tổng hợp para menthane 3 8 diol từ tinh dầu bạch đàn chanh eucalyptus citriodora

Nghiên cứu này chủ động tận dụng được nguồn nguyên liệu tinh dầu Bạch đàn chanh trong nước để tạo sản phẩm có thể ứng dụng làm hoạt chất xua đuổi muỗi.. Qua một số nghiên cứu cho thấy cá

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora Hook.)

Bạch đàn chanh (tên khoa học: Eucalyptus citriodora Hook.) là loài cây đặc hữu của vùng Queensland, Australia, họ Myrtaceae Loài cây này có thể được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới, bao gồm các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới [7] Ở Việt Nam, loài bạch đàn này đã được nhập vào từ những năm 1950 và được trồng với quy mô vừa và nhỏ trong cả nước kéo dài từ Vĩnh Phúc, Quảng Ninh (miền Bắc) đến Long An (miền Nam) [1]

Bạch đàn chanh là loài cây đại mộc thuộc họ Bạch đàn Cây thường đạt chiều cao từ 24 đến 40 mét, thân cao và thẳng, có vỏ nhẵn và xám, đường kính thân khoảng 0,6 đến 1,3 mét (Hình 1.1) Lá già mọc so le phiến lá hình liềm hẹp và dài hơn lá non, nụ hoa màu trắng được quan sát thấy trong một nhóm từ 3 đến 5 chiếc [8, 9] Loài cây này dễ dàng thích nghi với môi trường mới, chịu đựng hạn hán mạnh mẽ, thích hợp trồng ở vùng thấp và có thể phát triển ở các khu vực mưa cả mùa hè và mùa đông Loài cây này thường được trồng ở bờ ao, biển để lấy bóng mát và giữ đất Một số khu vực trồng rừng thương mại ở các vùng mưa nhiệt đới, chẳng hạn như Châu Phi, Châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Sri Lanka), Nam Mỹ (Brazil) [10]

Bạch đàn chanh là một loại cây cho gỗ có giá trị, có thể sử dụng cho hầu hết mọi mục đích như làm chất đốt, làm nguyên liệu để sản xuất giấy, gỗ để xây dựng Ở Việt Nam, do khả năng phát triển của bạch đàn chanh rất nhanh trên các loại đất nên chúng được trồng ở những vùng trung du, đồi núi để phủ xanh đồi trọc, giữ nước, … [2] Mùi thơm đặc trưng của bạch đàn chanh có tác dụng xua đuổi muỗi, do đó được trồng ở những vùng đầm lầy ẩm thấp để cải tạo môi sinh, làm giảm tỉ lệ bệnh sốt rét [2, 3]

Hình 1.1 Hình dáng thân và cành cây bạch đàn chanh tại Nigeria [11]

Tinh dầu là thành phần mang lại hoạt tính sinh học cho cây bạch đàn chanh Lá của cây bạch đàn chanh được dùng để sản xuất tinh dầu có màu vàng nhạt hoặc vàng nâu nhạt với hương vị cam quýt tươi [8] Bạch đàn chanh cung cấp tinh dầu với năng suất khá cao, có giá trị xuất khẩu [12, 13] Qua các khảo sát trước đây của các tác giả trên thế giới, tinh dầu bạch đàn chanh tuy cùng một loại cây nhưng nồng độ và thành phần hóa học lại khác nhau tùy vào thời điểm khảo sát và nguồn gốc địa lý

Bảng 1.1 Thành phần tinh dầu từ lá cây bạch đàn chanh được chưng tại Algeria [14]

1,8-Cineole 0,14 𝛼-Pinene 0,08 cis-Rose oxide 0,27 𝛽-Pinene 0,43 trans-Rose oxide 0,13 Limonene 0,25

𝛼-Terpineol 0,33 Bicyclogermacrene 0,07 Citronellol 10,63 Oxygenated Sesquiterpenes

PMD 2,76 Các hợp chất khác

Năm 2015, các nhà khoa học ở Algeria đã chiết xuất tinh dầu từ lá cây Bạch đàn chanh với hiệu suất 2,26% (kg tinh dầu/kg lá khô) và dùng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để định danh hầu hết các cấu tử dễ bay hơi có trong tinh dầu [14] Tổng cộng có 22 hoạt chất, chiếm 95,27% tổng lượng tinh dầu đã được xác định, Kết quả Bảng 1.1 cho thấy, tinh dầu bao gồm các nhóm thành phần như là oxygenated monoterpenes (91,8%), monoterpene hydrocarbons (0,76%), oxygenated sesquiterpenes (0,29%), sesquiterpene hydrocarbons (1,51%) và các hoạt chất không phải terpenoid khác (0,91%) Trong đó, các hoạt chất chiếm phần lớn bao gồm citronellal (69,77%), citronellol (10,63%), isopulegol (4,66%), PMD (2,76%) và citronellyl acetate (2,16%) Các thành phần còn lại hiện diện với nồng độ rất nhỏ (dưới 2%)

Bảng 1.2 So sánh thành phần tinh dầu từ lá cây Bạch đàn chanh ở các nơi khác nhau

Thành phần (%) Địa điểm India [7] Thailand [15] India [16] Benin [17]

Thành phần hóa học của tinh dầu chiết xuất từ lá cây Bạch đàn chanh ở một số nơi trên thế giới có sự khác biệt giữa các nghiên cứu đã công bố trước đó (Bảng 1.2) Citronellal là thành phần chính có trong tinh dầu với nồng độ có thể lên đến 84% và một lượng citronellol đáng kể (1,9 - 12,6%) Hai nhóm tạp chất khác là citronellyl acetate và isopulegol có nồng độ dao động từ 0,7 - 8,2% Ngoài ra, một nồng độ nhỏ PMD cũng đã được xác định (0,1 - 2,9%)

Hàm lượng citronellal trong tinh dầu Bạch đàn chanh ở Việt Nam cũng có sự khác nhau trong các công bố Nhóm tác giả Trần Minh Hợi ghi nhận nồng độ citronellal có trong tinh dầu là 78,2% [18], đối với nhóm tác giả Hồ Dũng Mạnh thì ghi nhận nồng độ citronellal là 78,6% trong tinh dầu được chưng cất từ cây Bạch đàn chanh ở Long An [19] Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả Trần Thị Như Trang cho thấy trong tinh dầu lá cây Bạch đàn chanh ở Việt Nam có chứa 62% citronellal, với tỷ lệ giữa đồng phân (R)-(+)-citronellal và đồng phân (S)-(-)-citronellal là 56,7/43,3 [20]

Hoạt tính sinh học của tinh dầu phụ thuộc vào thành phần hóa học (có thể thay đổi đáng kể, ngay cả trong cùng một loài) và sự tương tác giữa các thành phần cấu trúc của các thành phần hóa học Nhiều nghiên cứu cho thấy tinh dầu Bạch đàn chanh có các hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa [7], có tác dụng giảm đau và kháng viêm [17, 21, 22], có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn Gram âm và Gram dương như Salmonella typhi, Bacllus subtilis và Pseudomonas aeruginosa [15] Nhờ những hoạt tính sinh học này, tinh dầu Bạch đàn chanh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như điều trị y học, nước hoa và xà phòng [23], có thể chữa lành các bệnh nhiễm trùng bên trong và bên ngoài, chẳng hạn như thông mũi hay hen suyễn [8] Qua một số nghiên cứu cho thấy các thành phần monoterpene, sesquiterpene trong tinh dầu Bạch đàn chanh có tác dụng xua đuổi côn trùng và muỗi Tế bào thần kinh thụ cảm với chất tạo mùi trong râu của muỗi được kích hoạt bởi linalool và 1,8-cineole [24] Citronellal được phát hiện là đã can thiệp vào kênh cation ở các thụ thể khứu giác của

6 ruồi giấm (Drosophila spp.) [25] Các hoạt chất này hầu hết đều dễ độ bay hơi nên chỉ có hiệu quả xua đuổi muỗi trong khoảng thời gian ngắn Ngoài các thành phần này, trong tinh dầu Bạch đàn chanh còn chứa một thành phần khác có hoạt tính cao hơn đã được các nhà nghiên cứu quan tâm chú ý Thành phần đó chính là PMD, là một monoterpene có độ bay hơi thấp hơn các monoterpene dễ bay hơi khác được tìm thấy trong hầu hết các loại tinh dầu [26]

Với sự có mặt của các hoạt chất trên đã làm tăng giá trị của tinh dầu Bạch đàn chanh nói chung cũng như tinh dầu thực vật nói riêng Do vậy, việc phát triển các sản phẩm xua đuổi muỗi và côn trùng dựa trên cơ chế cảm nhận mùi bằng các loại tinh dầu là một hướng đi đầy tiềm năng cần được phát triển

