Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan gấm (anoectochilus setaceus blume)

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án Trước hết xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học Mơi Trường niềm kính trọng, tự hào học tập trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang Th.s Nguyễn Trọng Lực – Trưởng phịng Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên tận tình hướng dẫn động viên tơi suốt q trình thực đồ án tốt nghiệp Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ của: thầy cô giáo Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang anh chị Trung Tâm Ứng Dụng Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đồ án Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiên, động viên, khích lệ để tơi vượt qua khó khăn q trình học tập vừa qua Nha trang, ngày tháng năm 2012 Sinh viên thực Nguyễn Thị Huỳnh Uyên LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.2 Đặc điểm nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 1.1.2.1 Tính tồn tế bào 1.1.2.2 Khả biệt hóa phản biệt hóa tế bào 1.1.2.3 Sự trẻ hoá 1.1.3 Ưu điểm phương pháp nuôi cấy mô TBTV 1.1.4 Nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô TBTV .6 1.1.5 Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV 1.1.5.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 1.1.5.2 Nuôi cấy mô sẹo .7 1.1.5.3 Nuôi cấy bao phấn túi phấn 1.1.5.4 Nuôi cấy protoplast .9 1.1.5.5 Nuôi cấy mô quan tách rời .9 1.1.5.6 Nuôi cấy tế bào đơn 10 1.1.6 Môi trường nuôi cấy mô TBTV 10 1.1.6.1 Khoáng đa lượng 11 1.1.6.2 Khoáng vi lượng 12 1.1.6.3 Nguồn cacbon 12 1.1.6.4 Các vitamin .13 1.1.6.5 Amino acid nguồn cung cấp nitrogen khác 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ii 1.1.6.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 14 1.1.7 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 18 1.1.7.1 Giai đoạn chuẩn bị 18 1.1.7.2 Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy 18 1.1.7.3 Giai đoạn nhân nhanh .19 1.1.7.4 Giai đoạn tạo hoàn chỉnh 19 1.1.7.5 Giai đoạn đưa mơ ngồi vườn ươm 20 1.1.8 Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV 20 1.1.8.1 Điều kiện vô trùng .20 1.1.8.2 Ánh sáng nhiệt độ 22 1.1.8.3 pH môi trường 23 1.2 Giới thiệu lan gấm 23 1.2.1 Phân loại thực vật 23 1.2.2 Đăc điểm thực vật 24 1.2.3 Sự phân bố 26 1.2.4 Tính dược liệu cơng dụng 26 1.2.5 Tình hình nghiên cứu lan gấm 27 CHƢƠNG VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.3 Điều kiện nuôi cấy 28 2.2 Nội dung nghiên cứu .29 2.3 Địa điểm thực thí nghiệm nghiên cứu 30 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .30 2.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30 2.4.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu lan Gấm 30 2.4.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả tái sinh chồi .32 2.4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khoáng đến khả nhân nhanh chồi 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii 2.4.1.4 Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi 33 2.4.