tổng hợp và thử hoạt tính sinh học các dẫn chất auron có nhóm thế mạch dài

Trong khi các phân nhóm khác của flavonoid đãđược nghiên cứu hoạt tính ức chế lipase tụy, thử nghiệm trên dẫn chất auron vẫn cònhạn chế.. Năm 2021, dẫn chất 1H-inden-1-on với cấu trúc kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THANH TRANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌCCÁC DẪN CHẤT AURON CÓ NHÓM THẾ MẠCH DÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THANH TRANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌCCÁC DẪN CHẤT AURON CÓ NHÓM THẾ MẠCH DÀI

NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐCMÃ SỐ: 8720202

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VÕ THỊ CẨM VÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn với đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh họccác dẫn chất auron có nhóm thế mạch dài” dưới sự hướng dẫn khoa học củaTS Võ Thị Cẩm Vân là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi Các số liệu, hình ảnh,kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực và khách quan.Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài củamình.

Tác giả luận văn

Luận văn Thạc sĩ Dược học

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC DẪN CHẤT AURONCÓ NHÓM THẾ MẠCH DÀI

Nguyễn Thanh Trang

Giảng viên hướng dẫn: TS Võ Thị Cẩm VânĐặt vấn đề

Auron là nhóm dẫn chất tự nhiên thuộc họ flavonoid Mặc dù tồn tại trong tựnhiên với số lượng ít và cấu trúc kém đa dạng, auron vẫn thu hút nhiều sự quan tâmnghiên cứu nhờ sở hữu các hoạt tính sinh học tiềm năng như kháng khuẩn, khángnấm, chống oxy hóa và ức chế các enzym liên quan đến chuyển hóa Ngăn cản sự hấpthu chất béo thông qua ức chế enzym lipase tụy là một hướng tiếp cận trong điều trịbéo phì Cho đến nay, orlistat là thuốc duy nhất được FDA chấp thuận sử dụng trongđiều trị béo phì theo cơ chế này Trong khi các phân nhóm khác của flavonoid đãđược nghiên cứu hoạt tính ức chế lipase tụy, thử nghiệm trên dẫn chất auron vẫn cònhạn chế Năm 2021, dẫn chất 1H-inden-1-on với cấu trúc không gian tương tự khungbenzofuranon của auron được báo cáo có hoạt tính ức chế lipase tụy tốt, đặc biệt làcác dẫn chất với nhóm thế alkyl mạch dài trên vòng A.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Các dẫn chất auron chứa nhóm thế alkylamin trên vòng A được nghiên cứutổng hợp từ nguyên liệu 2'-hydroxyacetophenon hoặc p-aminophenol Các dẫn chấtalkoxyauron được tổng hợp bởi quy trình 3 giai đoạn: (1) tổng hợphydroxybenzofuran-3(2H)-on, (2) tổng hợp hydroxyauron và (3) tổng hợpalkoxyauron bằng phản ứng Williamson Hoạt tính ức chế lipase tụy và cơ chế ức chếenzym được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại-khả kiến với cơ chấtp-nitrophenyl palmitat Khả năng gắn kết giữa auron và lipase tụy được đánh giá bằngthử nghiệm tắt huỳnh quang Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng thử nghiệmđánh bắt DPPH và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được đánh giá bằng phươngpháp khuếch tán trong thạch.

Kết quả và bàn luận

12 dẫn chất alkoxyauron được tổng hợp thành công với hiệu suất 19,2-82,1%.Các dẫn chất với nhóm thế alkoxy mạch dài trên 6 carbon cho khả năng ức chế lipasetụy nổi bật Dẫn chất T12 với hai chuỗi alkoxy dài 10 carbon ở vị trí 4, 6 trên vòngA cho hoạt tính ức chế tốt nhất (IC50 = 1,501 ± 0,1603 µM), gấp khoảng 60 lần chấtđối chiếu quercetin (IC50 = 86,98 ± 3,859 µM) Kết quả động học enzym cho thấyauron T04 ức chế lipase tụy theo cơ chế hỗn hợp (Ki = 6,182 µM, Ki’ = 56,850 µM)và T14 ức chế theo cơ chế cạnh tranh (Ki = 1,288 µM) Các dẫn chất auron khảo sátđều có khả năng làm tắt huỳnh quang enzym theo cơ chế tĩnh T03, T06 và T09 cóhoạt tính chống oxy hóa với IC50 từ 102,45-156,50 µM, thay nhóm –OH phenol/ vòngA bằng nhóm thế alkoxy mạch dài làm giảm hoạt tính chống oxy hóa Nhóm thế mạchdài trên vòng A của auron cũng không có lợi cho hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.Kiến nghị

Tổng hợp 5-aminobenzofuran-3(2H)-on thông qua phản ứng nitro hóabenzofuran-3(2H)-on Tối ưu hóa quy trình tổng hợp các dẫn chất alkoxyauron Tổnghợp, thử hoạt tính ức chế lipase tụy của các dẫn chất 4,6-dialkoxyauron và6-alkoxyauron với mạch alkyl dài trên 10 carbon.

Master's Thesis

SYNTHESIS AND EVALUATION OF BIOLOGICAL ACTIVITIES OFAURONE DERIVATIVES WITH LONG-CHAIN SUBSTITUENTS

Nguyen Thanh Trang

Supervisor: Vo Thi Cam Van, Ph.DIntroduction

Aurones are natural compounds belonging to the flavonoid family Despitetheir presence in small quantities and poor structural diversity in nature, aurones haverecently attracted the attention of researchers with their potential biological activitiesincluding antibacterial, antifungal, antioxidant, and inhibition of some metaboliteenzymes Preventing fat absorption through the inhibition of pancreatic lipase is anapproach to the treatment of obesity To date, orlistat is the only FDA-approved drugacting with this mechanism While other subgroups of flavonoids have been studiedfor their pancreatic lipase inhibitory activity, studies on aurone derivatives have beenstill limited In 2021, 1H-inden-1-on derivatives with a similar structure tobenzofuranone of aurone were reported with good pancreatic lipase inhibitoryactivity, especially compounds with long-chain alkyl substituents on the ring A.Objectives and Methods

Aurone derivatives with alkylamine substituents on ring A were synthesizedfrom 2'-hydroxyacetophenone or p-aminophenol Alkoxyaurone derivatives wereprepared through a 3-step process: (1) synthesis of hydroxybenzofuran-3(2H)-one,(2) synthesis of hydroxyaurone, and (3) synthesis of alkoxyaurone via Williamsonreaction Pancreatic lipase inhibitory activity and enzyme inhibition mechanism weredetermined by ultraviolet-visible spectroscopy with the substrate p-nitrophenylpalmitate The binding properties of aurone with pancreatic lipase were explored byfluorescence quenching assay Antioxidant activity and antibacterial, antifungalactivities were evaluated by DPPH assay and agar diffusion assay, respectively.

12 alkoxyaurone derivatives were successfully synthesized with yields of19.2-82.1% Derivatives with long-chain (6-10 carbon) alkoxy substituents showedbetter potency T12 with two long alkoxy chains (10 carbon) at position 4, 6 on ringA displayed the best inhibitory activity on pancreatic lipase (IC50 = 1.501 ± 0.1603µM), 60-fold higher than the positive control – quercetin (IC50 = 86.98 ± 3.859 µM).Kinetic studies showed that aurone T04 acted as mixed-type inhibition of pancreaticlipase (Ki = 6.182 µM, Ki’ = 56.850 µM) and T12 inhibited the pancreatic lipaseactivity in a competitive manner (Ki = 1.288 µM) Fluorescence quenchingmeasurement indicated that aurones quenched the fluorescence of pancreatic lipasevia a static mechanism T03, T06, and T09 had antioxidant activity with IC50 from102.45-156.50 µM Replacing the –OH phenol group/ring A with a long-chain alkoxysubstituent reduced the antioxidant activity The long-chain substituent on ring A ofaurone has not been beneficial for antibacterial and antifungal activity.

Synthesis of 5-amino3(2H)-one via the nitrosation of 3(2H)-one Optimizing the synthesis process for alkoxyaurone derivatives.Synthesizing and evaluating the pancreatic lipase inhibitory activity of 4,6-dialkoxyaurone and 6-alkoxyaurone derivatives with alkyl chains longer than 10carbon.