Citronellal (3,7-dimethyl-6-octenal) là một hợp chất monoterpene, chủ yếu được hình thành bởi sự trao đổi chất thứ cấp của thực vật và là một chất lỏng không màu ở điều kiện phòng Citronellal thường được phân lập thành hỗn hợp đồng phân đối quang (R)- (+)- và (S)-(-)-citronellal (Hình 1.4) từ quá trình chưng cất hơi nước hoặc chiết xuất bằng dung môi từ tinh dầu Java citronella, Backhousia citriodora, hoặc Eucalyptus citriodora với nồng độ tương ứng có thể lên tới 45, 80, 85% [27, 28] Ngoài ra, citronellal còn được tìm thấy trong hơn 50 loại tinh dầu thực vật khác Cùng với citral, geranial, linalool, citronellol và citronellal là một trong những terpene quan trọng nhất.và được coi là tác chất xanh có thể thu được từ các nguồn tái tạo sinh học [29, 30] Citronellal cho một mùi sảng khoái gợi nhớ đến bạc hà và chanh tươi [27] Mặc dù ít được sử dụng trong hương thơm, nhưng citronellal được xem là nguồn tổng hợp ra các hoạt chất tạo mùi khác như ionones và methyl ionones với hương thơm của hoa [31] Với sự hiện diện của nhóm chức aldehyde -CHO và nối đôi -C=C-, citronellal có hoạt tính hóa học tương đối cao Hơn nữa, quá trình tổng hợp isopulegol, tinh dầu bạc hà, một số terpenoid và dược phẩm đòi hỏi citronellal như một nguyên liệu ban đầu hoặc một nguồn chiral [28, 31] Citronellal có thể được sử dụng ở một trong các dạng tinh khiết quang học (R hoặc S, (+) hoặc (-)) để điều chế các sản phẩm với tính chọn lọc quang học cao, đồng thời tránh các bước tách và tinh chế đắt tiền [28] Một số đặc tính lý, hóa của citronellal được thể hiện trong Bảng 1.3

Với nồng độ citronellal khá cao, tinh dầu Bạch đàn chanh được xem là nguồn cung cấp dồi dào hợp chất này Nghiên cứu về sự chuyển hóa citronellal là một trong những giải pháp làm phong phú hơn các hướng phát triển thị trường đối với tinh dầu Bạch đàn chanh Sự kết hợp giữa sản xuất, nghiên cứu và kinh doanh sẽ tạo ra thế mạnh cho sự phát triển vững chắc của các sản phẩm chiết xuất và chuyển hóa từ tinh dầu này

Bảng 1.3 Một số đặc tính lý, hóa của citronellal [32]

Nhiệt độ nóng chảy 28,33 °C Áp suất hơi 0,16 hPa (ở 20 °C) Độ tan (trong nước) 38,94 mg/L

1.2 Muỗi và sự ảnh hưởng đến con người

Muỗi là tên gọi chung cho họ côn trùng Culicidae, thuộc bộ Diptera với khoảng trên

3500 loài khác nhau Chúng được tìm thấy gần như trên toàn thế giới trừ châu Nam Cực, đặc biệt phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [33] Muỗi được biết đến nhiều về việc đốt và hút máu con người, tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ các loài muỗi trên Trái Đất thực hiện việc đó Đặc biệt có thể kể đến các chi được xem là vật chủ trung gian truyền bệnh đến con người như Anophele (sốt rét, giun chỉ), Aedes (sốt vàng da, sốt xuất huyết Dengue- SXHD, chikungunya) và Culex (Tây sông Nile, viêm não Nhật Bản, giun chỉ) [34] Để phát triển và hoàn thành vòng đời, muỗi cần môi trường nước đọng Muỗi đã thích nghi trong môi trường sống dưới nước đa dạng, bao gồm cả nước ngọt; đầm lầy nước mặn; nước lợ; hoặc nước tìm thấy trong thùng chứa, lốp xe cũ hoặc hốc cây [33] Vòng đời của muỗi có bốn giai đoạn: Trứng, ấu trùng (còn gọi là lăng quăng), nhộng và trở thành muỗi trưởng thành Đầu tiên, muỗi cái đẻ trứng, lên tới vài trăm quả mỗi lần, trên

8 mặt nước hoặc ở khu vực ngập nước Trứng chưa nở của một số loài có thể chịu được khô hạn hàng tuần đến hàng tháng, vẫn tồn tại cho đến khi có điều kiện thích hợp để nở Trứng của hầu hết các loài muỗi nở thành ấu trùng sau 2 đến 3 ngày và dùng chất hữu cơ trong nước khoảng một tuần cho đến khi ấu trùng muỗi biến thành nhộng Nhộng sống trên mặt nước từ 2 đến 3 ngày trước khi biến thái thành muỗi trưởng thành [33, 34] Đối với muỗi trưởng thành, trong khi muỗi đực chủ yếu ăn mật hoa, thì muỗi cái cần phải hút máu để sản xuất trứng Chúng thường kiếm ăn 3 đến 4 ngày một lần; trong một lần hút máu, muỗi cái thường tiêu thụ lượng máu nhiều hơn trọng lượng của chính nó [35] Một số loài muỗi thích kiếm ăn vào lúc chạng vạng hoặc ban đêm; những loài khác lại cắn chủ yếu vào ban ngày Một số loài muỗi thích hút máu động vật và một số khác lại thích hút máu người Ở một số loài muỗi, việc chuyển đổi vật chủ theo mùa tạo cơ chế truyền bệnh từ động vật sang người [34]

1.2.2 Các yếu tố thu hút muỗi

Các yếu tố liên quan đến việc thu hút muỗi đến với vật chủ rất phức tạp và vẫn chưa được hiểu đầy đủ [36-40] Muỗi sử dụng các kích thích thị giác, nhiệt độ và khứu giác để xác định vị trí vật chủ Trong khi kích thích thị giác quan trọng đối với việc định hướng trong chuyến bay thì kích thích khứu giác trở nên quan trọng hơn khi muỗi đến gần vật chủ [41] Chính vì vậy, tín hiệu khứu giác có lẽ là quan trọng nhất trong việc xác định mục tiêu

Chất xua đuổi muỗi

Hiện tại, các cơ chế thu hút muỗi vẫn chưa được xác định một cách cụ thể và rõ ràng [60] Tuy nhiên một số phương thức xua đuổi hiệu quả đã được đề xuất Trong đó, một phương thức nhận được nhiều sự chú ý là tạo ra hàng rào hơi bảo vệ để che giấu mùi của các chất dẫn dụ (như carbon dioxide và lactic acid được giải phóng trên da) [61, 62]

Từ đó, tín hiệu hấp dẫn bị ức chế và làm cho hệ thống khứu giác của muỗi không hoạt động để ngăn chặn hành vi tìm kiếm vật chủ [63] Để có hiệu quả, chất xua đuổi cần phải thể hiện mức độ bay hơi tối ưu, giúp duy trì nồng độ hơi hiệu quả trên bề mặt da mà không bay hơi quá nhanh làm giảm thời gian tác dụng Nhiều yếu tố đóng vai trò quyết định mức độ hiệu quả của bất kỳ loại thuốc chống côn trùng nào, bao gồm tần suất sử dụng, số lượng và loài sinh vật cố gắng cắn, sức hấp dẫn vốn có của người dùng đối với động vật chân đốt hút máu và mức độ hoạt động tổng thể của vật chủ tiềm năng [64] Sự mài mòn từ quần áo, sự bay hơi và hấp thụ từ bề mặt da, mồ hôi hoặc mưa, nhiệt độ cao hơn hoặc môi trường nhiều gió đều làm giảm hiệu quả xua đuổi [65-67] Ví dụ như mỗi lần tăng nhiệt độ thêm 10°C có thể làm giảm tới 50% thời gian bảo vệ khỏi muỗi đốt [66] Các loại thuốc chống côn trùng hiện có phải được bôi lên tất cả các vùng da hở, vùng da không được bảo vệ cách vùng được bôi vài cm có thể bị muỗi đói tấn công [64, 67]

1.3.1 Chất xua đuổi muỗi tổng hợp

Cho đến nay, đã có rất nhiều chất được chứng minh là có tác dụng xua đuổi muỗi hiệu quả Nhưng hiện tại, chỉ có một vài chất xua đuổi muỗi tổng hợp được Cơ quan Bảo vệ

11 môi trường của Mỹ (EPA) công nhận là có hoạt tính và được phép sử dụng cho người bao gồm DEET, picaridin, 2-undecanone, ethyl butylacetylaminopropionat (IR3535)

N,N-diethyl-meta-toluamide hay N,Ndiethyl-3-ethylbenzamide có tên thường dùng là DEET được các nhà khoa học tại Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ phát hiện và phát triển và được Quân đội Hoa Kỳ cấp bằng sáng chế vào năm 1946 Sau đó nó được công chúng đăng ký sử dụng vào năm 1957 [64, 68] Đây là một chất xua đuổi được sử dụng rộng rãi và đồng thời được xem như tiêu chuẩn vàng để so sánh hoạt tính xua đuổi muỗi với các hoạt chất khác DEET được dùng để xua đuổi các loại côn trùng như là muỗi, ve, bọ chét và các loại ký sinh khác [4], phổ biến với nhiều loại sản phẩm được sử dụng lên da người dưới dạng bào chế, bao gồm bình xịt, gel hay kem dưỡng da Tại Việt Nam, một sản phẩm xua đuổi muỗi phổ biến và được nhiều người biết tới là Soffell cũng sử dụng DEET (13% w/v) làm hoạt chất chính (Hình 1.2) a/ b/

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của DEET (a) và Soffell (b)

Tuy nhiên, gần đây DEET được coi là một yếu tố gây bệnh nhiễm độc thần kinh do sự hấp thụ lớn của hóa chất này qua da khi sử dụng liên tục [69] Đã có rất nhiều nghiên cứu về mối liên hệ giữa việc sử dụng quá mức chất xua đuổi muỗi có chứa hoạt chất DEET với tác dụng phụ lên hệ thần kinh Cuộc khảo sát đối với các nhân viên ở công viên Quốc gia Everglades, Florida cho thấy rằng những người thường xuyên sử dụng sản phẩm này sẽ có tỷ lệ mắc chứng buồn ngủ, mất phương hướng cao hơn, khó tập trung và làm cho da phát ban hơn những người không sử dụng [70] Theo nghiên cứu của Mohamed Abou-Donia, Đại học Duke, việc sử dụng DEET thường xuyên dẫn đến

