Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát một số dung môi phục vụ việc định tính lovastatin và khảo sát hệ gene sinh tổng hợp lovastatin có trong một số chủng nấm bào ngư xám (Pleurotus ostreatus)

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành dé tìm được loại dung môi cho hiệu quả chiết xuất hợpchất lovastatin tối ưu nhất bằng phương pháp chiết Soxhlet, phương pháp sắc ký UPLC-MS/MS và phát hi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

-KHOA -KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO SÁT MỘT SÓ DUNG MÔI PHỤC VỤ VIỆC ĐỊNH TÍNH LOVASTATIN VÀ KHẢO SÁT HỆ GENE SINH TONG HỢP LOVASTATIN CÓ TRONG MỘT SO CHUNG NAM BAO NGƯ XÁM (Pleurotus ostreatus)

Nganh hoc : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ ÁNH TRÚC

Mã số sinh viên : 19126205

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thu Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SÓ DUNG MÔI PHỤC VỤ VIỆC ĐỊNH TÍNH LOVASTATIN VÀ KHẢO SÁT HỆ GENE SINH TỎNG HỢP LOVASTATIN CÓ TRONG MỘT SỐ CHUNG NAM BAO NGƯ XÁM (Pleurotus ostreatus)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiệnThS LÂM VỸ NGUYÊN VÕ THỊ ÁNH TRÚC

TP Thú Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp, em đã học hỏi nhiều kiến

thức chuyên môn, kỹ năng bổ ích, thiết thực từ quý Thay, Cô và bạn bè Em xin gửi lời

cảm ơn đến:

Các Thay, Cô trường Đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh, đặc biệt là quýThầy Cô của khoa Khoa học Sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức và kinhnghiệm cho em trong suốt quá trình học tập ở giảng đường Dai hoc

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Lâm Vỹ Nguyên đã trực tiếp hướng dẫn em hoànthành dé tài này Trong quá trình thực hiện luận văn, Thay luôn tận tinh chỉ dạy, giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thê hoàn thành tốt luận văn trong thời gian

quy định.

Em xin cảm ơn ThS Võ Thị Minh Thảo — Trung tâm Công nghệ Sinh học đã giúp

đỡ, hướng dẫn em cách sử dụng, vận hành các thiết bị trong phòng thí nghiệm và luônquan tâm, chi bảo cho em biết được em làm sai ở đâu và hướng dẫn dé em khắc phục

lại.

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba, mẹ và gia đình đã tận tụy chăm

lo, động viên, khích lệ và là chỗ dựa tinh thần, vật chất giúp con vượt qua khó khăntrong suốt quá trình học tập

Em xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Võ Thị Ánh Trúc, MSSV: 19126205, Lớp: DH19SHB thuộc ngành Công nghệSinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luậntốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu

là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội

đồng về những cam kết này

Tp Hô Chí Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành dé tìm được loại dung môi cho hiệu quả chiết xuất hợpchất lovastatin tối ưu nhất bằng phương pháp chiết Soxhlet, phương pháp sắc ký UPLC-MS/MS và phát hiện được hệ gene sinh tổng hop lovastatin có trong các chủng nắm bàongư xám (Pleurotus ostreatus) bằng phương pháp PCR Nghiên cứu đã khảo sát trên 3loại dung môi gồm: acetonitrile, ethyl acetate và methanol Kết quả khảo sát đã tìm đượcacetonitrile cho hiệu quả chiết lovastatin cao nhất (3,40 ng/g) Phương pháp PCR sử

dụng 10 cặp primer mã hóa tương ứng cho 10 đoạn gene sinh tổng hợp lovastatin được

kiểm tra trên 10 mẫu nam bao ngư xám đã được thu thập từ các quận huyện khác nhaucủa TP Hồ Chí Minh và tinh Bình Dương Kết quả phân tích phát hiện được trong 10mẫu nam đều có lovastatin và có sự hiện diện của 7/18 gene trong hệ gene sinh tông hợp

lovastatin.

Từ khóa: Pleurotus ostreatus, lovastatin, Soxhlet, UPLC-MS/MS, PCR.

The aim of this research 1s conducted to find the most optimal solvent for extracting lovastatin compound using the Soxhlet extraction method, UPLC-MS/MS chromatography method and detecting the lovastatin biosynthetic gene in Oyster mushroom (P/eurotus ostreatus) strains by PCR method To find the solvent that gives the most optimal lovastatin extraction efficiency, the experiment investigated three types of solvents: acetonitrile, ethyl acetate, and methanol The results found that acetonitrile had the highest lovastatin extraction efficiency (3,40 ng/g) The PCR

method uses 10 pairs of primers corresponding to the lovastatin biosynthetic cluster

gene tested on 10 oyster mushroom strains collected from Ho Chi Minh City and Binh Duong province Analysis results revealed that all 10 mushroom samples contained lovastatin and the presence of 7/18 genes in the lovastatin biosynthetic cluster gene.

Keywords: Pleurotus ostreatus, lovastatin, Soxhlet, UPLC-MS/MS, PCR.

MỤC LỤC

Trang

(26125: D00 ĐH Ngã iXÁC NHAN VA CAM DOAN w cscssssessssseseeseeesessessessesscssesecseeesveseeeveseesesaeeeeeseesveseesees 1i

CE vs, ` iii

0.2.0 1V

MUC DI ‹esecessassesiaieii2koxt-BSEEESH-HSDINSGLESISKLEHBESEA NNBlA-SYSRMGGikBSioEDRNSIEEOLiBNMi2kihaegaosesai V

DANH SÁCH GÁC CHỦ VIỆT TÁT su sa tomenciantine nein senstewsaeensie viiiĐÁNH BÁCH GÁC HÃN cesassscaxasccasnzzsnsc cen cata area ixIM.9JE (0509 leiiinni in x(TITCINEI 1 -MH BU TT ngangesonnadoaboirosisy0t4008800196i000u08g8000089i1/800/5001150G08 280i |1.1 Đặt vấn đề - + s2 21221 11211121111112111111212111122212111 2112122121 eo 1

1.3 NO1i dung there W161 01117 = 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIBU 2- 22 s+2E+£E+EE££EezEersersereereersersersc-e.Ổ2.1 Tổng quan về nắm Pleurotus Sp -2-52-2252252252252222£zzzzzzzszsssssssseess-+3

2.1.1 Giới thiệu về nấm Pleur otis SPD -2-52- 52522 S22SS22222E2EE2EE£EE2EEEEEEEeEErrxrrrrrei 3

2.1.2 Giới thiệu về nắm PÏeirOfiIs OSff'€@f[iMS 5-52 St SE SE E111 1 re 42.1.2.1 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của P Øsírđ4fus . -5- 42.1.2.2 Hàm lượng dinh dưỡng và dược tinh của nắm Pleurotus osireafis - 62.1.3 Các nghiên cứu về hàm lượng lovastatin trong nam Pleurotus ostreatus 7

7 TÔng nh tà CCL §

3,21 CHƠI THỂ oangö bố nu E0á i29 3301043 CR1 10086 4014G030.3313k1G8.38303:88Ä3GS348A55S8LSGIBNHGkSNSIA eu 8

RC Buaseasnsaransrigtioariatitrtiogirpgitodordiotfogsoygegtydioitstnlbgiritayygtieltsiomisei 8