1.1 Đặc điểm cấu trúc và nguồn gốc tự nhiên của auron 3

1.2 Hoạt tính sinh học của auron 4

1.3 Vai trò của dây nối alkoxy và alkylamin với hoạt tính sinh học 9

1.4 Phương pháp tổng hợp auron 11

1.5 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất thế O-alkyl và N-alkyl 15

1.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Đối tượng nghiên cứu 29

2.3 Dung môi, hóa chất và trang thiết bị 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 47

3.1 Tổng hợp các dẫn chất auron có nhóm thế alkylamin mạch dài trên vòng A 47

3.2 Tổng hợp các dẫn chất auron có nhóm thế alkoxy mạch dài trên vòng A 51

3.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế lipase tụy 75

3.4 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa 82

3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 83

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 84

4.1 Tổng hợp các dẫn chất auron có nhóm thế alkylamin mạch dài trên vòng A 84

4.2 Tổng hợp các dẫn chất auron có nhóm thế alkoxy mạch dài trên vòng A 86

4.3 Hoạt tính ức chế lipase tụy của các dẫn chất alkoxyauron 93

4.4 Hoạt tính chống oxy hóa của các dẫn chất alkoxyauron 98

4.5 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các dẫn chất alkoxyauron 100

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102

5.1 Kết luận 102

5.2 Kiến nghị 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 CLSI Clinical and LaboratoryStandards Institute

Viện tiêu chuẩn xétnghiệm lâm sàng Hoa Kỳ

3 IC50 Half maximal inhibitoryconcentration

Nồng độ ức chế 50%

4 MHA Mueller-Hinton Agar Thạch Mueller-Hinton

Nồng độ ức chế tối thiểu

6 MSSA Methicillin-susceptibleStaphylococcus aureus

Tụ cầu vàngnhạy cảm Methicillin7 MRSA Methicillin-resistant

Staphylococcus aureus

Tụ cầu vàngkháng Methicillin

Phổ cộng hưởng từhạt nhân

13 SDA Sabouraud Dextrose Agar Thạch SabouraudDextrose14 SpCS Streptococcus pneumoniae

18 UV-Vis Ultraviolet-Visible Tử ngoại-khả kiến

STT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng ViệtKý hiệu viết tắt của hóa chất và dung môi hữu cơ

35 t-BuONa Sodium tert-butoxide Natri tert-butoxid36 t-BuOK Potassium tert-butoxide Kali tert-butoxid37 p-NPP p-Nitrophenyl palmitate p-Nitrophenyl palmitat

STT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng ViệtKý hiệu viết tắt trong phổ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trang thiết bị sử dụng trong tổng hợp 30

Bảng 2.2 Dung môi và hóa chất sử dụng trong tổng hợp 30

Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng trong thử hoạt tính sinh học 32

Bảng 2.4 Dung môi và hóa chất sử dụng trong thử hoạt tính sinh học 33

Bảng 2.5 Điều kiện thử nghiệm hoạt tính ức chế lipase tụy bằng phương pháp quangphổ tử ngoại-khả kiến 40

Bảng 2.6 Điều kiện thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp đánh bắtDPPH 44

Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế lipase tụy của 12 dẫn chất alkoxyauron và chấtđối chiếu bằng phương pháp tử ngoại-khả kiến 75

Bảng 3.2 KSV, Kq, Kgắn kết, n và R2của tương tác giữa các dẫn chất alkoxyauron vàenzym lipase tụy 81

Bảng 3.3 Kết quả chống oxy hóa của các dẫn chất 6-alkoxyauron 82

Bảng 3.4 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của ba dẫn chất auronT02, T04 và T05 83

Bảng 4.1 Các dữ liệu phổ đặc trưng của 12 dẫn chất T01-T12 93

Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả đánh giá hoạt tính ức chế lipase tụy in vitro của các dẫnchất alkoxyauron và chất đối chiếu 98

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc một số phân nhóm của flavonoid 3

Hình 1.2 Cấu trúc một số auron tự nhiên 4

Hình 1.3 Một số auron có hoạt tính kháng khuẩn 5

Hình 1.4 Một số auron có hoạt tính kháng nấm 6

Hình 1.5 Một số auron có khả năng chống oxy hóa tốt 7

Hình 1.6 Một số auron có hoạt tính ức chế enzym lipase tụy 9

Hình 1.7 Các dẫn chất alkoxy chalcon có hoạt tính kháng khuẩn tốt 10

Hình 1.8 Một số dẫn chất inden-1-on với nhóm thế mạch dài trên vòng A có hoạttính ức chế lipase tụy tốt 11

Hình 1.9 Một số phương pháp tổng hợp auron 12

Hình 1.10 Phản ứng oxy hóa đóng vòng chalcon tạo auron 13

Hình 1.11 Phản ứng ngưng tụ xúc tác oxid kim loại trong tổng hợp auron 13

Hình 1.12 Phản ứng ngưng tụ xúc tác kiềm trong tổng hợp auron 14

Hình 1.13 Phản ứng ngưng tụ sử dụng hỗn hợp eutecti trong tổng hợp auron 14

Hình 1.14 Quy trình tổng hợp auron không có nhóm thế trên vòng A từ2'-hydroxyacetophenon 14

Hình 1.15 Phản ứng ngưng tụ xúc tác kiềm trong điều kiện vi sóng 15

Hình 1.16 Phản ứng Williamson tổng hợp dẫn chất ether 15

Hình 1.17 Phản ứng ghép cặp C–O xúc tác kim loại kẽm 16

Hình 1.18 Phản ứng ghép cặp C–O xúc tác CuI 16

Hình 1.19 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác kiềm 17

Hình 1.20 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác kali tert-butoxid 17

Hình 1.21 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác kali hydroxid 17

Hình 1.22 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác triethylamin 18

Hình 1.23 Phản ứng ghép cặp Buchwald-Hartwig xúc tác paladi (II) acetat 18

Hình 1.24 Phản ứng ghép cặp Ullman xúc tác đồng (II) iod 19

Hình 1.25 Phản ứng ghép cặp của aryl nitro với alkyl halid 19

Hình 1.26 Quá trình thủy phân p-nitrophenyl palmitat thành p-nitrophenol 20

Hình 1.27 Phản ứng mô tả mô hình Michaelis-Menten 21

Hình 1.28 Đồ thị Michaelis-Menten 22

Hình 1.29 Đồ thị Lineweaver-Burk 22

Hình 1.30 Cơ chế ức chế cạnh tranh (Competitive Inhibition) 23

Hình 1.31 Cơ chế ức chế không cạnh tranh (Uncompetitive Inhibition) 24

Hình 1.32 Cơ chế ức chế không cạnh tranh (Non-competitive Inhibition) 24

Hình 1.33 Cơ chế ức chế hỗn hợp (Mixed Inhibition) 25

Hình 1.34 Đồ thị Lineweaver-Burk và các thông số động học của các kiểu chất ứcchế enzym 25

Hình 1.35 Cơ chế của phương pháp đánh bắt DPPH 26

Hình 2.1 Đối tượng nghiên cứu - cấu trúc các dẫn chất auron với nhóm thế mạch dàitrên vòng A 29

Hình 2.2 Quy trình tổng hợp các dẫn chất N-alkyl của auron từ nguyên liệu ban đầulà 2'-hydroxyacetophenon 34

Hình 2.3 Quy trình tổng hợp các dẫn chất N-alkyl của auron từ nguyên liệu ban đầulà p-aminophenol 36

Hình 2.4 Quy trình tổng hợp các dẫn chất O-alkyl của auron 37

Hình 3.1 Biểu đồ biểu thị giá trị %I của các dẫn xuất alkoxyauron và quercetin (Q) 76

Hình 3.2 Đường cong Sigmoid tổng quan giữa log(nồng độ) với %I của các dẫn chấtalkoxyauron và chất đối chiếu 77

Hình 3.3 Phổ phát xạ huỳnh quang của enzym lipase tụy lợn khi thêm chất ức chế alkoxyauron 78

-Hình 3.4 Đường hồi quy tuyến tính thể hiện sự tương quan giữa F0/F và nồng độ, log((F0 – F)/F) và log (nồng độ) của chất đối chiếu quercetin 79

Hình 3.5 Đường hồi quy tuyến tính thể hiện sự tương quan giữa F0/F và nồng độ, log((F0 – F)/F) và log (nồng độ) của các dẫn chất alkoxyauron 80

Hình 3.6 Kết quả xác định cơ chế ức chế enzym lipase tụy của dẫn chất T04 và T12 82

