Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết cây bạch cổ Đinh (polycarpaea corymbosa (l ) lam)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CÂY BẠCH CỔ ĐINH POLYCARPAEA CORYMBOSA L.. ĐẠI HỌC ĐÀ NẴN

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CAO CHIẾT

CÂY BẠCH CỔ ĐINH (POLYCARPAEA CORYMBOSA (L.) LAM)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Vân Anh Lớp : 20 CNSH

Giáo viên hướng dẫn: TS Bùi Thị Thơ

Đà Nẵng – Năm 2024

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CAO CHIẾT

CÂY BẠCH CỔ ĐINH (POLYCARPAEA CORYMBOSA (L.) LAM)

NGUYỄN THỊ VÂN ANH

Đà Nẵng – Năm 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng khóa luận với đề tài “Khảo sát hoạt tính sinh học của cao

chiết cây Bạch Cổ Đinh Polycarpaea Corymbosa (L) Lam” là à công trình nghiên cứu

của chính tôi Đề tài này được thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của Tiến sĩ Bùi Thị Thơ tại phòng thí nghiệm Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học

Đà Nẵng

Tôi cam đoan rằng tất cả các kết quả nghiên cứu và nhận định trong khóa luận này

là hoàn toàn mới và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đó Bất kỳ sự trùng lặp với công trình của người khác là hoàn toàn tình cờ và không có ý đồ gian lận hay sao chép

Tôi chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung được trình bày trong khóa luận và sẵn sàng chịu trách nhiệm pháp lý và hậu quả của mọi vi phạm đạo đức nghiên cứu nếu có

Đà Nẵng, ngày 19 tháng 04 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thị Vân Anh

LỜI CẢM ƠN

Ðể có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy TS Bùi Thị Thơ giảng viên khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã hướng dẫn, trực tiếp truyền đạt kinh nghiệm quý báu và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Thứ hai, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Và lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người

đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về Polycarpaea Corymbosa (L) Lam 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

1.1.2 Vị trí phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái 3

1.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn 4

1.2.1 Escherichia coli 4

1.2.2 Staphylococcus aureus 5

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 10

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 10

2.2 Nội dung nghiên cứu 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Phương pháp chiết cao 10

2.3.2 Phương pháp xác định một số hợp chất từ cao chiết………10

2.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nước cây Bạch cổ đinh 11

2.3.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 12

2.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng tế bào ung thư (NTERA2) 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 Xác định thành phần hóa học của cao chiết cây Bạch cổ đinh 15

3.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nước cây Bạch cổ đinh 16

3.2.1 Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS+ 16

3.2.2 Phương pháp bắt gốc tự do DPPH 17

3.2.3 Phương pháp khảo sát năng lực khử Fe 18

3.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Bạch cổ đinh 20

3.3.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Bạch cổ đinh bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 20

3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 25

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng tế bào ung thư (NTERA 2) 27

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

1 KẾT LUẬN 32

2 KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các hoạt chất được xác định trong cao chiết lá cây Bach cổ đinh bởi GC-MS

16

Bảng 3.2 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS+ 17

Bảng 3.3 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH 18

Bảng 3.4 Năng lực khử Fe 19

Bảng 3.5 Khả năng kháng Moraxella catarrhalis của cao chiết Bạch cổ đinh 20

Bảng 3.6 Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của cao chiết Bạch cổ đinh 21

Bảng 3.7 Khả năng kháng Escherichia coli của cao chiết Bạch cổ đinh 22

Bảng 3.8 Khả năng kháng Staphylococus aureu của cao chiết Bạch cổ đinh 23

Bảng 3.9 Khả năng kháng Escherichia fergusonii của cao chiết Bạch cổ đinh 24

Bảng 3.10 27

Bảng 3.11 Khả năng gây độc tế bào của mẫu nghiên cứu 27

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Polycarpaea corymbosa (L.) Lam được quan sát tại Ấn Độ 4