2.2.3 Sinh tổng hợp lovastatin -2-©2¿ 52 222SE22E22E2E2212232212112121212121 21212 te 92.2.4 Ung dung ctia lovastatin 8n a4 10

2.2.5 Phuong pháp phát hiện va định lượng lovastafin - 5-5 ++s<+e<+e<+scsxz 11

2.3 Phương pháp chiết Soxhlet 2-2-2 S22E22EE22E2EE22E2EE22E22212212231221 22222 112.3.1 Giới thiệu phương pháp chiết SoxhÏet -2-©2222+222+22Z+2£E+2£Ezzzxzsrxrr 11

2.3.2 Nguyén 0g ìn 0 12

2.3.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet - 2-2-5255: 122.4 Các phương pháp sắc ký - 2-2 ©2¿222221222222121122122112112211211271211211 21c 2e 132.4.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/M®) 132.4.2 Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-

IMIS/MSS) bán 660g d5 10a Hinh sarees sarees anne 13

2.4.3 Ung dying nhị 13

Dido WEG Tw At POR các cess evasnere egaess 0536 8668525015 15690001 28065216 nya aera eure 14

5 Fea) ens Gots Ac)! eee en ne ee ee ee ee ee 14

2.5.2 Thành phan của phan ứng PCR -2- 2-22 2S22E22E£2E22E2E22E2E22E22E22222222xe2 14

2.5.3 Nguyên lý hoạt động của phản ứng PCR 55 5< 2< *S2cserrerrrrrrrrrree 152.5.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR -2- 2: 2 2222S22E22E2EE22E22E2E22E 2121 2E2E2Eezxee 16

CHUNG 3, VAT LIỆU VA PHUIOING PHẬT sssccsccnsvcossmnoncsneneniccsossoesoannansnndisnis 173.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu -222222+22++2E2EE2EE2EE2EE2EEerxrrrrrrrres 17

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cỨU - 5< 5S S< 22 +E*2 2 HH ưêt 17

A j4 PA" 17

3.2.1.1 Thiết bị 5-22 222122125212212112121121121211211212112112112121121212112111211 21021 1e rceg 17

800i 17

Le: | a eee a 179.2.2 Đôi tượng nghiền CU eenenanenveannceneevnanseernennesnsenneaneannesnesnnenneentannsenesnnannnenns 18

3.2.35 Phuong phap ñgh1©h GỮU vss enemas mnnememem mcmama 18

VI

3.2.3.1 Khao sát một số loại dung môi phục vụ việc tách chiết lovastatin tối ưu nhất có

trong chủng nam bào ngư xám bằng phương pháp chiết xuất Soxhlet 183.2.3.2 Định tính lovastatin có trong chủng nắm bào ngư xám bằng phương pháp sắc

ký lỏng ghép khối pho siêu hiệu năng (UPLC-MS/M8) 2 52©2255255z25522 21

3.2.3.3 Khảo sát hệ gene sinh tổng hop lovastatin có trong chủng nam bào ngư xám 23

3⁄44, cre pin mỹ TẾ NÓ TRÍ a 26CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2- 252 +<+SE+E2£E£EE2EEEeEErErrrrxrex a74.1 Khao sát một sé loại dung môi phục vụ việc tách chiết lovastatin tối ưu nhất cótrong chủng nam bào ngư xám bằng phương pháp chiết xuất Soxhlet 274.2 Dinh tính lovastatin có trong chủng nam bao ngư xám bằng phương pháp sắc kýlỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/M®S) -22525c5cscscsscc.scc. 35

4.3 Khảo sát hệ gene sinh tổng hop lovastatin có trong chủng nam bào ngư xám 42

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ 2-22©22222222E22E2EE2EE2EE2EErrrrzrrees 485.1 Kết luận 2-52 2 22 2221221211212112112111211211121121112111111211211121121112112111 22 re 48

| aungnnrsetsnttrldertrioiitoinsnntirngiroioirdintirtgftytitdficbtrrlfogfiebtirolietifoiioera 48

jV ẤP 58gb š.v g ¡57115000030 T= 49

VI

DANH SACH CAC CHU VIET TAT

: Antigen presenting cell : Coronary Heart Disease : Dried Blood Spot

: Dextran natri sulfat : Electrospray ionization mass Electrospray ionization mass : Gas Chromatography/Mass Spectrocopy

: Glutathione : Hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase : High sensitivity C-Reactive Protein

: High Performance Capillary electrophoresis : High Performance Liquid Chromatography

: Liquid chromatography

: Low density lipoprotein : Liquid chromatography with tandem mass spectrometry : Major histocompatibility complex

: Mass spectrometry : Newborn Blood Screening : Nuclear Magnetic Resonance : Polymerase Chain Reaction : Protein precipitation extraction : Tumor Necrosis Factors

: Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem mass

vill

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 2.1 Các chất dinh dưỡng đa lượng của P Øsf€đfi/s -2-©22-522555zc55522 6Bang 3.1 Danh sách chủng nam bào ngư xám được khảo sát - 21Bảng 3.2 Điều kiện và thông số cho quá trình phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép

Bang 3.3 Chương trình gradient chạy mẫu trên máy sắc kí lỏng với sự thay đôi tỷ lệ

Bá AONE ssescacsscssscsse srr ans aon me 054853018133 6533383 OE 22 Bang 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCT - - + 5-2 5+*S+£++£+sezeeeereerrrrrrres 23

Bang 3.5 Trinh tự nucleotide của các cặp mồi sử dung trong phản ứng PCR 24

Bang 3.6 Thành phan phản ứng PCR -2-©52©5225222222EE22E22E2EE2E2EEerrzrrsrer 25

Bảng 3.7 Kích thước 18 đoạn gene sinh tổng hợp lovastatin - 25Bảng 4.1 Ước lượng giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của thiết

Bảng 4.2 Kết quả phân tích nồng độ lovastatin ở mẫu nắm rom có thêm chuẩn va không

a 28Bang 4.3 Giá trị xây dựng đường chuẩn của lovasfatin 2255255225z2s2zz25+2 33Bang 4.4 Phương trình và hệ số tương quan của đường chuẩn lovastatin 34Bảng 4.5 Độ am và hiệu suất tạo cao chiết của 1412105421Ñ101911S TT TU noBảng 4.6 Kết quả khảo sát hiệu quả chiết xuất của dung môi đến hàm lượng lovastatin

¬ =.ẽ T5 5 ốc ốc ốẽ 5 5 = 35

Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra 10 hệ gene sinh tổng hợp lovastatin - 46

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 2.1, FÏeiifotiis östreatiis trên thân: C8 BO u.cninsnncosnarsnnnnsnssonnsndanersensenanss itensamnadekand 4

Hình 2.2 Chu trình sống của nắm P Ø$/7đf//s -2-©2¿©222222222222222222+z2xzzzz 5

Hình 2.5: T)ược tinh của ?P: OStreatuscscscsassesacssaasensasxncersassavecondenzanes densenasdaneh an 8183343832 188 7 Hình 2:4 Công thức phan tử lovastatin vs csecsssssssesepssessvonsssspsssvennversstessessereevesseeseesesnneses 9