Hình 4.1 Cơ chế phản ứng Williamson trong tổng hợp các dẫn chất alkoxyauron 86Hình 4.2 Sự thay đổi tín hiệu phổ của hợp chất trung gian và sản phẩm trong tổnghợp 6-alkoxyauron (a) và 4,6-dialkoxyauron (b) 91Hình 4.3 Biện giải phổ trong xác định đồng phân (Z)/(E) của các dẫn chấtalkoxyauron 92Hình 4.4 So sánh khả năng ức chế lipase tụy của các dẫn chất hydroxyauron vàalkoxyauron 94Hình 4.5 Liên quan giữa hoạt tính ức chế lipase tụy và cấu trúc dẫn chất auron 95Hình 4.6 Sự giảm cường độ huỳnh quang của enzym lipase tụy khi thêm quercetinhoặc T12 96Hình 4.7 So sánh hoạt tính chống oxy hóa của dẫn chất 6-alkoxyauron và6-hydroxyauron 100Hình 5.1 Các dẫn chất alkoxyauron đã tổng hợp 102

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên và trân trọng nhất em xin gửi đến Cô TS Võ Thị CẩmVân, người đã định hướng và trực tiếp hướng dẫn đề tài Luận văn Thạc sĩ của em.Cảm ơn Cô vì thời gian qua đã quan tâm, thấu hiểu và tạo mọi điều kiện tốt nhất choem Được trở thành học trò của Cô là một điều may mắn vì nhờ Cô mà em có cơ hộihọc hỏi rất nhiều, không chỉ về chuyên môn mà cả phong cách sống.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy GS TS Trần Thành Đạo, ThầyPGS TS Phạm Ngọc Tuấn Anh, Thầy PGS TS Trương Ngọc Tuyền, Thầy TS.Tưởng Lâm Trường và Cô TS Nguyễn Kim Anh vì đã nhận lời tham dự Hội đồngđánh giá Luận văn Thạc sĩ của em Cảm ơn Thầy Cô đã dành thời gian đọc, góp ý vàphản biện cho đề tài để Luận văn của em được hoàn thiện hơn.

Xin gửi lời cảm ơn đến Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ ChíMinh đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị tốt nhất để em có thể thựchiện đề tài này Cảm ơn Đại học Kỹ thuật Y-Dược Đà Nẵng đã cho phép và tạo điềukiện cho tôi được theo học và hoàn thành chương trình đào tạo Thạc sĩ Tôi xin chânthành cảm ơn Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệulớn của Tập đoàn Vingroup đã cho tôi cơ hội được nhận học bổng Thạc sĩ trong nước(Mã học bổng: VINIF.2022.ThS.093) Khoản tài trợ này đã giúp tôi có kinh phí đểhọc tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.

Em xin thể hiện lòng kính trọng và sự tri ân sâu sắc đến các Thầy Cô Bộ mônBào chế, Bộ môn Công nghiệp dược, Bộ môn Hóa Dược nói riêng và các Thầy côtrong Khoa Dược nói chung vì đã tận tâm giảng dạy và hết lòng truyền đạt nhữngkiến thức, kinh nghiệm quý giá cho em Em xin cảm ơn Thầy GS TS Trần ThànhĐạo, Thầy GS TS Thái Khắc Minh, Thầy GS TS Lê Minh Trí, Thầy TS TrầnNgọc Châu, Thầy TS Tưởng Lâm Trường, Cô TS Huỳnh Nguyễn Hoài Phương,Thầy ThS Mai Thành Tấn, Thầy ThS Phan Minh Hoàng vì đã quan tâm, giúp đỡvà động viên em trong suốt thời gian làm Luận văn Cảm ơn Thầy Cô đã tạo điều kiệncho em được trải nghiệm và học tập tại Bộ môn Em xin gửi lời cảm ơn đến chị ĐặngThị Hồng Chi và chị Ngô Thị Kiều Khương đã hỗ trợ dung môi hóa chất, dụng cụ

cho em và các bạn làm nghiên cứu Em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô Bộ môn Hóahữu cơ, Bộ môn Phân tích - Kiểm nghiệm, Bộ môn Hóa sinh và Bộ môn Vi kýsinh đã cho phép và tạo điều kiện cho em được sử dụng trang thiết bị phục vụ nghiêncứu tại Bộ môn.

Chị cảm ơn Thương, Mạnh, Minh đã giúp đỡ chị rất nhiều từ những ngàyđầu chị vào lab Một lời cảm ơn rất đặc biệt chị muốn gửi đến Thiện, Oanh, Vy,Liên, Lộc và Phúc vì đã đồng hành cùng chị trong suốt thời gian trên lab Cảm ơn vìđã là động lực để chị lên lab mỗi ngày và cố gắng nhiều hơn Cảm ơn vì các em đãluôn sẵn sàng chia sẻ khó khăn với chị, đã quan tâm, kiên nhẫn lắng nghe và độngviên chị Chị cảm ơn Vân Anh, Liên đã lo cho chị từng bữa cơm trưa tại lab và khôngquên chị mỗi khi có đồ ăn ngon Cám ơn Quỳnh, Nhi và Quỳnh Trang đã hỗ trợ chịrất nhiều trong giai đoạn cuối chị làm thực nghiệm Cám ơn My, Yến, Thư, Phượng,Vinh, Phương, Thịnh, Nguyên Mẫn, Thiên Mẫn, Bình đã cùng chị/ mình thực hiệnđề tài tại Bộ môn Hóa Dược Chị cảm ơn An, Giao, Linh, Đào cùng các bạn monitortại lab Hóa dược đã cùng chị trải qua khoảng thời gian làm nghiên cứu thật đángnhớ Chị cảm thấy rất biết ơn và may mắn vì đã là một thành viên của lab 316 và labHóa Dược, cảm ơn tất cả các em!

Tiếp theo, mình cũng muốn cảm ơn Tú, Vi, Ý vì đã cùng nhau vượt qua cáckì thi, chuyên đề trong suốt thời gian 2 năm Cao học Cảm ơn Trâm, Huy, Thanhvà Kim đã đồng hành cùng mình trong mỗi chuyến đi xa, lắng nghe những lời thanvãn của mình và giúp mình hòa nhập với cuộc sống tại Sài Gòn.

Cuối cùng, lời cảm ơn đặc biệt nhất xin được gửi đến gia đình thân yêu củacon Cảm ơn ba mẹ, anh chị vì đã hỗ trợ không ngừng, động viên và luôn ở đó mỗikhi con cần Cảm ơn ba mẹ đã lắng nghe và cho con lời khuyên mỗi khi con gặp khókhăn Gia đình mãi là điểm tựa tinh thần lớn nhất trong suốt cuộc đời con.

Luận văn này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự hỗ trợ từ mọi ngườivà các tổ chức liên quan Một lời cảm ơn hẳn là không đủ để bày tỏ lòng biết ơn vàsự cảm kích của em/con/mình/chị Một lần nữa xin được gửi lời cảm ơn chân thànhnhất đến tất cả Thầy Cô, gia đình, bạn bè và các bạn sinh viên lab Hóa Dược.

MỞ ĐẦU

Auron là hợp chất tự nhiên thuộc nhóm flavonoid, thường được tìm thấy trongcác bộ phận hoa, lá, quả của các họ thực vật như Fabaceae, Anacardiaceae,Asteraceae…1 Gần đây auron thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu bởi những hoạttính sinh học đa dạng như kháng khuẩn,2 kháng nấm,3 chống oxy hóa,4 độc tế bào,5ức chế enzym tyrosinase,4,6,7 ức chế enzym α-glucosidase.8

Béo phì là một bệnh lý chuyển hóa có xu hướng gia tăng trong những năm gầnđây Đây cũng là yếu tố nguy cơ của các bệnh tim mạch, đái tháo đường hay ung thư.9Lipase tụy là enzym quan trọng của quá trình thủy phân và hấp thu chất béo Ức chếlipase tụy giúp ngăn chặn hay kiểm soát tình trạng béo phì.10 Cho đến nay, orlistat làthuốc duy nhất trên thị trường được FDA phê duyệt trong điều trị béo phì theo cơ chếnày.11 Tuy nhiên, orlistat gây ra các tác dụng phụ trên lâm sàng như độc gan vàthận.12,13

Nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thụy Việt Phương (2019) đã tiến hànhđánh giá in silico khả năng gắn kết của 82 dẫn chất auron vào khoang xúc tác củaenzym lipase tụy người và cho kết quả khả quan.14 Trên cơ sở đó, Lê Thị Mỹ Chi(2020) đã thử hoạt tính ức chế lipase tụy in vitro và báo cáo dẫn chất 2-(5-bromo-2-hydroxybenzyliden)benzofuran-3(2H)-on có phần trăm ức chế cao nhất là 60,95% ởnồng độ 0,05 mg/mL.15 Năm 2021, Peng-Chao Huo và cộng sự báo cáo các dẫn chấtkhung 1H-inden-1-on với cấu trúc không gian tương tự khung benzofuranon củaauron có hoạt tính ức chế lipase tụy nổi bật.16 Dẫn chất (E)-6-(bis(12-hydroxydodecyl)amino)-2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyliden)-2,3dihydro1H-inden-1-on với nhóm thế dialkylamin mạch dài trên vòng A có khả năng ức chế tốt nhất(IC50 = 0,33 µM) Trong đó, nhóm thế mạch dài trên vòng A đóng vai trò quan trọngvới hoạt tính ức chế lipase tụy.

Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Thị Cẩm Vân đã tiến hành tổnghợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa của các dẫn chấtauron có nhóm thế khác nhau trên vòng A và vòng B với một số kết quả khả quanban đầu Hợp chất 2-benzyliden-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-on ức chế

Staphylococcus aureus đề kháng methicillin với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là16 µg/mL và ức chế Streptococcus faecalis tốt hơn amikacin 8 lần.17 Đồng thời, mộtsố nghiên cứu chỉ ra rằng việc tăng chiều dài chuỗi alkoxy trên vòng B hay sự có mặtcủa nhóm thế methoxy trên vòng A đều làm tăng hoạt tính.18,19 Các dẫn chất O-alkyltrên vòng A của chalcon được chứng minh làm tăng tính ưa béo do đó làm tăng hoạttính kháng khuẩn.20 Ngoài ra, nhiều dẫn chất auron cũng được báo cáo với hoạt tínhchống oxy hóa nổi bật.21,22

Nhận thấy vai trò của nhóm thế mạch dài trong việc gia tăng hoạt tính sinh họccũng như ý nghĩa tổng hợp hóa học các dẫn chất auron, luận văn “Tổng hợp và thửhoạt tính sinh học các dẫn chất auron có nhóm thế mạch dài” được thực hiện vớimục tiêu chung là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học các dẫn chất auron vớinhóm thế mạch dài Để thực hiện được mục tiêu này, đề tài thực hiện hai mục tiêu cụthể sau:

- Mục tiêu 1: Tổng hợp các dẫn chất auron có nhóm thế alkoxy hoặc alkylaminmạch dài.

- Mục tiêu 2: Thử hoạt tính sinh học (ức chế enzym lipase tụy, chống oxy hóa,kháng khuẩn kháng nấm) của các dẫn chất tổng hợp được.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN1.1 Đặc điểm cấu trúc và nguồn gốc tự nhiên của auron1.1.1 Cấu trúc và trạng thái tồn tại trong tự nhiên

Auron là một phân nhóm nhỏ của flavonoid.23 Khung cấu trúc cơ bản củaauron gồm hệ thống hai vòng thơm: dị vòng benzofuranon (vòng A và C) gắn vớivòng phenyl (vòng B) bởi liên kết đôi C=C ngoại vòng (Hình 1.1).24,25 Auron có haicấu hình (E) và (Z) nhưng chủ yếu tồn tại ở dạng cấu hình (Z) bền vững.1,26

Hình 1.1 Cấu trúc một số phân nhóm của flavonoid

Năm 1943, auron đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc từ hoa của câyCoreopsis grandiflora.27 Auron chủ yếu tập trung trong hoa, lá và cũng được tìm thấyở các bộ phận khác như quả, hạt hay vỏ cây của một số họ thực vật bậc cao nhưAnacardiaceae, Asteraceae, Gesneriaceae, Fabaceae, Oxalidaceae, Plumbaginaceae,Rubiaceae, Rhamnaceae, Rosaceae, Cactaceae, Moraceae hoặc Plantaginaceae.1,28,29

So với các phân nhóm khác của flavonoid, auron tồn tại trong tự nhiên với sốlượng và cấu trúc kém đa dạng Theo một báo cáo năm 2017, chỉ có hơn 122 hợp chấtauron được phân lập từ thực vật và chủ yếu là các glycosid, auronol hay dimer.1 Trongtự nhiên, các vị trí 4, 6, 7, 3', 4' trong cấu trúc của auron thường gắn với các nhómthế; chủ yếu là hydroxy, methoxy hay glycosid (Hình 1.2) Thế ở các vị trí 5 và 2'kém phổ biến hơn.1,30

Phenyl

Hình 1.2 Cấu trúc một số auron tự nhiên1.1.2 Tính chất lý hóa

Auron là những dẫn chất có màu vàng đến cam Phần lớn auron có bốn cựcđại hấp thụ trong vùng tử ngoại-khả kiến (UV-Vis) và hai trong số chúng được tìmthấy ở bước sóng 370-430 nm.31

Auron có thể tham gia vào phản ứng khử, epoxy hóa auron với hydrogenperoxid và kali hydroxid, tổng hợp các dẫn chất hydrocarbon thơm đa vòng, phản ứngmở rộng vòng, các phản ứng liên quan đến alkoxy phenolic và hydroxy trên auron.261.2 Hoạt tính sinh học của auron

Mặc dù tồn tại trong tự nhiên khá ít nhưng auron được báo cáo với nhiều hoạttính sinh học tiềm năng Hoạt tính sinh học của các dẫn chất auron tự nhiên và tổnghợp gồm kháng khuẩn,2,18,19 kháng nấm,3,32 chống oxy hóa,21,22,33,34 độc tế bào,5,35-37ức chế enzym tyrosinase,6,7,38 ức chế enzym acetylcholinesterase,39,40 ức chế enzymlypase tụy,14 hay ức chế enzym α-glucosidase.8

1.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Auron có hoạt tính kháng khuẩn với phổ khá rộng, được báo cáo ức chế các vikhuẩn Gram (+) như Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcusaureus, Streptococcus pneumoniae, Gram (–) như Pseudomonas aeruginosa và cảcác chủng đề kháng như MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus).2,18,19

Năm 2003, Thomas và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của mộtloạt dẫn chất thế (Z)-2-benzyliden-6,7-dihydroxybenzofuran-3(2H)-on dựa trên khảnăng ức chế chorismat synthase ở vi khuẩn Streptococcus pneumoniae (SpCS) – mộtenzym cần thiết cho quá trình tổng hợp các acid amin thơm của vi khuẩn.18 Sự kếthợp nhóm thế hydroxy ở vị trí ortho và alkoxy ở vị trí para trên vòng B cho kết quảtốt Tăng chiều dài chuỗi alkoxy từ 1 đến 5 carbon làm tăng dần hoạt tính nhưng hoạt

tính giảm với dây dài 6 carbon Auron 1 (Hình 1.3) thể hiện hoạt tính ức chế SpCStốt nhất với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 0,22 µM.

Năm 2020, dẫn chất auron với vòng B là cấu trúc quinolin 2 được báo cáo cóhoạt tính kháng khuẩn tương đối tốt với MIC là 20,0 µg/mL trên B subtilis.41 Cácauron với vòng B là 1-methyl-5-nitro-imidazol và 4-nitroimidazol cũng được tổnghợp và thử hoạt tính kháng khuẩn trên một số chủng Gram (+) và Gram (–).19 Theođó, dẫn chất 1-methyl-5-nitro-imidazoyl với hai nhóm thế methoxy ở vị trí 6, 7 trênvòng A 3 có MIC (µg/mL) thấp hơn chất đối chiếu amoxicillin trên MRSA,B subtilis và K pneumoniae (Hình 1.3).

Hamza Olleik và cộng sự (2019) đã tổng hợp và thử hoạt tính chống lại MRSAvà P aeruginosa của 34 dẫn chất auron.2 Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩnchọn lọc trên vi khuẩn Gram (+) Auron với hai nhóm thế hydroxy ở vị trí 4 và 6 trênvòng A có hoạt tính chống lại MRSA tốt hơn so với các auron chỉ có hydroxy ở mộttrong các vị trí 4, 6, 7 hoặc không có nhóm hydroxy nào với MICtừ 7,8 đến 250 µM.