Nguồn ảnh: India Biodiversity Portal (https://indiabiodiversity.org/) 4

Hình 1.2 Escherichia coli 5

Hình 1.3 Staphylococcus aureus 6

Hình 1.4 Escherichia ferusonii (E.ferusonii) 7

Hình 1.5 Aeromonas Hydrophila (A Hydrophila) 8

Hình 1.6 Moraxella catarrhalis (M cartarrhalis) 9

Hình 3.1 Kết quả GC-MS của cao chiết nước cây Bạch cổ đinh 15

Hình 3.2 Tác động của cao chiết Bạch cổ đinh lên Moraxella Catarrhalis ở các nồng độ khác nhau 20

Hình 3 3 Tác động của cao chiết Bạch cổ đinh lên Aeromonas hydrophila ở các nồng độ khác nhau 21

Hình 3.4 Tác động của cao chiết Bạch cổ đinh lên Escherichia coli ở các nồng độ khác nhau 22

Hình 3 5 Tác động của cao chiết Bạch cổ đinh lên Staphylococus aureu ở các nồng độ khác nhau 23

Hình 3.6 Tác động của cao chiết Bạch cổ đinh lên Escherichia fergusonii ở các nồng độ khác nhau 24

Hình 3.7 Giá trị MIC của cao chiết Bạch cổ đinh trên 5 chủng vi sinh vật kiểm định 26

Hình 3.8 Cao chiết Bạch cổ đinh gây ức chế tăng sinh trên 4 dòng tế bào ung thư HT29, MCF7, HepG2 và A549 31

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hầu hết các loài thực vật dược liệu có sẵn trên thế giới đều có tiềm năng lớn để khám phá cũng như nghiên cứu và sản xuất các loại thuốc mới có lợi cho con người [1] Điều này được thể hiện rõ qua sự phổ biến và sự đa dạng của các loại thảo dược và dược liệu trong nền văn hóa dân gian, cũng như trong các hệ thống y học truyền thống của nhiều quốc gia trên thế giới Tuy nhiên, không phải tất cả các loài thực vật dược liệu này đều được nghiên cứu đầy đủ về giá trị dược liệu của nó Đa số các loài trong số chúng vẫn đang được sử dụng theo tri thức bản địa và khai thác chủ yếu từ tự nhiên Điều này dẫn đến việc vẫn chưa khai thác được hiệu quả và giá trị thực sự của chúng

Trong hệ thống các loài thực vật dược liệu, Polycarpaea corymbosa (L.) Lam là

loài phân bố rộng rãi tại các vùng nhiệt đới trên cả Đông bán cầu và Tây bán cầu, sự phổ biến của loài này là rất đa dạng, chúng thường được tìm thấy ở hầu hết các khu vực từ các cánh đồng mở, những vùng đất hoang vu cho đến những khu rừng dày đặc [2] Chính

nhờ sự đa dạng về sự phân bố cũng như khả năng thích nghi, Polycarpaea corymbosa

(L.) Lam từ lâu đã được sử dụng như là một phương pháp trong y học cổ truyền với nhiều khả năng chữa trị khác nhau bao gồm điều trị sỏi tiết niệu, làm thuốc đắp trị mụn nhọt và sưng viêm [3] Thêm vào đó, ngoài việc dùng lá để chữa bệnh vàng da, ứng dụng loài này cũng được áp dụng trong các phương pháp điều trị cho việc giảm viêm dạ dày và kiểm soát triệu chứng nôn mửa, thông qua việc kết hợp nước sắc từ cây với mật ong

Qua việc ghi nhận những ứng dụng của Polycarpaea Corymbosa (L) Lam trên thế

giới, có thể nói đây là một loài dược liệu được đánh giá cao trong y học cổ truyền và y

học dân gian với nhiều mục đích điều trị Tại Việt Nam, Polycarpaea corymbosa (L.)