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả nhân nhanh 35 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm 37 3.1.1 Khử trùng Javen 37 3.1.2 Khử trùng chlorine 39 3.1.3 Khử trùng kết hợp Javen Chlorin .40 3.2 Tái sinh chồi 42 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng mơi trƣờng khống thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm 45 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh thể chồi 46 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi .47 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến khả nhân nhanh chồi .49 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng TDZ đến khả nhân nhanh chồi 50 3.5 Khảo sát trình nhân nhanh 53 3.6 Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm .55 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Kiến nghị .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Công thức khử trùng mẫu 31 Bảng 2.2 Ảnh hưởng môi trường khoáng đến khả nhân nhanh chồi vật liệu nuôi cấy 33 Bảng 2.3 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi 34 Bảng 2.4 Ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến khả nhân nhanh chồi 34 Bảng 2.5 Ảnh hưởng nồng độ TDZ đến khả nhân nhanh chồi .35 Bảng 2.6: Khảo sát trình nhân nhanh 36 Bảng 3.1 Hiệu khử trùng với chất khử trùng Javen 37 Bảng 3.2 Hiệu khử trùng với chất khử trùng Chlorine 39 Bảng 3.3 Hiệu khử trùng với kết hợp Javen Chlorine 40 Bảng 3.4 So sánh hiệu khử trùng với chất khử trùng khác 41 Bảng 3.5 Khả tái sinh chồi mẫu cấy .42 Bảng 3.6 Ảnh hưởng mơi trường khống thích hợp nhân nhanh lan gấm 45 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi 47 Bảng 3.8 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi 49 Bảng 3.9: Ảnh hưởng TDZ đến khả nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51 Bảng 3.10 Khảo sát trình nhân nhanh .53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume 25 Hình 3.1 Biểu đồ hiệu khử trùng với chất khử trùng khác 41 Hình 3.2 Mẫu sau khử trùng 42 Hình 3.3 Sự tái sinh chồi 44 Hình 3.4 Sự phát triển hình thái chồi mơi trường khống 46 Hình 3.5 Sự phát triển hình thái chồi với nồng độ BA khác 48 Hình 3.6 Sự phát triển chồi với nồng độ Kinetin khác .50 Hình 3.7 Sự phát triển chồi với nồng độ TDZ khác 52 Hình 3.8 Khảo sát trình nhân nhanh 54 Hình 3.9 Khảo sát trình nhân nhanh protocorm 55 Hình 3.10 Quy trình nhân nhanh lan gấm .56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT TBTV : Tế bào thực vật DNA : Deoxyribonucleotic acid RNA : Ribonucleotic acid MS :Murashige&Skoog VW :Vaccine Went KC :Kundson C LS : Linsmainer Skoog ATP : Adenosine triphosphate GA3 : Acid ascorbic ĐTD : Đơn tử diệp STD : Sông tử diệp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI MỞ ĐẦU Thế kỉ 21 coi kỷ phát triển công nghệ sinh học dược liệu tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo Nắm được, phát huy tài nguyên di truyền nắm kinh tế, nắm tương lai Dùng mạnh dược liệu đẩy tộc.Từ lâu, người phương đông tôn hoa Lan “ vương giả chi hoa” người phương tây tôn hoa Lan “ nữ hoàng loài hoa” Hoa Lan chinh phục người phương Đông người phươngTây không cấu trúc kì diệu đa dạng màu sắc, hình dáng hương thơm quyến rũ mà cịn bỡi giá trị làm thuốc Từ xưa, người ta tiến hành nhân giống loài Lan nhiều phương pháp khác gieo hạt, tách mầm phương pháp nhiều nhược điểm thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều hệ, khả lây truyền bệnh cao, chất lượng khơng đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ , Hơn nữa, hạt lan lại nhỏ, có phơi; nảy mầm cần có mặt nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm tự nhiên thấp Để khắc phục nhược điểm này, người ta tiến hành nhân giống phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, tạo với số lượng lớn đồng kiểu hình, chất lượng đảm bảo, bệnh, giá