Hình 1.3 Một số auron có hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2022, nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Thị Cẩm Vân báo cáo một số dẫnchất 4,6-dihydroxyauron có khả năng kháng khuẩn đáng chú ý như dẫn chất thếmethylthio trên vòng B 4 với MIC trên cả hai chủng vi khuẩn MSSA và MRSA đều

là 64 µg/mL và dẫn chất auron 5 ức chế S faecalis tốt hơn chất đối chiếu amikacin 8lần, đồng thời ức chế MSSA và MRSA với MIC là 16 µg/mL (Hình 1.3).17

Năm 2015, Yan-xia Song và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của mộtauron glycosid là (Z)-7,4'-dimethoxy-6-hydroxy-auron-4-O-β-glucopyranosid Hợpchất này thể hiện hoạt tính kháng nấm đối với Candida sp Hiệu lực kháng nấm tươngđương amphotericin B và tốt hơn nhiều so với fluconazol.32

Một nghiên cứu của Sutton và cộng sự (2017) đã thực hiện đánh giá hoạt tínhkháng nấm in vitro của các dẫn chất auron.3 Trong số các hợp chất thử nghiệm, haiauron 6 và 7 (Hình 1.4) thể hiện hoạt tính kháng nấm tương đối tốt với IC50 đều thấphơn 20 µM trên cả ba chủng Candida Vị trí nhóm thế được cho là quan trọng đối vớihoạt tính kháng nấm Nếu thay đổi vị trí nhóm hydroxy và nhóm methoxy hoặc thaynhóm hydroxy thành nhóm methoxy trên vòng B hoặc giảm số lượng nhóm hydroxytrên vòng A đều làm giảm hoạt tính kháng nấm của auron 6 Trường hợp vòng B làdị vòng pyridin với nitơ ở vị trí số 2 thì có hoạt tính tốt nhất Các dị vòng chứa hainitơ hoặc dị tố khác như lưu huỳnh đều làm giảm hoạt tính.

Hình 1.4 Một số auron có hoạt tính kháng nấm1.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa

Sự gia tăng quá mức gốc tự do gây ra hiện tượng “stress oxy hóa”, đây lànguyên nhân dẫn đến sự phát triển của các bệnh lý như ung thư, rối loạn miễn dịch,lão hóa, đục thủy tinh thể, viêm khớp dạng thấp, bệnh tim mạch và thoái hóa thầnkinh.42 Hợp chất flavonoid, đặc biệt là các cấu trúc mang nhiều nhóm hydroxy có khảnăng đánh bắt gốc tự do, thể hiện hoạt tính chống oxy hoá tốt.43 Vòng B với nhóm

thế hydroxy ở vị trí 4' được xem là vị trí tấn công đầu tiên của các gốc tự do để tạogốc tự do phenoxy bền vững hơn.1

Năm 2000, 6 hợp chất auron được phân lập từ dịch chiết ethyl acetat của câyCotinus coggygria đã được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghiệm đánhbắt DPPH.22 Kết quả cho thấy các hợp chất này đều có giá trị IC50 thấp hơn chất đốichiếu là vitamin C (acid ascorbic) và 2(3)-tert-butyl-4-hydroxyanisol (BHA) Trongđó, disulfuretin có tiềm năng nhất với IC50 = 9,7 µg/mL.

Năm 2013, Talat Makhmoor và cộng sự đã phát hiện hai dẫn chất auron trongTảo nâu Spatoglossum variabile Nghiên cứu đánh giá khả năng chống oxy hóa thôngqua thử nghiệm đánh bắt gốc tự do DPPH và superoxid cho thấy hai auron 8 và 9 cókhả năng chống oxy hóa tương đối tốt với IC50 lần lượt là 54 µM và 92 µM (Hình1.5).33

Năm 2014, (Z)-2′,5′-dihydroxy-6-methoxyauron được phân lập từ dịch chiếtmethanol của rễ cây Astragalus englerianus thể hiện hoạt tính tốt với giá trịIC50 = 35,9 ± 1,1 µM trong thử nghiệm đánh bắt DPPH.21

Hình 1.5 Một số auron có khả năng chống oxy hóa tốt

Bên cạnh các auron tự nhiên, auron tổng hợp cũng được khảo sát hoạt tínhchống oxy hóa Daisuke Nakabo và cộng sự (2018) đã tổng hợp và đánh giá hoạt tínhchống oxy hóa bằng phương pháp đánh bắt DPPH của 12 dẫn chất auron Kết quảcho thấy nhóm hydroxy ở vị trí 3' và 4' trên vòng B có ý nghĩa quan trọng Khi thaybằng methoxy, hoạt tính giảm đáng kể Trong khi đó, nhóm thế hydroxy trên vòng Aít ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa hơn Hai auron 10 và 11 (Hình 1.5) đượcbáo cáo có %I cao nhất lần lượt là 85,8% và 84,2% ở nồng độ 40 µM.34

1.2.3 Hoạt tính ức chế enzym lipase tụy

Lipase tụy đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân chất béo từ thứcăn thành monoglycerid và acid béo tự do mà cơ thể có thể hấp thu được Ức chế lipasetụy giúp hạn chế sự hấp thu chất béo, làm giảm cân và hạ lipid máu.10

Theo một báo cáo tổng quan của Tian-Tian Liu và cộng sự (2020), khung cấutrúc flavonoid được xem là cần thiết cho hoạt động ức chế lipase tụy.10 Liên kết đôigiữa C2 = C3 (vòng C) có vai trò quyết định đối với sự tương tác giữa flavonoid vàlipase.44 Quercetin là một flavonoid phổ biến trong tự nhiên, thuộc phân nhómflavonol.45 Tác động ức chế lipase tụy in vitro của quercetin đã được báo cáo với IC50là 70 µg/mL Ở mô hình thực nghiệm trên chuột, quercetin làm giảm đáng kể sự hấpthu và tăng bài tiết chất béo ở liều 5-10 mg/kg Khả năng gắn kết của quercetin vớilipase tụy cũng được chứng minh thông qua thử nghiệm tắt huỳnh quang và mô hìnhdocking phân tử.46 Cùng với flavonol, các phân nhóm khác của flavonoid nhưchalcon47-49 và flavon50 đã được nghiên cứu rộng rãi Tuy nhiên, hiện có ít thử nghiệmđánh giá hoạt tính ức chế lipase tụy của auron được báo cáo.

Năm 2019, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thụy Việt Phương đã tiếnhành khảo sát in silico trên 82 dẫn chất auron và nhận thấy (Z)-5-cloro-2-(4-(2-(4-methoxyphenyl)-2-oxoethoxy)benzyliden)benzofuran-3(2H)-on 12 (Hình 1.6) có khảnăng gắn kết tốt nhất với lipase tụy người với điểm số docking là −10,6 kcal.mol −1,đồng thời hợp chất này cũng liên kết tốt và ổn định trong khoang xúc tác lipase tụythông qua kết quả mô phỏng động lực học phân tử.14 Dựa vào kết quả trên, Lê ThịMỹ Chi (2020) đã tổng hợp và thử hoạt tính ức chế lipase tụy in vitro của một số dẫn

chất auron với vòng benzyliden thế 9 trên 10 hợp chất được khảo sát có hoạt tính,trong đó dẫn chất 13 (Hình 1.6) có khả năng ức chế enzym lipase tụy tốt nhất vớiphần trăm ức chế là 60,95% ở nồng độ 0,05 mg/mL.

Hình 1.6 Một số auron có hoạt tính ức chế enzym lipase tụy1.3 Vai trò của dây nối alkoxy và alkylamin với hoạt tính sinh học

Ngoài khung cấu trúc cơ bản là benzofuranon, hoạt tính sinh học của auroncòn bị ảnh hưởng bởi các nhóm thế trên vòng A và B Bên cạnh các nhóm thế thườnggặp như hydroxy, halogen hay thiol, nhóm thế alkoxy và alkylamin mạch dài cũngđược quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây.16,20,51

1.3.1 Dây nối alkoxy với hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Hiện tại chưa có báo cáo nghiên cứu về ảnh hưởng của nhóm thế mạch dài trênvòng A đối với hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của auron Tuy nhiên, các nghiêncứu về vai trò của nhóm thế alkoxy trên chalcon20,51 đối với hoạt tính kháng khuẩn,kháng nấm đã được báo cáo.

