Nghiên cứu chiết tách, xác Định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) Ở tỉnh gia lai

Nhiều công trình khoa học nghiên cứu về cây mật nhân trên thế giới đã được công bố và được ứng dụng rộng rãi với kết quả phân lập được nhiều hợp chất hữu cơ có giá trị, các chiết

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ MINH ĐỨC

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CÂY MẬT NHÂN

(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) Ở TỈNH GIA LAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng – Năm 2024

Trang 2

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ MINH ĐỨC

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CÂY MẬT NHÂN

(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) Ở TỈNH GIA LAI

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng – Năm 2024

Trang 7

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH 7

DANH MỤC BẢNG 9

DANH MỤC VIẾT TẮT 10

MỞ ĐẦU 11

1 Lý do chọn đề tài 11

2 Mục tiêu nghiên cứu 12

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 12

3.1 Đối tượng nghiên cứu 12

3.2 Phạm vi nghiên cứu 12

4 Địa điểm nghiên cứu 12

5 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 12

5.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 12

5.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 12

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 13

6.1 Ý nghĩa khoa học 13

6.2 Ý nghĩa thực tiễn 14

7 Bố cục luận văn 14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1.1 Tổng quan về cây mật nhân 14

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học của cây mật nhân 18

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính sinh học của cây mật nhân 21

1.4 Khái quát về các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 22

1.5 Nhận xét chung về tình hình nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây mật nhân 26

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguyên liệu 28

2.2 Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ 29

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng thể 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Hiệu suất chiết xuất của rễ mật nhân 40

3.2 Kết quả định tính cao chiết rễ mật nhân 44

Trang 8

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 73

Trang 9

DANH MỤC HÌNH Số hiệu hình

vẽ, đồ thị

1.1 Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai 16

1.3 Nguyên tắc của quang phổ hấp thụ nguyên tử 26 2.1 Một số hình ảnh về rễ cây mật nhân 30 2.2 Hình ảnh chuột Swiss nuôi tại trường ĐHSP 31

2.6 Lò nung tại trường Sư phạm kỹ thuật Đà Nẵng 37

3.2 Kết quả định tính với thuốc thử Wagner 50 3.3 Kết quả định tính với thuốc thử Dragendorff 50 3.4 Kết quả định tính phản ứng với H2SO4 50 3.5 Kết quả định tính phản ứng với NaOH 51

3.10 Kết quả định tính phản ứng Salkowski 53

3.15 Hợp chất 9,10-dimethoxycanthin-6-one 66 3.16 Sắc ký đồ trong dung môi n-hexan 67 3.17 Sắc ký đồ trong dung môi cloroform 67

Trang 10

3.20 Đường chuẩn xác định EL4 (9,10-dimethoxycanthin-6-one) 69 3.21 Hàm lượng MDA (nmol/mL) trong gan chuột nhắt uống cao chiết

rễ mật nhân và paracetamol

72

3.22 Hoạt tính chống oxy hóa ở gan chuột 75 3.23 Hình ảnh đại thể tế bào nhu mô gan chuột nhắt 76

Trang 11

DANH MỤC BẢNG

1.1 Danh mục các hợp chất được phân lập từ cây mật nhân 21 3.1 Kết quả chiết xuất từ rễ cây mật nhân đến cao chiết tổng 45 3.2 Khảo sát pH của cao tổng rễ mật nhân trong metanol 48 3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại nặng trong cao chiết

toàn phần rễ mật nhân bằng metanol

Trang 12

DANH MỤC VIẾT TẮT

QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia Việt Nam

HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

ODT Mật độ quang của lô thí nghiệm

iNOS Enzyme tổng hợp oxit nitric

NAPQI (N-acetyl-p-benzoquinone imine)

Trang 13

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Mật nhân là một loại thực vật thân gỗ, có hoa thuộc họ Simaroubaceae (Thanh Thất) có

nguồn gốc từ Đông Nam Á Mật nhân có tên khoa học là Eurycoma longifolia jack hay còn gọi

là cây bách bệnh, ngoài ra còn có các tên theo địa phương như mật nhơn hay hậu phác nam

Nhiều công trình khoa học nghiên cứu về cây mật nhân trên thế giới đã được công bố

và được ứng dụng rộng rãi với kết quả phân lập được nhiều hợp chất hữu cơ có giá trị, các chiết xuất từ mật nhân được sử dụng để bổ sung vào sản xuất các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm

có lợi cho sức khỏe Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh, rễ cây mật nhân là thành phần

có giá trị nhất và được sử dụng để điều trị đau nhức, ăn uống không tiêu, no hơi, đầy bụng, sốt dai dẳng, sốt rét, suy dương, kiết lỵ, sưng tuyến và có thể dùng làm thuốc bổ tăng cường sức khỏe Các chiết xuất từ mật nhân đã được con người sử dụng để chống sốt rét, thuốc tăng trưởng hormone sinh dục và thuốc hạ nhiệt Ngoài ra, chiết xuất từ rễ cây mật nhân còn được dùng để khôi phục năng lượng và sinh khí, tăng cường lưu thông máu và có vai trò tốt đối với phụ nữ sau khi sinh con Bên cạnh đó, chiết xuất này còn chứa các hợp chất có hoạt tính chống khối u

và chống ký sinh trùng, chống loét Trong đó, được biết đến nhiều nhất là tác dụng làm tăng cường lượng hormone nội sinh testosterol ở nam giới

Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây ở Việt Nam cho thấy rễ cây mật nhân có khả năng gây độc tế bào ung thư lên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 rễ cây mật nhân cũng có tác dụng bảo vệ gan Các chất chống oxy hóa có trong rễ cây mật nhân giúp ngăn ngừa các tác động tiêu cực của các gốc tự do đến gan Ngoài ra, các hợp chất trong rễ cây mật nhân cũng có thể giúp tăng cường chức năng gan, giảm viêm và đẩy nhanh quá trình tái tạo tế bào gan

Ở nước ta, hiện nay, mật nhân không những được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền

mà còn có một số công trình nghiên cứu khoa học được công bố, khá nhiều hợp chất có giá trị được tìm thấy và đã ứng dụng mật nhân vào sản xuất một số sản phẩm

Đặc biệt, tỉnh Gia Lai có điều kiện tự nhiên và khí hậu phù hợp cho việc trồng mật nhân Vùng đất đỏ bazan cùng với lượng mưa phân bố đều qua các tháng trong năm tạo điều kiện lý tưởng cho cây mật nhân phát triển Huyện Chư Prong, cùng với một số huyện khác như Iagrai,

có thể đang trở thành điểm nóng về nguồn nguyên liệu mật nhân do có diện tích trồng cây mật nhân ngày càng tăng Đồng thời tình hình nghiên cứu về mật nhân còn hạn chế trong nước

Trên cơ sở kế thừa những nghiên cứu trước về rễ mật nhân ở huyện Iagrai, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

Trang 14

rễ cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) ở tỉnh Gia Lai” với đối tượng là rễ cây mật nhân

thu hái tại huyện Chư Prong

2 Mục tiêu nghiên cứu

Định danh một số hợp chất hóa học của của các phân đoạn và phân tích hàm lượng hoạt chất 9,10-dimethoxycanthin-6-one có trong các phân đoạn dịch chiết với các dung môi khác nhau

Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của dịch chiết methanol từ rễ cây mật nhân thu hái tại huyện ChưPrông - Gia Lai trên chuột bạch thử nghiệm chủng Swiss albino trưởng thành

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Rễ cây mật nhân được thu hoạch ở vùng núi tại huyện Chư Prông, tỉnh Gia Lai

- Chuột bạch thử nghiệm chủng Swiss albino trưởng thành

3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Khảo sát định tính các hợp chất chính có trong rễ cây mật nhân chiết xuất trong dung môi methanol và phân tích sơ bộ thành phần các phân đoạn dịch chiết n-hexan, CHCl3, EtOAc, MeOH bằng phương pháp GC-MS

- Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của dịch chiết methanol từ rễ cây mật nhân thu hái tại huyện ChưPrông - Gia Lai trên chuột chuột bạch thử nghiệm chủng Swiss albino trưởng thành

4 Địa điểm nghiên cứu

- Tại phòng thí nghiệm trường Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng, Viện Nghiên cứu

và Đào tạo Việt-Anh VN-UK và một số Trung tâm phân tích khác

5 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến các vấn đề: Thành phần hóa học của rễ cây mật nhân, hoạt tính sinh học của rễ cây mật nhân, công dụng bảo vệ gan, trị tiểu đường, kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng viêm, kháng oxy hóa

- Tham khảo các tài liệu về các quy trình, phương pháp xử lý mẫu rễ cây mật nhân

5.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

5.2.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý của dịch chiết

- Phương pháp chiết xuất

Rễ cây mật nhân sau khi được thu hái tại huyện Chư Prong tỉnh Gia Lai, được rửa sạch, phơi trong bóng râm đến khô, xay nhỏ làm nguyên liệu cho quá trình thu chiết cao

Bột mật nhân được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt bằng methanol, với sự hỗ trợ của sóng siêu âm Dịch chiết sau khi ngấm kiệt được thu hồi dung môi bằng cô quay chân không

Trang 15

- Phương pháp xác định hàm lượng tro (Ash Content Determination)

Phương pháp xác định hàm lượng tro (Ash Content Determination) là một phương pháp phân tích hóa học được sử dụng để xác định số lượng tro trong một mẫu Tro là phần còn lại của mẫu sau khi được đốt cháy ở nhiệt độ cao

- Phương pháp AAS

Phương pháp AAS (Atomic Absorption Spectroscopy - phân tích hấp thụ nguyên tử) là một phương pháp phân tích hóa học được sử dụng để xác định hàm lượng các nguyên tố kim loại trong các mẫu Phương pháp này hoạt động bằng cách đo lường lượng ánh sáng được hấp thụ bởi các nguyên tử kim loại trong mẫu, sau đó so sánh với một chuẩn độ để xác định hàm lượng nguyên tố trong mẫu

- Phương pháp GC-MS

GC-MS là viết tắt của Gas Chromatography-Mass Spectrometry, là một phương pháp phân tích hóa học được sử dụng để xác định thành phần hóa học của các mẫu hỗn hợp Phương pháp này kết hợp hai kỹ thuật phân tích khác nhau: sắc ký khí và phổ khối lượng Sắc ký khí được sử dụng để phân tách các thành phần hóa học trong mẫu, trong khi phổ khối lượng được

sử dụng để xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của các thành phần được phân tích

- Phương pháp HPLC

Phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatography) là một trong những phương pháp phân tích hóa học phổ biến trong thực tế Nó sử dụng một cột sắc ký lỏng để phân tách các hợp chất trong mẫu dựa trên tính chất hóa học của chúng HPLC có thể được sử dụng

để phân tích các hợp chất hữu cơ, vô cơ và sinh học trong các mẫu khác nhau

- Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê khoa học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (Data analysis) của Microsoft Excel

5.2.2 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

- Phương pháp thử độc tính cấp

Xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành

- Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng ức chế peroxidation lipid

- Phương pháp khảo sát hoạt tính bảo vệ gan In vivo

- Phương pháp xác định chức năng gan

- Phương pháp kiểm tra trực quan gan

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

6.1 Ý nghĩa khoa học

Trang 16

- Cung cấp thông tin khoa học về thành phần hoá học và hoạt tính bảo vệ gan của dịch chiết methanol từ rễ cây mật nhân thu hái tại huyện ChưPrông - tỉnh Gia Lai Góp phần làm phong phú thêm nguồn tư liệu về nguồn dược liệu thiên nhiên của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng

- Là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu sau này

6.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính bảo vệ gan trong điều kiện

In vivo của dịch chiết của rễ mật nhân góp phần cung cấp dữ liệu làm cơ sở khoa học về hoạt

tính sinh học của các bài thuốc dân gian đã sử dụng cây mật nhân trong thực tiễn

- Kết quả phân tích hàm lượng hoạt chất 9,10-dimethoxycanthin-6-one trong các phân đoạn dịch chiết của rễ mật nhân góp phần định hướng nghiên cứu ứng dụng các phân đoạn giàu hoạt chất tạo ra các sản phẩm bổ sung cho sức khỏe mới, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của thân cây mật nhân tại Gia Lai

7 Bố cục luận văn

Bố cục của luận văn:

- Mở đầu

- Chương 1 Tổng quan tài liệu

- Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm

- Chương 3 Kết quả và bàn luận

- Kết luận và kiến nghị

- Tài liệu tham khảo

- Phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây mật nhân

1.1.1 Đặc điểm sinh thái, phân bố

Mật nhân, còn gọi là bá bệnh, hậu phác, tho nan (Lào), antongsar (Campuchia), danh

pháp khoa học: Eurycoma longifolia Jack, là loại cây có hoa thuộc họ Thanh Thất Simaroubaceae, loài bản địa ở Malaysia, Indonesia, Việt Nam, mật nhân phân bố ít hơn ở

Thái Lan, Lào và Ấn Độ Ở Indonesia, cây mật nhân tự nhiên mọc duy nhất ở Sumatra và Kalimanta

Cây mật nhân (hình 1.1) là loại cây nhỏ có cành, bụi thân mảnh, sinh trưởng ở tầng rừng thấp, trên đất sỏi, ưa chua và dẫn lưu nước tốt Cây có kích thước trung bình, có thể cao đến 10

m, thường không phân nhánh Lá kép lông chim chẵn có thể dài đến 1m, cuống lá màu nâu đỏ

Trang 17

Mỗi lá kép gồm 30 – 40 lá chét, hình mũi mác hoặc hình trứng ngược Mỗi lá chét dài khoảng (5 – 20) cm, rộng (1,5 – 6) cm, mặt trên của lá màu xanh, mặt dưới màu trắng Hoa mọc thành cụm hình chùy ở nách lá, màu đỏ nâu, có nhiều lông tơ mịn Hoa lưỡng tính, cánh hoa nhỏ, rất mềm Quả hạch cứng, hình trứng, nâu vàng khi còn non và trở thành nâu đỏ khi chín Vỏ và rễ của mật nhân thường có màu trắng hoặc vàng ngà [1],[2]

Hình 1.1 Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai

Mật nhân thường mọc ở vùng đồi núi có sườn dốc cao, vùng đất cát có tính acid, nghèo chất dinh dưỡng mọc dưới tán cây, thích hợp ở những nơi có nhiệt độ trung bình 25 0C và độ ẩm khoảng (80 – 90) % mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và các khu rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa acid và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so với mực nước biển[1], [7]

Mật nhân được xem là loại thảo dược quý, các bộ phận của cây mật nhân gồm lá, quả, thân, đặc biệt là rễ có tác dụng điều trị nhiều bệnh Hiện nay, mật nhân được dùng rộng rãi ở rất nhiều nơi trên thế giới, trong đó, có ở cả ở châu Âu, Hoa Kỳ, dưới dạng thực phẩm bổ sung

và nước uống [8]

Cây mật nhân mọc nhiều nơi ở nước ta, nhưng phổ biến nhất là ở miền Trung và một số vùng Tây Nguyên như: Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Gia Lai, trong đó, ở vùng núi tỉnh Gia Lai như huyện Kbang, huyện Ia-Grai, cây mật nhân mọc tự nhiên rất nhiều và được khai thác với số lượng lớn [4], [7]