12 kích ứng mắt và gây nguy cơ co giật, mất ngủ, suy giảm nhận thức, tâm trạng không ổn định, tổn thương tế bào thần kinh [71] Đặc biệt, những hậu quả này dễ xảy ra hơn đối với trẻ em, do có làn da rất nhạy cảm, hệ thần kinh và não bộ đang trong quá trình phát triển nên dễ hấp thu và ảnh hưởng bởi DEET [72, 73]

❖ Picaridin [2-(2-hydroxyethyl)-1-piperidinecarboxylic acid 1-methylpropyl ester]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của picaridin

Picaridin là chất xua đuổi côn trùng được phát triển dựa trên phân tử piperidine - hợp chất được tìm thấy trong cây hồ tiêu và có mặt trên thị trường kể từ năm 2005 (Hình

1.3) [74] Sản phẩm có chứa hoạt chất này rất hiệu quả trong việc xua đuổi lại nhiều loài muỗi, có thể tương đương với DEET và sản phẩm hầu như không có mùi hóa học Picaridin có thể xua đuổi ruồi, bọ chét, muỗi và bọ ve dưới dạng kem dưỡng da, thuốc xịt và khăn lau với nồng độ dao động từ 7 - 20% [75] Một nghiên cứu được thực hiện ở Australia cho thấy các sản phẩm có chứa 19,2% picaridin sẽ cung cấp khả năng bảo vệ tương tự như sản phẩm có chứa 20% DEET khỏi loài muỗi Verrallina lineata sống trong rừng nhiệt đới Ở nồng độ 10%, picaridin có hiệu lực xua đuổi muỗi từ 2 - 5 tiếng, khi tăng lên 20%, hiệu lực tăng lên đáng kể lên 6 - 10 tiếng [76] Khi nghiên cứu về độc tính của picaridin lên hệ thần kinh, các nhà khoa học nhận thấy rằng so với DEET, picaridin ít gây độc hơn, ghi nhận nếu dùng liều lượng quá cao ở động vật thì sẽ gây ra tổn thương cho gan và thận, gây viêm da ở người [77, 78]

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của IR3535

IR3535 (Hình 1.4) là một hoạt chất được dùng để ngăn ngừa muỗi đốt, bọ ve và các loại côn trùng cắn và đốt khác, hiệu quả bảo vệ có thể tương đương với DEET [4, 79] Ở

13 nồng độ 20%, IR3535 cung cấp khả năng bảo vệ hoàn toàn xua đuổi lại muỗi Aedes và

Culex (hiệu lực trong khoảng 7 - 10 tiếng), nhưng đối với loài muỗi Anopheles thì lại cho hiệu quả ít hơn (hiệu lực chỉ còn khoảng 3,8 tiếng), điều này ảnh hưởng đến ứng dụng của sản phẩm trong các khu vực lưu hành dịch bệnh sốt rét [80] Trong các nghiên cứu về độc tính cấp tính, khi so sánh với DEET, IR3535 được phát hiện có mức độ độc tính thấp hơn khi tiếp xúc qua đường miệng, da trong cuộc thử nghiệm ở chuột và ít gây kích ứng hơn cho độc vật có vú [72] IR3535 có thể thấm qua da, hòa tan các đồ đựng Tuy nhiên, hoạt chất này không gây hại cho môi trường nước và không tích lũy trong môi trường [81]

1.3.2 Chất xua đuổi muỗi tự nhiên

Xu hướng tiêu dùng cũng như sự quan tâm của các nhà nghiên cứu ngày càng tập trung vào các sản phẩm từ tự nhiên và chất xua đuổi muỗi cũng không nằm ngoài xu thế đó Hàng nghìn loài thực vật đã được thử nghiệm làm nguồn thuốc chống côn trùng tiềm năng [68, 82, 83] Tuy nhiên, cho đến nay, không có hóa chất có nguồn gốc từ thực vật nào được thử nghiệm chứng minh được tính hiệu quả và thời gian bảo vệ lâu dài khi so sánh với DEET Mặc dù vậy, một số ít hoạt chất cho thấy hoạt động xua đuổi muỗi tương đối hiệu quả Các loại thực vật có tinh dầu đã được báo cáo là có hoạt tính xua đuổi bao gồm sả, tuyết tùng, cỏ roi ngựa, hoa đồng tiền, phong lữ, hoa oải hương, thông, tràm, quế, hương thảo, húng quế, húng tây, tiêu, tỏi và bạc hà [68, 84-86] Không giống như thuốc chống côn trùng tổng hợp, thuốc chống côn trùng có nguồn gốc từ thực vật chủ yếu là các loại tinh dầu và chúng được nghiên cứu tương đối ít Khi được thử nghiệm, hầu hết các loại tinh dầu này đều có xu hướng bảo vệ trong thời gian ngắn, thường dưới 2 giờ

Citronella (Hình 1.5) là thành phần hoạt chất phổ biến nhất được tìm thấy trong thuốc chống côn trùng "tự nhiên" hoặc "thảo dược" được bán trên thị trường Hoa Kỳ Nó được đăng ký với EPA như một loại thuốc chống côn trùng Citronellal có nhiều trong tinh dầu sả và ban đầu được chiết xuất từ cây Cymbopogon nardus [87]

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của (R)-(+)-citronellal (trái), (S)-(-)-citronellal (phải)

Các nghiên cứu cho thấy citronellal có thể là một chất xua đuổi hiệu quả nhưng nó mang lại thời gian bảo vệ hoàn toàn ngắn hơn so với các sản phẩm dựa trên DEET Việc bôi lại thuốc chống côn trùng thường xuyên có thể bù đắp một phần cho điều này Nhà sản xuất Natrapel (Tender Corp., Littleton, New Hampshire) có dữ liệu từ phòng thí nghiệm cho thấy rằng kem dưỡng da 10% của họ làm giảm 84% vết muỗi đốt trong thời gian thử nghiệm 4 phút Ngược lại, DEET 14% giảm khả năng cắn tới 96% trong cùng thời gian thử nghiệm Buzz Away (Quantum, Inc., Eugene, Oregon) với 5% dầu sả mang lại thời gian bảo vệ trung bình là 1,9 giờ chống lại muỗi Aedes aegypti [88] Trong thử nghiệm thực tế, Buzz Away Oil cung cấp khả năng chống thấm trung bình 88% trong thời gian tiếp xúc 2 giờ Nhìn chung, hiệu quả xua đuổi của Buzz Away cao nhất trong vòng 40 phút đầu tiên sau khi sử dụng và giảm dần trong thời gian còn lại của thời gian thử nghiệm [89]

Pyrethrim là một loại thuốc trừ sâu mạnh, tác dụng nhanh, có nguồn gốc từ hoa được nghiền nát và khô của hoa cúc Chrysanthemum cinerariifolium [90] Nó không xua đuổi côn trùng nhưng hoạt động như một loại thuốc trừ sâu tiếp xúc, gây độc cho hệ thần kinh dẫn đến cái chết hoặc khiến côn trùng bị "hạ gục" (ngoài không khí) Hóa chất này có tác dụng chống muỗi, ruồi, ve và bọ chét Permethrin có độc tính thấp ở động vật có vú, được da hấp thụ kém và nhanh chóng bị bất hoạt khi thủy phân este [91]

Tuy nhiên, nhược điểm lớn của permethrin là hoạt chất này nên được bôi trực tiếp lên quần áo hoặc các loại vải khác (chẳng hạn như vách lều hoặc màn chống muỗi), không được bôi lên da [92] Điều này khiến cho permethrin không thể sử dụng dưới dạng sản phẩm chăm sóc cá nhân, mà thay vào đó là dạng xịt trực tiếp lên quần áo Dạng xịt không gây ố màu, gần như không mùi và có khả năng chống phân hủy do nhiệt hoặc ánh nắng mặt trời và duy trì hiệu lực trong ít nhất 2 tuần, thậm chí sau nhiều lần giặt [93] Sự kết

Các nghiên cứu về tổng hợp PMD

Trong tự nhiên, cây Bạch đàn chanh là loại cây có quá trình tự chuyển hóa để hình thành PMD, tuy nhiên vì nhiều yếu tố khách quan, quá trình này xảy ra trong tự nhiên rất chậm với hàm lượng PMD rất thấp (cao nhất chỉ khoảng 4%) [108] Cho nên sự phát triển của PMD trong tự nhiên không thể đáp ứng được nhu cầu của thị trường, việc chiết xuất PMD không có lợi về mặt kinh tế Chính vì vậy, các phương pháp tổng hợp và làm giàu đã được đề xuất thay thế [110]

1.4.1 Cơ chế của quá trình tổng hợp PMD

PMD được tổng hợp từ citronellal theo cơ chế phản ứng Prins trong môi trường nước với xúc tác acid Phản ứng Prins là phản ứng hình thành liên kết cacbon-cacbon bao gồm phản ứng ngưng tụ aldehydes với alkenes được xúc tác bởi acid (Hình 1.9) Kết quả của phản ứng phụ thuộc vào cấu trúc cơ chất và điều kiện phản ứng, thu được nhiều loại sản phẩm như 1,3-diol, 1,3-dioxan hoặc rượu chưa bão hòa [5]

Hình 1.9 Cơ chế phản ứng Prins [112]

