Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các phân Đoạn polysaccharide chiết xuất từ sợi nấm Đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris)

Nó được biết đến như là một loại nấm dược liệu có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao: cordycepin, adenosine, ergosterol, và các chất khoáng v.v… có tác dụng hạ đường huyết, chống v

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN POLYSACCHARIDE CHIẾT XUẤT TỪ SỢI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

(Cordyceps militaris)

TRƯƠNG CÔNG PHÁT

Đà Nẵng, 04/2024

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN POLYSACCHARIDE CHIẾT XUẤT TỪ SỢI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

(Cordyceps militaris)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Sinh viên thực hiện : Trương Công Phát Lớp : 20 CNSH

Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Bích Hằng

Đà Nẵng, 04/2024

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

LỜI CAM ĐOAN iv

LỜI CẢM ƠN v

DANH MỤC VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

TÓM TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết 1

2 Mục tiêu 2

3 Ý nghĩa 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về nấm Cordyceps militaris 3

1.1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm Cordyceps militaris tại Việt Nam và trên thế giới 4

1.2 Tổng quan về polysaccharide trong nấm Cordyceps militaris 6

1.3 Giới thiệu chung về prebiotic 8

1.3.1 Khái niệm 8

1.3.2 Các loại prebiotic 8

1.3.3 Tiêu chí phân loại prebiotic 9

ii

1.3.4 Tác dụng của prebiotic 11

1.3.5 Cơ chế hoạt động của prebiotic 12

1.3.6 Tình hình nghiên cứu prebiotic 13

1.4 Tổng quan về kháng oxy hóa 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng 19

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp nuôi hệ sợi nấm Cordyceps militaris 19

2.2.2 Phương pháp tách chiết và định lượng polysaccharide 20

2.2.3 Phương pháp kháng oxy hóa 23

2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính prebiotic 24

2.2.5 Phương pháp định lượng SCFAs 25

2.2.6 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Khảo sát hàm lượng các phân đoạn PS 26

3.2 Khả năng kháng oxi hóa của các phân đoạn Polysaccharide 27

3.2.1 Bắt gốc tự do ABTS+ 27

3.2.2 Năng lực khử (RP) 28

3.3 Đánh giá hoạt tính prebiotic 29

3.3.1 Khả năng probiotic sử dụng phân đoạn PS làm nguồn dinh dưỡng 29

3.3.2 Chỉ số prebiotic 31

3.4 Định lượng SCFAs trong môi trường nuôi cấy chủng L plantarum WCFS1 33

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

iii

4.1 Kết luận 354.2 Kiến nghị 35TÀI LIỆU THAM KHẢO 36PHỤ LỤC a

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu sử dụng, phân tích trong khóa luận có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong khóa luận do tôi tự thực hiện, phân tích một cách trung thực, khách quan Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác Các số liệu trích dẫn có ghi chú nguồn gốc rõ ràng

Xác nhận của người hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) Sinh viên thực hiện

Trương Công Phát

v

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm

và giúp đỡ từ cá nhân và tập thể trong suốt thời gian thực hiện

Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn quý báu tới ThS Nguyễn Thị Bích Hằng và anh Bùi Đức Thắng học viên cao học, đã tạo mọi điều kiện và luôn giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn BCN khoa cùng toàn thể quý thầy cô giáo khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, xây dựng thành công khóa luận

Tôi xin cảm ơn tập thể lớp 20 CNSH các bạn sinh viên NCKH tại phòng công nghệ sinh học đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới ba, mẹ và gia đình tôi đã luôn lo lắng, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2024

vi

DANH MỤC VIẾT TẮT

PS: Polysaccharide

PI: Prebiotic index

SCFAs: Short-Chain Fatty Acids

Glc: D-Glucose

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của 3 phân đoạn 27

Bảng 3.2 Giá trị IC50 (OD0.5) của của các phân đoạn PS và acid

ascorbic

28

Bảng 3.3 Kết quả phân tích acid béo mạch ngắn (SCFAs) sau 24

giờ lên men

33

Hình 1.2 Đường đi của prebiotic trong cơ thể người 11

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của prebiotic 13

Hình 2.1 Hệ sợi nấm C militaris nuôi cấy tĩnh tại khoa Sinh –

Hình 3.2 Khả năng sinh trưởng của các chủng probiotic trên môi

trường các phân đoạn PS

30

Hình 3.3 Đặc tính kích thích chọn lọc của các của prebiotic 32

có một tác động tích cực trong sức khỏe đường ruột Nghiên cứu đã tiến hành tách chiết và

đánh giá một số hoạt tính của các phân đoạn polysaccharide từ sợi nấm C militaris Kết

quả cho thấy khối lượng các phân đoạn PS tách chiết phân đoạn bằng các dung môi H2O, HCL và Na2CO3 lần lượt là 81,35±4,22 mg/g; 22,53±1,84 mg/g và 13,33±3,46 mg/g Tất

cả các phân đoạn PS đều có khả năng kháng oxi hoá trung bình, khả năng bắt gốc ABTS cao nhất ở phân đoạn H2O giá trị IC50 bằng 2446,51±24,34 µg/mL; Các phân đoạn đều

hỗ trợ tăng trưởng chọn lọc các chủng probiotic, cao nhất đối với chủng L argentoraten NH13 nuôi trên phân đoạn PS(H2O) với PI đạt 1,012 và thấp nhất ở chủng L casein – 01

trên phân đoạn Na2CO3 PI 0,06 Đánh giá hàm lượng SCFA thông qua lên men phân đoạn

PS từ chủng L plantarum WCFS1 cho hàm lượng acid acetic, propionic và butyric lần lượt

đạt cao nhất ở các môi trường có bổ sung glucose, PS (HCl) và PS (H2O) Kết quả nghiên

cứu cho thấy tìm năng ứng dụng của các phân đoạn PS từ sợi nấm C militaris cho sức

khoẻ con người cũng như làm nguồn nguyên liệu sản xuất prebiotic bên cạnh các nguồn prebiotic phổ biến hiện nay từ thực vật