Các dẫn chất chalcon với độ dài chuỗi alkoxy khác nhau được tổng hợp và thửhoạt tính ức chế Escherichia coli.51 Kết quả cho thấy tất cả các dẫn chất này đều thểhiện hoạt tính kháng khuẩn khá tốt với MIC 104-163 ppm Trong đó, hợp chất 14(Hình 1.7) với chuỗi alkoxy 6 carbon trên vòng A cho hoạt tính mạnh nhất.

Nghiên cứu của Génesis López và cộng sự (2020) nhận thấy sự có mặt củamột chuỗi alkoxy trên vòng A giúp cải thiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm củachalcon.20 Nghiên cứu thực hiện trên các chuỗi alkoxy khác nhau như allyl,2-methylprop-2-en-1-yl, crotyl, prenyl và các dẫn chất này đều có giá trị MIC trênP infestans thấp hơn đáng kể so với chất đối chiếu difenoconazol Hợp chất 15 (Hình

1.7) có hoạt tính ức chế tốt nhất với MIC = 12,5 µg/mL và phần trăm ly giải màng100% so với natri dodecyl sulfat 2% (chất diện hoạt anion có khả năng ly giải 100%màng tế bào) Các báo cáo này cho phép dự đoán tiềm năng của nhóm thế alkoxy trênauron.

Hình 1.7 Các dẫn chất alkoxy chalcon có hoạt tính kháng khuẩn tốt1.3.2 Dây nối alkoxy và alkylamin với hoạt tính ức chế enzym lipase tụy

Với mục tiêu cải thiện độ ổn định về mặt hóa học và gia tăng hoạt tính sinhhọc, nghiên cứu của Peng-Chao Huo và cộng sự (2021) đã tiến hành tổng hợp và khảosát hoạt tính ức chế enzym lipase tụy của các dẫn chất với khung inden-1-on.16 Vềmặt cấu trúc, khung inden-1-on có sự tương đồng lớn với khung cấu trúc của auron.

Khi thay đổi nhóm thế trên vòng A của các dẫn chất inden-1-on, khả năng ứcchế lipase tụy của dẫn chất propyl ether 16 tăng gần 15 lần so với methyl ether 17(Hình 1.8) Nghiên cứu cũng cho thấy các dẫn chất N-dialkyl ở vị trí số 6 trên vòngA thể hiện hoạt tính tốt hơn so với các dẫn chất N-monoalkyl Dẫn chất thế một lần18 (IC50 = 25,09 µM) có giá trị IC50 cao hơn đáng kể so với dẫn chất thế hai lần 19(IC50 = 2,09 µM) (Hình 1.8) Trong các hợp chất được khảo sát, dẫn chất 20 mangnhóm thế alkylamin mạch dài với đuôi hydroxy ở cuối mạch thể hiện khả năng ứcchế mạnh nhất với IC50 là 0,33 µM Kết quả docking phân tử đánh giá khả năng gắnkết của 20 với lipase tụy cũng chỉ ra nhóm hydroxy ở cuối chuỗi carbon mạch dài tạođược liên kết hydro với Cys238 của lipase tụy.16 Nghiên cứu này mở ra định hướngvề vai trò của nhóm thế mạch dài trên auron đối với khả năng ức chế lipase tụy.

Hình 1.8 Một số dẫn chất inden-1-on với nhóm thế mạch dài trên vòng A có hoạttính ức chế lipase tụy tốt

1.4 Phương pháp tổng hợp auron

Auron tồn tại trong tự nhiên với số lượng khá ít và cấu trúc hóa học kém đadạng Vì vậy, tổng hợp auron là vấn đề nghiên cứu được chú ý trong những năm gầnđây Có nhiều con đường tổng hợp auron từ các nguyên liệu ban đầu khác nhau (Hình1.9),26,52 nhưng nhìn chung auron có thể được tổng hợp theo hai hướng chính:

(1) Tổng hợp auron thông qua phản ứng đóng vòng: đóng vòng nội phân tửdẫn chất thế acetylen hoặc oxy hóa đóng vòng 2'-hydroxychalcon.

(2) Tổng hợp auron thông qua phản ứng ngưng tụ giữa aldehyd và ceton.Trong đó, oxy hóa đóng vòng 2'-hydroxychalcon và ngưng tụ dẫn chấtbenzofuran-3(2Н)-on với các dẫn xuất benzaldehyd là hai hướng tổng hợp auron đãđược thực hiện tại Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược.

1 H2O2/OH

2 Tl(NO3)3/MeOH, H+3 Hg(OAc)2/DMSO4 K3Fe(CN)6

1 H+: HCl/EtOH, AcOH & HCl, SOCl2/EtOH2 Kiềm: KOH, NaOH, NaOMe

3 Oxid kim loại: Al2O34 Eutecti: cholin clorid và ureR2

(1) Tổng hợp auron thông qua phản ứng đóng vòng

(2) Tổng hợp auron thông qua phản ứng ngưng tụ

Hình 1.9 Một số phương pháp tổng hợp auron1.4.1 Phản ứng oxy hóa đóng vòng 2'-hydroxychalcon

2'-Hydroxychalcon được tổng hợp thông qua phản ứng ngưng tụ Schmidt giữa 2'-hydroxyacetophenon và dẫn xuất benzaldehyd, xúc tác kali hydroxidtrong ethanol hoặc natri hydrid trong dimethylformamid (DMF) khan.532'-Hydroxychalcon sau đó được oxy hóa đóng vòng với các tác nhân khác nhau nhưhydrogen peroxid, thallium trinitrat, kali hexacyanoferrat (III) hay thủy ngân (II)acetat.

Claisen-Phản ứng Algar-Flynn-Oyamada sử dụng hydrogen peroxid trong môi trườngkiềm làm tác nhân oxy hóa đóng vòng 2'-hydroxychalcon có một nhóm methyl hoặcmethoxy ở vị trí 6' tạo sản phẩm cuối cùng là dẫn chất auron (Hình 1.10).54 Nghiêncứu của Nicole Morales-Camilo (2014) sử dụng xúc tác thủy ngân (II) acetat, đun hồilưu trong 2 giờ thu được auron với hiệu suất cao (60-99%).55 Tác nhân oxy hóa thủyngân (II) acetat trong pyridin hoặc đồng (II) bromid trong dimethylsufoxid (DMSO)đều được sử dụng để tổng hợp auron với hiệu suất gần tương đương nhau (Hình1.10).56 Tuy nhiên do độc tính của thủy ngân (II) acetat nên gần đây đồng (II) bromidđược ưu tiên sử dụng hơn Thallium (III) nitrat trong dung môi methanol cũng được

cho phản ứng với 2'-hydroxychalcon để tạo ra isoflavon và (hoặc) auron tùy thuộcvào bản chất điện tử của nhóm thế trên vòng B (Hình 1.10).57

Hình 1.10 Phản ứng oxy hóa đóng vòng chalcon tạo auron

Tại Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minhauron đã được tổng hợp thành công từ nguyên liệu ban đầu là chalcon bởi nhómnghiên cứu của tác giả Trần Thành Đạo và Huỳnh Thị Ngọc Phương.58 Quy trình sửdụng xúc tác đồng (II) bromid trong dung môi DMSO ở 160-180 oC.

1.4.2 Phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt giữa benzofuran-3(2H)-on và dẫnxuất benzaldehyd

Phản ứng ngưng tụ có thể xảy ra trong môi trường kiềm, môi trường acid, dungmôi eutecti hoặc với sự có mặt của xúc tác oxid kim loại.

