn

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Tổng quan về xa khuẩn Streptomyces

Theo hệ thống phân loại của Atlas (1995), xạ khuẩn thuộc gidi vi khuẩn that

(Eubacteria), siêu giới nhân sơ (Prokaryota), ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn gram

dương cả xạ khuẩn), lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ

Actinomycetales Trong khoảng 1.000 chi và 5.000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có

khoảng 100 chi và 1.000 loài xạ khuẩn (Das và ctv, 2008)

Xa khuẩn là nhóm vi sinh vật di dưỡng, chúng thường sử dụng đường, rượu, acid hữu

co, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon, muối nitrat, mudiamon, uré, amonia acid, peptone, dé làm nguồn nito Tuy nhiên, ở các loài hay các chủng

xạ khuan khác nhau thì khả năng hấp thụ các chất cũng khác nhau (Phạm Văn Kim,

2000).

Xa khuan là nhóm vi khuẩn đặc biệt có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng

xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nắm (myces) Xa khuẩn là

vi sinh vật có rất ít loài gây hại cho cây trồng Chúng được nghiên cứu và ứng dụngnhiều trong lĩnh vực nông nghiệp sử dụng trong phòng trừ sinh học, thúc đầy tăng trưởngthực vật và nhiều lĩnh vực khác (Phạm Văn Kim, 2000)

Xa khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thé tim thay ở hầu hết các môi trường

như đất, nước, không khí và các chất hữu cơ Số lượng xạ khuẩn trong đất có thé biến

đổi tùy theo đặc tính của đất, phương pháp canh tác va sự bao phủ của thực vật Dat cónhiều dinh đưỡng va có độ ẩm, cũng như đất ở lớp bề mặt thường có nhiều xạ khuẩnhon Xa khuẩn có vai trò quan trọng trong chu trình hữu cơ và vô cơ của dat cũng nhưtrong việc sản xuất nhiều chất có lợi cho cây trồng và con người

2.1.1 Một số đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

2.1.1.2 Khuẩn lạc

Khuẩn lạc của xạ khuẩn tuy có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau nhưngtoàn bộ chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không có vách ngăn ngang Giống như vi khuẩngram dương, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn

của nắm mốc và đường kính thay đôi trong khoảng 0,2 — 1 um x 2— 2 pm (Nguyễn Lan

Dũng và ctv, 2002).

Khuan lạc thường chắc, xù xì có dạng vôi, dang nhung tơ hay dang màng dẻo Đường

kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 — 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính lớnhơn Khuan lạc có 3 lớp, lớp ngoài có dạng sợi, lớp giữa có cấu trúc tô ong và lớp trong

có dạng màng (Bùi Thị Hà, 2008).

Khuan lạc của xạ khuẩn thường có nhiều màu sắc khác nhau, tạo nên một bức tranh

da sắc trên đất Mau sắc của khuẩn lạc phụ thuộc vào loại xạ khuẩn, điều kiện môi trường

và các chất sinh học do xạ khuẩn tiết ra Một số màu sắc thường gặp của khuẩn lạc là

đen, trắng, đỏ, vàng, nâu, xanh, xanh lục, hồng tím Màu sắc của khuẩn lạc không chỉlàm cho xạ khuẩn trở nên đẹp mắt mà còn là một trong những tiêu chuẩn quan trọng để

định danh các loài xạ khuẩn Bang cách so sánh màu sắc của khuẩn lạc với các bảng

màu chuẩn, người ta có thé xác định được chi và loài của xạ khuẩn (Đường Hồng Dật

và ctv, 1979).

Hình 2.1 Streptomyces spp Nguồn: www.bacteriainphoto.com

2.1.1.3 Khuẩn ty

Theo Nguyễn Như Thành và ctv (2004), cho rằng khuẩn ty xạ khuẩn không có vách

ngăn và không bị đứt đoạn, có hình que hay hình cầu, đường kính khuẩn ty khoảng 0,2

—0,5 pm Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường không ổn định, phụ thuộc vào từngloài và môi trường nuôi cấy chúng

Xa khuẩn có hai loại khuẩn ty khác nhau, bao gồm khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ

chất Khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt cơ chất, có chức năng sinh sản bằng cách

tạo ra các bào tử Khuân ty cơ chât căm sâu vào môi trường, có chức năng cung câp dinh

dưỡng cho khuẩn lạc Tùy theo loài xạ khuẩn, có thé có cả hai loại khuẩn ty hoặc chi cómột loại khuẩn ty Nếu chỉ có khuẩn ty khí sinh, thì khuẩn ty này vừa đảm nhận vai trò

sinh sản vừa đảm nhận vai trò dinh dưỡng Nếu chỉ có khuẩn ty cơ chat, thì khuan tynày không tạo bào tử mà chỉ nhân lên bằng cách chia đôi Khuẩn ty khí sinh và khuẩn

ty cơ chất có thê khác nhau về hình thái, kích thước, thành phần hóa học và đặc tính sinh

ly Khuan ty khí sinh thường dai hơn, mỏng hon và có thành tế bao dày hơn so với khuẩn

ty cơ chất (Lê Xuân Phương, 2008)

Khuan ty có thé tao sắc tố tan trong nước hoặc trong dung môi chất béo Sắc tố tantrong nước xâm nhập vào môi trường nuôi cấy, làm cho môi trường nuôi cấy có màu

tương ứng với khuẩn ty Màu sắc của khuẩn ty co chat và loại dung môi hòa tan là một

trong những yếu tô xác định loài (Li va ctv, 2016)

Khuan ty co chat phat triển đến một giai đoạn nhất định sẽ mọc nhô lên bề mặt môitrường nuôi cấy tạo thành khuẩn ty khí sinh Khuan ty khí sinh phát triển đến một giaiđoạn nhất định sẽ tạo thành cuống sinh bào tử, tại đây bào tử được hình thành do sự kếtđoạn (fragmentation) tức là nguyên sinh chất trong khuẩn ty co lại thành từng cụm sau

đó được bao bọc bằng một màng đặc biệt hoặc do sự cắt khúc (segmentation) hình thànhnhững vách ngăn.