Hình 2.5 Chu trình sinh tổng hop lovastatin - 2: ©22©222222222E+z2EzExerxrzrrerer 10 Hình 2.6 Thiết bị chiết tách Soxhlet 2-52 52+SS+SE£EE2EE£EE2EE22E22E22E2E222222e2xe 12 Hình 3.1 Nam bào ngư xám tươi 2 22©222S222E22EE22E22E1221221221212222 21.22 cze 18 Tĩnh,33 im Xññ ffftnghlÖNsuacneennengonioaitirbirhdtntisge00105800140131300480303.80ãg00.304560% 18

Hinh 3.3 Quy trimh xt Ly mau c cc ceecs ccs essesesseesesecsessesessesuesessessestssesteseeseesees 19

Hình 4.1 Sắc ký đồ mau nam rơm không thêm chuẩn lần 1 -5- 28 Hình 4.2 Sắc ký đồ mẫu nam rơm không thêm chuẩn lần 2 -2- 5-5: 29

Hình 4.3 Sắc ký đồ mẫu nắm rơm không thêm chuẩn lần 3 - 29

Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu nam rơm không thêm chuẩn lần 4 -2- 2252 30 Hình 4.5 Sắc ký đồ mẫu nam rơm không thêm chuẩn lần 5 2- 2-52 30 Hình 4.6 Sắc ký đồ mẫu nắm rơm thêm chuẩn ở nồng độ 50 pe/L lần 1 3 Ì Hình 4.7 Sắc ký đồ mẫu nắm rơm thêm chuẩn ở nồng độ 50 pg/L lần 2 31

Hình 4.8 Sắc ký đồ mẫu nam rơm thêm chuẩn ở nồng độ 50 pg/L lần 3 32

Hình 4.9 Sắc ký đồ mẫu nam rơm thêm chuan ở nồng độ 50 #ug/L lần 4 32

Hình 4.10 Sắc ky đồ mẫu nam rơm thêm chuẩn ở nồng độ 50 pg/L lần 5 33

Hình 4.11 Đường chuẩn dung dịch acetonitrile 22-2- 2z 25+22++2z22+z2xzzzzzsez 34 Hình 4.12 Phản ứng phân mảnh của lovastatin . - 55555252 £+£+>£+sc+zceeres 36 Hình 4.13 Sắc ký đồ của chuẩn lovastatin ở nồng độ 2 qug/L - - 37

Hình 4.14 Sắc ký đồ của chuẩn lovastatin ở nồng độ 20 Itg/L -. -5: - 37

Hình 4.15 Sắc ký đồ của chuẩn lovastatin ở nồng độ 50 ug/L -52-55-55: 38 Hình 4.16 Sắc ký đồ của chuẩn lovastatin ở nồng độ 100 ug/L -2-55- 38 Hình 4.17 Sắc ký đồ của mẫu XSGI1 222-5222szessrererererre 38 Hình 4.18 Sắc ký đồ của mẫu XSG2 ¿©2222 222222212212221221211221 22122 cze 39 Hình 4.19 Sắc ký đồ của mẫu XIDLi -2-22222222222222222E22E221221222E22E 2E crrrrev 39

Hình 4.20 Sắc ký đồ của mẫu XBNI -2-©2++22222222222223122222211221.221 2E xe 39

Hình 4.21 Sắc ký đồ của mẫu XLTI ¿- 2¿22222222E+2EE2EE2EE2EE22E222EzEzzrzre 39Hình 4.22 Sắc ký đồ của mẫu XLT2 2-22 ©2++2++2E+2EE2EEt2EE2EE22EE2EErrErzrrrrer 40Hình 4.23 Sắc ký đỗ của mẫu X TH Tu x«esssessesesseoadsssvolisrasssdrosulisgS0000101123600/5546/06 40Tĩnh 4.24, Sốc kỹ đỗ của mu TỢ [2 c«csuskEeeaskidicsniing.LDHDLELiuiLEOii.didrcdag02gu 50) 40Hình 4.25 Sắc ký đồ của mẫu XTMT 2- -2+22222E222E2222122312222271127122212222.ee 40Hình 4.26 Sắc ký đồ của mẫu XBD - 2-22-5222 22122222212211221221211221 22.22 2e 41Hình 4.27 Phổ đồ lovastatin của chuẩn (a) và các mẫu XSGI (b), XLTI (e), 41Hình 4.28 Phổ đồ của các mẫu XTMT (a), XTHT (b), XBD (e), - 42Hình 4.29 Kết quả điện di của mẫu XSG2 -2 2-22 S2222222Ee2Ezrrerkrrrrrree 43Hình 4.30 Kết quả điện di của mẫu XSGI 2-©22©22222222222222222EEczEzrrcrev 43Hình 4.31 Kết quả điện di của mẫu XDLi -2-22-©22222222+2EE22EE+2ESzzESzerzree 43Hình 4.32 Kết quả điện di của mẫu XTMIT - 2-2 2222222S2E2EE22E22EEzzEzzzzczev 43Hình 4.33 Kết quả điện di của mẫu XBD 2 2 52222222S22EE2EE22E222E22Ezrxcrev 44Hình 4.34 Kết quả điện di của mẫu XTHT 22 2222+22E+22E+2EE+2ZE+z2z+zzzzee 44Hình 4.35 Kết quả điện di của mẫu XQ12 2- 2 52222222222EE2EE22E222EzZErzzrzrev 44Hình 4.36 Kết quả điện di của mẫu XLLT2 - 2 2 2222++2E2E+2EEz£EE2EEzrxrzzrzrer 44Hình 4.37 Kết quả điện đi của mẫu XIL/TÌ - 2-22 222222222+222+2EE+2ZS+zzz+zzsvee 45Hình 4.38 Kết quả điện di của mẫu XBN 2+ 222S22E22E22E2212212212122222 2x2 45

XI

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành sản xuất nắm ăn đã hình thành và phát triển trên thé giới từ hàng trăm năm.Hiện nay có khoảng 2.000 loài nắm ăn được, trong đó có 80 loài nam ăn ngon và đượcnghiên cứu nuôi trồng nhân tạo Ở Việt Nam việc nuôi trồng nam đang dan phát triểnvới nhiều loại nam trồng phổ biến như nam rơm, nắm kim châm, nam hương, nam baongư, nắm linh chi, Sản lượng nắm hàng năm ở nước ta khoảng 250 000 tan, trong đóriêng nắm bào ngư chiếm 60 000 tấn Tuy nhiên, phần lớn mọi người tiêu thụ nắm lớn

là vi giá trị dinh dưỡng và các đặc tính đặc trưng của nấm như: độ dai, giòn, ngọt, cómùi vị thơm ngon, dễ chế biến mà ít quan tâm đến các hoạt chất sinh học có trongnam đặc biệt là nam bao ngư xám (Pleurotus ostreatus), cũng vi thế mà chưa có nhiềunghiên cứu đánh giá về được tính điều trị bệnh của các hoạt chất sinh học có trong nam

bao ngu xam.