thành phù hợp không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết Nhờ đáp ứng nhu cầu khơng ngừng tăng lên thị trường Đây điều mà phương pháp truyền thống khơng thực Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, lồi lan gấm Anoectochilus setaceus Blume biết đến nhiều không giá trị làm cảnh hoa đẹp mà cịn giá trị làm thuốc Theo tài liệu y học giới, lan gấm loài thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phịng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thơng, chữa bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn người ta phát khả phòng chống ung thư loại thảo dược Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus Blume loại thảo dược có giá trị có tiềm lớn.Tuy nhiên, Việt Nam số lượng loài tự nhiên phát cịn mà lại bị thu hái với số lượng lớn để bán làm thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) loài lan bị đe doạ mạnh đứng trước nguy tuyệt chủng khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan Gấm xếp nhóm IA Nghị định 32/2006/CP; nhóm thực vật nguy cấp EN A1a, c, d Sách Đỏ Việt Nam 2007 Xuất phát từ vấn đề trên, cho phép Bộ môn Công nghệ sinh học- Viện công nghệ sinh học môi trường - trường Đại học Nha Trang, tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ” tìm điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật thuật ngữ dùng cách rộng rãi để nói việc mô tả phương thức nuôi cấy phận thực vật (tế bào đơn, mô, quan) ống nghiệm có chứa mơi trường xác định điều kiện vơ trùng [3] Mục đích chung ni cấy mô tế bào thực vật sử dụng điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng phát triển tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu yêu cầu đặt Nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp nghiên cứu hiệu q trình phát sinh hình thái nhiều lồi thực vật Phương pháp giúp mở hướng nghiên cứu sinh lý di truyền thực vật như: chế sinh tổng hợp chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng tế bào thực vật nhiều vấn đề sinh học khác… Tất dạng nuôi cấy mô tiến hành qua hai bước: - Các phần thực vật quan thực vật tách khỏi phần cịn lại Đó tách rời tế bào, mô hay quan tương tác lẫn tổ chức thực vật nguyên vẹn - Các phần tách nói phải đặt mơi trường thích hợp để biểu lộ hết chất khả đáp ứng nó.[3] 1.1.2 Đặc điểm nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 1.1.2.1 Tính tồn tế bào Mỗi tế bào mang đầy đủ lượng thông tin di truyền thể có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đặt móng cho ni cấy mơ tế bào thực vật Ơng đưa giả thuyết tính tồn tế bào sách "Thực nghiệm nuôi cấy tách rời" Theo ông: “Tế bào LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Kinetin (6-furfurylaminopurine-C10H9N5O) cytokinin tổng hợp sử dụng chủ yếu kỷ thuật ni cấy mơ Chức kinetin kích thích hình thành chồi, cải thiện chất lượng chồi, kích thích chồi khơng kìm hãm sinh trưởng chồi phụ Trong phạm vi nghiên cứu này, khảo sát kinetin nồng độ 0.0mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 1.5mg/l; 2.0mg/l để đánh giá hệ số nhân nhanh chồi Kết khảo sát thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Nồng độ Số kinetin (mg/l) chồi/mẫu NT1 (Đ/C) NT2 Nghiệm thức Số đốt/chồi Đặc điểm chồi + 0.5 ++ NT3 +++ NT4 1.5 ++ NT5 2 + Chú thích: + + +: Tốt (chồi phát triển mạnh, to, xanh đậm) + + : Trung bình (chồi nhỏ, nhỏ k có, màu xanh nhạt) + : Yếu (chồi nhỏ, nhỏ, màu xanh) Từ bảng 3.8 cho thấy: - Khi môi trường không