2.1.1.4 Bào tử

Xa khuẩn sinh san sinh dưỡng bằng bao tử, bào tử xạ khuẩn có hình bau dục, hìnhlăng trụ, hình cầu và đường kính khoảng 1,5 um Màng tế bào có thê nhẫn, gai, khối u,nếp nhăn tùy thuộc vào xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn

loài dài tới 100 — 200 nm, có loài dai chỉ 20 — 30 nm.

Bào tử xạ khuẩn là những cấu trúc bền bi, có thé chịu được các điều kiện môi trường

khắc nghiệt Bào tử xạ khuẩn được bảo vệ bởi một màng mucopolysaccharide, là một

loại polysaccharide có liên kết với protein Màng mucopolysaccharide có độ dày khoảng

300 — 400 A và gồm 3 lớp Các lớp này có chức năng ngăn chặn các tác động bắt lợi của

5

nhiệt độ, pH, ánh sáng, v.v Dé kích thích bào tử xạ khuẩn hình thành, cần phải tạo điềukiện thuận lợi cho khuẩn ty khí sinh phát triển Nếu môi trường quá giàu dinh dưỡng,

quá trình sinh bào tử sẽ bị ức chế Trong một số trường hợp, khi kích thích bào tử xạkhuẩn hình thành, hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh sẽ giảm đi

2.1.2 Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của xạ khuẩn

Xa khuẩn có khả năng thích nghỉ với nhiều điều kiện môi trường khác nhau, pH dao

động từ 4 — 8, nhiệt độ biến động từ 7 — 60 °C Khi gặp môi trường bất lợi, xạ khuẩn sẽtạo bào tử, là những cấu trúc bền bi, có thể chịu được các tác động bat lợi Tuy nhiên,

xạ khuẩn sẽ chết nếu nhiệt độ vượt quá 80 °C, trừ một số loài xạ khuan ưa nhiệt hoặc ưa

lạnh, có thé phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (Dang Thị Kim Uyên, 2010)

Màu sắc của khuân lạc và khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn sẽ phụ thuộc vào môi trườngnuôi cấy Trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucose, bào tử biêu hiện rõ ràng, và

màu sắc của khuẩn lạc và khuẩn ty khí sinh có thể biến đối khi nuôi cấy trên môi trường

khác nhau Vì vậy, dé phan loai xa khuan, Uy ban Quéc té vé phan loai xa khuẩn ISP đã

đề xuất các môi trường chuân và phương pháp chung Một trong những môi trường

chuẩn là môi trường ISP2, có thành phan là glucose, peptone, yeast extract, malt extract,

agar và nước Môi trường này được sử dụng đề xác định màu sắc, hình dạng, kết cấu và

kích thước của khuẩn lạc và khuan ty khí sinh của xạ khuẩn

2.1.3 Khả năng sinh enzyme của xạ khuẩn

Chi Streptomyces nỗi bật với khả năng sinh các enzyme có tiềm năng ứng dụng cao

trong công nghệ sinh học Một trong những enzyme quan trọng mà chúng có khả năngsản xuất là beta-1,3-glucanase, la enzyme có khả năng phân giải beta-glucan - một thànhphan cấu trúc chính của tế bào nam

Beta-1,3-glucanase không chỉ có vai trò trong việc nghiên cứu khoa học mà còn cótiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc kiểm soát và phòng trừcác bệnh do nam gây ra Vi khuân Streptomyces, thông qua khả năng sinh enzyme này,

có thé trở thành một công cụ sinh học hữu ích, giúp bảo vệ cây trồng khỏi sự tan công

của nam bệnh, đặc biệt là Fusarium solani, một loại nam gây hại phô biến (Nguyễn LânDũng và ctv, 2002).

Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, một số chủng vi khuẩn Streptomyces có khả năng

sản xuất lượng lớn enzyme beta-1,3-glucanase khi được nuôi cấy trong điều kiện phòng

thí nghiệm Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các chế phẩmsinh học dựa trên enzyme dé kiêm soát nam bệnh trong nông nghiệp.

2.1.4 Vai trò của xạ khuẩn

2.1.4.1 Trong tự nhiên

Xa khuẩn là vi khuân gram dương phân bố rộng rãi ở nhiều sinh cảnh Chi ưu thénhất được tìm thấy trong đất là Streptomyces Các chi khác như Nocardiopsis,

Saccharomonospora, Amycolaptosis, Actinoplanes và Catenuloplanes thường được tìm

thấy trong đất (Ratnakomala và ctv, 2016; Retnowati và ctv, 2017)

Xa khuẩn góp vai trò quan trong trong quá trình hình thành đất và tao ra độ phì nhiêu

cho đất Chúng đảm nhiệm nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu mỡ thêm cho

đất trồng (Đường Hồng Dật, 1997), chúng tham gia vào các quá trình phân giải các hợpchất hữu cơ trong đất như cellulose, tỉnh bột, lignin (EL-Tarabily và ctv, 2006) góp phần

khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Đặc tính này còn được ứng dụng trongquá trình xử lý rác thải bảo vệ môi trường (Lê Xuân Phương, 2008).