Lovastatin, bao gồm các chất chuyên hóa thứ cấp được sản xuất bởi nam soi, làloại thuốc được sử dụng dé điều trị chứng tăng cholesterol trong máu do lovastatin làchất ức chế cạnh tranh men khử HMG-CoA Hơn nữa, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ramột số ứng dụng quan trọng của lovastatin như: chất chống vi trùng, điều trị bệnh ungthư va các bệnh về xương (Mulder va ctv, 2015) Năm 1979, lovastatin được tìm thấyđầu tiên trên vi nắm thuộc chủng Aspergillus terreus

Với mục đích xác định được loại dung môi có khả năng tách chiết hợp chấtlovastatin tối ưu nhất và tìm được chủng nắm bào ngư xám chứa hoạt chất sinh học cógiá trị dược liệu trong điều trị bệnh nên ta tiến hành thực hiện đề tài “Khao sát một sốdung môi phục vụ việc định tính lovastatin và khảo sát hệ gene sinh tổng hợp lovastatin

có trong một số chủng nam bào ngư xám (Pleurotus ostreatus)”

1.2 Mục tiêu đề tài

Tìm được loại dung môi cho hiệu quả chiết xuất hợp chất lovastatin tối ưu nhất và

phát hiện được hệ gene sinh tổng hợp lovastatin có trong các chủng nam bào ngư xám(Pleurotus ostreatus).

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sát một số loại dung môi phục vụ việc tách chiết lovastatin tối

ưu nhất có trong chủng nam bào ngư xám (Pleurotus ostreatus)

Nội dung 2: Định tính hoạt chất lovastatin có trong chủng nắm bào ngư xám.Nội dung 3: Khảo sát hệ gene sinh tổng hợp lovastatin có trong chủng nam bao

ngư xám.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về nam Pleurotus spp

2.1.1 Giới thiệu về nắm Pleurotus spp

Có hơn 30 loài nam thuộc chi Pleurotus, đa số chúng thuộc loại nam ăn và đượctrồng thương mại Trong đó, nam Pleurotus là loại nam ăn được trồng nhiều chiếm 25%tong sản lượng nam trồng trên thế giới Với đặc điểm dé trồng, phù hợp với điều kiệnsông môi trường và khí hậu nên đây là loại nấm có nhiều hình dang khác nhau do quátrình lai tao (Phạm Thành Hồ, 2022)

Nam Pleurotus spp được phân bố rộng khắp trên thế giới, đầu tiên nó được trồng

ở châu Âu trên 20, sau đó là trên mun cưa, cùi bắp, rơm ra Một số loại nam Pleurotusspp được trồng ở vùng ôn đới, ở Việt Nam chúng mọc tốt ở điều kiện nhiệt độ 28 -30°C Hiện nay, nam Pleurotus cũng được trồng ở nhiều nước trên thế giới, chau A,châu Âu và các nước nhiệt đới, đặc biệt nó được khuyến khích trồng ở các nước đangphát triển nhằm dé bổ sung nguồn thực phẩm, xử lý các phế phẩm nông lâm nghiệp détránh 6 nhiễm, mặc khác còn giúp bổ sung cho đất có hàm lượng chất hữu cơ cao Ởmiền Nam thời điểm khoảng từ tháng 11 đến tháng 2 khí hậu lạnh hơn thích hợp choviệc trồng nam Pleurotus với khả năng mọc tốt va sinh trưởng tốt cho năng suất cao Dochứa nhiều ưu thé như trong việc trồng nam sử dụng nhiều phê liệu như mun cưa, rơm

ra, cùi bap, bã mía ké cả gỗ, với nguyên liệu chế biến đơn giản dé làm, thu được sanlượng cao, cứ bình quân 1 tạ rơm khô sẽ thu được 30 - 40 kg nam tươi, nếu trồng VỚIquy mô kỹ thuật tốt có thé đạt đến 70 - 80 kg nam tươi (Phạm Thành Hồ va ctv, 2022)

Nam Pleurotus spp được các nhà khoa học đánh giá là một trong những loại nam

có nhiều hoạt tinh sinh hoc vì chứa hop chat statin, đặc biệt là lovastatin - một loại thuốc

được phép lưu hành trên thị trường giúp làm giảm cholesterol trong máu và giảm nguy

cơ mắc bệnh tim mạch.

2.1.2 Giới thiệu về nam Pleurotus ostreatus

VỊ trí phân loại:

Lớp : Agaricomycetes

Bộ : Agaricales

Ho :Pleurotaceae Chỉ : Pleurotus Loài : Pleurotus ostreatus

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của P ostreatus

Nam bào ngư xám tên khoa học là Pleurotus ostreatus có dạng hình phiếu lệch,giống nắp sò, dai từ 5 đến 25 cm, mép mũ nam cuộn lại khi còn non và nhẫn, quả thékhá to đường kính trung bình từ 2 — 4 cm trơn bóng, mau từ xám đến trắng xám, thịtnam màu trắng dày, cuống mọc xiên, day từ 2 — 6 em Nam P ostreatus mọc chủ yếu

thành cụm, ít mọc đơn lẻ.

Trong tự nhiên, nam P ostreatus thường được moc trên các thân cây khô, trongmôi trường nuôi trồng nông nghiệp nam P ostreatus được trồng trên rơm, ba mia, muncưa cao su, Thường là trên những cây đã chết, hoặc trên những khúc gỗ đã dé Cácchất nền khác nhau có chứa lignin va cellulose có thé được sử dụng để canh tác nam P.ostreatus chang hạn như dam gỗ, lúa mì ngô, rơm ra, thân cây bông, vỏ phế thải và cácchất thải nông nghiệp, một số có thể được tái chế để sử dụng làm thức ăn gia súc

Chu trình sống của nam bào ngư xám có thể được mô tả thông qua Hình 2.2 như

Meiosis @

(e) BASIDIUM

Nuclear Fusion

nhất với sợi nắm khác có kiểu giao phối tương thích Sau khi hợp nhất giữa các sợi nắmđồng nhân tương thích, sự di chuyên hạt nhân đối ung xảy ra và một sợi nam dị hạchđược hình thành Sự tăng trưởng tiếp theo liên quan đến sự phân chia đồng bộ của hainhân trong mỗi ngăn và sự phân bố đều đặn của chúng dưới dạng cặp nhân trong toàn

bộ sợi nắm thông qua các kết nối kẹp Hệ sợi nam di hạch với đủ khối lượng sợi nam vàcác kích thích môi trường thích hợp (làm mát 10 - 21°C, độ âm tương đối 85 — 90 %,yêu cầu ánh sáng 1000 — 2000 lux, CO2 < 1000 ppm) có thé hình thành quả thể Trongquá trình hình thành quả thể, phản ứng tổng hợp hạt nhân và giảm phân chỉ xảy ra ở

basidia (đảm) chuyên biệt Mỗi nhân đơn bội di chuyên vào một bào tử basidiospores,

bên ngoài basidium Mỗi basidium thường có bốn basidiospores đơn nhân Những bào

tử này nảy mam thành sợi nam đồng nhân (homokaryotic) (OECD, 2016)

2.1.2.2 Hàm lượng dinh dưỡng và dược tinh của nam Pleurotus ostreatus

P ostreatus chứa khoảng 100 hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau, chủ yếu đượccoi là một nguồn chất xơ mới tiềm năng Trong khi đó, thành tế bào nắm rất giàu

polysacarit phi tinh bột, trong đó j-glucan là thành phần chức năng thú vị nhất và các

hợp chat phenolic như axit protocatechuic, axit gallic, axit homogentisic, rutin, myrictin,

chrysin, naringin, tocopherol như a-tocopherol và y-tocopherol, axit ascorbic và

ÿ-caroten mỗi loại đều có tác dụng chữa bệnh nổi bật riêng (Wang va ctv, 2001; Ferreira

va ctv, 2009) Hon nữa, chúng là thực phẩm tốt cho sức khỏe, giàu protein, lipid,carbohydrate, vitamin và khoáng chất nhưng lại ít calo và chất béo