bổ sung kinetin phát triển chồi, có diện Kinetin số lượng chồi tăng lên đáng kể số đốt/chồi tăng lên - Số lượng chồi thay đổi theo nồng độ kintine Tại nồng độ 0.5mg/l Kinetin số lượng chồi tạo 04 chồi/mẫu, tăng nồng độ kinetin mg/l số lượng chồi/mẫu tăng lên gấp đơi (8 chồi/mẫu) mẫu có xuất số LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 chồi dạng protocorm có màu trắng Tuy nhiên, tăng nồng độ kinitine lên 1.5 mg/l 2.0 mg/l số lượng chồi chất lượng chồi giảm đáng kể Như vậy, nồng độ kinitine 1mg/l cho kết số chồi nhiều đạt chồi/mẫu  Kết luận: sử dụng kinitin chất điều hoà sinh trưởng để nhân nhanh chồi nồng độ tối ưu mg/l, tạo số lượng chồi chồi/mẫu a b c d Hình 3.6 Sự phát triển chồi với nồng độ Kinetin khác (a) Bổ sung 0,5mg/l Kinetin (c) Bổ sung 1,5mg/l Kinetin (b) Bổ sung 1mg/l Kinetin (d) Bổ sung 2mg/l Kinetin 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng TDZ đến khả nhân nhanh chồi TDZ – thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5’-ylurea), công bố lần chất có khả làm rụng gịn, dẫn xuất urea có hoạt tính tương tự cytokinin (Eapen cs, 1998; Mok cs, 1982), cảm ứng tăng sinh chồi, tái sinh chồi bất định từ mô số loài thân gỗ cảm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 ứng cho trình phát sinh phôi Các nhà khoa học cho TDZ kích thích q trình chuyển đổi dạng nucleotide cytokinin sang dạng nucleoside có hoạt tính sinh học cao kích thích tích lũy cytokinin nội sinh dạng purin (Thomas cs,1986) Theo Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), TDZ dễ kháng với cytokinin adenine Trong nuôi cấy mô TDZ sử dụng hay kết hợp với NAA cảm ứng phát sinh quan hay phát sinh phôi (Babaoglu cs, 2000; Lu Chin-Yi, 1993; Hosokawa cs, 1998; Magioli cs, 1998) TDZ có chức cytokinin Các sinh trắc nghiệm thực nhận thấy TDZ có ảnh hưởng gấp lần cytokinin Ở nồng độ thấp, TDZ cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp từ mô Ở nồng độ cao, TDZ cảm ứng hình thành sẹo cấu trúc bất thường Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát ảnh hưởng TDZ nồng độ 0.0mg/l; 0.1mg/l; 0.2mg/l; 0.4mg/l; 0.6mg/l Kết khảo sát sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.9 Bảng 3.9: Ảnh hưởng TDZ đến khả nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/l) Số chồi /mẫu Số đốt/ mẫu Đặc điểm chồi NT1 (Đ/C) Chồi xanh NT2 0.1 Chôi trắng, chồi xanh Chồi màu vàng xanh, có xuất protocorm NT3 0.2 10 NT4 0.4 Cụm chồi NT5 0.6 Cụm chồi Cụm chồi màu xanh, protocorm Có tạo mơ sẹo, chồi màu xanh Qua bảng 3.9 cho thấy: - Khi khơng có chất kích thích sinh trưởng số chồi tạo chồi, mơi trường có bổ sung tăng nồng độ TDZ chiều hướng phát sinh hình thái chồi có thay đổi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 - Tại nồng độ 0.1 mg/l 0.2 mg/l TDZ, chồi phát triển mạnh tăng dần từ chồi lên đến 10 chồi Đồng thời, nồng độ 0.2 mg/l TDZ nhiều chồi mà cịn có chồi phát triển theo kiểu dạng protocorm Khi tăng nồng độ TDZ lên 0.4 - 0.6 mg/l, thấy xuất hiện tượng tạo cụm chồi (Hình 3.7 c d) có khuynh hướng xuất mơ sẹo nồng độ 0.6 mg/l TDZ - Tuỳ mục đích việc nhân nhanh dạng chồi, protocorm, mô sẹo mà chọn nồng độ thích hợp Để chọn vật liệu nhân nhanh chồi chọn nồng độ 0.2 mg/l; vật liệu nhân nhanh protocorm chọn nồng độ 0.4 mg/l Vấn đề tạo mô sẹo nhân nhanh mô sẹo cần có hướng nghiên cứu sâu Đây vấn đề phát trình nhân giống lan gấm  Kết luận: Khi sử dụng TDZ nồng độ khác có phát sinh hình thái chồi