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Nấm Cordyceps militaris còn được gọi là nấm Trùng thảo đã sử dụng rộng rãi

trong thực phẩm hoặc làm dược liệu ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và một số

nước Châu Á [1] Nó được biết đến như là một loại nấm dược liệu có nhiều hoạt chất

sinh học có giá trị cao: cordycepin, adenosine, ergosterol, và các chất khoáng v.v… có tác dụng hạ đường huyết, chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, điều hòa

hệ miễn dịch, chống oxi hóa [2] Mặt khác, với hàm lượng polysaccharide cao, đặc biệt

là các Polysaccharide từ sợi nấm có thể làm giảm cân, giảm nồng độ glucose trong huyết tương, cải thiện dung nạp glucose, bảo vệ các cơ quan miễn dịch và sửa chữa rối loạn lipid máu để làm giảm bệnh tiểu đường ở chuột mắc bệnh tiểu đường [3] Bên cạnh đó, polysaccharide chiết xuất từ nấm đã được đề xuất sử dụng trong các chế phẩm prebiotic

để thúc đẩy sự phát triển của các vi sinh vật có lợi như Bifidobacteria và Lactobacillus

[4] Các polysaccharide hoạt động như là một chất nền cho sự phát triển của probiotic Khi có sự lên men của hệ vi sinh đường ruột, polysaccharide tạo thành các acid béo mạch ngắn có một tác động tích cực trong sức khỏe đường ruột, bao gồm tác dụng làm tăng sinh các tế bào biểu mô và làm giảm pH đại tràng Những tác động này có thể làm giảm tỷ lệ mắc ung thư ruột già, chứng xơ vữa động mạch và các biến chứng liên quan đến béo phì ở người [5]

Các nghiên cứu hiện nay tập trung vào đánh giá hoạt tính sinh học của polysaccharide sợi nấm thu được bằng quá trình lên men lỏng, kết quả cho thấy hiệu quả chống khối u cao hơn polysaccharide thu được từ quả thể bằng cách trồng rắn Do đó, người ta cho rằng các polysaccharide từ sợi nấm có thể được sử dụng như một chất thay

thế tiềm năng cho các polysaccharide có nguồn gốc từ quả thể của C militaris [6] Điều này cho thấy sợi nấm nói chung và của C militaris nói riêng có tiềm năng lớn trong sản

xuất các hợp chất sinh học

Tuy các hoạt động dược lý của polysaccharide chiết xuất từ C militaris đã được

công bố và đã có những kết quả đáng chú ý, nhưng hầu hết các nghiên cứu này tập trung vào polysaccharide hòa tan trong nước Mà bỏ qua các polysaccharide còn lại trong bã

2

nhưng không tan trong dung môi chiết này Điều này dẫn đến cơ sở dữ liệu không đầy

đủ về các polysacharide có nguồn gốc từ C militaris và hoạt tính sinh học của chúng

Xuất phát từ những lý do trên tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các phân đoạn polysaccharide chiết xuất từ sợi nấm Đông trùng hạ thảo

(Cordyceps militaris)” Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đánh giá khả năng

kháng oxi hóa và hoạt tính prebiotic từ các phân đoạn polysaccharide chiết xuất từ sợi

nấm C militaris

2 Mục tiêu

Đánh giá được hoạt tính kháng oxi hóa và hoạt tính prebiotic của các phân đoạn PS chiết

xuất từ sợi nấm C militaris

3 Ý nghĩa

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu từ đề tài sẽ là dẫn liệu khoa học về các hoạt tính sinh của các

phân đoạn PS từ hệ sợi nấm C militaris Cung cấp dữ liệu khoa học cho các nghiên cứu

hoạt tính polysaccharide trong sợi nấm

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu chứng minh tiềm năng ứng dụng của các phân đoạn PS tách

chiết từ sợi nấm C militaris

4 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết phân đoạn PS từ hệ sợi nấm C militaris

- Đánh giá hàm lượng PS tách chiết ở các phân đoạn

- Đánh giá hoạt tính kháng oxi hoá của các phân đoạn PS

- Đánh giá hoạt tính prebiotic của các phân đoạn PS

- Đánh giá hàm lượng SCFA thông qua lên men phân đoạn PS từ chủng L plantarum

WCFS1

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nấm Cordyceps militaris

1.1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris

Hình 1.1 Nấm Cordyceps militaris tại khoa Sinh – Môi trường – ĐHSP

Tên khoa học: Cordyceps militaris (Berk) Sacc., thuộc họ Cordycipitaceae, giống

hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ Phần “lá” hình dạng giống ngón tay, dài khoảng

4 – 11 cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành

4

Chu trình sống của nấm C militaris: giống như hầu hết các loài Cordyceps khác,

C militaris là một loài sống ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Chúng chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau rồi nhân lên trong

cơ thể của ký chủ vào mùa đông Bào tử nấm theo gió dính vào bên ngoài ký chủ, sau

đó bào tử hình thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào cơ thể Sau

đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh sản mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ Đến cuối hè hoặc thu quả thể nhô ra khỏi cơ thể và bào tử phát tán vào không khí [7][8]