Theo các nghiên cứu đã công bố, ngoài sản phẩm chính là PMD và tác chất citronellal dư, phản ứng còn hình thành các sản phẩm phụ là isopulegol và PMD-acetal (Hình 1.10) [111, 112] Trong quá trình tổng hợp, PMD được hình thành theo hai con đường khác nhau (Hình 1.11) Trong đó, một con đường đi từ tác chất citronellal qua sản phẩm trung gian carbocation A và hình thành nên PMD, với cơ chế là phản ứng đóng vòng và hydrate hóa giữa hai nhóm chức -CHO và -C=C- của citronellal Một con đường khác được hình thành từ sản phẩm phụ isopulegol, với cơ chế tương tự một phản ứng hydrate hóa alkene thông thường [111, 112]

Hình 1.10 Các sản phẩm hình thành từ quá trình tổng hợp PMD

Sản phẩm phụ isopulegol được hình thành từ phản ứng dehydro hóa chất trung gian A

22 do liên kết hydro nội phân tử giữa nguyên tử oxy và hydro định hướng, hay từ phản ứng dehydrate hóa nhóm chức hydroxyl bậc ba của PMD với xúc tác acid (Hình 1.11) [111]

Hình 1.11 Cơ chế hình thành PMD và isopulegol từ citronellal [111, 112]

PMD-acetal (para-menthane-3,8-diol citronellal acetal) là sản phẩm phụ thứ hai được hình thành từ quá trình tạo vòng giữa citronellal với chất trung gian A (Hình 1.12), hay từ quá trình tạo vòng giữa PMD với citronellal, được xem là phản ứng cạnh tranh với sự hình thành PMD từ citronellal trong quá trình tổng hợp (Hình 1.13) Măc dù không có hoạt tính xua đuổi muỗi nào của PMD-acetal được ghi nhận trước đó, tuy nhiên một số nghiên cứu đã cho thấy hợp chất này giúp kìm hãm và giải phóng PMD dần theo thời gian, từ đó giúp tăng đáng kể thời gian hiệu lực của các sản phẩm xua đuổi muỗi [109]

Do vậy, mặc dù là sản phẩm phụ nhưng không cần phải phân tách PMD-acetal ra khỏi sản phẩm dầu sau quá trình tổng hợp

Hình 1.12 Cơ chế hình thành PMD-acetal từ chất trung gian A và citronellal [112]

Hình 1.13 Cơ chế hình thành PMD-acetal từ PMD và citronellal [112]

Nhìn chung, cả ba sản phẩm của quá trình tổng hợp đều được hình thành từ chất trung gian A Giai đoạn hình thành A là bước có tốc độ chậm và được xem là bước quyết định tốc độ phản ứng theo nhận định của nhóm tác giả Charles C Price khi nghiên cứu về động học sự đóng vòng của phản ứng Prins trên citral và citronellal [113] Để tăng tốc độ phản ứng, xúc tác acid đã được dùng để hoạt hóa nhóm chức -CHO của citronellal, thúc đẩy quá trình đóng vòng hình thành A Đồng thời phản ứng sẽ được gia nhiệt để tăng tốc độ chung của quá trình chuyển đổi Tuy nhiên, cần phải xem xét rằng PMD và isopulegol có thể chuyển hóa lẫn nhau qua chất trung gian A, PMD-acetal có thể được tạo ra ngay sau khi PMD được hình thành Nếu nồng độ acid lớn hoặc nhiệt độ cao hoặc có cả hai điều này, quá trình dehydrate hóa PMD sẽ dễ xảy ra hơn làm giảm lượng PMD hình thành và tạo ra các sản phẩm phụ isopulegol và PMD-acetal Đồng thời, nếu thời gian phản ứng quá dài, hàm lượng PMD có thể giảm do sự hình thành cạnh tranh của PMD-acetal Vì vậy, để thu được PMD nhiều nhất, nghiên cứu sẽ tiến hành khảo sát và tìm các điều kiện tổng hợp thích hợp nhất

1.4.2 Tổng hợp từ citronellal tinh khiết

Kể từ khi PMD được tìm thấy và đánh giá là có hoạt tính đuổi muỗi tốt, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để tổng hợp ra hoạt chất này bằng nhiều phương pháp khác nhau Trong đó, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy citronellal được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để tổng hợp PMD thông qua cơ chế phản ứng Prins dưới xúc tác acid [5]

Nhóm nghiên cứu Howard E Zimmerman và các cộng sự đã tổng hợp PMD từ citronellal với xúc tác H2SO4 ở nồng độ 5%, ở nhiệt độ phòng, trong vòng 27 giờ Sản phẩm tổng hợp được chiết bằng ether và cho làm khan bằng Na2SO4, sau đó tiến hành chưng cất phân đoạn để thu PMD tinh khiết [6]

Cũng theo phương pháp trên, Bryan David Lett và các cộng sự đã tiến hành tổng hợp ở quy mô lớn với 4 kg (26 mol) citronellal phản ứng với 20 kg dung dịch H2SO4 5% trong ít nhất 5 giờ Hỗn hợp sau phản ứng được chiết bằng toluene, sau đó rửa bằng nước và dung dịch NaHCO3 2% Cuối cùng, tiến hành chưng cất phân đoạn ở áp suất 4 mmHg để thu hồi PMD [103]

Một nghiên cứu khác được thực hiện bởi nhóm tác giả Rainer Schoftner nhằm đánh giá tác động của các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp và các tạp chất liên quan trong quy trình tổng hợp PMD Ở nghiên cứu này đã cho thấy khi tiến hành phản ứng với xúc tác citric acid, ở nhiệt độ 60 °C, lượng nguyên liệu còn dư sau hơn 3 giờ phản ứng, nhưng khi tiến hành ở nhiệt độ 72 °C và 90 °C thì sau hơn 3 giờ phản ứng diễn ra gần như hoàn toàn Lượng PMD thu được nhiều nhất ở 90 °C, tuy nhiên lượng tạp PMD- acetal thu được cũng là nhiều nhất (gần 6%) Các loại xúc tác ascorbic acid, citric acid, tartaric acid giúp tổng hợp ra PMD nhiều hơn và lượng tạp ít hơn so với maleic acid, oxalic acid, adipic acid và salicylic acid Tỉ lệ giữa hai đồng phân cis/trans của PMD cao hơn khi dùng adipic acid và citric acid [114]

Việc sử dụng chất nhũ hóa để hỗ trợ cho phản ứng tổng hợp hai pha PMD đã được nhóm Clark và các cộng sự nghiên cứu thực hiện thí nghiệm trong vòng 4 ngày Với chất nhũ hóa sodium dodecyl sulfate (SDS), nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp PMD bằng cách sử dụng hệ đệm acetat hoặc hệ đệm phosphat hoặc sulfuric acid để chuyển hóa citronellal Sử dụng citronellal hòa tan trong nước với lượng nhỏ, kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ cis tăng khi hệ phản ứng có SDS (từ 66,67% lên 83%) [115]

Năm 2000, nhóm nghiên cứu của Yoshifumi Yuasa đã tổng hợp thành công PMD từ citronellal với hiệu suất trên 90% Nghiên cứu cho thấy ở nồng độ 0,25% H2SO4 trong dung dịch loãng, đạt hiệu suất tổng hợp cao hơn nhiều so với khi thực hiện ở nồng độ 5% trong các nghiên cứu trước đó Quy trình phản ứng được thực hiện với 636 g (16,3 mmol) dung dịch H2SO4 0,25% (theo khối lượng) trong bình cầu đáy tròn có thể tích 3

L, ở nhiệt độ 55 °C và được khuấy đều Thêm từ từ từng giọt 500 g (3,2 mol) (+)-

25 citronellal trong hơn 1 giờ Giữ hỗn hợp phản ứng ổn định ở 55 °C trong 10 giờ Kết quả là độ chuyển hóa citronellal và độ chọn lọc của PMD đạt 99% và 92,3% tương ứng (tỷ lệ ca/cb/ta/tb = 61,2/1,2/35,0/2,6) Dẫn xuất PMD-acetal thu được có nồng độ 2,1% Thêm 8 g (50 mmol) dung dịch NaOH 25% (theo khối lượng) vào hỗn hợp phản ứng, tiếp theo là thêm 1200 mL n-heptane Rửa lớp dung dịch hữu cơ bằng 500 mL nước và thu hồi lại lớp dung dịch hữu cơ này Làm lạnh lớp dung dịch hữu cơ đến -50 °C và khuấy ở nhiệt độ này trong vòng 20 giờ Lọc tinh thể PMD không màu (dùng ly tâm) Đun sôi PMD kết tinh thu được 447 g PMD (hiệu suất đạt 80%) (điểm sôi của hỗn hợp tinh thể khoảng 100 – 130 °C/0,8 Torr) Hỗn hợp sản phẩm được đem đi kết tinh lại ở nhiệt độ 30 °C Kết quả là hỗn hợp đồng phân quang học PMD có độ tinh khiết 99,5% (tỷ lệ ca/cb/ta/tb = 64,7/0,2/34,0/1,1) Ngoài ra, còn có các tạp chất khác bao gồm: 0,1% citronellal, 0,25% neoisopulegol và isopulegol, 0,15% tạp PMD-acetal Khoảng 25 g PMD sẽ được đem đi xử lý bằng sắc ký cột (300 g silica gel, rửa giải bằng dung dịch ethyl acetat/n-hexan với tỷ lệ 1/5) để thu được 5,2 g cis-PMD và 3,5 g trans-PMD [116] Để có thể cải thiện quy trình tổng hợp, Cheng Haiyang và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về xúc tác của phản ứng, hướng tới mục tiêu tổng hợp xanh hơn, điều này đã dẫn đến phương pháp áp dụng CO2 và H2O để làm môi trường xúc tác acid, có lợi để thay thế cho H2SO4 độc hại và không cần phải tốn nhiều công đoạn loại bỏ acid sau khi tổng hợp Hỗn hợp sản phẩm dạng dầu sau phản ứng sẽ được chiết bằng n-hexan và cho làm khan với Na2SO4 khan Sản phẩm sau đó sẽ được đem đi phân tích GC Kết quả là độ chuyển hóa và độ chọn lọc hình thành PMD thấp hơn so với các loại acid khác, đồng thời còn phải điều chỉnh áp suất cao và nhiệt độ cao Ngoài ra, nghiên cứu còn chỉ ra rằng đồng phân S-(-)-citronellal dễ dàng chuyển đổi thành PMD hơn so với hỗn hợp racemic và tác giả cũng nhận định rằng với 1 mmol citronellal thì độ chuyển hóa sẽ được gia tăng đáng kể khi thể tích nước tăng từ 2 lên 15 mL và khi tiếp tục tăng thì độ chuyển hóa tác chất sẽ thay đổi không đáng kể Lượng PMD thu được cao nhất khi lượng nước được thêm vào ở mức 10 mL [117] Ở Việt Nam, nhóm tác giả Nguyễn Thị Kim Thu và Mạc Đình Hùng cũng nghiên cứu về quy trình tổng hợp PMD vào năm 2017 Trong nghiên cứu này, nhóm đã sử dụng xúc tác acid H2SO4 ở nồng độ từ 0,01 - 5% , với nhiệt độ dao động từ 50 – 60 °C (đối với nồng độ acid lớn hơn 2% sẽ được thực hiện ở 50°C với lý giải của nhóm nghiên cứu là