2.1.4.2 Trong phòng trừ sinh học

Theo Phạm Văn Kim (2006), vi sinh vật có tác động ngăn chặn mầm bệnh với nhiều

cơ chế khác nhau như: trực tiếp bằng cách tiết ra kháng sinh và các enzyme phân hủyvách tế bào gây bệnh, hạn chế mầm bệnh phát triển thông qua quá trình cạnh tranh dinhdưỡng và nơi cư trú Xạ khuẩn có thể ức chế được mầm bệnh thông qua các cơ chế nhưtiết kháng sinh, tiết enzyme ngoại bao, cạnh tranh, kích kháng (Lam, 2006) Ngoài ra,chúng còn khả năng giúp cây trồng tăng trưởng thông qua việc tiết các hormone thực

B-glucan là một loại polysaccharide có nguồn gốc từ thiên nhiên, được hình thành từ

các đơn vị glucose nối với nhau bằng các liên kết B-glycoside B-glucan có trong nhiều

loại thực vật như yến mạch, lúa mạch và rong biển, cũng như trong tế bào của một số vikhuẩn và nắm Đặc biệt, tế bào nắm men Saccharomyces cerevisiae có hàm lượng B-glucan cao nhất (Boraston va ctv, 2007) B-glucan là một thành phan quan trọng của

thành tế bào nắm, chiếm đến 65-90% tổng lượng glucan trong tế bào (Ruiz-Herrea vàctv, 2019) B-glucan có cấu trúc phức tap, bao gồm một mạch chính B-1,3-glucan có cácnhánh B-1,6-glucan, kết hợp với chitin và các polysaccharide khác tùy theo từng loài

nam Ví dụ, 6 Aspergillus fumigatus, thành tế bao nam có chứa galactomannan và

B-1,3-1,4-glucan, trong khi ở Candida albicans, thành tế bào nam chủ yếu có B-16-glucan(Latgé và Jean-Paul, 2010).

CH,OH OH OH ¢H,OH OH OH CH,OH CH;OH CH,OH CH,OH

° 0 ft ~ ° cee | ° = “\ ° "Or O emer, | ¢ —OÒ, % =O

O-F-ou + es O-F-ou or are O-F-ou KG KOH

Ơ ` Ơ ónN ' ĐH `

Ou CH,OH On CH,OH Rr Ou ou ĐH ôn

n

CH,OH CH,OH CH,OH CH,OH CH;OH CH;OH CH;OH CH,OH

——ú(c0 On Dr ——o Q /——o Of: —o.ö —o Q Oh Oh:

B-glucanase là một nhóm enzyme thuộc ho glycosyl hydrolases (GHs, E.C 3.2.1.x),

có kha năng thủy phân các liên kết B-glycoside trong cấu trúc B-glucan, tạo ra các đơn

vị glucose B-glucanase có thé được phân biệt theo hai tiêu chí: vi trí phân cắt và loại

liên kết phân cắt Theo vị trí phân cắt, B-glucanase có thể là endo hoặc exo-hydrolase

Endo-B-glucanase cắt ngẫu nhiên chuỗi B-glucan ở phần bên trong, tạo ra cácoligosaccharide ngắn Exo-B-glucanase cắt chuỗi B-glucan ở đầu không khử, tạo ra cácđơn vị glucose Theo loại liên kết phân cắt, B-glucanase có thé là B-1,4-glucanase, B-

1,3-glucanase, B-1,2-glucanase, B-1,6-glucanase, B-1,3-1,4-glucanase, v.v (Dake và ctv,

2004; Abe va ctv, 2017) B-1,3-glucanase là một loại B-glucanase phổ biến, có tác dụngphân hủy các liên kết B-1,3-glycosidic trong B-1,3-glucan, là thành phan chủ yếu của tế

bào nắm Theo cấu trúc acid amine, B-1,3-glucanase của thực vật thuộc nhóm GHI7,

còn B-1,3-glucanase của vi khuẩn thuộc nhóm GH16 (Henrissat, 1991; Henrissat, 1999)

2.2.3 Sự phân bố enzyme j-1,3-glucanase trong tự nhiên

Enzyme B-1,3-glucanase phân bố rộng rãi và được tìm thấy trong tat cả các giới củasinh vật sông từ vi khuẩn cô đến sinh vật nhân chuẩn (Mackay và ctv, 1985; Sova và ctv,

2013) B-1,3-glucanase được tìm thấy ở Flavobacteria (Maneners va ctv, 1973), vi khuẩnPaenibacillus (Hong va ctv, 2003), Arthrobacter (Pang va ctv, 2004), Pyrococcus (Lieshout va ctv, 2004), Actinomyces rutgersensis (Javmen va ctv, 2012), Streptomyces

sp (Dinh Hồng Thái và Lê Minh Tường, 2016) Nhìn chung đã phân lập va xác địnhđược khoảng 84 B-1,3-glucanase từ vi khuan, 136 từ nắm biển và nam trên cạn (Burtseva

và ctv, 2000), 58 từ thực vat bậc cao (Keen và ctv, 1983; Hoj va ctv, 2014).