Giá trị dược liệu: C militaris chứa 17 acid amin khác nhau, D-mannitol, lipit và các nguyên tố vi lượng như Al, Si, K, Na v.v…Đặc biệt, C militaris có chứa nhiều hợp

chất chứa hoạt tính sinh học trong đó phải kể đến acid cordiceptic, cordycepin, adenosin, hydroxyethyl-adenosin Đáng chú ý hơn là nhóm hợp chất HEAA (HydroxyEtyl-Adenosin- Analogs) Ngoài ra, C militaris còn chứa nhiều loại vitamin như: B12, A, C, B2 (riboflavin), E và K Vì thế, C militaris có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người: nâng cao khả năng phòng chống ung thư, làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch, chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim, giữ ổn định nhịp đập của tim, làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể, bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thương do thiếu máu, tăng cường tác dụng lưu thông máu trong cơ thể, tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh, tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong máu, tăng cường chức năng tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng, kháng viêm và tiêu viêm, hạn chế tác hại của tia gamma đối với cơ thể, cường dương và chống liệt dương [9]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu nấm Cordyceps militaris tại Việt Nam và trên thế giới

a Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Hiện nay nước ta đã có nhiều báo cáo khoa học về nhân giống, sản xuất và tách

chiết hợp chất sinh học có hoạt tính cao từ nấm C militaris, tuy nhiên việc nghiên cứu

về điều kiện nuôi cấy, tích lũy và tách chiết các hợp chất sinh học trong môi trường dịch thể vẫn còn hạn chế Trong Hội nghị nấm học tổ chức tại Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM (11/2014), một số công trình của các nhóm tác giả Vũ Xuân Tạo và cs, cùng

5

với nhóm tác 6 giả Phạm Nguyễn Duy Bình và Phan Kim Ngọc đã công bố kết quả

nghiên cứu về các yếu tố môi trường tác động đến sự sinh trưởng của C militaris

Trần Thị Thu Hà (2015) đã nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống và

nuôi trồng nấm C militaris mới nhập nội ở Việt Nam Kết quả bài nghiên cứu nêu ra

được ưu điểm của sản xuất giống sử dụng công nghệ nhân giống dạng dịch thể là cho tiềm năng, năng suất cao hơn trong thời gian ngắn hơn và tỷ lệ nhiễm bệnh thấp hơn [10]

Bên cạnh đó Nguyễn Thị Liên Thương và cs (2016), đã khảo sát về đặc điểm sinh

học, giá trị dược liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trồng nấm C militaris và

cải tiến thành công môi trường nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo bằng cách kiểm soát

sự ổn định của các yếu tố như giống, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và dinh dưỡng [11]

b Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có nhiều báo cáo khoa học cũng như nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, điều kiện sinh trưởng, môi trường nuôi cấy, tách chiết các hoạt chất sinh

học có giá trị dược liệu cao của giống nấm C militaris Có thể kể đến một số nghiên

cứu như sau:

Theo nghiên cứu của Sung JM, Park YJ, Lee Jo (2006), nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến việc tạo quả thể trong nuôi trồng nấm Nghiên cứu cho thấy khoảng nhiệt độ 18–22°C là tối ưu cho sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể Tuy nhiên, quá trình này sẽ giảm mạnh khi tăng nhiệt độ trên 25°C [12]

Năm 2014, Yuan Dong và cs đã nghiên cứu hoạt động chống đái tháo đường của

C militaris trên bệnh đái tháo đường týp 2 do streptozotocin gây ra ở chuột Những con

chuột mắc bệnh tiểu đường được cho uống với chiết xuất nước hoặc chiết xuất cồn ở mức 0,05 g/kg và 2 g/kg trong 3 tuần, và sau đó, các yếu tố liên quan đến đường huyết, lipid, các gốc tự do và thậm chí cả bệnh thận được xác định Thấy được, tương tự như

metformin, C militaris chiết xuất cho thấy làm giảm đáng kể mức đường huyết bằng

cách thúc đẩy chuyển hóa đường và ức chế mạnh nồng độ cholesterol toàn phần và

triglyceride trong huyết thanh Chiết xuất từ C militaris thể hiện tác dụng chống oxy

hóa được chỉ ra bởi mức superoxide dismutase và glutathione peroxidase được bình thường hóa Tác dụng ức chế nitơ urê trong máu, axit uric và protein cho thấy 7 khả

6

năng bảo vệ của các chất chiết xuất từ C militaris chống lại bệnh thận do tiểu đường,

đã được xác nhận bởi sự cải thiện tình trạng bệnh lý [13]

Bên cạnh đó, nghiên cứu của Aguilar CN và cs (2008), nghiên cứu phương pháp nuôi cấy trên môi trường rắn cho rằng, phương pháp này đã có thể được tối ưu hóa quá

trình phát triển của C militaris dưới các điều kiện như: cho phép hệ sợi phát triển trên

bề mặt môi trường rắn, tối ưu hóa dòng khí và các điều kiện hình thành quả thể [14] Các nghiên cứu gần đây của Jian-Guo Zhang và cs (2013), đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng cách lặp đi lặp lại quá trình lên men liên tục để kiểm soát sự sinh, tổng hợp Cordycepin Kết quả bài nghiên cứu đã tìm ra được điều kiện nuôi cấy và đã chứng minh việc lặp đi lặp lại quá trình lên men là một phương pháp hiệu quả để tăng năng suất Cordycepin [15]

Mặt khác, Hwan Hee Lee và cs (2015) đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư của

C militaris đối với tế bào RKO ung thư biểu mô trực tràng ở người kết quả cho thấy chiết xuất etanol của C militaris có khả năng gây độc tế bào cao đối với các tế bào RKO

ung thư biểu mô trực tràng ở người và ức chế sự phát triển của khối u trong mô hình

xenograft Tác dụng chống khối u của C militaris có liên quan đến việc kích thích quá

trình bắt giữ chu kỳ tế bào và quá trình chết rụng qua trung gian ty thể [16]

Ngoài ra, Lima và cs (2015), khi nghiên cứu những ảnh hưởng của Cordycepin từ

C militaris về bệnh tiểu đường trên cơ thể chuột, làm giảm lượng đường trong máu, cải

thiện chỉ số của bệnh tiểu đường và góp phần vào việc điều chỉnh sự trao đổi chất glucose trong gan ở chuột mắc bệnh tiểu đường [17]

1.2 Tổng quan về polysaccharide trong nấm Cordyceps militaris

Khái niệm: Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate

và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide) của vi sinh vật v.v [18]