26 để tránh hình thành sản phẩm phụ do sự có mặt của acid đã dẫn đến phản ứng mất nước của PMD để tạo thành isopulegol hay tạo sản phẩm đóng vòng acetal) trong vòng 16 giờ Kết quả cuối cùng thu được sản phẩm PMD với độ chuyển hóa citronellal cao nhất là 91,5% với nồng độ acid sử dụng tối ưu là 0,1% [118]

Ngoài xúc tác là các loại acid thông thường như sulfuric acid, citric acid, …, còn có nhiều xúc tác khác đã được nghiên cứu để đóng vòng citronellal hình thành PMD Pavel Kocˇovsky và các cộng sự đã sử dụng Mo(CO)5(OTf)2 làm chất xúc tác và citronellal làm nguyên liệu để tổng hợp chọn lọc cho ra cis-PMD Sau 24 giờ phản ứng, PMD thu được với hiệu suất là 73%, trong đó, đồng phân cis-PMD chiếm 80% [119] Năm 2020, nhóm nghiên cứu của Irwan Kurnia đã sử dụng chất xúc tác dị thể carbon acid dẫn xuất từ lignin kiềm để đóng vòng (±)-citronellal nhằm tạo ra PMD ở nhiệt độ 50 °C trong 24 giờ Kết quả là độ chuyển hóa tác chất đạt 97%, độ chọn lọc đối với PMD là 89% và hiệu suất tổng hợp đạt 86% [111] Nhìn chung, những phản ứng sử dụng xúc tác dị thể đòi hỏi phải chuẩn bị chất xúc tác ban đầu, nhiều trong số đó là khá đắt tiền, độc hại và khó có thể mở rộng lên quy mô công nghiệp

Mục tiêu nghiên cứu

Khả năng xua đuổi muỗi của PMD và hiệu quả của quá trình tổng hợp PMD từ tinh dầu Bạch đàn chanh đã được chứng minh Tuy nhiên, các báo cáo đã được công bố vẫn còn một vài nhược điểm gây khó khan trong việc nâng cao quy mô tổng hợp từ đó ứng dụng vào thực tiễn Chính vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là tổng hợp PMD từ tinh dầu

Bạch đàn chanh một cách hiệu quả Trong đó, hai nhiệm vụ chính là nâng cao quy mô của quá trình tổng hợp và kiểm tra mức độ an toàn của sản phẩm

Với mục tiên trên, nghiên cứu bao gồm các giai đoạn sau:

• Giai đoạn 1: Tổng hợp PMD từ citronellal tinh khiết và khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ hai pha (pha nước/pha dầu - W/O), nồng độ sulfuric acid, nhiệt độ và thời gian phản ứng đến độ chuyển hóa citronellal và hiệu suất PMD theo phương pháp luân phiên từng biến

• Giai đoạn 2: Tổng hợp PMD từ tinh dầu Bạch đàn chanh ở các điều kiện thích hợp đã xác định từ giai đoạn 1 và so sánh kết quả tổng hợp của hai giai đoạn theo độ chuyển hóa citronellal, hiệu suất PMD và thành phần hóa học

• Giai đoạn 3: Thử nghiệm kích ứng da và độc tính cấp đường uống

• Giai đoạn 4: Thay đổi hệ thống thiết bị nhằm tổng hợp PMD ở năng suất cao hơn

THỰC NGHIỆM

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tổng hợp PMD từ citronellal tinh khiết

Để khảo sát sơ bộ phản ứng, thí nghiệm tổng hợp đầu tiên đã được thực hiện dựa trên các điều kiện tổng hợp của nhóm nghiên cứu Yoshifumi Yuasa [116] Phản ứng được tiến hành với 20 g (0,124 mol) citronellal và 20 g dung dịch sulfuric acid có nồng độ acid 0,25%, ở nhiệt độ 50 °C, duy trì phản ứng trong 6 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm dầu sẽ được xử lý tinh chế và phân tích đánh giá (Mục 2.2.1)

Hợp chất thu được từ quá trình tổng hợp ở dạng dầu sẽ được phân tích sắc ký khí (GC) và nhận dạng cấu trúc bằng phương pháp phân tích phổ khối lượng (MS) Ngoài ra, sản phẩm được phân lập bằng phương pháp kết tinh và kết tinh lại, sau đó phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR) Kết quả phân tích được thể hiện trong các phổ đồ ở phần Phụ lục 27, 28, 29, 31, 32 Kết quả cho thấy, các phổ thu được có dữ liệu tương đồng với các nghiên cứu đã công bố, từ đó khẳng định chất tổng hợp là PMD Sau đây là một số bàn luận về việc nhận dạng cấu trúc

Theo kết quả GC-MS đã xác định có bốn peak tương ứng với các đồng phân của PMD Khối phổ của bốn peak rất giống nhau về các phân mảnh và tỷ lệ các phân mảnh (Phụ lục 31, 32) Kết quả được đề xuất khi so sánh với dữ liệu trong thư viện NIST Ver 2.0a là PMD

Phân tích các phân mảnh (m/z) ghi nhận từ các khối phổ của các đồng phân PMD: 157 [M - Me] + , 154 [M - H2O] + , 139 [M - H2O - Me] + , 121 [M - H2O - H2O - Me] + , 96 [M -

OH - hydroxyisopropyl] + , 81 [M - OH - hydroxyisopropyl - Me] + , 59 [hydroxyisopropyl] + Trong đó, mảnh 81 và 59 chiếm tỉ lệ cao và đặc trưng cho những chất có cấu trúc vòng cyclohexane và nhóm hydroxyisopropyl như PMD Kết quả phân tích này tương đồng với nghiên cứu của nhóm Yoshifumi Yuasa [116], Lubabalo Mafu [122], Stephen Barasa [102] và Yoshinori Asakawa [100] Từ đó, khẳng định hợp chất tổng hợp là PMD theo phương pháp định danh MS

Tinh thể thu được sau khi thực hiện quá trình kết tinh và kết tinh lại được đưa đi phân tích GC nhằm xác định độ tinh kiết Kết quả cho thấy tinh thể có độ tinh khiết là 99,3%, đạt yêu cầu để có thể thực hiện phân tích NMR Ngoài ra, việc chỉ xuất hiện một peak (Hình 3.1) với thời gian lưu là 11,85 phút cho thấy chỉ có đồng phân cis-PMD kết tinh (Mục 3.1.2)

Hình 3 1 Sắc ký đồ phân tích tinh thể PMD thu được sau kết tinh

Hình 3.2 Kí hiệu các carbon của PMD trong biện giải phổ

Nhìn chung, dữ liệu phổ NMR của nghiên cứu này khá tương đồng với dữ liệu phổ của cis-PMD của các nghiên cứu khác (Bảng 3.1) Phổ 1 H-NMR thể hiện đủ 20 proton trong cấu trúc phân tử PMD (Phụ lục 27, 28) Ba proton trong nhóm methyl ở vị trí 1 xuất hiện dưới dạng mũi đôi có độ dịch chuyển là 0,87 ppm và J = 6,4 Hz tương ứng sự ghép spin với proton ở vị trí 2 trong cấu trúc Các proton trong hai nhóm methyl ở vị trí 9 và

10 cho hai độ dịch chuyển khác nhau ở 1,35 ppm và 1,22 ppm và là hai mũi đơn thấy rõ Hai proton trong hai nhóm hydroxyl cho cùng độ chuyển dịch 3,64 ppm và là một mũi đơn thấy rõ Proton liên kết với carbon mang nhóm hydroxyl ở vị trí 4 cho độ dịch chuyển 4,4 ppm sẽ ghép spin với proton ở vị trí 5 và hai proton ở vị trí 3 tạo thành peak có 6 mũi, kiểu ghép dt (Hình 3.3) Tuy nhiên, do sự sát nhau giữa các mũi nên peak tạo thành quan sát được chỉ là một mũi đơn rộng Các vị trí proton khác trong cấu trúc PMD để xác định thì cần phải có thêm phổ hai chiều