2.2.4 Tính chất hóa lý của enzyme j-1,3-glucanase

Khối lượng phân tử của endo-B-1,3-glucanase nằm trong khoảng rộng từ 12 đến 230kDa (Manners và ctv, 1973; Cheng và ctv, 2009), nhưng chủ yếu là từ 30 đến 50 kDa

Độ pH tối ưu của endo-f-1,3-glucanase nằm trong khoảng hơi axit, khoảng 5,1 Giátrị pH tối ưu điển hình cho glucanase của vi khuẩn là từ 5,5 — 6,0, hầu hết các endo-J-

1,3-glucanase của nắm có độ pH tối ưu ở phạm vi hơi axit (3,8 -6,0) (Martin va ctv,

2011), hiếm khi ở mức trung tinh hoặc hơi kiềm (7,0 — 9,0) (Cruz va ctv, 1995; Fontaine

va ctv, 1997) Giá trị pH tối ưu thấp nhất thuộc về endo 1,3-glucanase của vi khuẩnDelftia tsuruhatensis (pH 4,0) (Blattel va ctv, 2011), vi tao Euglena gracilis (pH 4,0 —

5,5) (Takeda va ctv, 2015) va nam Lentinula edodes (pH 4,0) (Sakamoto va ctv, 2011).Giá trị pH tối ưu cao nhất thuộc về endo-B-1,3-glucanase từ vi khuẩn Bacillus sp (pH9,0 — 10) (Nogi và ctv, 2014), Zobellia galactanivorans (pH 8,5) (Labourel và ctv, 2014)

và Thermotaga maritima (pH 6,0 — 7,0) (Liu va ctv, 2012) Có thé thay, cac gia tri kiém

nhất của độ pH tối ưu hoàn toàn thuộc về vi khuẩn

Nhiệt độ tới ưu thấp nhất thuộc về glucanase của nam Aspergillus fumigates (24 —40°C) (Hartl và ctv, 2011) và Alternaria tenuissima (30°C) (Jirku va ctv, 2009) Nhiệt

độ tối ưu cao nhất thuộc glucanase của vi khuẩn Thermotoga maritima (95°C) và vikhuẩn cô Pyrococcus furiosus (100 — 105°C) (Gueguen và ctv, 1997)

Endo-j-1,3-glucanase hoạt động theo cơ chế tan công nhiều lần, trong đó các enzyme

không tách khỏi co chat sau lần xúc tác đầu tiên Khả năng xử lý (hoặc mức độ tan côngnhiều lần) được định nghĩa là số lượng liên kết bị thủy phân trong suốt thời gian tồn tạicủa phức hợp enzyme-co chat Vì vậy, tính xử lý của endo-B-1,3-glucanase được tinh

bang ty lệ giữa sản phâm phân tử thấp và sản pham phân tử cao (Bezulkadnikov và ctv,

1990; Bragatto và ctv, 2010).

2.2.5 Ứng dụng của enzyme j-1,3-glucanse

Các B-1,3-glucanase ngoại bao rất có tiềm năng trong việc thương mại hóa, chang

hạn như được ứng dụng trong các ngành công nghiệp lâu đời như sản xuất bia và rượuvang, công nghiệp thức ăn chăn nuôi, chế biến cà phê, công nghiệp dệt may, sản xuất

nhiên liệu sinh học, xử lý chất thải và cả trong nông nghiệp (Annamalai và ctv, 2016)

Trong sản xuất bia và rượu vang, j-1,3-glucanase giúp giảm lượng j-glucan trongngũ cốc, làm giảm độ đục và độ nhớt của hỗn hợp, tăng tốc độ lọc và cải thiện màu sắc,

chất lượng và độ ôn định của sản phẩm Ngoài ra, B-glucanase cũng giúp giảm lượng

bọt và làm tăng độ bền của bia (Celestino va ctv, 2006; Singh va ctv, 2007)

Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, B-glucanase giúp giảm tac dụng khang dinh dưỡng

của B-1,3-glucan trong thức ăn giàu lúa mạch, làm giảm độ nhớt trong hệ tiêu hóa của

vật nuôi, cải thiện môi trường và trạng thái của ruột, tăng cường hap thụ và chuyên hóa

chất dinh dưỡng Mặt khác, B-1,3-glucanase còn giúp cải thiện trong lượng và giảm ty

lệ chuyên đôi thức ăn của vật nuôi (Choct, 2001; Mathlouthi và ctv, 2002)

Trong nông nghiệp, B-1,3-glucanase được sử dụng như một phương pháp phòng trừsinh học, vì nó có thé phân hủy thành tế bào của nắm bệnh, làm suy yêu nội nhũ hạt vàkích thích hạt nảy mầm j-1,3-glucanase cũng giúp tăng khả năng chịu bệnh và tăngnăng suất của cây trồng bằng cách làm giảm sự xâm nhập và lây lan của nam bệnh, làmtăng sự phát triển va sinh trưởng của cây trồng Ngoài ra, B-1,3-glucanase còn có thégiúp cải thiện chất lượng và độ 6n định của hạt giống, làm tăng tỷ lệ nảy mầm và giảmthời gian nảy mầm của hạt giống (Bahat, 2000)

Ngoài ra, B-1,3-glucanase còn có thé được sử dung trong các ngành công nghiệp khác.Trong chế biến cà phê, B-1,3-glucanase giúp làm giảm độ nhớt của cà phê, làm tăng khảnăng trích xuất và hương vị của cà phê Trong công nghiệp đệt may, B-1,3-glucanasegiúp làm giảm hàm lượng B-glucan trong sợi bông, làm tăng độ bóng và độ mềm của

soi, giảm độ co rút và độ ban của sợi Trong sản xuất nhiên liệu sinh học, B-1,3-glucanase

giúp phân hủy B-glucan trong ngũ cốc và rom ra, làm tăng khả năng chuyền hóa ethanol.Trong xử ly chat thải, B-1,3-glucanase phân hủy B-glucan trong chat thải hữu cơ, làmtăng khả năng phân hủy sinh học và giảm lượng chất thải (Annamalai và ctv, 2016)