Polysaccharide chiếm 3-8% trong toàn bộ trọng lượng khô và được xem là hoạt chất chính góp phần tạo nên hoạt tính sinh học của Cordyceps, được chia làm hai loại

7

dựa vào vị trí của chúng trong nấm: polysaccharide nội bào và polysaccharide ngoại bào hay còn gọi là exopolysaccharide – EPS Polysaccharide tham gia tích cực trong việc ngăn chặn sự hình thành và lây lan các khối u, gây ức chế hoạt động của các gốc tự do, kích thích và điều hòa miễn dịch, tham gia phản ứng viêm, kháng oxy hóa v.v…Trong

đó hoạt tính kháng oxy đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất Polysaccharide hiện diện ở thành tế bào và tham gia vào cấu trúc thành phần trong tế bào chất của Cordyceps [19]

Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã khẳng định polysaccharide chính là thành

phần quyết định hoạt tính kháng oxy hoá của C militaris Đặc biệt, một số nghiên cứu

đã cho thấy rằng dịch nuôi cấy C militaris cũng chứa một lượng lớn exopolysaccharide

có hoạt tính sinh học

Lin và cộng sự (2012) đã nghiên cứu hoạt tính của exopolysaccharide từ C militaris SU5 – 08, kết quả cho thấy rằng PS có khả năng bắt gốc tự do hydroxyl, superoxide anion và DPPH Từ đó có thể kết luận rằng PS của C militaris SU5 – 08 là

một chất kháng oxy hóa và tăng cường phản ứng miễn dịch tiềm năng [20]

Tabassum Khan (2019), đã đánh giá về tiềm năng chống ung thư của polysaccharide, cho thấy rằng: polysaccharide là một trong những chất tiềm năng để chống lại tế bào ung, nó thể hiện hoạt động chống ung thư tốt trên nhiều dòng tế bào và

có thể được phát triển như chất thay thế của các chất hóa trị liệu ung thư hiện nay, có hoạt tính chọn lọc chống lại các tế bào khối u với tác dụng phụ thấp [21]

Sun và cộng sự (2020) đã nghiên cứu cấu trúc và hoạt động hạ đường huyết của

một exopolysaccharide mới của C militaris Kết quả phân tích hoạt động hạ đường

huyết in vivo cho thấy EPS-III có thể làm giảm cân, giảm nồng độ glucose trong huyết tương, cải thiện dung nạp glucose, bảo vệ các cơ quan miễn dịch và sửa chữa rối loạn lipid máu để làm giảm bệnh tiểu đường ở chuột mắc bệnh tiểu đường do STZ [22] Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học với những

Khái niệm prebiotic được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1995 bởi Glenn Gibson

và Marcel Roberfroid Prebiotic được mô tả là: “một thành phần thực phẩm không thể tiêu hóa có tác dụng có lợi cho vật chủ bằng cách kích thích có chọn lọc sự phát triển và hoạt động của một hoặc một số ít vi khuẩn trong ruột kết, do đó cải thiện sức khỏe vật chủ” [24] Theo định nghĩa này, chỉ một số hợp chất thuộc nhóm carbohydrate, chẳng hạn như β-fructan chuỗi ngắn và dài [FOS và inulin], lactulose và GOS, có thể được phân loại là prebiotic

Năm 2008, Hội nghị lần thứ 6 của Hiệp hội Khoa học Quốc tế về Probiotic và Prebiotic (ISAPP) đã định nghĩa “prebiotic trong chế độ ăn uống” là “một thành phần lên men có chọn lọc dẫn đến những thay đổi cụ thể trong thành phần và hoạt động của

hệ vi sinh vật đường tiêu hóa, do đó mang lại lợi ích sức khỏe của vật chủ [25]

Và gần đây nhất vào năm 2016, Hiệp hội khoa học Quốc tế về Probiotic và Prebiotic (ISAPP) ở London (Vương quốc Anh), đã định nghĩa Prebiotic là “chất nền được sử dụng có chọn lọc bởi các vi sinh vật mang lại lợi ích cho sức khỏe” [26]

1.3.2 Các loại prebiotic

Fructans: loại này bao gồm inulin và fructo-oligosaccharide hoặc oligofructose Cấu trúc của chúng là một chuỗi fructose tuyến tính với liên kết β (2→1) Chúng thường

có các đơn vị glucose đầu cuối với liên kết β (2→1) Inulin có DP lên đến 60, trong khi

DP của FOS nhỏ hơn 10 [27] Trước đây, một số nghiên cứu chỉ ra rằng fructan có thể kích thích vi khuẩn lactic một cách chọn lọc Tuy nhiên, trong những năm gần đây, có một số điều tra cho thấy chiều dài chuỗi của fructan là một tiêu chí quan trọng để xác định vi khuẩn nào có thể lên men chúng Do đó, các loài vi khuẩn khác cũng có thể được thúc đẩy trực tiếp hoặc gián tiếp bởi fructan

Galacto-Oligosaccharides: Galacto-oligosaccharides (GOS), sản phẩm của quá trình kéo dài đường lactose, được phân loại thành hai phân nhóm: GOS với lượng

9

galactose dư thừa ở C3, C4 hoặc C6 và GOS được tạo ra từ lactose thông qua quá trình chuyển hóa glycosyl hóa bằng enzyme Sản phẩm cuối cùng của phản ứng này chủ yếu

là hỗn hợp của tri đến pentasaccharid với galactose ở các liên kết β (1→6), β (1→3) và

β (1→4) Loại GOS này còn được gọi là trans-galacto-oligosaccharides hoặc TOS [28] [25] GOS có thể kích thích rất nhiều Bifidobacteria và Lactobacilli Bifidobacteria ở trẻ

sơ sinh cho thấy sự kết hợp cao với GOS Enterobacteria, Bacteroidetes và Firmicutes cũng bị kích thích bởi GOS, nhưng ở mức độ thấp hơn Bifidobacteria [29]