khác Tại nồng độ 0,4 mg/l khả tạo protocorm cao a b c d Hình 3.7 Sự phát triển chồi với nồng độ TDZ khác (a) Môi trường có 0,1mg/l TDZ (c) Mơi trường có 0,4mg/l TDZ (b) Mơi trường có 0,2mg/l TDZ (d) Mơi trường có 0.6mg/l TDZ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 53 3.5 Khảo sát trình nhân nhanh Quá trình nhân nhanh chồi giai đoạn tăng hệ số nhân, tạo số lượng giống nhiều nhằm hạ giá thành sản xuất Hệ số nhân nhanh tuỳ thuộc vào nồng độ chất kích thích sinh trưởng mơi trường thích hợp Theo kết nghiên cứu thí nghiệm cho thấy: nồng độ 1.5 mg/l BA; nồng độ mg/l kinitine; nồng độ 0.4 mg/l TDZ cho hệ số nhân chồi cao Tuy nhiên, tổ hợp nồng độ chất điều hoà sinh trưởng tối ưu khả tạo hệ số nhân nhanh cao sử dụng đơn lẻ Chính vậy, thí nghiệm chúng tơi nghiên cứu vấn đề Kết nghiên cứu thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Khảo sát trình nhân nhanh Nghiệm Chồi Protocorm Đặc điểm chồi Chồi vàng, xanh thức Số chồi/mẫu Số đốt/mẫu NT1 NT2 NT3 2 Chồi vàng, trắng NT4 1 15 Chồi trắng Chồi xanh, to khỏe Qua bảng 3.10 ta thấy: - Khi kết hợp BA TDZ; kinitine TDZ; BA, kinitine TDZ kết cho loại hình thái chồi: chồi protocorm Số lượng protocorm cao dạng chồi chất lượng protocorm tốt - Khi kết hợp BA kinitine kết thu đuợc 01 dạng chồi với số lượng 08 chồi số đốt/chồi 03 đốt Kết nghiên cứu cao dùng 1.5 mg/l BA (7 chồi đốt/chồi); mg/l kinitine (8 chồi 02 đốt/chồi) chất lượng chồi tốt dùng chất điều hoà sinh trưởng riêng rẻ Như vậy, BA kinitien có tác dụng hỗ trợ giúp tạo nhiều chồi hơn, số đốt/chồi cao chiều dài lóng/đốt kéo dài (Hình 3.8.b) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 54 Hình 3.8 Khảo sát trình nhân nhanh (a) Mơi trường có BA+TDZ (c) Mơi trường có kinetin+TDZ (b) Mơi trường có BA+kinetine (d) Mơi trường có BA+TDZ+ kinetin - Khi kết hợp BA, kinitin TDZ kết tạo nhiều protocorm nhất, đạt 15 protocorm/mẫu chất lượng tốt dùng dạng TDZ riêng lẻ Kết mở hướng nhân nhanh lan gấm thông qua nhân nhanh protocorm Đây hướng nhân nhanh thường áp dụng phổ biến cho loại lan Do thời gian thực đề tài ngắn nên phạm vi nghiên cứu tiến hành khảo sát nhân nhanh protocorm mơi trường Knudson C có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng 1.5 mg/l BA+1 mg/l kinitine + 0.4 mg/l TDZ, kết quan sát sau tuần nuôi cấy số lượng protocorm tạo 25-30 protocorm/cụm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 55 chồi Tiếp tục thử nghiệm chuyển protocorm sang mơi trường Knudson C có bổ sung 1.5 mg/l BA + 0.2 mg/l NAA, kết sau tuần ni cấy mẫu chuyển thành chồi (hình 3.9) Hình 3.9 Khảo sát trình nhân nhanh protocorm  Kết luận: kết hợp BA kinitine cho số lượng chồi cao chồi với 03 đốt/chồi nên tạo đuợc hệ số nhân 24 lần Khi kết hợp BA + kinitine + TDZ khả nhân chồi dạng protocorm cao, với hệ số nhân 25-30 lần 3.6 Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm Thời gian nghiên cứu diễn thời gian 04 tháng tương đối ngắn nên vấn đề nghiên cứu liên quan chưa đuợc nghiên cứu hết Vì vậy, phạm vi kết nghiên cứu đạt được, chúng tơi đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm sau: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 56 Cây lan gấm - Khử trùng Javen (2:1) 10 phút + Chlorine 5% phút - Môi trường: Knudson C Vô mẫu thành công KC + 0.3 mg/l kinitine Tái sinh chồi KC + mg/l kinitine + 1.5 mg/l BA Nhân nhanh chồi KC + 0.3 mg/l kinitine + 0.3 mg/l BA + 0,1 mg/l TDZ Tái sinh protocorm KC + mg/l