Lam thường xuất hiện tại các nhà thuốc đông y với tên gọi “Bạch cổ đinh” và thường được sắc uống để chữa cảm sốt, đổ mồ hôi trộm, các triệu chứng ngoài da khác

Tuy nhiên, tại Việt Nam nói riêng và quốc tế nói chung, vẫn chưa có nhiều công

bố chính thức về những ứng dụng của Polycarpaea Corymbosa (L) Lam Việc thiếu đi

nghiên cứu khoa học cụ thể và các công bố liên quan vẫn là một thách thức đối với việc xác định và khai thác toàn diện tiềm năng của loài thực vật dược liệu này Trong bối

cảnh đó, việc khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết từ Polycarpaea Corymbosa (L)

Lam sẽ mang lại thông tin quan trọng về tính chất và tiềm năng của loài dược liệu này

trong y học Kết quả nghiên cứu của đề tài “Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết

cây Bạch cổ đinh (Polycarpaea Corymbosa (L) Lam)” sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu

tiếp nhằm mục đích tối ưu hóa sử dụng và phát triển giá trị dược liệu của chúng

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được hoạt tính sinh học của cao chiết nước cây Bạch cổ đinh bao gồm tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư

3 Ý nghĩa của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp một số dẫn liệu khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về tính kháng khuẩn, kháng tế bào ung thư và tính kháng oxy hóa của cây Từ đó có thể phát triển giá trị dược liệu của Bach cổ đinh và phát triển nó thành cây trồng cho các vùng canh tác khác

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về Polycarpaea Corymbosa (L) Lam

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Polycarpaea Lam là một chi thuộc họ Caryophyllaceae, phát triển trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, phân bố rộng rãi ở ở cả Đông bán cầu và Tây bán cầu Chi này bao gồm khoảng 50 loài, trong đó có ba loài được tìm thấy tại Ấn Độ theo các nghiên cứu

của Hooker vào năm 1874 Trong số này, Polycarpaea corymbosa (L.) Lam được biết đến nhiều nhất, là loài phổ biến và đa dạng nhất ở Ấn Độ [4] Ngoài Ấn Độ, Polycarpaea corymbosa (L.) Lam cũng được tìm thấy ở một số quốc gia khác như Trung Quốc,

Campuchia, Thái Lan, và Malaysia

Trong khi đó tại Việt Nam, Polycarpaea corymbosa (L.) Lam hay Bạch Cổ Đinh

thường được tìm thấy chủ yếu ở vùng ven biển Từ các khu vực như Hải Phòng, Thái Bình cho đến Ninh Thuận và Bình Thuận, cây mọc và phát triển mạnh mẽ, thích nghi với điều kiện khí hậu và đất đai tại các khu vực này

1.1.2 Vị trí phân loại

Bộ: Caryophyllales

Họ: Caryophyllaceae Juss - Cẩm chướng

Chi: Polycarpaea Lam - polycarpaea Loài: Polycarpaea corymbosa (L.) Lam [4]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Polycarpaea corymbosa (L.) Lam là thực vật thân thảo hàng năm

• Mọc thẳng và mọc theo bụi

• Có chiều cao trung bình khoảng 15 cm

• Cành cây thường có một lớp lông mịn màu trắng hoặc xám nhạt, lông sẽ giảm dần theo thời gian, vì vậy khi cây lớn cành có thể ít lông hoặc không có lông

• Chiều dài lóng từ 0.5cm - 1cm Lá cây được sắp xếp giả đối, mỗi đốt thường có

ít hơn 8 lá

• Lá hình dài hẹp hoặc hẹp mũi kim, dài từ 0.5cm đến 1cm và rộng khoảng 0.1cm, với đầu tròn hoặc hơi nhọn ở gốc và đỉnh lá nhọn Lá màu xanh dày và có mịn, chỉ có một gân