Tinh bột và các Oligosaccharide có nguồn gốc từ glucose: có một loại tinh bột có khả năng chống lại sự tiêu hóa ở ruột trên được gọi là tinh bột kháng (RS) RS có thể tăng cường sức khỏe bằng cách tạo ra một lượng butyrate cao; vì vậy nó đã được đề nghị phân loại như một prebiotic [4] Các nhóm Firmicute khác nhau cho thấy khả năng kết hợp cao nhất với lượng RS cao Một nghiên cứu đã chứng minh rằng RS cũng có thể bị

phân hủy bởi Ruminococcus bromii, Bifidobacterium teencentis và ở mức độ thấp hơn bởi Eubacterium directale và Bacteroides thetaiotaomicron Polydextrose là một

oligosaccharide có nguồn gốc từ glucose Nó bao gồm glucan với rất nhiều nhánh và

liên kết glycosidic Có một số bằng chứng cho thấy nó có thể kích thích Bifidobacteria

Oligosaccharid khác: một số oligosaccharide có nguồn gốc từ polysaccharide được gọi là pectin Loại oligosaccharide này được gọi là oligosaccharide pectic (POS) Chúng dựa trên sự mở rộng của axit galacturonic (homogalacturonan) hoặc rhamnose (rhamnogalacturonan I) Các nhóm cacboxyl có thể được thay thế bằng quá trình este hóa metyl, và cấu trúc có thể được axetyl hóa ở C2 hoặc C3 Nhiều loại đường khác nhau hoặc axit ferulic được liên kết với các chuỗi bên Cấu trúc của chúng thay đổi đáng

kể tùy thuộc vào nguồn POS [30]

Oligosaccharides không carbohydrate: mặc dù carbohydrate có nhiều khả năng đáp ứng các tiêu chí của định nghĩa prebiotic, nhưng có một số hợp chất không được phân loại là carbohydrate nhưng được khuyến nghị phân loại là prebiotic, chẳng hạn như

flavanol có nguồn gốc từ ca cao Các thí nghiệm in vivo và in vitro chứng minh rằng

flavanol có thể kích thích vi khuẩn axit lactic [31]

1.3.3 Tiêu chí phân loại prebiotic

10

Các tiêu chí để giúp phân loại và đánh giá các prebiotic bao gồm không bị tiêu hóa trong đường ruột, lên men bằng chính các vi sinh vật trong đường ruột, phải có lợi cho sức khỏe, chọn lọc sự kích thích của men vi sinh và cuối cùng đó là ổn định trong quá trình chế biến sản phẩm

Các tiêu chí cho phép phân loại thành phần thực phẩm như một prebiotic cũng bao gồm quá trình lên men có chọn lọc của các vi khuẩn có lợi trong đường ruột Các tác động của quá trình lên men này có thể dẫn đến sự gia tăng biểu hiện hoặc thay đổi thành phần của các acid béo chuỗi ngắn, tăng trọng lượng phân, giảm nhẹ độ pH của ruột kết, giảm các sản phẩm cuối cùng chứa nito và các enzyme khử, làm tăng sự biểu hiện của các protein liên kết hoặc chất mang hoạt tính liên quan đến sự hấp thu khoáng chất và điều hòa hệ thống miễn dịch, có lợi cho sức khỏe con người

Kích thích có chọn lọc sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột có khả năng liên quan đến sức khỏe được coi là một trong những tiêu chí của prebiotic Prebiotic được cho là có khả năng phù hợp với sự phát triển của probiotic, vi khuẩn sinh học, Lactobacilli và ngăn chặn sự phát triển của Clostridia và chất diệt khuẩn Chỉ số prebiotic (PI) chính là dụng cụ để đo lường các tác dụng của prebiotic Chỉ số PI [32] được tính theo công thức sau:

𝑃𝐼 = [(𝑃𝑃

24− 𝑃𝑃0) − ((𝑃𝐺𝐹24− 𝑃𝐺𝐹0 )(𝑃𝐺24− 𝑃𝐺0) − ((𝑃𝐺𝐹24− 𝑃𝐺𝐹0 )] − [(𝐸𝑃

24− 𝐸𝑃0) − ((𝐸𝐺𝐹24− 𝐸𝐺𝐹0 )(𝐸𝐺24− 𝐸𝐺0) − ((𝐸𝐺𝐹24− 𝐸𝐺𝐹0 )]

Trong đó: Pp , Pp24 – Giá trị OD600 của Probiotic ở môi trường chứa 1 g/L prebiotic tại 0 giờ

và 24 giờ

P𝐺𝐹0 , P𝐺𝐹24 – Giá trị OD600 của Probiotic ở môi trường không bổ sung glucose tại 0 giờ và 24 giờ

P𝐺0, P𝐺24– Giá trị OD600 của Probiotic ở môi trường chứa 1 g/L glucose tại 0 giờ và 24 giờ

Ep , Ep24 – Giá trị OD600 của E coli ở môi trường chứa 1g/L prebiotic tại 0 giờ và 24 giờ

E𝐺0, E𝐺24– Giá trị OD600 của E coli ở môi trường chứa 1g/L glucose tại 0 giờ và 24 giờ

E𝐺𝐹0 , E𝐺𝐹24– Giá trị OD600 của E coli ở môi trường không bổ sung glucose tại 0 giờ và 24 giờ