1.1.2 Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian

Mật nhân là một loại thảo dược có giá trị, theo Đông y, cây mật nhân có vị đắng, tính

Trang 18

ấm, có thể chữa nhiều bệnh nên còn có tên là bá bệnh như: Ăn không tiêu, tiêu chảy, nôn mữa, kiết lỵ… Nước sắc lá cây trị ghẻ lở, mụn nhọt Các quassinoid từ rễ có tác dụng diệt kí sinh

trùng sốt rét Plasmodium [9]

Theo nội dung trong sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi, trong vỏ cây mật nhân có chứa một chất đắng gọi là quassin Vỏ cây dùng để chữa những trường hợp

ăn uống không tiêu, đau mỏi lưng Quả của cây này dùng để chữa lỵ [2]

Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi, người ta dùng rễ cây mật nhân thái nhỏ, tẩm rượu sao để làm thuốc, có vị đắng, tính mát Thường dùng chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu, tức ngực, gân xương yếu, tay chân tê đau, tả lỵ, nôn mửa Ngoài ra, rễ mật nhân còn dùng để chữa tứ thời cảm mạo [2]

Tại Việt Nam, rễ, vỏ và quả cây được dùng sắc thuốc, vị rất đắng Thuốc được dùng trị tẩy giun, sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc, đầy bụng, và cả say rượu Khi dùng ngoài da có thể trị ghẻ lở

Có lẽ vì đa dụng nên cây này còn được gọi là bách bệnh Ngoài ra mật nhân còn có khả năng tăng cường tetosterone bên trong nam giới, cây dùng như vị thuốc bổ giúp năm giới tăng cường chức năng sinh lý và sức khỏe tình dục, bổ sung năng lượng cho cơ thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hóa, giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể [8]

Các kết quả nghiên cứu đã được chứng minh rõ ràng trên phương diện khoa học và đã được công bố rộng rãi cho thấy, mật nhân các tác dụng dược lý linh hoạt bao gồm hoạt tính chống ung thư, chống sốt rét, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích tình dục, chống viêm, chống loét, chống đái tháo đường

Hoạt tính kháng sốt rét: Một nghiên cứu tiến hành với dịch chiết rễ mật nhân trên Plasmodium falciparum với mô hình lactate dehydrogenase cho thấy bốn quassinoid gồm

eurycomalactone; 13,21-dihydroeurycomanone; 13-α-(21)-epoxyeurycomanone; eurycomanone đều có tác dụng kháng sốt rét, trong đó, eurycomanone cho tác dụng mạnh nhất [36]

Tác dụng trị tiểu đường: Bệnh đái đường (hay tiểu đường) là một bệnh mãn tính, do rối

loạn chuyển hoá hydrat cacbon vì thiếu insulin ở các mức độ khác nhau, do đó, nó gây tăng đường huyết và nếu vượt quá ngưỡng thì có đường niệu (nước tiểu có đường) Insulin là hormone do tụy tiết ra, khi dòng máu mang glucose đến các cơ quan, insulin sẽ giúp glucose đi vào trong tế bào và giúp tế bào sử dụng glucose để sinh ra năng lượng cho hoạt động của các tế bào Khi thiếu insulin, cơ thể sẽ không sử dụng được glucose, hậu quả là glucose trong máu sẽ tăng cao và xuất hiện trong nước tiểu Do đó, để điều trị bệnh này có thể bằng các cách làm chậm hấp thu đường glucose từ ruột vào máu, tăng hoạt tính của insulin, kích thích tế bào bêta

Trang 19

của tụy tăng sản xuất insulin… Một trong những nguyên nhân làm tăng lượng glucose vào máu

đó là do sự có mặt của enzyme α-glucosidase Lá và rễ cây mật nhân đã được dùng để kiểm soát đường huyết Năm 2004, nhóm nghiên cứu của Husen và cộng sự đã thử dịch chiết nước của rễ mật nhân ở ba liều (50 mg/kg; 100 mg/kg và 150 mg/kg) theo mô hình steptozotocin trên chuột bình thường và chuột có đường huyết cao, kết quả cho thấy ở nồng độ 150 mg/kg cao nước rễ mật nhân có khả năng làm hạ đường huyết ở lô thử và không gây giảm có ý nghĩa ở lô

đối chứng [69]

Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn là hoạt tính sinh học cho thấy khả năng

tiêu diệt hoặc ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật Hầu hết các loại vi sinh vật gây độc đối với sức khỏe con người thường được sử dụng trong việc nghiên cứu về hoạt tính kháng

khuẩn của thực vật như: Tụ cầu vàng (S.aureus), E.coli, Samonella, P.aeruginosa … Năm 2007,

nhóm nghiên cứu Farouk cùng cộng sự đã thử nhiều dịch chiết khác nhau (methanol, ethanol, acetone, nước) từ lá, thân và rễ mật nhân trên hoạt tính kháng khuẩn Gram (-) và (+) Kết quả cho thấy dịch chiết lá và thân có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (-) và (+), ngoại trừ hai chủng

Gram (-) là Escherichia coli và Salmonella typhi Dịch chiết nước từ lá cũng có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng Staphylococcus aureus và Serratia marscesens [70]

Tác dụng kích thích sinh dục: Đây là tác dụng chính, vượt trội của cây mật nhân, đã

được chứng nhận và công bố rộng rãi với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới Đó là khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormone giới tính nam (testosterone) một cách tự nhiên, duy trì sự hưng phấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm khi bước vào tuổi trung niên Theo kết quả nghiên cứu vào năm 2010 của nhóm Mohd Ismail Bin và cộng sự cho thấy, 76 trong số 320 bệnh nhân mắc chứng suy sinh dục khởi phát muộn (LOH) đã được cung cấp 200 mg dịch chiết mật nhân tiêu chuẩn trong 1 tháng Các triệu chứng lão hóa nam giới (AMS) theo thang đánh giá tiêu chuẩn

và nồng độ testosterone trong huyết thanh đã được theo dõi Kết quả cho thấy điều trị bệnh nhân LOH với chiết xuất mật nhân này (P <0,0001) đã cải thiện điểm AMS cũng như nồng độ testosterone trong huyết thanh [71]

Tác dụng kháng ung thư: Năm 2018, nhóm tác giả Thu Hnin E và cộng sự đã công bố,

eurycomanone là một trong những hợp chất dược liệu mạnh nhất của mật nhân, chúng thể hiện được hiệu quả cao trong việc chống ung thư biểu mô phổi (tế bào A-549) và ung thư vú (tế bào MCF-7) và cho thấy hiệu quả trung bình chống lại ung thư dạ dày (tế bào MGC-803) và ung thư biểu mô đường ruột (tế bào HT-29) [72].

Bên cạnh đó, năm 2018, nhóm tác giả Chunxin Zou và cộng sự đã công bố, tám hợp chất trong mật nhân thuộc các dẫn xuất squalene, biphenyl, neolignans và alkaloids được dự

Trang 20

đoán là có tiềm năng hoạt động ức chế ung thư gan [74].