Phản ứng giữa dẫn chất benzofuran-3(2H)-on với dẫn xuất benzaldehyd trongdung môi dicloromethan (DCM) hoặc cloroform (CHCl3), xúc tác Al2O3, thực hiệnqua đêm ở nhiệt độ phòng để thu được auron với hiệu suất dao động từ 13,2% đến97,0% (Hình 1.11).59

Hình 1.11 Phản ứng ngưng tụ xúc tác oxid kim loại trong tổng hợp auronNăm 2004, Venkateswarlu và cộng sự sử dụng xúc tác acid anhydrid acetic,gia nhiệt đến 90 oC trong vòng 2 giờ cũng tạo sản phẩm auron nhưng với hiệu suấtkhông cao (21-48%).4 Benzofuran-3(2Н)-on phản ứng với dẫn xuất benzaldehyd cómặt xúc tác acid acetic và lượng nhỏ acid hydrocloric để hình thành auron.60

Một xúc tác đơn giản hơn được sử dụng là kiềm trong cồn hoặc hỗn hợp cồnnước Cụ thể, với sự có mặt của kali hydroxid hoặc natri hydroxid, dung môi ethanol,

methanol hoặc hỗn hợp của chúng với nước trong điều kiện có hoặc không gia nhiệtthu sản phẩm có hiệu suất cao (Hình 1.12).39,61,62

Hình 1.12 Phản ứng ngưng tụ xúc tác kiềm trong tổng hợp auron

Hỗn hợp eutecti cholin clorid và ure (tỉ lệ 1:2) cũng đã được nghiên cứu và sửdụng vừa làm xúc tác vừa làm dung môi cho phản ứng tổng hợp auron với hiệu suấtcao (Hình 1.13).63

Hình 1.13 Phản ứng ngưng tụ sử dụng hỗn hợp eutecti trong tổng hợp auronNăm 2020, nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Thị Cẩm Vân đã tiến hành tổnghợp auron từ 2'-hydroxyacetophenon Quy trình tổng hợp gồm hai giai đoạn chính làtổng hợp chất trung gian benzofuran-3(2H)-on từ 2'-hydroxyacetophenon và tổng hợpauron thông qua phản ứng ngưng tụ với dẫn xuất benzaldehyd trong môi trường acid(acid p-toluensulfonic 40%).15 Quy trình cho hiệu suất ổn định từ 44,8% đến 72,9%và điều kiện nhiệt độ ít khắc nghiệt hơn quy trình đi từ chalcon.

Hình 1.14 Quy trình tổng hợp auron không có nhóm thế trên vòng A từ2'-hydroxyacetophenon

Năm 2022, nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Thị Cẩm Vân tối ưu hóa quy trìnhtổng hợp các dẫn chất auron từ nguyên liệu ban đầu là 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-on và dẫn xuất benzaldehyd, dung môi ethanol 50% với sự có mặt của xúc tác

kiềm kali hydroxid bằng phương pháp vi sóng giúp rút ngắn thời gian phản ứng vàcải thiện hiệu suất đáng kể (Hình 1.15).17,64

Hình 1.15 Phản ứng ngưng tụ xúc tác kiềm trong điều kiện vi sóng1.5 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất thế O-alkyl và N-alkyl

1.5.1.1 Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (phản ứng Williamson)

Phản ứng Williamson là phản ứng kinh điển trong tổng hợp dẫn chất alkylether Phản ứng dựa trên cơ chế thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2) giữa một tác nhân áinhân là ion alkoxid và một tác nhân ái điện tử là alkyl halid với sự có mặt của xúc táckiềm để hình thành sản phẩm ether Tác nhân kiềm thường sử dụng là KOH, NaOHhoặc các muối carbonat như K2CO3, Na2CO3.

Hình 1.16 Phản ứng Williamson tổng hợp dẫn chất ether

Với nguyên liệu ban đầu là dẫn chất alcol/phenol và alkyl halid, xúc tác kalicarbonat trong dung môi DMSO Phản ứng có thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ phòngtrong thời gian thích hợp.65 Trong một nghiên cứu của Ya-Zheng Zhang và cộng sự(2013), phản ứng ether hóa cũng được thực hiện với sự có mặt của hỗn hợp xúc táckali iodid và kali carbonat, dung môi aceton khan, đun hồi lưu Việc thêm một lượngkali iodid thích hợp được báo cáo làm tăng tốc độ phản ứng và hiệu suất sản phẩm.66

Ngoài ra, quy trình tổng hợp dẫn chất ether sử dụng tetra-n-butylammonium iodid(TBAI) – xúc tác chuyển pha cùng với xúc tác kiềm kali carbonat trong dung môiDMSO (50 oC) hoặc methyl ethyl ceton (hồi lưu) cũng đã được báo cáo Kali carbonatđược đánh giá là kiềm thích hợp cùng với sự hiện diện của lượng nhỏ TBAI giúp rútngắn thời gian phản ứng, điều kiện phản ứng nhẹ nhàng hơn và gia tăng hiệu suất.67,681.5.1.2 Phản ứng ghép cặp C–O xúc tác kim loại

Phản ứng ghép cặp C–O giữa một alkyl halid với một alcol/phenol để hìnhthành liên kết ether xảy ra với sự có mặt của xúc tác kim loại.

Một nghiên cứu của Satya Paul và Monika Gupta (2005) đã tổng hợp ether từdẫn chất phenol và alkyl halid nhờ xúc tác kẽm trong dung môi N,N-dimethylformamid (DMF) bằng phương pháp vi sóng (Hình 1.17).69 Hiệu suất sảnphẩm và thời gian phản ứng được cải thiện đáng kể so với phương pháp gia nhiệtthông thường (đun cách dầu) trong dung môi tetrahydrofuran.

Hình 1.17 Phản ứng ghép cặp C–O xúc tác kim loại kẽm

Alkyl aryl ether được tổng hợp thông qua phản ứng ghép cặp với xúc tác làmuối đồng Tùy vào dẫn xuất iod, brom hay clo mà điều kiện phản ứng (thời gian,nhiệt độ) và xúc tác là khác nhau (Hình 1.18).70 Cụ thể, phản ứng giữa aryl iodid vàalkyl alcol sử dụng xúc tác CuI, t-BuONa và dung môi 1,4-dioxan Hỗn hợp đượckhuấy và duy trì ở nhiệt độ phòng, 60 oC hoặc 80 oC trong 24 giờ để thu sản phẩmvới hiệu suất khá cao từ 69 đến 98%.

Hình 1.18 Phản ứng ghép cặp C–O xúc tác CuI1.5.2 Phương pháp tổng hợp dẫn chất N-alkyl

Dẫn chất N-alkyl hóa có thể được tổng hợp từ các nguyên liệu ban đầu khácnhau như aryl amin, aryl nitro hay aryl halid nhưng về mặt cơ chế phản ứng có thểchia thành hai hướng chính:

(1) Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử(2) Phản ứng ghép cặp C–N xúc tác kim loại1.5.2.1 Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử

Các dẫn chất aryl alkyl amin được tổng hợp thông qua phản ứng alkyl hóa dẫnxuất anilin với alkyl halid trong môi trường kiềm (Hình 1.19).

Hình 1.19 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác kiềm

Quá trình amin hóa trực tiếp giữa một aryl halid và một amin được thực hiệnbằng vi sóng với xúc tác kali tert-butoxid trong dung môi DMSO (Hình 1.20) thuđược sản phẩm hiệu suất khá cao (61-97%), đặc biệt là các aryl halid giàu điện tử.71

Hình 1.20 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác kali tert-butoxidMột xúc tác kiềm tiềm năng khác cũng đã được nghiên cứu bởi Jianzhong Yuvà cộng sự (2013) với hiệu suất sản phẩm thu được từ 48% đến 98%.72 Kết quả chothấy sự kết hợp của kali hydroxid trong dung môi DMSO là tốt nhất cho phản ứng(Hình 1.21) Ngoài ra, sự có mặt của các nhóm thế hút điện tử trên dẫn chất phenolcho hiệu suất cao hơn so với các nhóm cho điện tử như methyl hoặc methoxy.

Hình 1.21 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác kali hydroxid

Nghiên cứu khảo sát điều kiện phản ứng N-alkyl hóa của amin thơm bậc 1 vớialkyl bromid được thực hiện bởi Shubhankar Bhattacharyya và cộng sự (2014).73 Kếtquả cho thấy DMF, DMSO và nitromethan là ba dung môi phân cực không proton

(aprotic) phù hợp cho phản ứng Khảo sát các tác nhân kiềm khác nhau xúc tác chophản ứng, N,N-dimethyl-4-aminopyridin (DMAP), diisopropylethylamin (DIPEA)và triethylamin (Hình 1.22) cho sản phẩm có độ chọn lọc tốt và hiệu suất cao.