11

1.3.4 Tác dụng của prebiotic

Hình 1.2 Đường đi của prebiotic trong cơ thể người

Tái tạo sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột (Chống tại các vi khuẩn gây bệnh) Nghiên cứu cho thấy thức ăn trẻ sơ sinh có bổ sung Galacto-oligosaccharides (GOS) và Fructo-oligosaccharides (FOS) làm tăng vi khuẩn Bifidobacteria trong phân (Buttriss & Stokes, 2008) Prebiotic để thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột, bằng cách cung cấp nguồn năng lượng cho hệ vi sinh vật đường ruột, prebiotic có thể điều chỉnh thành phần và chức năng của các vi sinh vật này Đôi khi, sản phẩm phụ của quá trình lên men phức tạp của prebiotic là chất nền cho một vi sinh vật khác Prebiotic cũng có thể thay đổi môi trường của ruột, các sản phẩm lên men của prebiotic chủ yếu là axit làm giảm độ

pH trong ruột Người ta đã chỉ ra rằng một sự thay đổi đơn vị trong pH ruột từ 6,5 đến 5,5 có thể góp phần làm thay đổi thành phần và quần thể của hệ vi sinh vật đường ruột

Sự thay đổi độ pH có thể thay đổi quần thể của các loài nhạy cảm với axit, chẳng hạn như Bacteroid, và thúc đẩy sự hình thành butyrate bởi Firmicutes [27]

Prebiotic duy trì sức khỏe và bảo vệ chống lại các rối loạn, các sản phẩm phân hủy prebiotic chủ yếu là SCFA Những phân tử này đủ nhỏ để khuếch tán qua các tế bào ruột

và đi vào tuần hoàn máu Do đó, prebiotic có thể ảnh hưởng không chỉ đến đường tiêu hóa mà còn ảnh hưởng đến các cơ quan và hệ thống ở xa khác

Prebiotic giúp điều trị hội chứng kích thích ruột (IBS) và bệnh corhn, giúp bảo vệ ngăn ngừa ung thư đại trực tràng, ung thư đại trực tràng được xếp hạng là loại bệnh ác

12

tính phổ biến thứ ba trên toàn thế giới Người ta đã chứng minh rằng các sản phẩm lên men prebiotic, chẳng hạn như butyrate, có thể có tác dụng bảo vệ chống lại nguy cơ ung thư đại trực tràng, cũng như sự tiến triển của nó, thông qua việc gây ra quá trình apoptosis [27]

Ngoài ra, một thử nghiệm lâm sàn đã chứng minh rằng liệu pháp cộng sinh

(Lactobacillus rhamnosus và Bifidobacterium Lactis cộng với inulin) có thể làm giảm

nguy cơ ung thư đại trực tràng bằng cách giảm tốc độ tăng sinh ở đại trực tràng, gây hoại tử tế bào ruột kết, dẫn đến cải thiện tính toàn vẹn và chức năng của hàng rào biểu

Cải thiện bệnh viêm ruột (Inflammatory Bowel Disease-IBD): chuột có chế độ ăn gồm oligosaccharides chiết xuất từ sữa dê có những cải thiện về triệu chứng bệnh so với chuột đối chứng Inulin và oligofructose cũng được báo cáo là hiệu quả trong điều trị IBD [34]

1.3.5 Cơ chế hoạt động của prebiotic

Khi sử dụng có chọn lọc prebiotic trong ruột, hệ vi sinh vật phát triển để thực hiện các chức năng tăng cường miễn dịch khác nhau ở các loài và chủng đa cấp Thành tế bào vi khuẩn và các sinh khối khác làm tăng khả năng điều hòa miễn dịch và tạo thành phân để chuyển động ruột khỏe mạnh Các chất chuyển hóa như acid hữu cơ làm giảm

độ pH, có hại cho mầm bệnh nhưng hỗ trợ khả năng hòa tan và khả năng hấp thụ của các khoáng chất như canxi, cũng như điều hòa tích cực các hormone và tính toàn vẹn

của biểu mô [35]

13

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của prebiotic [36]

GLP1: glucagon like peptide1; M cell: microfold cell; NK: natural killer; PYY: peptide YY; TGFβ: transforming growth factor-β; TH1, TH2: type 1 T helper, type 2 T helper; Treg: regulatory T; ZO1: zonula occludens

Các cơ chế quan trọng là sự cạnh tranh của các vi sinh vật để lấy nguồn thức ăn (chính là các prebiotic), dẫn đến sự xâm nhập có chọn lọc của các vi khuẩn có lợi và loại trừ mầm bệnh trong tế bào biểu mô ruột; sản xuất các acid béo chuỗi ngắn (SCFAs)

và điều chỉnh phản ứng miễn dịch, tăng cường chức năng bảo vệ đường ruột Các lợi ích sức khỏe liên quan đến cơ chế này đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu, prebiotic

có thể tăng cường khả năng sinh học và hấp thu khoáng chất, giảm viêm và các triệu chứng liên quan đến rối loạn đường tiêu hóa, giảm tần suất và thời gian của bệnh tiêu chảy do nhiễm trùng và kháng sinh, ngăn ngừa ung thư ruột kết Ngoài ra, prebiotic còn cho thấy có tiềm năng trong điều trị bệnh béo phì và các rối loạn chuyển hóa liên quan, ngoài việc cải thiện chức năng miễn dịch thông qua điều chỉnh sự biểu hiện của cytokines [36]

1.3.6 Tình hình nghiên cứu prebiotic

14

a Trên thế giới

Với những tác dụng tuyệt vời mà prebiotic mang lại cho sức khỏe đã có rất nhiều nghiên cứu về phương thức sản xuất, công dụng, khả năng kích thích sinh trưởng của probiotic, cũng như các nguồn nguyên liệu để sản xuất prebiotic Nhưng những nghiên cứu về nguồn nguyên liệu sản xuất prebiotic chủ yếu là về thực vật, chưa có nhiều nghiên cứu về nấm hiện nay, nấm đang được quan tâm như nguồn nguyên liệu sản xuất prebioics mới, an toàn, hiệu quả

Năm 2013, Wei-Ting Chou và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng phần gốc và phần thân nấm như là một nguồn Prebiotic Từ những kết quả nghiên cứu cho thấy các phần thải của nấm như gốc nấm hoặc thân nấm rẻ hơn các nguồn khác và là nguồn mới để khai thác prebiotic [37]