Hoạt tính kháng viêm: Năm 2018, nhóm nghiên cứu Lê Thanh Liêm cùng cộng sự đã

công bố kết quả: Chiết xuất alkaloid từ rễ cây mật nhân tại Kỳ Sơn – Nghệ An đã cho thấy tác

dụng chống viêm đáng kể ở cả mẫu in vitro và in vivo Dịch chiết này thể hiện hoạt động chống

viêm thông qua việc ức chế các chất trung gian gây viêm như NO, iNOS và COX-2 và bảo vệ chuột khỏi tử vong do LPS gây ra trong mô hình sốc nhiễm trùng [39]

Hoạt tính kháng oxy hóa: Khả năng kháng oxy hóa của một chất là khả năng làm ức chế

quá trình oxy hóa của các phân tử khác Oxy hóa là một phản ứng hóa học có thể tạo ra các gốc

tự do, dẫn đến các phản ứng dây chuyền có thể làm hỏng các tế bào Các chất kháng oxy hóa như thiolis hay vitamin C có thể chấm dứt các phản ứng dây chuyền này để ngăn cản quá trình oxy hóa xảy ra Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Varghese và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa và kết luận rằng dịch chiết mật nhân trong cồn thể hiện hoạt động kháng oxy hóa ở tất cả các nồng độ (10, 25, 50, 100 và 250 μg/mL) Khả năng kháng oxy hóa của chiết xuất này được so sánh với các giá trị của ascorbic acid [73]

Ngoài ra, theo phát hiện của nhóm nghiên cứu Hulol Saleh Alruhaimi và cộng sự vào năm 2019 ở Malaysia cho thấy, mật nhân có tác dụng bảo vệ thần kinh đối với giảm máu đến

não mãn tính (chronic cerebral hypoperfusion) bằng cách tăng cường khả năng chống oxy hóa

và giảm peroxide hóa và viêm, có thể cải thiện chức năng nhận thức ở chuột [73].

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học của cây mật nhân

Nhóm nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Dược Hiroshima, Nhật (1982) đã phân lập được hai hợp chất quassinoid có số oxy hoá cao có tên là eurycomanone và eurycomanol từ rễ cây mật nhân có nguồn gốc Indonesia [17] Nhóm nghiên cứu của K.L.Chan và cộng sự (1986)

đã tìm thấy hợp chất mới thuộc nhóm quassinoid là 3,4-dihyroeurycomalacton, dehyroeurycomalacton, 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalacton và nhóm alkaloid có tên là 10-

5,6-hydroxycantin- 6-on, tinh thể màu vàng từ cao ête dầu trích từ rễ cây mật nhân Ngoài ra, từ cao cloroform của rễ cây cũng phát hiện được một hợp chất coumarin là scopoletin [18] Nhóm

nghiên cứu của K L Chan và cộng sự (1989) đã phân lập được một quassinoid glycoside có tên

là eurycomanol-2-O- 𝛽-D-glucopyranosid trích từ cao n- butanol của rễ cây mật nhân [19]

Năm 1982, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sương và công sự đã phân lập được hai hợp chất laurycolactone A và laurycolactone B, chúng là các quassinoid có bộ khung cơ bản C18 [20]

Tiếp theo vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của K L Chan và cộng sự đã phân lập được

từ hợp chất 13β,18-dihydroeurycomanol, kết tinh trong methanol từ dịch trích từ rễ cây với ête dầu [21]

Trang 21

Nhóm Kadono và công sự đã công bố kết quả nghiên cứu các thành phần gây độc tế bào và chống sốt rét của rễ, đã phân lập được bốn alkaloid thuộc nhóm canthin- 6-one đó là 9-methoxycanthin-6-one, 9-methoxycanthin-6-one-N-oxide, 9-hydroxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxide và -carboline-1-propionic acid vào năm 1991 [22]

Cũng vào năm 1991, nhóm nghiên cứu của H Tada và cộng sự đã phân lập được hợp chất paskbumin A eurycomanon và hai hợp chất mới cũng có khung sườn quassinoid là pasakbumin B, pasakbumin C từ cao chiết methanol [23] Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học y dược, Tokyo - Nhật trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây mật nhân đã phân lập được hai hợp chất mới với khung squallan Đây đồng thời là hai đồng phân lập thể của nhau, một là eurylen, một là teurylen, cả hai đều có dạng tinh thể không màu, có công thức phân tử là C34H58O8 [24]

Năm 1993, nhóm nghiên cứu của H Itokawa và cộng sự đã phân lập được một hợp chất mang khung squallan tên là longilen peroxide, là một hợp chất không màu, có công thức phân

tử là C30H52O8 [25]

Vào năm 2014, nhóm nghiên cứu của Seon Ju Park và cộng sự đã phân lập và định danh cấu trúc của năm hợp chất thuộc nhóm quassinoid: Eurylactone E ,eurylactone F, eurylactone

G, eurycomalide D, and eurycomalide E [26]

Năm 2015, nhóm nghiên cứu Lê Thị Huyền và cộng sự đã phân lập được 3 chất thuộc nhóm quassinoid từ dịch chiết methanol của rễ cây mật nhân tại tỉnh Đăk Lăk: Pasakbumin-C, 13α,21-epoxyeurycomanone and eurylactone A [27]

Năm 2017, nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Tùng và cộng sự đã tìm ra một quassinoid glycoside mới và thành phần hoạt chất tiềm năng eurycomanone từ E longifolia trong điều trị bệnh bạch cầu từ rễ cây mật nhân ở Malaysia [28]

Năm 2021, Từ rễ cây mật nhân ở miền Trung – Tây Nguyên, Võ Khánh Hà và cộng sự đã phân lập được một số hợp chất từ rễ cây mật nhân tại huyên Iagrai tỉnh Gia Lai: β-carboline-1-propionic acid và infractine lần đầu tiên được công bố; 9,10-dimethoxycanthin-6-one; β-carboline-2N-oxide-1-propionic acid lần đầu tiên được phân lập từ rễ mật nhân; eurycomanone cùng eurycomanol và 14,15β-hydroxy klaineanol [9]

Trang 22

Bảng 1.1 Danh mục các hợp chất được phân lập từ cây mật nhân

tham khảo

9 15 -hydroxyklaineaone, longilactone, 2-hydroxylongilactone-

4(18)-ene, eurycomaoside, 13,21-dihydroeurycomaone, 14,15–

dihydroxyklaineanone

[27]

10 12-acetyl-13, 21-dihydroeurycomanone, longilene peroxide, eurylene,

14,15p-dihydroxyklaineanone, triperpenes, 14- deaacteyl eurylene,

eurycomalactone E, 9-methoxycanthin 6- one-N-oxid, eurycomalactone

F,

9-hydroxycanthin-6-one,5-iso-eurycomadilactone,9-hydroxycanthin-6-one-N-oxid,6-dehydroxylongilactone,biphenylneolignans,7-

hydroxyeurycomalactone, eurycomalactone D, 6acetoxy14,15

-dihydroxyklaineanone, 18-dehydro-6 - hydroxyeurycomalactone,

12-epi-11-dehydroklaineanone, eurycomalactone, 11-dehyroklaineanone,

dihydroniloticin, 9- metoxycanthin-6-one, eurycomalide B,

eurycomalide A, 15 - O-acetyl-14-hydroxyklaineanone, hispidone,

piscidinol, bourjotinolone, 14-ep-13,21-dihydro eurycomaone,

3-episapeline, 6-14,15-trihydroxyklaineanone, melianone,

9,10-[28]

Trang 23

dimetoxycanthin-6-one, 7-methoxyinfractin, 13 ,21-

dihydroeurycomaone, 2,3-dihyroxy-1- propan-1-one,

dehydrolongilactone, 7-methoxy- -carboline-1-propionic acid,

2,3-dehydro-4a-hydroxylongilactone, pasakbumin D

11 β-carboline-1-propionic acid, infractine, 9,10-dimethoxycanthin-6-one,

β-carboline-2N-oxide-1-propionic acid, eurylen, eurycomanone,

eurycomanol, 14,15β-hydroxy klaineanol

[9]

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính sinh học của cây mật nhân

Năm 1989, K L Chan và cộng sự đã thử nghiệm dịch chiết của rễ cây mật nhân cho thấy

có họat tính chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum trong điều kiện in vitro Các hợp chất phân lập trong cây mật nhân là: 10-hydroxycanthin-6-one, eurycomalactone, eurycomanone và eurycomanol cho tác dụng chống sốt rét [17]