Hình 3.3 Trích phổ 1 H-NMR của các proton ở nhóm -OH và carbon vị trí 1, 4, 9, 10

Phổ 13 C-NMR thể hiện đủ 10 carbon trong cấu trúc phân tử PMD (Phụ lục 29) Dựa trên phổ 13 C-NMR dự đoán được các peak đặc trưng 67,9 và 73,2 ppm tương ứng với carbon liên kết trực tiếp hai nhóm hydroxyl ở vị trí 4 và 8, các vị trí carbon khác trong cấu trúc PMD để xác định thì cần phải có thêm phổ hai chiều

Bảng 3.1 Đối chiếu dữ liệu phổ NMR trong nghiên cứu này với các nghiên cứu khác

Ghi chú: phổ đồ chi tiết được trình bày trong Phụ lục 27, 28, 29

3.1.2 Phân tích sắc ký đồ và nhận diện hợp chất

Hình 3.4 Phân tích GC-MS sản phẩm dầu của thí nghiệm tổng hợp đầu tiên

Thông tin GC-MS sản phẩm dầu cho thấy có bốn peak P6, P7, P8, P9 được gợi ý từ thư viện khối phổ NIST là PMD với thời gian lưu lần lượt là 11,84; 12,02; 12,13; 12,31 phút và có tỷ lệ phần trăm diện tích peak giảm dần theo thứ tự: P6 > P8 > P9 > P7 (59,4 > 35,5 > 3,5 > 1,6) (Hình 3.4) Trong nghiên cứu của nhóm Yoshifumi Yuasa có đề cập bộ bốn peak tương ứng với bốn đồng phân PMD khi tổng hợp từ (+)-citronellal Trong đó, hai cấu hình chính là trans-PMD (ta) và cis-PMD (ca), hai cấu hình phụ là trans- PMD (tc) và cis-PMD (cc) với thứ tự các peak từ trái qua phải lần lượt là PMD ca, cc, ta, tc [116] Nhóm nghiên cứu Jeremy Drapeau cũng cho kết quả tương tự khi tác giả tổng hợp PMD từ (+)-citronellal [109] Nghiên cứu này được thực hiện trong điều kiện tương tự trên (±)-citronellal, nên bộ bốn peak P6, P7, P8, P9 có thể lần lượt là các cặp đồng phân đối quang PMD (ca + cb), (cc + cd), (ta + tb) và (tc + td) (Hình 3.5)

(+)-citronellal PMD (ca) PMD (cc) PMD (ta) PMD (tc)

(-)-citronellal PMD (cb) PMD (cd) PMD (tb) PMD (td)

Hình 3.5 Các đồng phân PMD được tổng hợp từ (±)-citronellal

Khả năng hình thành của các của các đồng phân PMD phụ thuộc nhiều vào cấu trúc không gian của chất trung gian A trong quá trình tổng hợp Trong quá trình tổng hợp, A khó có cấu hình cả ba nhóm isopropyl, hydroxyl, methyl nằm trên cùng một hệ mặt phẳng do ảnh hưởng của hiệu ứng không gian (Hình 3.6) Mặt khác, phản ứng tổng hợp PMD hiện diện hai pha khác nhau (pha dầu và pha nước), trong đó quá trình cộng nước vào A để hình thành PMD diễn ra chủ yếu tại bề mặt phân pha Nếu cấu hình của A có nhóm isopropyl mang điện tích dương nằm cùng phía với nhóm phân cực hydroxyl thì sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phân tử nước tiếp cận với hợp chất này để xảy ra phản ứng Ngược lại, nếu cấu hình của A có nhóm isopropyl mang điện tích dương nằm cùng phía với nhóm methyl không phân cực thì sẽ gây cản trở cho quá trình cộng nước hình thành PMD Điều này cũng được xác nhận qua nghiên cứu của nhóm tác giả Clark khi tác giả sử dụng thêm chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl sulfate để giúp giữ phần thân ưa dầu bên trong và phần thân ưa nước hướng ra pha nước, tỷ lệ đồng phân cis-PMD tăng lên rất nhiều [115]

Hình 3.6 Cơ chế hình thành PMD và isopulegol từ citronellal (trên) và các nhóm chức của chất trung gian A (dưới) [111, 112]

Từ những phân tích trên, nhận thấy sản phẩm trung gian của hai cặp đồng phân cis-PMD (ca + cb) và trans-PMD (ta + tb) có khả năng tiếp xúc với phân tử nước nhiều hơn so với hai cặp đồng phân cis/trans-PMD còn lại do trong cấu trúc có nhóm isopropyl nằm khác phía với nhóm methyl Vì vậy hai cặp đồng phân này sẽ là hai dạng sản phẩm PMD chính Trong đó, dạng đồng phân cis-PMD (ca + cb) sẽ có hàm lượng cao nhất do cấu hình của sản phẩm trung gian của cặp đồng phân này có các nhóm isopropyl và hydroxyl nằm cùng phía với nhau và khác phía với nhóm methyl nên khả năng phản ứng với nước để hình thành PMD là lớn nhất Và dạng đồng phân cis-PMD (cc + cd) sẽ có hàm lượng thấp nhất trong các đồng phân do cấu hình của sản phẩm trung gian của cặp đồng phân này rất kém bền khi cả ba nhóm thế đều nằm cùng phía với nhau Vì vậy, hàm lượng của các cặp đồng phân PMD sẽ theo thứ tự giảm dần như sau: (ca + cb) > (ta + tb) >

(tc + td) > (cc + cd) Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả tỷ lệ phần trăm các đồng phân PMD trên sắc ký đồ như đã nhận định ban đầu (P6 > P8 > P9 > P7) Nghiên cứu của nhóm Yoshifumi Yuasa cũng cho tỷ lệ các đồng phân PMD như đã đề cập [116]

Về citronellal và isopulegol, thư viện NIST đã nhận diện và đề xuất các peak P3 và P5 có thời gian lưu 9,10; 9,28 phút là các đồng phân isopulegol và nằm gần với peak P4 có thời gian lưu 9,14 phút được đề xuất là citronellal Cũng theo nghiên cứu của nhóm tác giả Yoshifumi Yuasa [116], hai đồng phân isopulegol là (+)-neoisopulegol và (+)- isopulegol được tổng hợp từ (+)-citronellal, nghiên cứu này được thực hiện trong điều kiện tương tự trên (±)-citronellal, bộ hai peak hiện diện có thể là hỗn hợp các đồng phân (±)-neoisopulegol và (±)-isopulegol theo thứ tự lần lượt là P3 và P5 (Hình 3.7)

Hình 3.7 Các đồng phân isopulegol tổng hợp từ (±)-citronellal

Về PMD-acetal, không thấy đề xuất chất này trên kết quả dò tìm khối phổ Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Yoshifumi Yuasa đã chỉ ra các đồng phân PMD-acetal được tổng hợp từ (+)-citronellal bằng cách phân lập và xác định cấu trúc, tác giả nhận định PMD- acetal hiện diện trên sắc ký đồ với hai đồng phân PMD-acetal (1) và (3) (Hình 3.8), trong đó đồng phân (3) có thời gian lưu nhỏ hơn đồng phân (1) [116] Kết quả tương tự cũng được tìm thấy trong nghiên cứu của nhóm Jeremy Drapeau [109] Trong nghiên cứu này sử dụng nguyên liệu (±)-citronellal, các peak P10 và P11 có thời gian lưu 18,84 phút và 19,35 phút đều cho các khối phổ phù hợp với cấu trúc PMD-acetal (Phụ lục 30), từ đó suy ra hai peak này lần lượt là hỗn hợp PMD-acetal (1 + 2) và (3 + 4)

Hình 3.8 Các đồng phân PMD-acetal tổng hợp từ (±)-citronellal

Ngoài các peak hợp chất chính và tác chất đã xác định, trong phổ đồ còn hiện diện hai peak khác là P1 và P2 với thời gian lưu 3,30 và 4,12 phút Trong đó, P1 được xác định là DMF, là chất nội chuẩn được đưa vào mẫu đo để phục vụ cho việc phân tích định lượng nồng độ hợp chất, còn peak P2 không thấy được đề xuất cụ thể hợp chất gì trên kết quả dò tìm khối khổ thư viện NIST và trong các nghiên cứu khác cũng không được đề cập, có thể xem đây là peak tạp trong quá trình phân tích

3.1.3 Kết quả khảo sát phản ứng tổng hợp PMD

Tổng hợp PMD từ tinh dầu Bạch đàn chanh

3.2.1 Phân tích thành phần tinh dầu Để đánh giá hiệu quả của quy trình tổng hợp, phân tích các thành phần hóa học và hàm lượng của chúng có trong tinh dầu nguyên liệu là một yêu cầu cần thiết Theo kết quả phân tích GC-MS (Bảng 3.2), tổng cộng có 18 hợp chất đã được phát hiện trong tinh

56 dầu, với hầu hết các thành phần chính được trình bày trong phạm vi tiêu chuẩn ISO (ISO 3044:2020 [124]) Trong các thành phần này, citronellal (63,1%) và citronellol (11%) chiếm tỷ lệ cao nhất, theo sau là 𝛽-caryophyllene (3,96%), isopulegol và các đồng phân (2,91%), 1,8-cineole (2,63%) và một số thành phần khác