• Lá bẹ hình nhọn mỏng, dài từ 3 đến 3.5 mm

• Cụm hoa thường phân nhánh hai lần và mọc thành chùm ở đỉnh hoặc thường mọc

ở nách lá

• Hoa có màu trắng bạc đến hồng hoặc đỏ tía

Hình 1.1 Polycarpaea corymbosa (L.) Lam được quan sát tại Ấn Độ

Nguồn ảnh: India Biodiversity Portal

1.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn

E.coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình từ 2 – 3 µm x 0,5 µm; trong

những điều kiện không thích hợp (ví dụ trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có

thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng

di động

E.coli hiện diện thường xuyên trong ruột người và động vật Hầu hết các dòng E.coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa, chúng đóng vai

trò quan trọng trong ổn định sinh lý đường tiêu hóa Tuy nhiên, khi xâm nhiễm một liều

lượng lớn vào trong cơ thể người và động vật, E.coli là loài phổ biến nhất gây viêm

nhiễm đường tiểu, thỉnh thoảng có thể tìm thấy chúng gây lở loét và tạo mủ, nhiễm trùng máu và có thể tìm thấy vi sinh vật này gây viêm não [5]

Hình 1.3 Staphylococcus aureus

S.aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 - 1,5 µm;

có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên

da, màng nhày của người và động vật máu nóng

S.aureus có thể mọc ở nhiều điều kiện, môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở

nhiệt độ từ 30 – 37 oC và pH gần trung tính Chúng kháng được với các chất diệt trùng,

độ khô nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl

S.aureus là tác nhân gây bệnh nhiều nhất; nó thường gây ra nhiễm trùng da và

đôi khi viêm phổi, viêm nội tâm mạc, viêm tủy xương Một số chủng gây nên các độc

tố phức tạp gây viêm dạ dày ruột, hội chứng bong vảy da và hội chứng sốc nhiễm độc [6]

Hình 1.4 Escherichia ferusonii (E.ferusonii) Escherichia fergusonii là mộtloài vi khuẩn gram âm , hình que Có liên quan

chặt chẽ với loài Escherichia coli nổi tiếng, E fergusonii lần đầu tiên được phân lập từ

các mẫu máu người Loài này được đặt theo tên của nhà vi trùng học người Mỹ William

W Ferguson

Một số chủng E fergusonii có khả năng gây bệnh Nó được biết là gây nhiễm

trùng vết thương hở ở người và cũng có thể gây nhiễm khuẩn huyết hoặc nhiễm trùng đường tiết niệu Các chủng gây ra các bệnh nhiễm trùng này đã được phát hiện là có khả năng kháng thuốc kháng sinh ampicillin cao , mặc dù một số cũng có khả năng kháng gentamicin và chloramphenicol Một chủng kháng kháng sinh của loài này được phát hiện có liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh viêm bàng quang ở một phụ nữ 52 tuổi vào năm 2008 [7]

Hình 1.5 Aeromonas Hydrophila (A Hydrophila)

Aeromonas hydrophila là một loại vi khuẩn hình que , gram âm , dị dưỡng, chủ

yếu được tìm thấy ở những vùng có khí hậu ấm áp Vi khuẩn này có thể được tìm thấy trong nước ngọt hoặc nước lợ Nó có thể tồn tại trong môi trường hiếu khí và kỵ khí ,

đồng thời có thể tiêu hóa các vật liệu như gelatin và huyết sắc tố A hydrophila được

phân lập từ người và động vật vào những năm 1950 Đây là loài được biết đến nhiều

nhất trong loài Aeromonas Nó có khả năng kháng hầu hết các loại kháng sinh thông thường và nhiệt độ lạnh, đồng thời dương tính với oxidase và indole Aeromonas hydrophila cũng có mối quan hệ cộng sinh như hệ thực vật đường ruột bên trong một số loài đỉa, chẳng hạn như Hirudo drugis [8].