Năm 1991, nhóm nghiên cứu của Kardono và cộng sự đã phân lập được năm thành phần

có khả năng gây độc tế bào từ rễ mật nhân từ vùng Kalimantan, Indonesia, có một quassinoid

là eurycomanone có tác dụng gây độc tế bào chống một số dòng tế bào ung thư như: Vú, đại tràng, phổi, da, các dòng tế bào kháng thuốc KB, KB-V1 và bệnh bạch cầu (P-388) Ngoài ra các hợp chất eurycomanone và 7-methoxy-P- carboline-1-propionic acid cho thấy chống lại ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum [18]

Năm 1991, nhóm nghiên cứu của H.Itokawa và cộng sự đã phát hiện một số hợp chất thuộc nhóm triterpen với khung tirucallan, niloticin, hydroniloticin, piscidinol A, bourjotinolon

A, 3-episapelin A, melianon, hispidon, các hợp chất này được công bố có độc tính đối với một

số loại tế bào ung thư [24]

Năm 2004, nhóm nghiên cứu của Kuo và cộng sự đã phân lập và xác định được gần 65 hợp chất từ rễ mật nhân Trong đó tám hợp chất đã chứng minh khả năng gây độc mạnh đối với dòng

tế bào ung thư phổi (A-549), bảy hợp chất tác chống lại dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Hai trong số các hợp chất có tác dụng mạnh với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum [31]

Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Dương Thị Ly Hương và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống trắng ở dịch chiết nước rễ cây mật nhân nhận thấy rằng ở liều uống 10 mL/kg thể trọng, trọng lượng các cơ quan sinh dục cơ nâng hậu môn, tinh hoàn, túi tinh đều tăng hoặc có xu hướng tăng ở các lô chuột uống dịch chiết rễ mật nhân Mức độ tăng

ở lô dùng testosterol cao hơn rất nhiều so với lô dùng mật nhân (p < 0,0001) [32]

Khoảng thời gian từ năm 2010 đến năm 2012, nhóm nghiên cứu Tambi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trực tiếp trên người, tiến hành cho 76 người trong 320 người bệnh nhân

Trang 24

bị suy giảm testosterol uống mật nhân với liều 200 mg trong vòng một tháng Kết quả là có sự tăng testosterol trong huyết thanh [33]

Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Khanam và cộng sự đã nghiên cứu và chỉ ra rằng: Các hợp chất phenolic, flavonoid, terpenoid, alkaloid, protein trong chiết xuất từ thân cây và từ rễ thể hiện hoạt động kháng khuẩn, tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đã được quan sát chống lại vi khuẩn gram dương bằng cả chiết xuất từ thân và rễ Tuy nhiên, chiết xuất từ thân cây mạnh hơn chiết xuất từ rễ chống lại Bacillus cereus và Staphylococcus aureus [38]

Năm 2017, nhóm tác giả Trần Thu Trang và cộng sự đã khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên cây bá bệnh tại vườn quốc gia Bái Tử Long, khu bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh Kết quả cho thấy cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên ức chế sản xuất cytokine gây viêm Cao chiết methanol từ rễ tơ

và rễ tự nhiên có hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở mức trung bình Tuy nhiên, cả hai loại cao chiết nghiên cứu đều không có khả năng ức chế quá trính peroxy hoá lipid (IC50 > 100) [35]

Năm 2018, nhóm tác giả Lê Thanh Liêm và cộng sự đã phân lập và chứng minh hoạt tính kháng viêm của hợp chất 9,10-dimethoxy-canthin-6-one có trong rễ cây mật nhân tại Kỳ Sơn – Nghệ An [39]

Năm 2020, nhóm nghiên cứu Ying Zhang và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO của dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân tại Thái Lan [35]

Năm 2021, nhóm nghiên cứu Võ Khánh Hà và cộng sự đã phân lập và chứng minh khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO của dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân ở khu vực miền Trung – Tây Nguyên, đạt 50,41 % (ở nồng độ 200 µg/mL) với giá trị IC50 đạt 198,87 ± 9,05 µg/mL [9]

Với những kết quả nghiên cứu nêu trên cho thấy, cây mật nhân, đặc biệt là rễ rất có giá trị, chúng thể hiện hoạt tính sinh học phong phú và giá trị cao Tuy nhiên nghiên cứu về rễ cây mật nhân ở huyện Chuprong, tỉnh Gia Lai còn nhiều hạn chế về số lượng nghiên cứu Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu về chiết xuất từ rễ cây mật nhân thu hái ở huyện Chuprong, tỉnh Gia Lai, nhằm cung cấp thêm những thông tin khoa học về loại cây quý này

1.4 Khái quát về các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1.4.1 Phương pháp chiết xuất

Có nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau được sử dụng khi nghiên cứu hợp chất thiên nhiên

- Ngâm chiết: là phương pháp chiết xuất dựa trên sự hòa tan của dung môi trong một thời gian dài để thu nhận các hợp chất từ nguyên liệu [3]

Trang 25

- Chiết Soxhlet: là phương pháp sử dụng thiết bị Soxhlet để chiết xuất các hợp chất kém hòa tan trong dung môi [3]

- Chiết bẳng lò vi sóng: là phương pháp sử dụng năng lượng vi sóng để tăng tốc quá trình chiết xuất [3]

- Chiết bằng sóng siêu âm: là phương pháp sử dụng năng lượng siêu âm để tạo ra các sóng xung kích, tăng cường sự thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu [3]

- Chiết bằng CO2 siêu tới hạn: là phương pháp sử dụng carbon dioxide ở trạng thái siêu tới hạn (trạng thái mà CO2 có cả tính chất của lỏng và khí) làm dung môi [3]

Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chúng tôi lựa chọn phương pháp ngâm chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở nhiệt độ 50-60oC

1.4.2 Phương pháp GC-MS

Phương pháp GC-MS, hay Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Nguyên Tắc: GC-MS kết hợp cả sắc ký khí (GC) và phổ khối lượng (MS) để phân lập

và xác định cấu trúc của hợp chất thường được sử dụng để phân tích và định danh những hợp chất có tính chất rễ bay hơi [40] Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi sử dụng để định danh một

số hợp chất trong các phân đoạn dịch chiết

- Nguyên tắc đo lường AAS (phép đo phổ hấp thụ nguyên tử)

Cơ sở lý thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lượng bởi một nguyên tử tự do ở trạng thái hơi (khí) khi chiếu một chùm bức xạ đơn sắc qua hơi của nguyên tố đó trong môi trường hấp thụ [40]

Hình 1.2 Hệ thống quang phổ hấp thụ AAS

Trang 26

(Nguồn: Tác giả)

Các bước để thực hiện phép đo AAS như sau [40]:

- Quá trình nguyên tử hóa mẫu: chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hoặc

dung dịch) sang trạng thái hơi của nguyên tử tự do Mục đích của quá trình này là tạo ra một

đám mây nguyên tử tự do từ mẫu cần phân tích, làm môi trường hấp thụ bức xạ và tạo ra phổ

hấp thụ nguyên tử Mẫu phân tích có thể được nguyên tử hóa bằng kỹ thuật nguyên tử hóa ngọn

lửa hoặc không ngọn lửa

- Chọn nguồn sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tố cần phân tích rồi chiếu

chùm sáng đơn sắc đó vào đám mây hơi của nguyên tố cần phân tích Các nguyên tử của nguyên

tố được xác định sẽ hấp thụ một số tia bức xạ và tạo ra phổ hấp thụ của nó Phần cường độ của

chùm ánh sáng được nguyên tử hấp thụ sẽ phụ thuộc vào nồng độ của nó trong môi trường hấp

thụ

- Thu toàn bộ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, tách chúng thành một quang

phổ và chọn vạch quang phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích vào khe đó để đo cường độ

của chúng Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch hấp thụ

- Ghi tín hiệu và đo kết quả cường độ hấp thụ bằng thiết bị phù hợp

- Các linh kiện trong máy quang phổ hấp thụ AAS (Hình 2.10)