Bảng 3.2 Thành phần hóa học của tinh dầu Bạch đàn chanh thô

Phụ lục 22; a Thời gian lưu (phút); b % Diện tích peak;

Hàm lượng citronellal trong tinh dầu Bạch đàn chanh sử dụng ở nghiên cứu này có sự khác biệt so với các nghiên cứu khác Cụ thể, hàm lượng citronellal trong nghiên cứu này thấp hơn so với kết quả được báo cáo ở Việt Nam của nhóm tác giả Trần Minh Hợi (78,2%) [18], nhóm tác giả Hồ Dũng Mạnh (78,6%) [19], cao hơn so với kết quả được báo cáo của nhóm tác giả Trần Thị Như Trang (62%) [20] Đồng thời hàm lượng citronellal trong nghiên cứu này còn thấp hơn hàm lượng citronellal (74%) trong tinh

57 dầu Bạch đàn chanh dùng để tổng hợp PMD trong nghiên cứu của nhóm Jeremy Drapeur [109] Sự khác biệt này có thể là do giống cây Bạch đàn, điều kiện trồng trọt, thời điểm thu hoạch và phương pháp chiết xuất khác nhau ở mỗi nghiên cứu gây ra

Có thể thấy, PMD hiện diện trong tinh dầu với hàm lượng rất thấp (0,33%), vì vậy việc chiết xuất không có lợi về mặt kinh tế Với hàm lượng citronellal trên 60%, tinh dầu Bạch đàn chanh là nguồn nguyên liệu thích hợp để tổng hợp PMD

Các thí nghiệm tổng hợp PMD từ tinh dầu Bạch đàn chanh được thực hiện ở các điều kiện thích hợp đã xác định từ kết quả tổng hợp tốt nhất trên nguyên liệu citronellal tinh khiết (Mục 3.1.3) Phản ứng được thực hiện với 20 g tinh dầu Bạch đàn chanh và 40 g dung dịch sulfuric acid có nồng độ 0,75%, nhiệt độ 60 o C, trong vòng 6 giờ Thí nghiệm được thực hiện ba lần, lấy kết quả trung bình

Bảng 3.3 So sánh kết quả tổng hợp PMD từ citronellal và từ tinh dầu Bạch đàn chanh ở cùng điều kiện

Yếu tố Tổng hợp từ citronellal Tổng hợp từ tinh dầu Độ chuyển hóa (%) 98,5 98,1

Kết quả thu được cho thấy, hiệu quả của quy trình tổng hợp PMD đã giảm đi đáng kể khi chuyển sang sử dụng nguyên liệu tinh dầu Bạch đàn chanh So với kết quả tổng hợp từ nguyên liệu citronellal, mặc dù độ chuyển hóa là gần như không thay đổi (98,1% so với 98,5%) nhưng hiệu suất lại giảm đi rõ rệt (84,8% so với 95,6%) (Bảng 3.3) Điều này được lý giải là do trong tinh dầu Bạch đàn chanh không chỉ có citronellal mà còn có nhiều thành phần không phân cực khác không tham phản ứng như Limonene, 𝛼-Pinene, 3-Carene (Bảng 3.2) Các thành phần này làm giảm độ phân cực khiến cho sự phân chia pha diễn ra mạnh hơn làm giảm bề mặt tiếp xúc giữa hai pha Đồng thời, hàm lượng citronellal có trong tinh dầu thấp hơn đáng kể so với nguyên liệu citronellal tinh khiết dẫn đến việc giảm sự chênh lệch độ phân cực nhờ vào sự hình thành PMD cũng giảm đi đáng kể Và theo như cơ chế đã bàn luận ở Mục 1.4.1, trong quá trình tổng hợp PMD có sự hình thành cạnh tranh sản phẩm phụ PMD-acetal, với PMD được hình thành từ quá trình cộng nước diễn ra chủ yếu tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha, còn PMD-acetal

58 được hình thành chủ yếu trong pha dầu Do vậy, khi diện tích bề mặt tiếp xúc giữa hai pha bị giảm đã khiến cho tốc độ hình thành PMD bị giảm theo, dẫn đến PMD-acetal được hình thành nhiều hơn làm hiệu suất giảm Qua kết quả phân tích về thành phần hóa học của sản phẩm đã minh chứng cho điều này (Bảng 3.4) Với nguồn nguyên liệu tinh dầu Bạch đàn chanh, sản phẩm thu được có tỷ lệ thành phần PMD so với PMD-acetal là 53,08/16,71 (3,18) nhỏ hơn so với sản phẩm tổng hợp từ citronellal có tỷ lệ này là 71,33/18,86 (3,78)

Kết quả phân tích về thành phần hóa học của tinh dầu Bạch đàn chanh trước và sau tổng hợp (Bảng 3.4) cho thấy, phản ứng không sinh ra chất mới khác nào ngoài PMD-acetal Citronellal, PMD, PMD-acetal là những thành phần có sự thay đổi hàm lượng rõ rệt sau tổng hợp Đối với sản phẩm phụ isopulegol, hàm lượng của hợp chất này thay đổi không đáng kể (từ 2,91 lên 6,2%) do phản ứng được thực hiện ở nồng độ acid loãng (0,75%) nên đã hạn chế quá trình tách nước của PMD để hình thành isopulegol như đã đề cập ở

Mục 1.4.1 Đối với các thành phần còn lại hầu như không thay đổi

Về hàm lượng PMD trong tinh dầu sau phản ứng (citriodiol), kết quả của nghiên cứu này (53%) thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Drapeau Jeremy hay với tinh dầu citriodiol đã được đăng ký tại Cơ quan Bảo vệ môi trường của Mỹ (EPA) có nồng độ PMD là 64 - 65% [105, 109] Tuy nhiên, khi so sánh về hiệu quả của quy trình tổng hợp, trong nghiên cứu này có độ chuyển hóa citronellal 98,1% và hiệu suất PMD 84,8% tương ứng với độ chọn lọc PMD 86,4% lớn hơn so với kết quả độ chọn lọc PMD của nhóm tác giả Jeremy Drapeau là 79,6% [109] Do đó, quy trình tổng hợp của nghiên cứu này có thể được xem là hiệu quả hơn Lý giải cho việc hàm lượng PMD trong nghiên cứu này thấp hơn là do nguồn nguyên liệu tinh dầu Bạch đàn chanh sử dụng có hàm lượng citronellal thấp hơn (63,1%) so với nghiên cứu của nhóm tác giả Jeremy Drapeau là 74% Vậy nếu thay đổi nguồn tinh dầu ban đầu có nồng độ citronellal cao hơn, kết quả thu được sẽ khả quan hơn rất nhiều

Bảng 3 4 So sánh thành phần hóa học của tinh dầu thô với các sản phẩm tổng hợp

STT Cấu tử Tinh dầu thô

Phụ lục 21, 22, 24; d Sản phẩm tổng hợp từ tinh dầu thô; e Sản phẩm tổng hợp từ citronellal

3.3 Thử nghiệm kích ứng da

Dầu PMD hay còn gọi là dầu citriodiol thường được sử dụng làm hoạt chất chính cho các sản phẩm xua đuổi muỗi ở dạng bôi hoặc xịt trực tiếp lên da Do đó, việc đánh giá khả năng gây kích ứng da của các mẫu dầu PMD là hết sức cần thiết a) b)

Hình 3.16 Da thỏ sau khi tiếp xúc với NaCl (a), và choloroform (b)

Mẫu da đặt NaCl 0,9% không có biểu hiện bất thường, không có dấu hiệu ban đỏ hay phù nề trong suốt thời gian thử nghiệm Do đó mẫu NaCl được sử dụng làm chứng âm cho thí nghiệm Ngược lại ở vùng da đặt chloroform, thời điểm 1 giờ khi làm sạch da,

60 kết quả cho thấy hiện tượng da bị phù nề ở mức độ từ 1 đến 3 đồng thời bị đỏ tẩy (mức độ 1 đến 2 theo Bảng 2.3) Sau 24 giờ, các hiện tượng này giảm dần đến 48 giờ Sau 72 giờ, da có dấu hiệu bong tróc (Hình 3.16) Do vậy nên mẫu chloroform được sử dụng làm chứng dương cho thí nghiệm

Hình 3.17 Da thỏ sau khi tiếp xúc với mẫu dầu PMD 50%

Hình 3.17 đã cho thấy, thời điểm 1 giờ sau khi làm sạch da, vùng đặt mẫu dầu PMD

50% có một vài điểm ban đỏ Sau đó, tại thời điểm 24 và 48 giờ, da không còn hiện tượng ban đỏ, có màu sắc trở lại bình thường như ban đầu Sau 72 giờ, da có dấu hiệu bong tróc nhẹ Tuy nhiên sự tạo vảy và ban đỏ đó chỉ xảy trên 1 trong số 3 con thỏ làm thí nghiệm Đồng thời các hiện tượng như phù nề hay nổi mẩn đều không xuất hiện Có thể kết luận mẫu dầu PMD 50% gây kích ứng không đáng kể (Bảng 2.4)