Bảng 2.1 Các chất dinh dưỡng đa lượng của P ostreatus (Khan, 2010)

Chât dinh dưỡng Hàm lượng (trong 100g nam khô) Protein 17 — 42 (g)

Carbohydrates 37 — 48 (g)

Lipids 0,5 —5 (g)

Fibers 24 —31 (g) Minerals 4-10 (g) Moisture 85 — 87 (%)

Năm 1994, Karacsonyi và Kuniak đã phân lập được B-D Glucan từ quả thé của P.ostreatus B-D glucan màng phối đã làm tăng khả năng sống sót của những con chuột dé

bị nhiễm vi khuẩn Tuy nhiên, các thành phần phenolic và tanin được quan sát thấy của

P ostreatus cũng có thé tạo ra hoạt tính kháng khuẩn như được tìm thấy trong nhiều câythuốc với cơ chế hoạt động được đặc trưng bởi sự phân giải thành tế bảo, ức chế tổnghợp protein, enzyme phân giải protein và adhensin của vi khuẩn (Cowan, 1999)

Năm 2007, Petrova cho rằng P ostreatus có tác dụng ức chế quá trình phosphorylhóa IBơ có hoạt tính sinh học liên quan đến tăng cường miễn dịch và tác nhân chốngung thư trong ống nghiệm Tuy nhiên, điều trị P os/rea/zs làm giảm đáng ké sự biểuhiện của các dấu ấn sinh học liên quan đến sự tiến triển của ung thư ruột kết như cyclin

DI và Ki-67 Những điều này chỉ ra rõ ràng rằng việc sử dung P ostreatus đã ngăn chặn2-amino-1- methyl-6-phenylimidazo [4,5-b] pyridine (PhIP) và muối dextran natri sulfat

(DSS) gây ra sự hình thành khối u đại tràng liên quan đến viêm đại tràng ở chuột mà

không có bat kỳ tác dụng phụ nao (Jedinak A va ctv, 2010) Chiết xuất protein của P

ostreatus đã được chứng minh là có hiệu quả điều trị đối với dòng tế bào ung thư đại

trực tràng ở người (tế bào SW 480) và đòng tế bào ung thư bạch cầu đơn nhân ở người(tế bao THP-1) bằng cách gây ra quá trình chết lập trình trong các tế bao SW 450 mộtphan thông qua các gốc oxy hóa hoạt động có nguồn gốc từ oxy (ROS), suy giảmGlutathione (GSH) và rối loạn chức năng ty thé (Wu va ctv, 2011) Do đó, chiết xuấtprotein của những loại nam này có thể được coi là nguồn quan trọng của thuốc chống

ung thư mới.

2.1.3 Các nghiên cứu về hàm lượng lovastatin trong nam Pleurotus ostreatus

Năm 1995, Gunde đã khảo sát hàm lượng lovastatin ở quả thé với các kích cỡ khácnhau (2 cm, 5 cm, 10 cm, 15 cm) Kết quả cho thấy chất ức chế HMG - CoA reductase

có nhiều trong qua thé nam Pleurotus ostreatus có đường kính 10 em

Năm 2003, Alarcon đã khảo sát hàm lượng lovastatin có trong nam Pleurotusostreatus trên môi trường lỏng và môi trường rom lúa mì, kết quả cho thay hàm lượnglovastatin khi nuôi trồng Pleurotus ostreatus trên môi trường lỏng cao hơn khi nuôi

trông trên môi trường rơm lúa mi.

Vào năm 2019, Atli đã báo cáo rằng môi trường nuôi trồng tối ưu dé sinh lovastatinđối với chủng nam P ostreatus OBCC 1031 là môi trường gồm lúa mach, dịch chiếtnam men cho hàm lượng lovastatin là 34, 97 mg/g.

2.2 Tổng quan về lovastatin

2.2.1 Giới thiệu

Lovastatin (mevin-olin) là một hợp chất thuộc nhóm statin, có cấu trúc liên quanđến sự ức chế quá trình tổng hợp sinh học cholesterol, cụ thé là chuyên đổi 3-hydroxy-

3-methylglutaryl coenzym A (CoA) thành mevalonate được xúc tác bởi

HMG-CoA reductase - enzyme dau tiên trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol có kha năng

làm giảm cholesterol trong máu (Lisec B va ctv, 2012) Lovastatin được dùng dưới dang

b-hydroxy lactone, chất nay theo thời gian sẽ chuyền đổi in vivo thành dạng axit hydroxytương ứng (Serajuddin và ctv, 1991), một phần tương tự như HMG-CoA, do đó b-hydroxy lactone hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh

2.2.2 Lịch sử phát triển

Statin đầu tiên được phân lập ở Nhật Bản bởi các nhà khoa học nghiên cứu củaCông ty TNHH Sankyo Họ sàng lọc từ nhiều loại nam dé tìm kiếm các hợp chất có thé

ức chế HMGCoA reductase (enzyme giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp

cholesterol) trong chiết xuất từ gan chuột Từ đó đã tìm thấy một hợp chất được tạo ra

bởi một chủng Penicillium citrinum ban đầu được đặt tên là ML236B hoặc mevastatin

và sau đó được gọi là compactin (Endo và ctv, 1976) Ngay khi hiểu được tiềm năng củahợp chat mới này, các nhà khoa học từ Merck đã bắt đầu sang lọc chủng nam của riêng

họ Họ đã phân lập được chung Aspergillus terreus tạo ra một statin hiệu quả hon: lovastatin (Alberts và ctv, 1980).

Hình 2.4 Công thức phân tử lovastatin.

(Memeo, 2019)

Công thức hóa học: C24H360s

Tên thông thường: Mevinolin, Monacolin K

Khối lượng phân tử: 404,5 g/mol

2.2.3 Sinh tong hợp lovastatin

Nghiên cứu ban đầu dựa trên nắm Monascus ruber chỉ ra rằng monacolin L và J làchất trung gian trong con đường sinh tổng hợp lovastatin (Endo và ctv, 1985) Người ta

đã chứng minh rằng monacolin L là chất đầu tiên được tổng hợp từ 9 phân tử axetate vàlần lượt được chuyền thành monacolin J bằng quá trình hydroxyl hóa Trong phản ứnghydroxyl hóa, '8O2 đã được tích hợp vào monacolin J thong qua hoạt động của hệ thốngmonooxygenase liên quan đến cytochrom P - 450 có trong dịch chiết xuất của M ruber(Komagata và ctv, 1989) Các nghiên cứu sau đó đã chứng minh sự biến đổi củamonacolin J thành lovastatin (Kimura và ctv, 1990) Nghiên cứu trên nam Aspergillusterreus, sử dung tién chat duoc danh dau (Chan va ctv, 1983; Greenspan va Yudrovitz,1985; Moore va ctv, 1985; Shiao va Don, 1987) chỉ ra rang quá trình sinh tổng hợplovastatin cũng bat dau từ các đơn vị axetate được liên kết với nhau theo kiểu từ dau đếncuối dé tạo thành hai chuỗi polyketide (Hình 2.5) Nhóm methyl hiện diện trong một sốstatin ở chuỗi bên hoặc ở các dẫn xuất C6 từ methionine, và được chèn vào cấu trúc

trước khi đóng vòng (Shiao và Don, 1987) Chuỗi chính sau đó được xi lanh hóa và

trong một số statin được este hóa bởi chuỗi bên tại C8 Các nguyên tử oxy có trong chuỗichính được đưa vào sau đó bằng quá trình oxy hóa hiếu khí (Alberts và ctv, 1980;