Hình 1.3 Nguyên tắc của quang phổ hấp thụ nguyên tử [40]

Nguồn đơn sắc

Nguồn đơn sắc là nguồn phát ra chùm bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần phân tích, chùm

bức xạ phải có cường độ ổn định, có thể lặp lại cho nhiều phép đo khác nhau trong cùng điều

Trang 27

kiện và phải điều chỉnh được để có cường độ yêu cầu cho mỗi phép đo Nguồn đơn sắc thường

là đèn catot rỗng

Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích

Bộ phận nguyên tử hóa mẫu chuyển đổi mẫu cần phân tích từ trạng thái ban đầu thành dạng hơi của các nguyên tử tự do dưới tác động của nhiệt độ Đám mây nguyên tử tự do này là

môi trường hấp thụ bức xạ và tạo ra quang phổ hấp thụ nguyên tử

Phương pháp HPLC là viết tắt của "High Performance Liquid Chromatography" hoặc

"High Pressure Liquid Chromatography", được dịch là Sắc ký Lỏng Hiệu Suất Cao Đây là một kỹ thuật phân tích hóa học được sử dụng rộng rãi để tách, định tính và định lượng các hợp chất trong mẫu HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc của sắc ký Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi sử dụng để định danh và phân tích định lượng hợp chất 9,10-dimethoxycanthin-6-one

1.4.5 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

- Phương pháp thử độc tính cấp

Xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành Mẫu được cho uống với liều cao nhất có thể và giảm dần Sau khi cho uống cao chiết chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục và đánh giá Đồng thời, chuột chết

sẽ được mổ để xét nghiệm đại thể [13]

- Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng ức chế peroxidation lipid (thử nghiêm MDA) Phương pháp xác định hàm lượng MDA và hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết toàn phần rễ mật nhân trên gan chuột nhắt dịch tương đồng Thực hiện theo phương pháp của Stroev và Makarova (1989), Jelili và cộng sự (2011), có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Xác định khả năng ức chế quá trình peroxid hóa lipid của mẫu nghiên cứu bằng cách xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA)

Nguyên lý của phương pháp:

MDA là sản phẩm phụ của quá trình peroxid hóa lipid màng MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric tạo thành phức hợp triethylene (màu hồng) có đỉnh hấp thụ cực đại

ở bước sóng λ = 530 – 532 nm

Trang 28

Nguyên lý của phương pháp: MDA là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 – 532 nm [14]

- Phương pháp khảo sát hoạt tính bảo vệ gan In vivo

Để xác định hoạt tính bảo vệ gan bằng Paracetamol, chia chuột thành các lô đối chứng nuôi ổn định chuột và gây độc gan bằng Paracetamol ở các lô nghiên cứu Cho uống dịch chiết với các nồng độ khác nhau Sau đó lấy máu đo các chỉ số và mổ chuột để quan sát gan [15]

-Phương pháp xác định chức năng gan

Xác định chức năng gan thông qua định lượng aminotransferase (AST, ALT), cholesterol toàn phần và protein toàn phần trong huyết thanh chuột [16]

- Phương pháp kiểm tra trực quan gan

1.5 Nhận xét chung về tình hình nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây mật nhân

Từ những thông tin tổng hợp ở trên cho thấy, nghiên cứu về cây mật nhân, đặc biệt là rễ của chúng đã được triển khai và công bố ở nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam chúng ta Nhiều hợp chất mới được phát hiện trong thành phần hóa học và nhiều đặc tính dược lý có giá trị đã được khảo sát và công bố trên các tạp chí khoa học uy tín Rất nhiều nước trên thế giới đã công bố các sản phẩm thực phẩm hỗ trợ sức khỏe được chế biến từ mật nhân, trong

đó có Mỹ, một số nước châu Âu, Nhật, Singapore, Malaysia.v.v [75]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về mật nhân đã công bố tương đối nhiều, kết quả được thực hiện trên nhiều nguồn nguyên liệu trên cả nước Tuy nhiên, đa phần là những nghiên cứu quy mô nhỏ, dưới dạng các bài báo khoa học chuyên ngành, chưa có nghiên cứu nào mang tính hệ thống

và tính định hướng từ khảo sát nguyên liệu, chiết tách, thăm dò hoạt tính sinh học và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt đối với mật nhân tại khu vực miền Trung và Tây Nguyên, mặc dù thực tế, rễ cây mật nhân được bày bán khá phổ biến, đặc biệt là ở Quảng Nam, Huế và Gia Lai Bên cạnh đó, trên thị trường đã có một số sản phẩm dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ loài cây này Hiện chưa nhiều các sản phẩm ứng dụng mật nhân được sản xuất và kinh doanh mang tính thị hiếu vừa có tác dụng hỗ trợ sức khỏe, vừa có chức năng giải khát Tuy nhiên nghiên cứu về rễ cây mật nhân ở huyện Chuprong, tỉnh Gia Lai còn nhiều hạn chế về số lượng

nghiên cứu Những nghiên cứu sàng lọc ban đầu trên tế bào gan mới dừng ở nghiên cứu In vitro

Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi chọn đối tượng nghiên cứu là chiết xuất từ rễ cây mật nhân thu hái ở huyện Chuprong, tỉnh Gia Lai nhằm cung cấp thêm những thông tin khoa học về loại cây quý này góp phần bảo tồn và sử dụng nguồn gen quý cây mật nhân tại Tây Nguyên Đồng thời, kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính bảo vệ gan trong

Trang 29

điều kiện In vivo của dịch chiết của rễ mật nhân góp phần cung cấp dữ liệu làm cơ sở khoa học

về hoạt tính sinh học của các bài thuốc dân gian đã sử dụng cây mật nhân trong thực tiễn

Nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:

- Định danh một số hợp chất hóa học của của các phân đoạn được tách từ dịch chiết rễ cây mật nhân thu hái tại huyện Chư Prong thuộc tỉnh Gia Lai và phân tích hàm lượng hoạt chất 9,10-dimethoxycanthin-6-one có trong các phân đoạn dịch chiết

- Thu nhận cao chiết tổng và thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính bảo vệ gan chuột trong điều kiện invivo trên mô hình chuột nhắt thử nghiệm chủng Swiss albino trưởng thành bị gây tổn thương gan bằng paracetamol

- Kết quả phân tích hàm lượng hoạt chất 9,10-dimethoxycanthin-6-one trong các phân đoạn dịch chiết của rễ mật nhân góp phần định hướng nghiên cứu ứng dụng các phân đoạn giàu hoạt chất tạo ra các sản phẩm bổ sung cho sức khỏe mới, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của thân cây mật nhân tại Gia Lai

Trang 30

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu: Rễ cây mật nhân được xử lý để loại bỏ tạp chất và bụi bẩn, rửa sạch rồi phơi khô Sau khi sấy khô, chúng có mùi thơm đặc trưng Chia thành các lát mỏng rồi sấy khô ở nhiệt độ 50oC trong 24 giờ, độ ẩm khoảng (10 ÷ 12) %, nghiền thành bột có kích thước

từ (0,5 ÷ 1) mm, đóng gói, bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm để phục vụ cho các nội dung nghiên cứu [6,9,36]

(a) Chưa chế biến (b) Sau khi băm nhỏ (c) Bột rễ mật nhân

Hình 2.1 Một số hình ảnh về rễ cây mật nhân

2.1.2 Nguyên liệu động vật

Chuột bạch chủng Swiss albino trưởng thành, từ 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, không mắc bệnh, không phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, nặng 40-45 gam, số lượng 60 con (nguồn: Viện Dịch tễ Hà Nội) Nuôi chuột ổn định trong 10 ngày tại Phòng thí nghiệm Di truyền