Hình 3.18 Da thỏ sau khi tiếp xúc với mẫu dầu PMD 100%

Hình 3.18 đã cho thấy, ở vùng đặt mẫu dầu PMD 100%, thời điểm 1 giờ, 24 và 48 giờ sau khi làm sạch da, da không hề có bất cứ dấu hiệu bất thường Sau 72 giờ, da có dấu hiệu bong tróc nhẹ Kết quả dựa theo đánh giá ở Bảng 2.4 đã cho thấy PMD tổng hợp từ tinh dầu Bạch đàn chanh (dầu citriodiol) không gây kích ứng lên da Từ kết quả này tương tự với kết quả của mẫu dầu PMD 50%, vì vậy có thể luận dầu citriodiol không gây kích ứng và an toàn để sử dụng trên da Tuy nhiên, vì đây là sản phẩm sử dụng trực tiếp lên da nên có thể đi vào đường tiêu hóa thông qua tiếp xúc trực tiếp ở miệng hoặc thông qua việc bốc đồ ăn thức uống, đặc biệt là với trẻ nhỏ Do đó, việc kiểm tra độc tính cấp đường uống là hết sức cần thiết

3.4 Thử nghiệm độc tính cấp đường uống

Thử nghiệm độc tính cấp đường uống

3.4 Thử nghiệm độc tính cấp đường uống

Dầu citriodiol được sử dụng làm hoạt chất chính cho các sản phẩm bôi hoặc xịt trực tiếp lên da nên nguy cơ và hàm lượng nhiễm độc qua đường uống là khá thấp Đồng thời, các chế phẩm xua đuổi muỗi thường có hàm lượng PMD từ 5-20% Chính vì vậy nghiên cứu này chọn sử dụng mẫu dầu citriodiol 10% để thử nghiệm độc tính nhằm xác định độ an toàn của sản phẩm

Giai đoạn sơ khởi được thực hiện nhằm xác định sơ bộ mức độ độc tính cấp của mẫu dầu citriodiol đồng thời là cơ sở cho các thí nghiệm xác định LD50 Mỗi thí nghiệm trong giai đoạn sơ khởi được thực hiện trên 4 con chuột (2 chuột đực và 2 chuột cái) với liều bắt đầu từ 50 mL/kg sau đó giảm dần Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả các thí nghiệm của giai đoạn sơ khởi

Số chuột đực tử vong trong vòng 72 giờ (con)

Số chuột cái tử vong trong vòng 72 giờ (con)

Phân suất tử vong trên giới đực (%) 100 100 50 50 0 0

Phân suất tử vong trên giới cái (%) 100 100 100 50 0 0 Ở hai liều đầu tiên (50 và 25,6 mL/kg), tất cả chuột thử nghiệm đều có các dấu hiệu bất thường như co giật, thở mạnh, di chuyển chậm và lắc lư mạnh sau đó trở nên bất động và tử vong Thời gian tử vong đều không quá 2 giờ sau khi chuột được cho uống mẫu với phân suất tử vong là 100%

Khi liều lượng mẫu được hạ xuống mức 20,48 mL/kg, đối với chuột đực, 50% chuột có các dấu hiệu bất thường như di chuyển rất chậm, lắc lư toàn bộ cơ thể, đặc biệt là phần đầu, có hiện tượng cứng chi sau 1 phút uống mẫu, nằm im, thở mạnh sau 6 phút uống

62 mẫu, di chuyển nhẹ lại sau 4 giờ 11 phút uống mẫu và chuột ăn uống lại bình thường sau 4 giờ 30 phút Chuột này vẫn sống và ăn uống, sinh hoạt bình thường trong 7 ngày theo dõi 50% chuột có các dấu hiệu bất thường như di chuyển nhẹ, lắc lư toàn bộ cơ thể, đặc biệt là phần đầu sau 1 phút uống mẫu, nằm im sau 4 phút uống mẫu, nằm im, thở mạnh sau 13 phút uống mẫu và tử vong sau 4,5 giờ uống mẫu Đối với chuột cái, chuột có các dấu hiệu bất thường như cứng 2 chi sau sau 5 phút uống mẫu, co giật nhẹ, không di chuyển được sau 6 phút uống mẫu, thở mạnh, nằm im, co giật từng cơn sau 11 phút và tất cả chuột đều tử vong sau 1 giờ 20 phút uống mẫu

Phân suất tử vong của chuột giảm về 0% ở mẫu 13,11 và 10,49 mL/kg Tuy nhiên, sau khi được uống mẫu, chuột vẫn có các dấu hiệu bất thường như di chuyển rất chậm đồng thời lắc lư toàn bộ cơ thể, sau đó trở nên bất động và thở mạnh Chuột bắt đầu di chuyển trở lại và ăn uống bình thường vời thời gian hồi phục giảm dần từ 2 giờ 40 phút xuống còn 45 phút lần lượt ở mẫu 13,11 và 10,49 mL/kg Những con chuột còn sống vẫn tiếp tục không có bất kì dấu hiệu bất thường nào trong ăn uống và sinh hoạt trong 7 ngày theo dõi Kết quả giai đoạn sơ khởi cho thấy mẫu dầu PMD có độc tính cấp đường uống tương đối cao và cần được thực hiện thêm các thí nghiệm để xác định thông số LD50,

Từ các kết quả khảo sát ở giai đoạn sơ khởi, tiến hành thực hiện giai đoạn xác định để ước tính liều LD50 Thí nghiệm được thử nghiệm với 4 liều khác nhau, trong đó liều 16,38 mL/kg được thực hiện với số chuột gấp đôi Chi tiết thông số và kết quả được trình bày ở Bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả các thí nghiệm của giai đoạn xác định

Số chuột thử nghiệm (con)

Số chuột tử vong (con)

Từ kết quả ở Bảng 3.6, qua quá trình tính toán, mẫu dầu PMD 10% có độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng ở cả 2 phái, với liều LD50, LD0 và LD100 lần lượt là 17,36 mL/kg, 13,11 mL/kg và 25,6 mL/kg Mẫu dầu Citrodiol với kết quả LD50,36

63 mL/kg ≈ 16 492 mg/kg được xem là vô hại đối với con người dựa theo thang đo của Hodge and Sterner (LD50 > 15 000 mg/kg) [125] Do đó, dầu Citrodiol hoàn toàn có thể được sử dụng làm hoạt chất cho các sản phẩm xua đuổi muỗi một cách an toàn.

Nâng cao quy mô phản ứng tổng hợp PMD từ tinh dầu

Để làm cơ sở cho quá trình sản xuất ở quy mô pilot, nghiên cứu tiến hành thử nghiệm nâng câp quy mô tổng hợp PMD từ 20 g lên 200 g tinh dầu Bạch đàn chanh ở các điều kiện thích hợp đã xác định (Mục 3.2.3) Các thiết bị sử dụng được lắp đặt phù hợp với quy mô lớn hơn (Hình 2.5), các thông số lượng hóa chất sử dụng, thời gian thêm các chất tham gia phản ứng được cân nhắc cho phù hợp để tạo thành các thao tác chuẩn

Bảng 3.7 So sánh kết quả tổng hợp PMD từ 20 g và từ 200 g tinh dầu

Yếu tố Tổng hợp từ 20 g tinh dầu Tổng hợp từ 200 g tinh dầu Độ chuyển hóa (%) 98,1 99,3

Bảng 3.8 So sánh thành phần hóa học của tinh dầu tinh chế ở hai quy mô tổng hợp

STT Cấu tử Từ 20 g ( b %) Quy mô 200 g ( b %)

Phụ lục 24, 26; a Thời gian lưu (phút); b % Diện tích peak

Kết quả phân tích cho thấy, cả độ chuyển hóa và hiệu suất thu được khi tổng hợp PMD từ 200 g tinh dầu đều được cải thiện đáng kể so với kết quả tổng hợp từ 20 g tinh dầu Độ chuyển hóa tăng lên 99,3% và hiệu suất tăng lên 91,5% (Bảng 3.7) Điều này được giải thích là do phản ứng tổng hợp PMD từ 200 g tinh dầu được diễn ra trên hệ thiết bị phản ứng có cánh khuấy (được trình bày ở Mục 2.3.2) Hệ thiết bị này có sự khuấy trộn tốt hơn hơn so với hệ phản ứng khuấy từ sử dụng ban đầu Điều này đã góp phần làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa hai pha dẫn đến tăng hiệu quả tổng hợp Ngoài ra, khi chuyển sang sử dụng hệ thiết bị này, quá trình truyền nhiệt được ổn định hơn do phản ứng được gia nhiệt bởi dòng nước nóng đi trong lớp vỏ áo thiết bị được cung cấp bởi bể điều nhiệt đã tạo sự truyền nhiệt ổn định hơn so với phản ứng được gia nhiệt bởi bể nước giữ nhiệt thông thường Điều này được thể hiện khi các thí nghiệm tổng hợp cho hiệu suất và độ chuyển hoá ổn định (sai số nhỏ hơn 1%, Phụ lục 3) Đồng thời, sự truyền nhiệt ổn định này đã góp phần hạn chế được sự hình thành các sản phẩm phụ Điều này được minh chứng qua kết quả phân tích về thành phần hóa học của sản phẩm được mô tả trong Bảng 3.8 So với kết quả tổng hợp từ 20 g, hàm lượng PMD-acetal trong sản phẩm tổng hợp từ 200 g thấp hơn đáng kể, 16,71% so với 10,2% Sản phẩm phụ còn lại là isopulegon hầu như không thay đổi Các kết quả trên đã cho thấy việc tăng năng suất của phản ứng từ 20 lên 200 g không những không ảnh hưởng đến phản ứng mà còn làm tăng đáng kể hiệu quả tổng hợp PMD Điều này cũng cho thấy tiềm năng trong việc tiếp tục nghiên cứu để đưa quy trình tổng hợp PMD lên quy mô pilot và hơn nữa là quy mô công nghiệp