10

A K x eK 2 F$ + °

2.3 Một so đặc diém của nam Fusarium solani

2.3.1 Vi tri phan loai nam Fusarium solani

Loai: Fusarium solani (F- solani)

2.3.2 Pho ki chủ của nam Fusarium solani

Nam Fusarium solani hiện diện rất phô biến trong đất va có phổ kí chủ rộng Caytrồng ở quốc gia nào cũng có bệnh do nắm Fusarium solani gây ra Leslie va ctv (2006)các cây ký chủ của Fusarium solani bao gồm cây có múi (Citrus sp.), cây bo (Persea

americana), chanh day (Passiflora edulis), đậu Hà Lan (Pisum sativum), bí

(Cucurbitaceae sp.), khoai tay (Solanum tuberosum), ớt (Capcium annum), cà chua (Solanum lycopersicum) và đậu phong (Arachis hypoaea) Phức hợp loài Fusarium

solani (FSSC) bao gồm các loại nam sợi phân bố trên toàn thé giới, gây bệnh ở nhiều

loài cây trồng quan trọng về mặt kinh tế Nhìn chung, FSSC có phô kí chủ rộng trên 100loại cây nông nghiệp và thường gây bệnh thối rễ ở cây ký chủ Cây bị nhiễm bệnh cóbiểu hiện héo, còi cọc, vàng lá và tôn thương thân Ngoài việc là mầm bệnh thực vật,

các thành viên của FSSC còn bao gồm một nhóm nắm sợi lâm sàng quan trọng, gây

nhiễm trùng ở người và động vật (Fatemeh Sabahi và ctv, 2023)

Phạm Văn Kim (1997) đã thực hiện thành công việc chứng minh tác nhân gây bệnh

vàng lá thối rễ của cam mật (Citrus cinensis) và quýt tiều (Citrus reculata) qua các bước

thực hiện qui trình Kock, đã công bồ tác nhân gây bệnh này là nam Fusarium solani LêThị Hong và ctv (2002) đã nghiên cứu bệnh vàng lá chết nhanh trên cây quit tiều tai Lai

Vung, Đồng Tháp và cũng kết luận là bệnh này do nhiều tác nhân gồm Fusarium,

Pythium, Phytophthora và tuyên trùng gây ra, trong đó sự tương tác giữa nam Fusarium

và tuyến trùng là quan trọng nhất

2.3.3 Đặc điểm hình thái, sinh học của nam Fusarium solani

Giống như các loài trong chi Fusarium, Fusarium solani tạo ra các khuẩn lạc có màutrắng và dạng bông Tuy nhiên, thay vì phát triển phần tâm màu hồng hoặc tím như hầu

II

hết các loài Fusarium, Fusarium solani chuyên sang màu xanh lam hoặc nâu xanh(Sigler va Lynne, 1997; Summerbell và Richard, 2003; Larone và Davise H, 2011) Ở

mặt dưới, chúng có thể có màu nhạt, màu nâu trà sữa hoặc nâu đỏ Tuy nhiên, một số

chủng phân lập lâm sàng có màu xanh lam hoặc xanh mực ở mặt dưới (Summerbell và

Richard, 2003) Các khuẩn lạc của Fusarium solani có hàm lượng floccose thấp, lỏng

lẻo, nhay nhụa và rời rac (Summerbell và Richard, 2003) Khi nuôi cấy trên môi trường

thạch khoai tây dextrose (PDA), loại nắm này phát triển nhanh chóng, nhưng khôngnhanh bằng Fusarium oxysporum (Sigler và Lynne, 1997) Trên môi trường PDA, khuẩnlac Fusarium solani đạt đường kính 64 — 70 mm trong 7 ngày (Summerbell và Richard, 2003).

Nam Fusarium solani thường không gây bệnh cho cây trồng trong giai đoạn nuôi cấy.Tuy nhiên, trong giai đoạn vô tính, Fusarium solani có thé gây ra các van dé cho cây

Giai đoạn vô tính bao gồm cả hai hình thức giao phối đồng loại (homothallism) và khác

loại (heterothallic) Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa ba kiều bào tử vô tính là

bào tử đính lớn (Macroconidia), bao tử đính nhỏ (Microconidia) và bao tử vách dày (hậu

bào tử - chlamydospores) (Nguyễn Văn Bá, 2005) Bao tử đính lớn của Fusarium solani

có hình trụ hoặc hình liềm, thường có 3-5 vách ngăn (Barreto và ctv, 2005) Bào tử đínhnhỏ có hình trụ hoặc hình nêm, có thể có một vách ngăn Còn bào tử hậu của nam

Fusarium solani hình thành ở nhiệt độ 30°C (Li va ctv, 1998) va được kích thích hình

thành bởi các chiết xuất từ củ hành tây ở nhiệt độ 35°C và pH từ 6 — 7 (Sood, 1996)2.3.4 Đặc điểm sinh lý của nam Fusarium solani

Trên môi trường Richard’s nam Fusarium solani cho thay sự phát triển tốt, trên môi

trường PDA và V§ khả năng sinh bào tử tốt Trong nghiên cứu sinh lý học, người ta quansát thay rang sự tăng trưởng và sinh bao tử tối đa của Fusarium solani dao động từ 25°C

— 30°C và phát triển tốt ở độ pH 6,5 — 7 (Sanganma và ctv 2020)