- Giải phẫu - Sinh lý động vật, Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do (Quá trình cho chuột ăn thường vào sáng sớm vì chuột có tập tính ngủ ngày và thức khuya) đêm, tránh ảnh hưởng đến sinh lý của chuột) [42,44] Việc nghiên cứu chuột theo quy định của Ủy Ban Đạo Đức Động Vật

Trang 31

Hình 2.2 Hình ảnh chuột Swiss nuôi tại trường ĐHSP

2.2 Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ

2.2.1 Hóa chất và vật tư

- Hóa chất, dung môi hữu cơ: Cloroform, n-hexan, ethyl acetate, methanol, acetic acid

- Thuốc thử: Dragendorff, Trim-Hill, Wagner, Lugol, Fehling A, Fehling B

- Hóa chất vô cơ: H2SO4 đặc, HNO3 đặc, NaOH, HCl, FeCl3, Na2CO3

- Một số hóa chất khác đều có cấp độ phân tích và được sử dụng mà không cần thanh lọc thêm: Paracetamol, S lymarin, TCA (Acid Tricloacetic), TBA (Acid thiobarbituric)

Thiết bị bao gồm:

- Cân phân tích, d = 0,0001 g (Model: TDX-A300, Marcus, Germany);

- Cân phân tích, d = 0,01g

- Tủ sấy (Model: UNB-400, Memmert, Đức);

- Máy cô đặc chân không (Model: Hei-VAP precision, Heidolph, Đức);

Trang 32

- Thiết bị sóng siêu âm

Trang 33

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng thể

Hình 2.3 Tổng quan nội dung nghiên cứu

Rễ cây mật nhân được thu hái tại huyện Chưprông - tỉnh Gia Lai và nguồn nguyên liệu được khảo sát, đánh giá, lựa chọn để sử dụng cho toàn bộ quá trình nghiên cứu Rễ cây được

xử lý sơ bộ, nghiền thành bột, sau đó được chiết xuất trong metanol (MeOH) và loại bỏ MeOH bằng máy cô quay chân không để tạo ra cao chiết tổng Từ kết quả đó, xác định các chỉ tiêu hóa lý trong cao chiết toàn phần theo dược điển V (như xác định pH, hàm lượng tro bằng máy AAS

và định tính một số nhóm chất có trong rễ mật nhân) Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa

Trang 34

học của dịch chiết methanol từ rễ cây mật nhân Đánh giá độc tính cấp của cao chiết tổng trên

mô hình chuột, nhằm xác định mức độ an toàn cho các nghiên cứu sinh học Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết bằng phương pháp đo lường malondialdehyde (MDA) Khảo sát

hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết tổng qua mô hình thí nghiệm In vivo

2.4 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

2.4.1 Thu nhận cao chiết từ rễ cây mật nhân

Bột rễ cây mật nhân được chiết trong metanol với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (gia nhiệt

ở nhiệt độ 45-50oC) để thu được cao chiết tổng từ rễ cây mật nhân Quy trình chiết xuất trong

2 lần, nhằm tìm ra điều kiện chiết tối ưu Kế thừa nghiên cứu từ những nghiên cứu trước của

Võ Khánh Hà và các cộng sự sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi methanol nhiệt độ chiết ở 45-50oC [4,6], bổ sung hỗ trợ bằng phương pháp siêu âm (với thời gian siêu âm khác nhau)

Quy trình chiết xuất, sử dụng 200 g bột rễ cây mật nhân ngâm chiết 3 lần với dung môi methanol, chiết trong 3 ngày bằng máy siêu âm với thể tích mỗi lần lần lượt là 500mL; 400 mL; 300mL Thời gian chạy máy siêu âm 2 giờ Sau đó, lọc dịch chiết và tiến hành loại bỏ dung môi

để thu được cao chiết tổng số bằng hệ thống thiết bị cất quay chân không (xem hình 2.4) ở áp suất: 250 mbar, nhiệt độ: 50oC, tốc độ quay: 35 vòng/phút Phần cặn dịch chiết thu được được loại bỏ hoàn toàn dung môi bằng cách cân 3 lần khối lượng không đổi để thu được cao chiết

Hình 2 4 Hệ thống cất quay chân không

(Nguồn: Tác giả)

Hệ thống cất quay chân không (hình 2.4): gồm hai bình cầu nối với ống sinh hàn, bình

1 đặt trên bể điều nhiệt, bình 2 nối trực tiếp với ống sinh hàn để thu dung môi

Mô tả cảm quan cao chiết tổng:

Trang 35

- Về màu sắc và độ đặc: Dùng 0,01g cao chiết toàn phần rễ mật nhân sau khi loại bỏ dung môi, cho vào đĩa petri, quan sát dưới ánh sáng tự nhiên Đánh giá màu sắc và độ đặc của dịch chiết

- Về độ tan và mùi vị: hòa tan 0,01g dịch chiết rễ mật nhân trong 5mL nước ấm, quan sát độ tan và đánh giá mùi, vị của cao chiết

2.4.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý của chiết xuất

2.4.2.1 Phương pháp xây dựng quy trình chiết xuất rễ cây mật nhân

Bột rễ mật nhân được chiết xuất bằng sóng siêu âm ở các điều kiện nhiệt độ, thời gian

và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu xác định, sau đó được lọc để thu được dịch chiết Cô quay chân không (Áp suất: 250 mbar, nhiệt độ: 50oC, tốc độ quay: 35 vòng/phút) Cuối cùng, phần cặn dịch chiết thu được được loại bỏ hoàn toàn dung môi bằng cách cân 3 lần khối lượng không đổi

để thu được cao chiết toàn phần [4,6]

2.4.2.2 Xác định dư lượng không tan trong nước

Hòa tan 0,5 g cao chiết toàn bộ rễ mật nhân trong 75 mL nước cất, để lắng trong 24 giờ Tiến hành hút dịch lọc phía trên cho đến khi gần hết Thêm 75 mL nước cất để lắng 4-6 giờ, tiếp tục hút dịch lọc nổi phía trên, lặp lại như trên cho đến khi dịch lọc trong hoàn toàn Tiến hành ly tâm để thu cặn, sau đó cho bã lên giấy lọc và sấy khô ở 60 – 70oC cho đến khi khối lượng không đổi (Hình 2.6)

Xác định phần trăm khối lượng của cặn không tan trong nước theo công thức sau:

Trang 36

Đun nóng một chén sứ đến đỏ trong 30 phút Để nguội trong bình hút ẩm và cân Dùng 0,441 g dịch chiết toàn bộ rễ mật nhân cho vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 - 105o C sau đó nung trong lò nung ở 450 - 550o C (xem hình 2.6) cho đến khi khối lượng không đổi Sản phẩm thu được sau khi tro hóa ở hình 2.7

Hình 2 6 Lò nung tại trường đại học sư phạm kỹ thuật đà nẵng

2.4.2.5 Xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp AAS

Hòa tan lượng tro thu được tại mục 2.4.2.4 bằng dung dịch acid nitric 10% và định mức bằng nước cất đến 100 mL Hàm lượng kim loại nặng trong dung dịch thu được được phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

2.4.2.6 Định tính một số nhóm chất có trong rễ cây mật nhân

Định tính alkaloid

Trang 37

Hòa tan 0,01g cao rễ mật nhân trong dung dịch acid chlorhydric 1% và có thể đun nóng cho đến khi hòa tan Lọc dung dịch để thử với thuốc thử Wagner và Dragendorff

- Pha chế Thuốc thử Wagner: Hòa tan 0,127 g iod và 0,2 g KI trong 10 mL nước cất Thêm vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu

- Chuẩn bị thuốc thử Dragendorff:

Giải pháp 1: Hòa tan 0,85 g bismuth bazơ nitrat trong 40 mL nước và 10 mL acid axetic Dung dịch 2: hòa tan 8 g KI trong 20 mL nước cất

Trộn các thể tích bằng nhau của dung dịch 1 và dung dịch 2 Thêm 100 mL nước và 20

mL acid axetic vào mỗi 10 mL hỗn hợp thu được Thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch chứa alkaloid Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu cam

- Phản ứng với dung dịch natri hydroxyde 1%: nhỏ vài giọt dung dịch natri hydroxyd 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc Nếu là flavone, isoflavone, isoflavonoid, chalcone hoặc leucoantocyanidin, nó sẽ có màu vàng; flavonol cho màu từ vàng sang cam; auron cho màu tím đến đỏ tím

Hòa tan 0,01g cao rễ mật nhân trong 50 mL etanol, đun cách thủy 5 phút, lọc lấy dung

dịch làm thí nghiệm trong 2 ống nghiệm có kích thước bằng nhau

Ống 1: 5 mL HCl 0,1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch ethanol có chứa mẫu thử

Trang 38

Ống 2: 50 mL NaOH 0,1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch ethanol chứa mẫu thử

Đậy nút ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống trong 1 phút rồi để yên, quan sát bọt khí ở cả hai ống:

→Nếu các cột bọt trong cả hai ống có chiều cao bằng nhau và bọt có độ bền như nhau thì

- Pha chế thuốc thử Fehling A: hòa tan 0,6932 g đồng sunfat trong nước đã acid hóa với

2 giọt đến 3 giọt acid sunfuric loãng vừa đủ 10 mL

- Pha chế thuốc thử Fehling B: hòa tan 3,46 g natri kali tartrat và 1 g natri hydroxit trong

8 mL nước, để nguội, sau đó thêm nước cho đủ 10 mL

Định tính polyphenol

Hòa tan 0,01g cao rễ mật nhân trong 10 mL metanol, lọc lấy dịch cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 1% Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh đậm thì có chứa polyphenol

Định tính steroid

Phản ứng Libermann-Burchard: thêm 1 mL anhydrit axetic và 1 mL cloroform, làm lạnh ống nghiệm và thêm vài giọt acid sunfuric đậm đặc, sau đó nhúng dịch lọc vào cloroform, nếu dung dịch chuyển sang màu xanh lam, xanh lá cây, cam hoặc đỏ , bền màu có sterol

Phản ứng Salkowski: ngâm 2 g bột rễ mật nhân trong cloroform Lọc lấy dung dịch cho vào ống nghiệm và thêm vài giọt acid sunfuric đặc, phản ứng dương tính là dung dịch chuyển sang màu đỏ sẫm, xanh lam hoặc xanh tím

Định tính acid hữu cơ

Hòa tan 0,01g cao rễ mật nhân trong 10 mL nước cất, đun sôi 10 phút Để nguội, lọc dung dịch Cho 2-3 mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài tinh thể natri cacbonat Quan sát hiện tượng, nếu có mặt acid hữu cơ thì có bọt khí bay ra

Trang 39

Hòa tan 0,01g cao rễ mật nhân trong 10 mL n-Hexan trong 15 phút, lọc dung dịch và cho

20 mL dịch lọc vào ống nghiệm, đun cách thủy để thu cặn, sau đó thêm giọt acid sunfuric đặc

và lắc Nếu có carotenee, nó sẽ có màu xanh

Ống 1: 2 mL dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 2 mL nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

2.4.1.7 Nghiên cứu thành phần hóa học của một số phân đoạn bằng phương pháp GC-MS

Thu nhận các phân đoạn qua các dung môi khác nhau là n-hexan, cloroform, EtOAc, MeOH Dựa vào độ phân cực khác nhau giữa các dung môi nên đề xuất chiết phân đoạn dựa trên thứ tự từ dung môi ít phân cực nhất sang dung môi phân cực nhất Đầu tiên cho cao chiết toàn phần lắc phân đoạn với n-hexan rồi lần lượt đến các dung môi cloroform, ethyl acetate, methanol Sau đó cho chạy GC-MS để xác định sơ bộ về thành phần hóa học sử dụng trang thiết bị tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2 (Quatest 2)

2.4.1.8 Phân tích hàm lượng hoạt chất 9,10-dimethoxycanthin-6-one bằng phương pháp HPLC

Hàm lượng 9,10-dimethoxycathin-6-one được phân tích bằng HPLC

Điều kiện sắc ký: Pha động: MeOH : H2O = 70% : 30%; Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; Thể tích mẫu tiêm: 5 µL; Detector DAD, bước sóng: 254 nm; Cột C8 - 250 mm; Thời gian lưu: 5 - 6 phút

Xây dựng đường chuẩn: dựa trên việc xác định diện tích peak của các dung dịch chuẩn

có nồng độ

Từ đường chuẩn và giá trị diện tích peak của mẫu phân tích xác định được nồng độ của chất cần phân tích trong mẫu

Trang 40

2.4.3 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

2.4.3.1 Thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bảo vệ gan acetaminophen (Paracetamol) trên chuột nhắt trắng

Xác định độ độc cấp tính theo phương pháp do Bộ Y tế Việt Nam ban hành Cụ thể, cao chiết toàn phần được điều chế ở nồng độ gốc là 20 g/mL (có thể thu được từ mẫu cao chiết toàn phần) để điều tra độc tính cấp tính 35 con chuột được chia thành 6 nhóm (5 con/nhóm) gồm 1 nhóm chứng sinh lý, 1 nhóm chứng bệnh lý và 3 nhóm thí nghiệm, được bỏ đói hoàn toàn trong

16 giờ trước khi uống mẫu cao chiết toàn phần Các mẫu được cho uống ở liều cao nhất có thể

và giảm dần là 500, 400, 300, 200 và 100mg/kg trọng lượng cơ thể Sau khi cho uống dịch chiết rễ mật nhân bằng methanol với liều duy nhất trong 1-2 giờ, chuột được nuôi bình thường (cho

ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số lượng chuột chết trong mỗi lô

và tính giá trị LD50

Xác định LD 50 được thực hiện theo phương pháp của Karber như sau:

LD 50 = LD - Σab/n

Trong đó:

LD 50 là liều gây chết 50% động vật thí nghiệm;

LD là liều gây chết 100% động vật thí nghiệm;

n là số lượng động vật trong một nhóm;

a là hiệu số liều giữa hai liều liên tiếp;

b là tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp Đồng thời, chuột chết sẽ được mổ

để kiểm tra đại thể

Chuột thí nghiệm được gây độc bằng cách cho chuột uống acetaminophen (Paracetamol) với liều 2g/kg trong 7 ngày liên tục

2.4.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng MDA và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết toàn phần rễ mật nhân trên dịch đồng đẳng gan chuột nhắt

Thực hiện theo phương pháp của Stroev và Makarova (1989), Jelili và cộng sự (2011),

có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Xác định khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu bằng phương pháp xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA) Nguyên tắc của phương pháp: MDA là sản phẩm phụ của quá trình

peroxy hóa lipid màng tế bào MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức hợp trimetylen (màu hồng) có cực đại hấp thụ tại bước sóng λ = 530 – 532 nm

Cách tiến hành:

Tách gan chuột và nghiền thành bột trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS, pH 7.4) theo tỷ lệ 1:10 ở 0-4 o C

Tiêu đề	Nghiên Cứu Chiết Tách, Xác Định Thành Phần Hóa Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Rễ Cây Mật Nhân (Eurycoma Longifolia Jack) Ở Tỉnh Gia Lai
Tác giả	Vũ Minh Đức
Trường học	Đại học Đà Nẵng
Chuyên ngành	Hóa hữu cơ
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Đà Nẵng

Định dạng
Số trang	99
Dung lượng	7,29 MB