Năm 2015, Denji KA và Cs đã ngiên cứu ảnh hưởng của prebiotic mannan oligosaccharide trong chế độ ăn uống (mos) lên hiệu suất tăng trưởng, hệ vi sinh đường ruột, thành phần cơ thể và đã chỉ ra rằng tiêu thụ prebiotic có thể cải thiện các chức năng miễn dịch bằng cách tăng dân số vi sinh vật bảo vệ, làm giảm số lượng vi khuẩn có hại

do Lactobacilli và Bifidobacteria [38]

Năm 2018, Thornthan Sawangwan và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính của prebiotic chiết suất từ 7 loại nấm ăn khác nhau cho thấy tổng số cacbohydrate và tổng lượng đường khử của nấm Pleurotus ostreatus đạt cao nhất lần lượt là 6,7325±0,0261mg/mL

và 2,6737±0,0027mg/mL Các đặc tính của prebiotic xác định dựa trên sự kích thích tăng trưởng của probiotic với nhóm vi khuẩn có lợi trong đường ruột, ức chế gây bệnh đối với vi khuẩn có hại và dung nạp đường tiêu hóa Sự ức chế gây bệnh thể hiện qua đường kính vòng và vùng ức chế rộng nhất của Samonella typhy trong môi trường có

bổ sung dịch chiết từ nấm P ostreatus [39]

Mặt khác, Imrankhan và cộng sự đã nghiên cứu Polysaccharide từ nấm Ganoderma Lucidum và Poria Cocus đã cho thấy được khả năng prebiotic thông qua sự ảnh hưởng của polysaccharide đến thành phần của hệ vi sinh đường ruột trong chuột [40]

Gần đây, Mitsou et al, (2020) đã nghiên cứu về tác động của β-glucans trong nấm

ăn tới hệ vi sinh vật đường ruột lão hóa Kết quả thấy rằng β-glucans có thể phát huy tác

15

dụng có lợi trong việc khôi phục hệ vi sinh vật đường ruột và SCFAs ở người cao tuổi [41]

b Tại việt nam tại Việt Nam

chưa có nhiều nghiên cứu về prebiotic cũng như các nguồn nguyên liệu sản xuất prebiotic, chỉ có một số nghiên cứu về hiệu quả bổ sung prebiotic đến sức khỏe con người, tiêu biểu như:

Liều Mỹ Đông và Nguyễn Thúy Hương đã khảo sát ảnh hưởng của Whey Protein

và Prebiotic lên tỉ lệ sống sót của Bifdibacterium Bifidum vi gói trong sữa chua

Synbiotics Kết quả khảo sát cho thấy, pH của mẫu chứa B bifidum tự do có giá trị pH thấp nhất và lượng tế bào sống sót cũng đạt thấp nhất so với mẫu chứa sản phẩm vi gói Khi canxianginat được bao phủ bởi whey protein đã cải thiện hơn 3 log (CFU/g) so với khi không bao phủ Prebiotic FOS được bổ sung vào sữa chua cũng đã giúp nâng cao sự sống sống của B bifidum trong quá trình bảo quản Kết quả cũng cho thấy rằng, chế phẩm vi gói canxi-anginat 2%, FOS 2% bao phủ bởi whey protein 10% cho hiệu quả bảo vệ tốt nhất và đạt tỉ lệ sống sót 97% sau 9 tuần bảo quản và 54% sau khi ủ 5h trong môi trường dạ dày và muối mật [42]

Năm 2017, Vũ Thị Kim Hoa và các cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả của việc bổ sung các sản phẩm dinh dưỡng có Probiotic và Prebiotic đến chỉ số miễn dịch, tiêu chảy

và nhiễm khuẩn hô hấp của trẻ 25 – 36 tháng tuổi Sau 5 tháng nghiên cứu, kết quả chỉ

ra rằng: đối với các trẻ được sử dụng sản phẩm Synbiotics thì tình trạng miễn dịch được cải thiện rõ rệt: nồng độ IgA trong máu tăng cao hơn (+3,64mg/ml) và IgA trong phân (+48mg/ml) so với đối chứng Nhóm Synbiotics giảm số lần cũng như số ngày mắc bệnh tiêu chảy; số ngày mắc nhiễm khuẩn hô hấp ở nhóm dùng Synbiotics cũng giảm đáng

kể Như vậy, sản phẩm có chứa probiotic và prebiotic đã giúp điều hòa miễn dịch và ổn định hệ vi sinh đường ruột của trẻ em [43]

Theo tác giả Trần Hữu Dũng và Nguyễn Hải Thúy đã thực hiện đề tài “Tổng quan

về vai trò tinh bột kháng trong kiểm soát đường huyết sau ăn trên bệnh nhân đái tháo đường tuýt 2” Qua nghiên cứu đã cho thấy với sự hạn chế giải phóng glucose trong ruột non, RS đã tham gia rất hiệu quat trong sự làm giảm đường huyết sau ăn, góp phần hạn chế sựu hấp thu cholesterol trong huyết tương và nồng độ thấp hơn, cải thiện độ nhạy

1.4 Tổng quan về kháng oxy hóa

Căng thẳng oxy hóa là do sự mất cân bằng giữa ROS (các loại oxy phản ứng) và

hệ thống phòng thủ chống oxy hóa và được coi là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh thoái hóa thần kinh, viêm khớp dạng thấp, xơ vữa động mạch và tăng huyết áp [45] Chất chống oxy hóa để điều trị thoái hóa tế bào đang bắt đầu được xem xét vì chúng ức chế hoặc trì hoãn quá trình oxy hóa bằng cách ngăn chặn cả sự khởi đầu và lan truyền của các phản ứng dây chuyền oxy hóa Khi bị căng thẳng, cơ thể chúng ta sẽ có nhiều loại oxy phản ứng hơn các loại chống oxy hóa, sự mất cân bằng có thể dẫn đến tổn thương các thành phần tế bào như lipid, protein và DNA Sự suy thoái tế bào cuối cùng dẫn đến mất một phần hoặc toàn bộ chức năng của