Greenspan và Yudrovitz, 1985; Moore va ctv, 1985) Do đó, năm 1985 Moore đã chứng

minh rang lovastatin được tao ra từ axetate thông qua con đường polyketide

2-Methylbutyryl CoA

Lovastatin Acid

Monacolin L Monacolin J

lovA love lovG lovD lovE lovF lovH ORF1S ORF16 ORF17 Qpr1¿

ORF1 ORF2 lovC LovR LovT ORF12 ORF14

Modified from Mulder et al

Hình 2.5 Chu trình sinh tổng hợp lovastatin (Mulder, 2015)

Cơ chế hoạt động: LovB mã hóa lovastatin nonaketide synthase (LDKS) tổng hợpdihydromonacolin L với sự tham gia của các sản phẩm của lovC và lovG Sản phẩm củalovA biến đổi monacolin L thành monacolin J Ở nhành còn lại, sản phẩm của lovF(lovastatin diketide synthase LDKS) tổng hợp chuỗi bên 2-methylbutyryl-S LovD mãhóa một esterase hợp nhất cả hai polyketide đề tạo thành lovastatin axit

2.2.4 Ứng dụng của lovastatin

Những bệnh nhân sử dung lovastatin đã cho thay kha năng ngăn ngừa bệnh đa xơcứng Các nghiên cứu cho thay rang lovastatin đã ức chế yếu tố hoại tử khối u (TNFa),ngoài ra còn làm giảm mức độ phản ứng viêm Những phản ứng này xảy ra do sự điềuchỉnh của tế bảo trình điện kháng nguyên (APCH) và sự ức chế MHCII (Zamvil và

Steinman, 2002).

Năm 2007, Garret đã nghiên cứu tác dụng của lovastatin trong quá trình trưởng

thành của xương, các nghiên cứu đã được thực hiện bằng cách tiêm các hạt nanolovastatin với liều lượng cao Kết quả cho thấy rằng các liều lượng cao kích thích sựhình thành xương cao, và việc tiêm lovastatin tại các vi tri cụ thể sẽ chữa lành vết gay

xương đùi và giảm khoảng cách gãy xương vỏ não Những su hình thành xương nay

được quan sat rõ ở liều lượng cao, nơi có sự kích thích hình thành xương dài ở chuột.Những nghiên cứu này cho thấy rằng lovastatin có thé được sử dụng dưới dang hạt nano,

có thê được sử dụng trong việc sửa chữa gãy xương

Lovastatin đã được chứng minh là làm giảm bệnh tim mạch vành (CHD) ở bệnh

nhân, bằng cách giảm mức cholesterol trong huyết tương Các thử nghiệm lâm sàng đã

10

chứng minh rằng statin không chỉ làm giảm mức cholesterol trong huyết tương mà còn

làm giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân (Seenivasan và ctv, 2008).

2.2.5 Phương pháp phát hiện và định lượng lovastatin

Phương pháp đề phát hiện và định lượng lovastatin thường được sử dụng là phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong

các phòng thí nghiệm lên men, theo đó các cột pha đảo phân tích C18 được ồn định

trong các pha động khác nhau, và các dạng axit lovastatin va lacton dé dàng được phân

tách và định lượng Tuy nhiên, một số báo cáo đã tập trung vào điện di mao quản dé

định lượng lovastatin trong môi trường canh thang (Kittell va ctv, 2005; Nigovic và ctv,

2013) Ưu điểm của phương pháp điện di mao quan so với định lượng bang HPLC nam

ở chỗ không cần dùng cột, sử dụng ít dung môi hơn và thời gian chạy sắc ký ngắn hơn,cho phép sang lọc thông lượng cao các chủng A terreus đột biến (Kittell va ctv, 2005).Gan đây, các giao thức sử dụng phép đo khối phổ phun điện (ESI-MS) kết hợp với sắc

ký long (LC) dé phát hiện và định lượng ngày càng phô biến Mặc dù nổi bật hơn trong

lĩnh vực lâm sang, phát hiện và định lượng lovastatin bằng LC-MS đã được sử dụng

thành công cho các chủng M purpureus (Lee và ctv, 2006; Nigovic và ctv, 2013; Song

va ctv, 2012) và cho A terreus (Askenazi va ctv, 2003).

Ngoài ra, dé phát hiện lovastatin có thé sử dụng phương pháp phố cộng hưởng từhạt nhân (NMR) Đây là một kỹ thuật quang phô dé quan sát từ trường cục bộ xungquanh hạt nhân nguyên tử Từ trường xung quanh nguyên tử trong phan tử làm thay đổitần số cộng hưởng, do đó cho phép nghiên cứu chỉ tiết về cau trúc điện tử của phân tử

và các nhóm chức riêng lẻ của phân tử Xét nghiệm NMR đã được phát triển dé xác địnhtổng hàm lượng statin trong men gạo đỏ Giới hạn phát hiện NMR đối với statin toànphần là 6 mg/L Thử nghiệm này có thể được áp dụng để xác định hàm lượng statinnhằm kiểm soát theo quy định đối với các sản phẩm gạo men đỏ (Lachenmeier và ctv,

2012).

2.3 Phương pháp chiết Soxhlet

2.3.1 Giới thiệu phương pháp chiết Soxhlet

Phương pháp chiết Soxhlet là một kỹ thuật truyền thống dùng dé chiết chất béotrong thực pham được Franz von Soxhlet phát minh vào năm 1879 Cho dén hién tai,phương pháp chiết Soxhlet đã trở thành “tiêu chuẩn vàng (gold standard)” trong kỹ thuậtchiết lỏng — rắn khi hợp chất cần chiết có độ hòa tan hạn chế trong dung môi đã chọn và

11

các tạp chất không hòa tan và phương pháp này vẫn sẽ tiếp tục được sử dụng vì tính đơn

giản, chi phí tương đối thấp, hiệu quả chiết cao và dé sử dụng

2.3.2 Nguyên lý hoạt động

Dược liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết Dung môi mới

được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngănchiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dưới, mang theo các chấthòa tan từ được liệu Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng

tụ xuống bình chiết và đi qua lớp dược liệu dé hòa tan các chất tan còn lại Cứ như vậycho đến khi được liệu được chiết kiệt

Hình 2.6 Thiết bị chiết tách Soxhlet

2.4 Các phương pháp sắc ký

2.4.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký long ghép khối phố (LC-MS/MS)

Sắc ký lỏng ghép khối phổ cho phép xác định, mô tả đặc tính và định lượng cáchợp chất hóa học làm chất phân tích mục tiêu dựa trên khối lượng phân tử tương ứng vàkiểu phân mảnh của chúng; khối lượng phân tử của toàn bộ phân tử và/hoặc mô hìnhphân mảnh khối lượng của các manh phân tử ôn định và có lợi về mặt nhiệt được sửdụng để mô tả một hợp chất cụ thể

2.4.2 Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng ghép khối pho siêu hiệu năng

(UPLC-MS/MS)