Hình 1.22 Phản ứng tổng hợp dẫn chất N-alkyl xúc tác triethylamin1.5.2.2 Phản ứng ghép cặp C–N xúc tác kim loại

Phản ứng ghép cặp Buchwald-Hartwig

Phản ứng Buchwald-Hartwig là phản ứng tổng hợp hữu cơ để hình thành liênkết C–N thông qua phản ứng ghép cặp giữa aryl halid và amin với xúc tác kim loạipaladi Với nguyên liệu ban đầu là aryl halid và alkyl amin, phản ứng sử dụng phứchợp xúc tác paladi (II) acetat và phối tử L (Hình 1.23) trong môi trường kiềm với sựcó mặt của cesi carbonat hoặc natri tert-butoxid Phản ứng gia nhiệt ở 80-110 oC trongthời gian từ 15-24 giờ để thu được sản phẩm với hiệu suất khá cao.74

Hình 1.23 Phản ứng ghép cặp Buchwald-Hartwig xúc tác paladi (II) acetatPhản ứng ghép cặp Ullman

Phản ứng Ullman tổng hợp aryl alkyl amin từ một aryl halid và một amin vớixúc tác muối đồng ở nhiệt độ cao Điều kiện phản ứng khắc nghiệt không phù hợpvới các chất kém bền nhiệt, vì vậy hệ xúc tác đồng kết hợp với các phối tử khác nhaulà hướng tổng hợp được ứng dụng trong những năm gần đây Năm 2013, Liye Huangtiến hành phản ứng giữa aryl halid với anilin, benzylamin, alkyl amin hoặc imidazol.Phản ứng ghép cặp C–N sử dụng hỗn hợp chất xúc tác CuI/polystyren-supportedpyrrole-2-carbohydrazid (PSP) (Hình 1.24) với sự có mặt của tetrabutylammonium

bromid (TBAB) trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 70-130 oC tùy thuộc vào loạiamin.75

Hình 1.24 Phản ứng ghép cặp Ullman xúc tác đồng (II) iod

Phản ứng ghép cặp có tính khử của nitro thơm với dẫn xuất halogen của hợp chấthữu cơ

Theo nghiên cứu của Chi Wai Cheung và Xile Hu (2016), phản ứng tổng hợparyl alkyl amin từ aryl nitro được đánh giá tiết kiệm chi phí hơn, không cần phải bảovệ nhóm chức amin thơm và hiệu suất sản phẩm cao hơn.76 Quy trình sử dụngN-methylpyrolidon làm dung môi, xúc tác sắt (II) clorid tetrahydrat, kẽm là tác nhânkhử và trimethylsilyl chlorid (TMSCl) làm chất đồng khử (Hình 1.25).

Hình 1.25 Phản ứng ghép cặp của aryl nitro với alkyl halid1.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

1.6.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym lipase tụy

Có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính enzym đã được nghiên cứu và báocáo như chuẩn độ thể tích, đo phổ, xét nghiệm phóng xạ, xét nghiệm miễn dịch, sắcký, cảm biến sinh học…77 Trong đó phương pháp quang phổ được ứng dụng rộng rãi.1.6.1.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis)

Khi bị thủy phân bởi xúc tác lipase tụy, cơ chất giải phóng sản phẩm có màuvà được phát hiện trong vùng UV-Vis Hoạt tính ức chế được xác định dựa trên việcgiảm độ hấp thụ của mẫu có chất khảo sát so với mẫu không có chất khảo sát Cơ chấtthường dùng là ester của p-nitrophenyl hoặc naphthyl với các acid béo mạch dài và

các thioester Trong đó, p-nitrophenyl palmitat (p-NPP) được lựa chọn làm cơ chấttrong nhiều nghiên cứu.49,78,79 Dưới tác dụng của enzym lipase tụy, p-NPP bị thủyphân thành acid palmitic và p-nitrophenol p-nitrophenol có màu vàng và hấp thụmạnh ở bước sóng 410-415 nm (Hình 1.26).

Hình 1.26 Quá trình thủy phân p-nitrophenyl palmitat thành p-nitrophenolCơ chất p-NPP cũng được lựa chọn trong thử nghiệm hoạt tính ức chế lipasetụy bởi nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Thị Cẩm Vân tại Bộ môn Hóa Dược, KhoaDược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (2021).80 Nghiên cứu đã khảo sátcác yếu tố thực nghiệm ảnh hưởng đến hoạt động của enzym để tối ưu hóa quy trìnhthử nghiệm khả năng ức chế lipase tụy in vitro.

1.6.1.2 Phương pháp huỳnh quang để đánh giá tương tác giữa enzym và phối tửSự tương tác giữa các phân tử protein và phối tử có thể dẫn đến sự tắt huỳnhquang do va chạm Việc xác định và đánh giá các thông số của quá trình tắt quang cóthể dùng để phân tích sự tương tác và khả năng gắn kết giữa các phân tử Cơ chế củasự tắt quang gồm tắt quang động, tắt quang tĩnh và dạng phối hợp.81 Trong đó tắtquang tĩnh thường là cơ sở để nghiên cứu sự gắn kết giữa các phân tử nhỏ vớiprotein.82 Phân biệt tắt quang tĩnh và tắt quang động dựa trên sự biến thiên của hệ sốtắt quang 𝐾 theo nhiệt độ, hệ số tốc độ tắt quang 𝐾 , liên hệ giữa sự tắt quang vàvòng đời của phân tử kích thích bằng cách so sánh và Tắt quang tĩnh có 𝐾giảm khi tăng nhiệt độ, 𝐾 > 2.1010 L.mol-1.s-1, ≠ và làm thay đổi phổ hấp thụcủa phân tử tắt quang.81

Sự phát huỳnh quang của protein chủ yếu gây ra bởi ba acid amin Tryptophan(Trp), Phenylalanin (Phe) và Tyrosin (Tyr) Trên thực tế, phenylalanin có năng suấtlượng tử rất thấp và huỳnh quang của tyrosin gần như bị dập tắt hoàn toàn nếu nó bịion hóa hoặc ở gần nhóm amin và nhóm carboxyl Vì thế, huỳnh quang của protein

chủ yếu được quyết định bởi tryptophan.83 Lipase tụy người chứa 7 Trp, năm trongsố chúng ở vùng N tận và hai acid amin còn lại ở vùng C tận Lipase tụy cũng có 25Phe và 16 Tyr đóng góp vào sự phát huỳnh quang của protein này.84

Sự thay đổi cường độ huỳnh quang của enzym lipase tụy được cho là do sựtương tác với phối tử, làm thay đổi tính phân cực của môi trường xung quanhtryptophan.84 Khả năng tương tác giữa phối tử và enzym lipase tụy được đánh giáthông qua sự thay đổi phổ phát xạ của enzym ở nồng độ cố định và các thông số thuđược, cụ thể:

Phổ phát xạ: Đánh giá dựa trên sự giảm cường độ huỳnh quang và sự dịch chuyểncủa bước sóng phát xạ cực đại của enzym khi tăng nồng độ phối tử.85

Các thông số: Các thông số cần thiết được tính toán theo phương trình Stern-Volmer.Hệ số tốc độ tắt quang (𝐾 ) giúp phân biệt tắt quang tĩnh và động, phản ánh khả năngtắt quang của phối tử (𝐾 càng lớn thì khả năng tắt quang của phối tử càng cao).Hệ số gắn kết 𝐾 ắ ế và số vị trí gắn kết 𝑛 (hay số phân tử nhỏ được gắn kết trênmột phân tử enzym) để đánh giá khả năng gắn kết của phối tử và enzym lipase tụy.851.6.1.3 Phương pháp xác định cơ chế ức chế enzym lipase tụy

𝑉 = 𝑉 × [𝑆]𝐾 + [𝑆]

Hình 1.27 Phản ứng mô tả mô hình Michaelis-Menten

(Chú thích: K1, K2, K3 là hằng số vận tốc của các bước khác nhau trong quá trình xúctác, E là enzym, S là cơ chất, ES là phức hợp enzym-cơ chất và P là sản phẩm)

Trong đó: V là vận tốc phản ứng enzym, Km là hằng số Michaelis-Menten và giá trịcủa nó chính là nồng độ cơ chất mà tại đó vận tốc phản ứng đạt một nửa giá trị cựcđại (Vmax/2), Vmax là vận tốc tối đa của phản ứng, xảy ra khi toàn bộ enzym được tạophức với cơ chất và [S] là nồng độ cơ chất.86

Hình 1.28 Đồ thị Michaelis-MentenĐồ thị Lineweaver-Burk

Để tính toán giá trị Km và Vmax, đồ thị Lineweaver-Burk (Hình 1.29) biểu thịphương trình Michaelis-Menten ở dạng tuyến tính bằng cách lấy nghịch đảo hai vế.86

1𝑉 =

Dựa vào vị trí giao điểm của đồ thị Lineweaver-Burk khi có và không có chấtức chế để xác định cơ chế ức chế enzym (Hình 1.34).86

Độ dốc: Km

Hình 1.29 Đồ thị Lineweaver-Burk