hệ thống sinh lý trong cơ thể [46] Mặc dù hầu hết tất cả các sinh vật đều có chất chống oxy hóa và một số hệ thống enzyme như superoxide effutase, catalase, glutathione peroxidase và glutathione reductase để bảo vệ chúng khỏi tổn thương oxy hóa, nhưng những hệ thống này không đủ để ngăn chặn hoàn toàn thiệt hại Do đó, cần bổ sung chất chống oxy hóa hoặc thực phẩm chứa nồng độ chất chống oxy hóa cao để giúp loại bỏ các gốc tự do và giảm tổn thương oxy hóa Các chất chống oxy hóa tổng hợp hiện có bao gồm Butylat hydroxytoluene (BHT), Butylat hydroxyanisole (BHA), axit Gallic, v.v., đã được phát hiện là gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe Do đó, ứng dụng của chúng bị hạn chế và có xu hướng thay thế chúng bằng các chất chống oxy hóa

tự nhiên [47]

Nhiều loại nấm ăn được và không ăn được từ lâu đã được sử dụng ở Châu Á và Châu Phi cho mục đích làm thuốc Trong những năm gần đây, nhiều hợp chất có hoạt tính dược lý từ nấm đã được phát hiện và phân lập có tác dụng kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng virus, chống ung thư, chống dị ứng, điều hòa miễn dịch, chống viêm, bảo vệ

gan [48] Cordyceps militaris, Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum, Grifola

17

frindosa, Poria cocos, Tremella fuciformis, Lentinus edodes, v.v chỉ là một số ít trong

số các loại nấm quan trọng về mặt y học có đặc tính chữa bệnh Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, polysaccharide từ các quả thể, sợi nấm trên là thành phần quan trọng giúp các loài nấm này có hoạt động chống oxi hóa

Vì có một số phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa trong ống nghiệm nên cần phải chọn phương pháp phù hợp để có thể cho kết quả chính xác về chất chống oxy hóa trong nghiên cứu Ba phương pháp đo quang phổ được sử dụng phổ biến nhất

là xét nghiệm hoạt tính dọn gốc tự do (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (DPPH), azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] xét nghiệm hoạt tính dọn gốc tự do (ABTS) và xét nghiệm năng lượng chống oxy hóa làm giảm ion sắt (FRAP) Vì vậy, để khảo sát đầy đủ khả năng kháng oxy hóa của một hợp chất, nhiều phương pháp được sử dụng và mỗi phương pháp hướng tới các gốc tự do khác nhau trong tế bào [45]

[2,2'-Trong nghiên cứu của Jing Wang và cs 2008, một nhóm dị polysaccharide sunfat

chiết xuất phân đoạn từ một loại tảo biển có tên Laminaria japonica đã được chứng

minh là có khả năng kháng oxi hóa thông qua các phản ứng kháng oxi hóa khác nhau bao gồm loại bỏ gốc superoxide và hydroxyl, khả năng chelat và khả năng khử [49] Một nghiên cứu so sánh hoạt động chống oxy hóa của của các loài nấm Ganoderma lucidum, Lentinus edodes và Agaricus bisporus với ba phương pháp đo quang phổ được chọn là xét nghiệm hoạt tính dọn gốc tự do (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (DPPH), [2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] xét nghiệm hoạt tính dọn gốc

tự do (ABTS) và xét nghiệm năng lượng chống oxy hóa làm giảm ion sắt (FRAP) Đã được mô tả trong nghiên cứu Pooja Shah và cộng sự năm 2015 Nhằm so sánh phản ứng kháng oxi hóa của ba phương pháp trên và thảo luận cùng về những ưu nhược điểm của chúng Kết quả cho thấy kết quả của các thử nghiệm khác nhau trên cùng một vật liệu

có thể khác nhau đáng kể Sự khác biệt có thể là do nhiều loại chất chống oxy hóa có trong các mẫu phản ứng khác nhau với các gốc được sử dụng Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và hạn chế riêng về chi phí, sự sẵn có của hóa chất, sự tẻ nhạt, thời gian chuẩn bị, độ tái lập, v.v Trong nghiên cứu này, DPPH được cho là phương pháp phù hợp nhất để xác định hoạt tính chống oxy hóa của sợi nấm của ba loài nấm vì nó có thể được thực hiện nhanh chóng và có khả năng tái sản xuất cao Trong phương pháp DPPH, các gốc không cần phải được tạo ra trước khi thử nghiệm, điều này hóa ra lại là nhược

18

điểm lớn nhất của phương pháp ABTS Nhược điểm duy nhất của phương pháp FRAP

là tốn thời gian chuẩn bị hóa chất Tuy nhiên, trước khi chọn bất kỳ xét nghiệm cụ thể nào, cần phải hiểu cơ chế của từng phương pháp Điều quan trọng là phải nhận ra phương pháp nào sẽ phù hợp nhất cho các mẫu đang nghiên cứu khi xem xét tất cả các ưu điểm

và hạn chế hiện có [45]

19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Giống Đông trùng hạ thảo (C.militaris) được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm Công

nghệ Sinh học Nấm của Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Đà Nẵng

Hình 2.1 Hệ sợi nấm C militaris nuôi cấy tĩnh tại khoa Sinh – Môi trường

Chủng probiotic Lactiplantibacillus plantarum WCFS1, Lactiplantibacillus pentosus NH1, Lactiplantibacillus argentoraten NH13, Pediococci acidilactici NDB8, Lactiplantibacillus casein - 01, Bifidobacterria animalis YC 381 và chủng hại khuẩn Escherichia coli ATCC 85922 được sử dụng để đánh giá hoạt tính prebiotic PS sợi nấm

Prebiotic thương mại FOS được cung cấp bởi công ty CP Dược phẩm Novaco

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu từ tháng 11/2023 đến tháng 04/2024

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi hệ sợi nấm Cordyceps militaris