UPLC-MS/MS là một kỹ thuật hóa học kết hợp kha năng phân tách vật ly của sắc

ký lỏng với khả năng phân tích khối lượng của phép đo khối phổ, được sử dụng chonhiều ứng dụng có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, cung cấp khả năng phân giải khốilượng và sắc ký cao, chế độ thu thập dit liệu linh hoạt cho phép nhận dang các chatchuyền hóa và thu thập dữ liệu để phân tích hàng trăm hoặc hàng nghìn mẫu và chấtchuyền hóa phục vụ cho nghiên cứu kiểu hình và kiểu gene, tiêu thụ dung môi it và rútngắn thời gian phân tích (Dunn và Lewis, 2019)

2.4.3 Ứng dụng

Năm 1989, các hệ thông LC-MS/MS đầu tiên được ứng dụng vào thiết lập thườngquy đã có sẵn trên thị trường Trong những năm tiếp theo, kỹ thuật này đã nhanh chóng

được giới thiệu, đặc biệt là trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu dược động học Trong

vòng một vài nam, LC-MS/MS đã thay thé phan lớn HPLC và GC/MS như một kỹ thuậtthông thường trong các phòng thí nghiệm dược lý Những lợi thé chính là việc phân tích

cụ thé cao, phân tích nhiều loại chất mục tiêu tiềm năng và sự phát triển linh hoạt củacác phương pháp phân tích nhạy cho số lượng lớn trong việc phân tích thuốc LC-MS/MS trong khi đó đã được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực phân tích thực phẩm và

môi trường (Vogeser và Parhofer, 2007).

Ứng dụng trong phòng thí nghiệm dé sang lọc trẻ sơ sinh về các lỗi chuyển hóabam sinh Các lỗi bam sinh về chuyển hóa propionate, cobalamin và methionine 14 mụctiêu của sàng lọc sơ sinh (NBS) trong hau hết các chương trình trên toàn thế giới và chủyếu được sảng lọc bằng cách phân tích propionyl carnitine (C3) và methionine trong vếtmáu khô (DBS) bằng phương pháp khối phổ song song (MS/MS) Các phương pháp tiếp

cận sang lọc sơ sinh bậc một chỉ sử dụng C3 va methionine thiêu tính đặc hiệu, điêu này

13

có thê dẫn đến tỷ lệ dương tính giả tăng lên Việc triển khai xét nghiệm bậc hai của phép

đo sắc ky lỏng ghép khối phố (LC-MS/MS) đối với axit 2-metylcitric (MCA), axitmetylmalonic (MMA) va homocysteine (HCY) từ cùng một thé DBS có thé cải thiện

hiệu suất sàng lọc bệnh bang cách giảm ty lệ đương tinh giả và loại bỏ nhu cau lay mẫu

lặp lại (Dubland và ctv., 2021).

Phương pháp LC-MS/MS được ứng dụng để xác định và định lượng lovastatintrong huyết tương người So với các phương pháp như sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC), điện di mao quản hiệu suất cao (HPCE) với đầu dé UV thì ở LC-MS/MS đạt

độ nhạy tốt hơn, tuyến tính trong khoảng 0,5 — 30 ng/mL với giới hạn định lượng là 0,5ng/mL trong thời gian khoảng 5 đến 6 phút (Yuan và ctv, 2008)

Phương pháp UPLC-MS/MS dựa trên PPE đơn giản đã được kiểm chứng đãđược áp dụng dé định lượng đồng thời lovastatin và lovastatin B-hydroxy axit trong cácmẫu huyết tương người thu được từ một nghiên cứu tương tác thuốc - thuốc lâm sangliên quan đến lovastatin (Wujian và ctv, 2015)

2.5 Kỹ thuật PCR

2.5.1 Giới thiệu

PCR viết tắt của Polymerase Chain Reaction là một phản ứng nhân bản trình tựDNA quan tâm dựa trên các chu trình nhiệt Đây là một kỹ thuật phổ biến và không thểthiếu trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu y học và sinh học với nhiều ứng dụng khácnhau như: nhân bản DNA để giải trình tự, nghiên cứu quá trình phát sinh chủng loại dựatrên bằng chứng về DNA hoặc phân tích chức năng của gen nhằm chuẩn đoán các bệnh

di truyền, phát hiện bệnh truyền nhiễm,

2.5.2 Thành phần của phản ứng PCR

Phản ứng PCR diễn ra trong eppendorf chứa dung dịch phản ứng gồm các thànhphan:

(1) Template (DNA hoặc RNA mạch khuôn)

(2) Primer: Các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 18 - 22 nucleotide và bắt cặp

bô sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản

(3) DNA polymerase (Taq polymerase): có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72 °C(4) dNTP: gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP là nguyên liệu dé tổng hợp ra các bản

sao DNA

(5) Cation Mg?”: là co-factor quan trọng dé DNA polymerase hoạt động hiệu quả

14

(6) Buffer: cung cấp môi trường hoạt động thuận lợi cho enzyme DNA polymerase,

ồn định pH

(7) Nước

Nguyên tắc thiết kế primer:

(1) Độ dài của primer nằm trong khoảng từ 15 — 30 nucleotide, độ dài tối ưu làkhoảng từ 16 — 20 nu Điều này phụ thuộc vào việc primer đủ dài dé gắn đặc hiệu và đủngắn để có thé gắn dễ dàng vào mạch khuôn tại nhiệt độ bắt cặp primer

(2) Doan primer kết thúc ở C hoặc G tại đầu 3’ dé giúp cho đầu 3’ của primer liênkết mạnh hơn Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3’ có nhiều hon 3 G hoặc C

do có thé gây liên kết đầu 3” quá mạnh khiến primer bat cặp không đặc hiệu.

(3) Nhiệt độ nóng chảy của primer (Tm) nên cách nhau càng ít càng tốt, Tm tối ưu

là nằm trong khoảng 52 — 62 °C Tính T theo công thức sau:

Tm=4*(G+CŒ)+2 *(A+T)

(4) Nhiệt độ bắt cặp cua primer (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy củaprimer Nhiệt độ bat cặp thấp có thé dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, dokhông đủ số lượng phức hợp lai giữa primer và mạch khuôn Ngược lai, sản phẩm không

đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu nhiệt độ gắn moi qua thap Nguoi ta thuong tinh nhiét

độ gan mồi theo công thức sau:

Ta = 0,3 * Tm (Primer) + 0,7 * Tm (Sản phẩm) — 14,9(5) Mật độ GC nam trong khoảng 50 — 60 %

2.5.3 Nguyên lý hoạt động của phan ứng PCR

Một chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: (1) biến tính, (2) bắt cặp và

(3) kéo dai.

(1) Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên khoảng 94 — 95 °C, lúc này cácliên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA/RNA khuôn mẫu bị biến tính từ mạch

đôi thành mạch đơn.

(2) Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống khoảng 55 — 65 °C, tạo năng lượng

dé liên kết hydro của các nu từ các đoạn môi bắt cặp bô sung vào hai đầu trình

tự mục tiêu.