Ở điều kiện tự nhiên Fusarium solani có kha năng sông trong đất, phân bố trên phạm

vi toàn thế giới, xuất hiện ở các vùng mưa nhiều và đất thoát nước kém Là loài phố biến

nhất ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Tác nhân gây thối rễ, cô rễ của nhiều loại câytrồng như đậu, cà chua(Nelson, 1981)

2.3.5 Triệu chứng bệnh do nam Fusarium solani

Bệnh hại do Fusarium solani phân bố rộng ở nhiều vùng trên thế giới, gây ra thiệt hại

hau hét các loại rau màu Trên các loại cây kí chủ khác nhau, Fusarium solani sẽ gây ra

12

các loại bệnh khác nhau Triệu chứng bệnh có thé thay đổi phan nao tùy theo giai đoạnsinh trưởng của cây và theo điều kiện môi trường khi bị nhiễm bệnh Các triệu chứng

bệnh phô biến trên hầu hết cây trồng là vàng lá, rụng lá và thối rễ

Bệnh héo dây, thối củ trên khoai lang do nam Fusarium solani gay ra, là loại mam

bệnh gây ảnh hưởng vừa ở giai đoạn sinh trưởng ở ngoài đồng và vừa ở giai đoạn tồn

trữ Ở giai đoạn đầu, dây và củ sẽ bị thối và mục, ở giai đoạn sau, củ thu hoạch sẽ bị thối

và hoại tử bên trong (Clark và ctv, 2013) Đặc biệt ở giai đoạn sinh trưởng ngoài đồng

ruộng, nắm Fusarium solani gây triệu chứng dây còi cọc, rễ kém phát triển và đôi màu,

từ đó cây không hấp thu chất dinh đưỡng làm lá bị héo và hóa vàng, cuối cùng gây chết

Ngoài ra, nắm bệnh còn gây hại trên củ với vết bệnh hình tròn có vòng đồng tâm màu

nâu nhạt và tối, mô bị nhiễm bệnh chuyên sang màu nâu, bên trong bị bệnh cho thấy cácton thương có thể kéo dài vào trung tâm của củ Vết bệnh phát triển trở nên khô và lõm

xuống, đôi khi có thé nhìn thấy sợi nam màu trang ở bên ngoài của vết bệnh (Scruggs

và Quesada-Ocampo, 2016).

Bệnh do nam Fusarium solani gây ra trên cây có mui, thường được gọi là bệnh thối

rễ khô, sẽ có các triệu chứng như: sức sống của cây giảm, màu lá xanh nhạt, lá đột ngộthéo, chết ngọn và héo khô trên cây Bệnh thường sẽ bắt đầu ở các rễ lớn và lạn rộng vàovùng ngọn, các vết hoặc khu vực lớn của vỏ trên phần dưới mặt đất âm sau đó mục nát

(Kunta và ctv, 2015).

Bệnh thối rũ hoặc thối rễ khô do nắm Fusarium solani, triệu chứng đầu tiên là lá thấphoặc lá vàng trên một cành duy nhất, sau đó thân và lá bắt đầu héo Nếu gọt hoặc táchmột thân trên cành, sẽ thấy mô mạch màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô cả đoạn thân

sát mặt đất, bộ rễ kém phát triển, rễ thối dần và chết đi (Debbarma và ctv, 2018)

2.3.6 Biện pháp phòng trừ bệnh do nam Fusarium solani

Biện pháp kỹ thuật, canh tác:

Làm đất: đất là nơi lưu tồn nhiều nắm bệnh khác nhau Do đó, đất trở thành nguồn dự

trữ, tích lũy và lây lan bệnh Khi cày bừa đất, đã làm thay đổi lý tính, cấu trúc, âm độ,nhiệt độ của dat từ đó thay đôi điều kiện sống va phát triển của mầm bệnh trong đất Khi

cày đất cần vùi mầm bệnh xuống sâu dưới đất làm cho mầm bệnh chết hoặc khó khăn

trong hoạt động gây hại cho cây Việc cày ải phơi đất trong một thời gian nhất định trong

năm có ảnh hưởng khá quan trọng đối với bệnh cây (Phạm Văn Kim và ctv, 2000)

13

Vệ sinh đồng ruộng chú ý diét cỏ dại Trồng với mật độ cây thích hợp cho từng giống

và từng vụ, nên trồng thưa vào đầu mùa mưa

Luân canh với các cây trồng it bị bệnh dé hạn chế nguồn bệnh và cải tạo đất Thu dọn

tan dư cây trồng sau thu hoạch Bon phân hợp ly: bón phân NPK day đủ, cân đối dé câysinh trưởng mạnh tăng cường sức chống bệnh, đặc biệt ở các vùng đất bạc màu cần bónvôi nhiều, dùng phân chuồng hoai mục để bón

Biện pháp hóa học:

Khi bệnh xuất hiện và phát triển có thé sử dụng một số thuốc BVTV có chứa hoạtchat dé phòng trị: Metalaxyl, Fosetyl-aluminum, Propamocarb, Pencycuron, Propineb

Biện pháp hóa hoc dé phòng trừ bệnh thường có hiệu quả thấp vì nắm bệnh tồn tai chủ

yêu trong đất, xâm nhiễm gây hại ở bộ phận rễ, cô rễ

Phòng trừ sinh học là biện pháp thay thế biện pháp hóa hoc trong phòng trừ bệnh câykhi sử dụng biện pháp hóa học không tối ưu Tiềm năng sử dụng vi sinh vật vùng rễ thaythế hoặc bổ sung vào hóa chất diệt nam đã được nhiều tác giả đề cập đến