kinitine + 1.5 mg/l BA + 0,4 mg/l TDZ Nhân nhanh protocrm Hình 3.10 Quy trình nhân nhanh lan gấm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 57 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, chúng tơi có kết luận kỹ thuật nhân nhanh sau: Khử trùng mẫu dung dịch Javen (2:1) 10 phút sau khử chlorine 5% phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao 50% tỷ lệ mẫu nhiễm đạt 33,33% Mơi trường thích hợp để nhân nhanh lan gấm môi trường Knudson C Với nồng độ 0.3 mg/l kinetin cho khả tái sinh chồi lan Gấm cao (5 chồi/mẫu) Tại nồng độ 0.3 mg/l BA+0.3 mg/l kinitine+0.1 mg/l TDZ tái sinh chồi dạng protocorm Nồng độ thích hợp nhân nhanh chồi lan Gấm 1.5 mg/l BA + mg/l kinitine Nồng độ thích hợp nhân nhanh protocorm lan gấm 1.5 mg/l BA + mg/l kinitine + 0.4 mg/l TDZ 4.2 Kiến nghị Bên cạnh kết đạt trình bày Để hồn thiện quy trình nhân giống lan gấm, đề nghị tiếp tục nghiên cứu số hướng sau: Cần tiếp tục khảo sát q trình vơ mẫu sử dụng vật liệu vơ mẫu thân ngầm, gieo hạt Khảo sát nồng độ chất điều hoà sinh trưởng để tái sinh chồi theo hướng tạo mô sẹo protocorm Khảo sát trình nhân nhanh với vật liệu Protocorm Nghiên cứu tạo hoàn chỉnh Huấn luyện đưa đồng ruộng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Thị Phương Thảo(2009), Cơ sở công nghệ sinh học – tập ba công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục Việt Nam Dương Cơng Kiên (2006), Giáo trình ni cấy mô – Tập 1-2-3 Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng (2006), Cơng nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh PGS – TSKH Lê Văn Hồng, Giáo trình cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật TS Dương Tấn Nhựt (2007) , Công nghệ sinh học thực vật tập 1, NXB Nơng Nghiệp , Tp Hồ Chí Minh Hồ Ngọc Văn (2007), “Nghiên cứu quy trình nhân giống invitro lan hài hồng (paphiophidium delenatii) đặc hữu quý Việt Nam” Luận văn tốt nghiệp Đại hoc Nha Trang Luận văn :“Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật nhângiống in vitro loài lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)” Bộ môn Giống& Công nghệ sinh học- khoa Lâm Học- trường Đại học Lâm Nghiệp Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 26 (2010) 248-253, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In Vitro loài Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii - Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 26 (2010) 104-109, Đặc điểm hình thái, phân bố lồi lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus blume Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc 10 Trần Văn Minh (1997), Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh học cơng nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới, Trung tâm Khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 59 11 Nguyễn Công Nghiệp(1985), Trồng hoa lan, Nhà xuất trẻ 12 Lê Hồng Thủy Tiên(2006), Luận văn Khảo sát hoa ống nghiệm dừa cạn (catharanthus roseus) dã yên thảo (Petunia hybrida), Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tài liệu Tiếng anh 13 Roberts H Smith (1992), plant tissue culture – Techniques and Experiments, Academic press, Inc, The United States of America 14 Dr Oradee Sahavacharin (1996), Tissue culture micropropagation technology, Department of Horiticulture, Facutly of Agriculture, Kasetsart University 15 George SA, Bilsland DJ, Wainwright NJ, Ferguson J Failure of coconut oil to accelerate psoriasis clearance