(3) Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 °C, Tag polymerase sẽ sử dụng

dNTP dé kéo dai đầu 3’ của đoạn môi và tạo ra mạch bồ sung

15

Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi Nếu chu kỳnhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 239 ~ 2“ bản sao Số lượng bản saoDNA không lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (vi dụ: Ethidium Bromide,SYBR green) thì có thé nhìn thấy bang mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV.2.5.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học như: trong chuẩn đoán bệnhung thư giúp tìm HPV trong ung thư cô tử cung, phát hiện gene APC trong ung thư đạitrang, gene BRCA 1- BRCA 2 trong ung thư vú, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh; xácđịnh độc tố của vi sinh vật và còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vikhuẩn (Mai Văn Tuấn, 2012)

Ứng dung kỹ thuật PCR dé khuếch đại gene lovD từ DNA bộ gene của Aspergillusterreus trong quá trình sinh tổng hợp các chất tương tự lovastatin (Xie và ctv, 2006)

16

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: 6 tháng

Địa điểm: Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chi Minh Số 2374, quốc

lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, thành phó Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Trang thiết bị

3.2.1.1 Thiết bị

- Hệ thống chiết xuất Soxhlet thé tích 250 mL

- Hệ thống sắc ký lỏng ghép hai lần khối phố (UPLC-MS/MS)

- Máy cô quay chân không R-300, Buchi, Thuy Sy

- Máy PCR, Benchmark, Mỹ

- May ly tam 5430R, Eppendorf, Dirc

- May vortex, Stuart weitzman, Phap

- Cân 2 số lẻ, Mettler Toledo, Thụy Sỹ

- Bề rửa siêu âm Elmasonic S 300 H, Elma, Đức

- Vial thuy tinh 1.5 mL

- Mang loc PTFE 0.22 um

- Eppendorf 0,2 mL, 1,5 mL

3.2.1.3 Hóa chất

- Methanol, Merk, Đức; Acetonitrile, Merk, Đức; Ethyl acetate, Merk, Duc;

Formid axit, Merk, Đức; Agarose, Meridian bioscience; Potato Dextroso Broth, Himedia; Agar.

17

3.2.2 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu này khảo sát trên 10 chủng nam bào ngư xám (Pleurotus ostreatus)được thu tại các chợ ở TP Hồ Chí Minh và tỉnh Bình Dương

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu

3.2.3.1 Khảo sát một số loại dung môi phục vụ việc tách chiết lovastatin tối ưu nhất

có trong chủng nắm bào ngư xám bằng phương pháp chiết xuất Soxhlet

Mục tiêu thí nghiệm: Tìm được loại dung môi cho hiệu quả chiết xuất hợp chấtlovastatin tối ưu nhất

Quy trình xử lý mẫu: Từ mẫu nam bào ngư xám tươi, rửa sạch đề loại bỏ bụi ban,đem di sấy khô ở nhiệt độ 50 °C sấy trong khoảng 2 ngày Nam sau khi sấy khô đượcmang đi nghiền Mẫu sau đó được rây ở kích thước 0,5 mm

Hình 3.1 Nắm bào ngư xám tươi Hình 3.2 Nắm khô đã nghiền

Quy trình thực hiện:

Tiến hành khảo sát hiệu quả chiết xuất hợp chat lovastatin có trong mẫu nam bàongư xám với 3 loại dung môi lần lượt là acetonitrile (ACN), ethyl acetate (EA) vàmethanol (MeOH), tiến hành phân tích lặp lại 3 lần bằng phương pháp chiết Soxhlet với

tỷ lệ của mẫu nam và dung môi là 1:50 w/v, quy trình thực hiện được thể hiện ở Hình 3.3

18

- Acetonitrile

255 = - Ethyl acetate

Mãu | “” | Chiế -Methanol »| Dịch chiết

ÏS0søy | Posttet 60°C, 3 giờ

Cô lsqc

quay

" x na ak + 2mL pes % š aie

UPLC- | Loe mang] Dịch chiết x |Thôikhô| Dich chiết

} MeOH | Cao chiét a

MS/MS 022um MeOH |“ J cô đặc

Hình 3.3 Quy trình xử lý mẫu

Diễn giải quy trình: Từ mẫu nam khô đã nghiền, cân 2,55 g mẫu cho vào giấy lọcđược gói trong túi lọc; đong 120 mL dung môi cho vào bình cầu, với 3 loại dung môi làacetonitrile, ethyl acetate và methanol, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, tỉ lệ giữakhối lượng mẫu với dung môi là 1: 50 w/v; Sau đó tiến hành chiết Soxhlet ở 60 °C trong

3 giờ; Sau khi Soxhlet hoàn thành, thu được dich chiết và tiến hành cô quay chân không

ở 60 °C nhằm loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết, cô quay cho đến khi lượng dịch chiếttrong bình cầu còn lại khoảng 10 — 12 mL thì dừng lại; đồ dịch chiết cô đặc vào ốngfalcon 50 mL và mang đi thổi khô trong khoảng 2 giờ để loại bỏ hết lượng dung môicòn lại trong dịch chiết cô đặc và thu được cao chiết (cao chiết được bảo quản ở nhiệt

độ - 20 °C); sau khi thu được cao chiết, thêm 2 mL methanol và dem đi đánh sóng siêu

âm dé dung môi hòa tan cao chiết; hỗn hợp được lọc qua mang lọc có kích thước mang0,22 um, dung dịch đã lọc được cho vào vial; tiến hành chạy sắc ký UPLC-MS/MS.Tính toán độ âm và hàm lượng chất chiết khô của nguyên liệu thông qua các công thức:

+ Độ ẩm: w = — x 100%

Trong đó: W: khối lượng nước chứa trong nguyên liệu (g)

m: khối lượng chung của nguyên liệu am (g)

+ Hàm lượng chất chiết khô:

ae) — Me Ty

0

Trong đó: mạ: khối lượng bình cầu chứa dịch chiết sau khi loại dung môi (g)

mi: khối lượng bình cầu rỗng (g)

mo: khối lượng mẫu đem chiết (g)

19

Mục đích: Lựa chọn được dung môi chiết tách tối ưu phục vụ cho các thí nghiệm của

nội dung sau.

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị:

Đề đánh giá độ nhạy của thiết bị dựa vào giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

và được tính toán như sau:

"` cae Nhu

Giá trị trung bình: x = ==—

Độ lệch chuẩn: SD = —

Giới hạn phát hiện: LOD = 3 x SD

Giới hạn định lượng: LOQ = 10 x SD

Trong đó: X: giá tri trung bình

SD (Standard Deviation): độ lệch chuẩnx¡: nồng độ của chất cần phân tích

n: số lần thí nghiệm

LOD (Limit of detection): giới hạn phát hiện LOQ (Limit of quantification): giới hạn định lượng

Đánh giá LOD tính được thông qua giá trị R = = và nếu 4 < R < 10 thì nồng độ

dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy.

Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết xuất lovastatin:

Thử nghiệm đánh giá hiệu suất thu hồi trên đối tượng nắm rơm Tiến hành thêmchuẩn lovastatin ở nồng độ 50 ug/L vào mẫu nắm rơm sau khi say và nghiền, quy trình

xử lý mẫu và phân tích thực hiện tương tự như đối với mẫu nắm bào ngư xám Phầntrăm hiệu suất thu hồi (%H) được tính theo công thức được trình bày bên dưới và theotiêu chuẩn của AOAC, ứng với mỗi nồng độ của chat phân tích thì phan trăm hiệu suấtthu hồi nằm trong những khoảng giới han chấp nhận khác nhau

Công thức tính hiệu suất thu hồi:

%H = “HT TH x 100%

Cc

Trong đó: Cmic: nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Cm: nồng độ chất phân tích trong mẫu

Cc: nông độ chuân thêm vào mau.

20