2.4 Tình hình nghiên cứu về enzyme f-1,3-glucanase trong phòng trừ sinh học

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo nghiên cứu của Dinh Hồng Thai và Lê Minh Tường (2016), 05 chủng xạ khuẩn

CMI8, HG3, HG4, TG1 và BL6 được phân lập từ đất trồng sen ở một số tỉnh Đồng bằng

sông Cửu Long có khả năng đối kháng cao với nam Phytophthora sp gây bệnh cháy lá,thối thân trên cây sen Các chủng xạ khuẩn này có thé ức chế sự phát triển của hệ sợi

nam bang cách tiết ra enzyme B-1,3-glucanase, làm phá vỡ vách tế bào của nam gâybệnh Trong số 5 chủng xạ khuẩn, chủng CM18 có khả năng tiết enzyme B-1,3-glucanase

cao nhất, với bán kính vòng phân giải B-1,3-glucan là 10,81 mm Hiệu quả ức chế nambệnh trong phòng thí nghiệm đạt 89,89 % ở thời điểm 60 giờ sau nuôi cấy

Nghiên cứu mới nhất Đinh Thị Ngọc và Lê Minh Tường (2022) họ đã phát hiện ra 5chủng xạ khuân BM5-VL, CT12-HG, CB4-TG, BM7-VL và BM3-VL có khả năng đối

14

kháng lại nắm Phytopthora sp tác nhân gây bệnh nứt thân và xì mủ trên cây mít Tháisiêu sớm Đặc biệt, chủng xạ khuẩn CT12-HG thé hiện khả năng phân giải B-1,3-glucan

hiệu quả nhất với bán kính vòng phân giải là 14,5 mm

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

B-1,3-glucanase được tong hợp trong cây trồng giữ vai trò trong bảo vệ thực vật chốnglại tác nhân nam bệnh Hiện nay có nhiều nghiên cứu phân tích nam men và vách tế bào

nắm cũng như những ứng dụng sinh vật sản xuất B-1,3-glucanase hoạt động như một tác

nhân kiểm soát sinh học tiềm năng chống lại các loại nắm gây bệnh trong nông nghiệp(Gacto và ctv, 2000) Theo kết quả nghiên cứu của Gopalakrishnan và ctv (2011), 5chủng xạ khuẩn phân lập CAI - 24, CAI — 121, CAI - 127, KAI - 32 và KAI - 90 cókhả năng kháng bệnh cây trồng đều tiết B-1,3-glucanase

Kết quả nghiên cứu của Valois và ctv (1996) báo cáo rằng, chủng xạ khuẩn

Streptomyces sp EF14 được phân lập từ vùng rễ của khoai tây cho thấy hoạt động đối

kháng với bệnh thối rễ do nắm phytophthora fragariae var rubi Ching này có thê thủyphân cơ chất B-1,3, B-1,4 và B-1,6-glucan bằng cách tạo ra B-1,3-glucanase, B-1,4-glucanase và B-1,6-glucanase.

Ching Actinomyces rutgersensis 88 có khả năng sản xuất laminarinase (B-1,3),gentibiosinase (-1,6), licheninase (B-1,3; 1,4) và B-glucanase (B-1,3; 1,6), do đó được

khẳng định là ứng cử viên triển vọng cho hiệu quả trong việc chiết xuất B-glucan từthành tế bao nam men Saccharomyces cerevisiae (Javmen và ctv, 2012)

Sreevidya va ctv (2016), nghiên cứu nhận thay rang 4 chủng xạ khuẩn SAI — 13, VAI

—7 va VAI — 40 đối kháng với nắm bệnh trên đậu (chickpea) có khả năng sản xuất

B-1,3-glucanase, lipase, protease va chitinase (trừ VAI — 40).

15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2023, tại phòng Sinh học tích hợp

thực vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mười một chủng xạ khuẩn Streptomyces sp va nam Fusarium solani được cung cấp

từ phòng Sinh học Tích hợp Thực vật, thuộc Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại họcNông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Bang 3.1 Đặc điểm hình thái của 11 chủng xạ khuẩn sau 7 ngày trên Gause I

STT Ký hiệu Đặc điểm hình thái Hình ảnh đại thể

Khuẩn lạc có màu nâu trắng, tròn và có

1 BT2 dang phong xa Khuan ty co chat mau

trang nga.

Khuẩn lạc có màu nâu xám, tròn bờ

2 BT3 nhan dang phong xa Khuan ty co chat

có mau trăng nga.

Khuan lạc có mau nâu xám, tron, dang

3 BT6 phóng xạ Khuan ty co chat có màu nâu

vàng

16

Khuan lạc có màu nâu trang, tâm trang,

tròn dạng phóng xạ Khuân ty cơ chât

có màu trăng ngà.

Khuân lạc có màu trăng xám, tròn xù Khuan ty cơ chat màu vàng.

Khuẩn lạc có màu trắng ngà to, tâm

trăng ngà, dạng phóng xạ Khuân ty cơ

chat có màu trang ngà

Khuan lac mau trang, tròn, dang phóng

xạ Khuan ty co chất có mau trăng ngà.

Khuân lạc có màu nâu xám, tròn đêu, dạng phóng xạ Khuân ty cơ chât có

màu tím hoặc trắng.

Khuẩn lạc có màu trắng, tâm trắng ngà,

dạng phóng xạ, Khuẩn ty cơ chất màu

vàng nâu.