in narrow-band UVB phototherapy or photochemotherapy Photobiology Unit, Ninewells Hospital and Medical School, Dundee, Scotland, U.K 1993 Tài liệu Internet 16 http://thuviensinhhoc.com/component/content/article/594.html?joscclean=1 &comment_id=3099 17 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/cay-lan-gam.569480.html LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Các thành phần môi trường MS ( Murashige & shoog, 1962) MS Khoáng đa lượng Phosphats Khống vi lượng Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) Kali nitrat (KNO3) 1900 Amoni nitrat ( NH4NO3) 1650 Canxi clorua ( CaCl2) 440 Magiê sunphat (MgSO4 7H2O) 370 Kali monophosphat (KH2PO4) 170 Boric acid (H3PO3) 6,2 Mangan sunphat 22.3 (MnSO4.7H2O) Khoáng vi lượng Khoáng vi lượng Kẽm sunphat (ZnSO4.7H2O) 8,6 Kali iốt (KI) 0,83 Natri molypdat (Na2Mo4.H2O) 0,25 Đồng sunphat 0,025 (CuSO4.5H2O) Coban sunphat 0,025 (CoCl2.6H2O) Sắt EDTA Na2-EDTA 37,3 Sắt sunphat 27,8 (FeSO4.7H2O) Vitamin Glycine 2,0 Nicotinic acid 0,5 Piridoxin – HCl (B6) 0,5 Thiamin – HCl (B1) 0,1 Myo – inositol 100 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Thành phần môi trường VW (Vacin & Went) VW Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) Khống đa lượng Kali nitat(KNO3) 525 Amoni sunphat ((NH4)2SO4) 500 Canxi photphat ( Ca3(PO4)2) 200 Magiê sunphat (MgSO4.7H2O) 250 Kali monophosphat 250 Phosphate (KH2PO4) Khoáng vi lượng Boric acid (H3PO3) 10 Mangan sunphat (MnSO4.7H2O) 19 Kẽm sunphat 10 (ZnSO4.7H2O) Khoáng vi lượng Kali iốt(KI) 0,83 Natri molypdat 0,25 (Na2Mo4.H2O) Vi lượng Đồng sunphat 0,025 (CuSO4.5H2O) Coban sunphat 0,025 (CoCl2.6H2O) Sắt EDTA Vitamin Na2-EDTA 37,3 Sắt tatrate 27,8 Thiamin – HCl (B1) 0,4 Myo – inositol 100 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Thành phần mơi trường KundSon C KundSon C Khống đa lượng Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) Canxi nitat ((CaNO3)2) 1000 Amoni sunphat 500 ((NH4)2SO4) Magiê sunphat 250 (MgSO4.7H2O) Kali monophosphat 250 (KH2PO4) Sắt II sunphat Khoáng vi lượng Vitamin 25 ( FeSO4.7H2O) Mangan sunphat (MnSO4.7H2O) Thiamin – HCl (B1) 25 0,4 Myo – inositol 100 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Các thành phần môi trường 1/2 MS ( Murashige & shoog, 1962) MS Khoáng đa lượng Phosphats Khoáng vi lượng Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) Kali nitrat (KNO3) 800 Amoni nitrat ( NH4NO3) 825 Canxi clorua ( CaCl2) 220 Magiê sunphat (MgSO4 7H2O) 185 Kali monophosphat (KH2PO4) 185 Boric acid (H3PO3) 6,2 Mangan sunphat 22.3 (MnSO4.7H2O) Khoáng vi lượng Khoáng vi lượng Kẽm sunphat (ZnSO4.7H2O) 8,6 Kali iốt (KI) 0,83 Natri molypdat (Na2Mo4.H2O) 0,25 Đồng sunphat 0,025 (CuSO4.5H2O) Coban sunphat 0,025 (CoCl2.6H2O) Sắt EDTA Na2-EDTA 37,3 Sắt sunphat 27,8 (FeSO4.7H2O) Vitamin Glycine 2,0 Nicotinic acid 0,5 Piridoxin – HCl (B6) 0,5 Thiamin – HCl (B1) 0,1 Myo – inositol 100 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... học Nha Trang, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ” tìm điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực... để nhân nhanh chồi lan gấm 45 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh thể chồi 46 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi. .. luanvanchat@agmail.com 28 CHƢƠNG VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu đề tài lan gấm (Anoectochilus setaceus Blume) Trung tâm ứng dụng chuyển giao