17

Khuẩn lạc màu trắng, tâm trắng ngà

10 BT16 tròn to, dạng phóng xạ Khuân ty cơ

chât màu trăng ngà

Khuan lac mau trang, tron, dang phong

11 PB0I xạ Khuân ty cơ chât có màu cam và

nhạt về phía ria.

3.2.2 Hóa chất, trang thiết bị và dụng cụ

Môi trường Gause I (g/L): Tinh bột tan 20 g; MgSO4.7H20 0,5 g; NaCl 0,5 g; K›HPOa0,5 g; KNO3 0,5 g; FeSO4.7H20 0,01 g; agar 20 g; nước cất đủ 1 lít; pH 7,0

Môi trường Gause I long (g/L): Tinh bột tan 20 g; MgSOa.7H›O 0,5 g; NaCl 0,5 g;K;HPO¿ 0,5 g; KNO3 0,5 g; FeSO4.7H20 0,01 g; nước cất đủ 1 lít; pH 7,0

Môi trường MSF (Mannitol — Soya flour) (g/L): Bột đậu nành 20 g; D — mannitol 20

ø; agar 20 g; nước cất đủ 1 lít; pH 7,0

Môi trường Czapek — dox (g/L): Sucrose 30 g; KaHPO¿ 1,5 g; KCI 0,5 g; NaNOa 3,5

g; MgSO4.7H20 0,5 g; FeSO4.7H20 0,1 g; nước cất vừa đủ 1 lít; pH 7,0

Môi trường PDA (g/L): Khoai tây 200 g thu lay dịch; D-glucose 20 g; agar 20 g

Hóa chat dùng trong định tinh enzyme f -1,3 - glucanase: Laminarin 1 % trong Vacci

plant của công ty Arysta (laminarin 4,5 %); thuốc nhuộm Congo red 0,6 %; NaCl 1M.Hóa chat dùng trong định lượng enzyme — 1,3 - glucanase: Laminarin 0,5% và 2 %trong Vacci plant của công ty Arysta (laminarin 4,5%); thuốc nhuộm DNS

Các thiết bi dùng trong thí nghiệm bao gồm: cân kỹ thuật, nồi hấp tiệt trùng autoclave,

máy vortex, máy ly tâm, máy lắc, tủ cấy, tủ lạnh, lò vi sóng, bề ồn nhiệt, máy đo quang

phô UV — Vis

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu

3.2.3.1 Khảo sát khả năng phân giải — 1,3 -glucan của các chủng xạ khuẩn

Mục tiêu: Khảo sát sơ bộ kha năng phân giải B - 1,3 - glucan của 11 chủng xạ khuẩn

18

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại, mỗinghiệm thức là một chủng xạ khuẩn Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của

Renwick va ctv (1991) có cải tiến nhằm làm cải thiện khả năng quan sát vòng hallo bằngdung dich muối NaCl 1M (Ngô Thanh Phong va ctv, 2021)

Cac bước thực hiện:

Bước 1: Chuan bi xạ khuẩn, mười một chủng xạ khuẩn thi nghiệm được nuôi lắc môi

trường Gause I lỏng trong 7 ngày, ở điều kiện nhiệt độ 30°C với tốc độ 100 vòng/phút.Sau đó, đo OD ở bước sóng 610 nm xác định mật số và chuyển về mật số cần dùng là

10° CFU/mL (giá tri OD =1).

Bước 2: Tiến hành thí nghiệm, dùng kẹp gỗ chuyên dung cho các khoanh giấy tham

có đường kính 5 mm vào dung dịch huyền phù xạ khuẩn, phơi giấy thấm trên miệng

thành ống nghiệm khoảng 1 phút Sau đó, đặt các khoanh giấy thâm lên trên dia petri có

chứa khoảng 10 mL môi trường MSF chứa I % laminarin Các dia petri thí nghiệm được

đặc ở điều kiện nhiệt độ phòng Xác định khả năng phân giải — glucan ở từng thờiđiểm ghi nhận chỉ tiêu bằng cách tráng dung dịch Congo red 0,6% lên đĩa thạch, đỗ bỏphần dung dịch Congo red thừa và tráng bề mặt với nước cất thanh trùng, sau đó tiếp

tục rửa bang dung dịch muối NaCl 1M Vòng phân giải B-1,3-glucan được quan xácdưới ánh đèn.

Bước 3: Ghi nhận chỉ tiêu, đo bán kính vùng không bắt màu thuốc nhuộm Congo red

là vòng phân giải glucan ở các thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau bố trí thí nghiệm

3.2.3.2 Xác định hoạt độ enzyme f - 1,3 — glucanase do các chủng xạ khuẩn tiết raMục tiêu: Xác định hàm lượng enzyme f - 1,3 — glucanase do các chủng xạ khuẩnsinh ra.

Phương pháp bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4lần lặp lại Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Renwick va ctv (1991)

Cách thực hiện:

Bước 1: Chuẩn bị hóa chất, chuẩn bị dung dịch cơ chất laminarin 2 % pha trong đệm

sodium acetate 0,2 M pH 5,4; chuẩn bị dung dich NaOH 1 N cân 20 g NaOH pha trong

500 mL nước cất; chuan bị dung dich 2-hydroxy—3,5—dinitrobenzoic (DNS) cân 10 gDNS cho vào, bổ sung thêm 300 mL nước cất, khuấy đều Thêm từ từ 400 mL dung dịch

NaOH 1 N vào và khuấy đều ở nhiệt độ khoảng 50°C Thêm 300 g sodium potassiumtartrate vào dung dịch trên, tiếp tục khuấy đều, dé nguội về nhiệt độ phòng, thêm nước

19