Do cấu trúc của nó nên nó rất độc đối với nhiều sinh vật Khi xâm nhập vào cơ thể nạn nhân, nó sẽ di chuyển theo dòng máu đến cơ quan có sẵn đầu tiên Nó tạo

ra aerolysin , một loại độc tố gây độc tế bào có thể gây tổn thương mô A hydrophila , A caviae và A sobria đều được coi là mầm bệnh cơ hội, nghĩa là chúng hiếm khi lây nhiễm sang người khỏe mạnh A hydrophila được nhiều người coi là mầm bệnh chính ở cá và

lưỡng cư [9], và khả năng gây bệnh của nó ở người đã được công nhận trong nhiều thập

Hình 1.6 Moraxella catarrhalis (M cartarrhalis)

Moraxella catarrhalis là một loại vi khuẩn lưỡng bội khó tính , không di

động , gram âm , hiếu khí , oxidase dương, có thể gây nhiễm trùng hệ hô hấp , tai giữa , mắt , hệ thần kinh trung ương và khớp của con người Nó gây nhiễm trùng

tế bào chủ bằng cách bám vào tế bào chủ bằng chất kết dính trimeric autotransporter

Vi khuẩn này đã được biết là gây viêm tai giữa [11], viêm phế quản [12] , viêm xoang và viêm thanh quản Bệnh nhân cao tuổi và những người nghiện thuốc lá nặng

trong thời gian dài mắc bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính nên biết rằng M catarrhalis có

liên quan đến viêm phế quản phổi cũng như làm trầm trọng thêm bệnh phổi tắc nghẽn

mạn tính hiện có

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Bạch cổ đinh được thu hái tại Hải Lăng – Quảng Trị Mẫu được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật thuộc khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được tiến hành trên cây Bạch cổ đinh Các hoạt tính sinh học của cao chiết được thực hiện thông qua các phép thử hoạt tính tại phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, phòng công nghệ Vi sinh – Hóa sinh thuộc Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (Quatest 2) và Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nước cây Bạch

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết cao

Cây Bạch cổ đinh sau khi được thu hái, được rửa sạch, phân tách phần thân

lá và rễ ra riêng biệt Sau đó, phần rễ cây được sấy ở 50oC đến khối lượng không đổi, xay thành bột mịn làm nguyên liệu cho quá trình thu chiết cao

Mẫu Bạch cổ đinh được chiết bằng dung môi nước Dịch chiết được lọc bằng

bộ lọc chân không Tập trung toàn bộ dịch chiết đem cô quay giảm áp ở 50 oC Cao loãng được cô trong tủ sấy ở 50 oC thu được cao chiết nước từ rễ cây Bạch cổ đinh

2.3.2 Phương pháp xác định một số hợp chất từ cao chiết

Cao chiết được xử lý với máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) tại trung tâm

Kỹ thuật Tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (Quatest 2) để xác định các hợp chất có

trong cao chiết Kết quả phân tích được đính kèm ở phần kết quả

2.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nước cây Bạch cổ đinh 2.3.3.1 Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS•+

Phương pháp ABTS: ABTS+ [2,2’-azinobis sulfonate)] là một gốc tự do bền phát huỳnh quang màu xanh có bước sóng hấp thu đặc trưng là 734 nm Khi bổ sung một hợp chất có khả năng kháng oxy hóa, ABTS+ sẽ bị khử về dạng không màu dẫn đến độ hấp thu bước sóng đặc trưng giảm Quy trình cụ thể được làm theo phương pháp của Re và đồng tác giả đã công bố [13]

Gốc tự do ABTS* được tạo bằng cách ủ dung dịch ABTS 7 mM với dung dịch K2S2O8 2,45 mM tỷ lệ 1:1 (v/v) trong đệm PBS trong tối 12 - 16 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó điều chỉnh giá trị OD của dung dịch ABTS* về giá trị 0,70 ± 0,02 Phản ứng được tiến hành bằng cách thêm 100 µL cao chiết ở các nồng độ khác nhau vào 3 mL dung dịch ABTS* Ủ tối 30 phút ở 25 C sau đó tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 734 nm bằng UV spectrophotometer

Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức: [100* (A–B)]/A Với A là giá trị OD734 của mẫu đối chứng (thay mẫu bằng dung dịch đệm) và B là giá trị OD734 của mẫu

→Phần trăm ức chế được dựng đường chuẩn và tính giá trị IC50

2.3.3.2 Phương pháp bắt gốc tự do DPPH

Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao chiết được đánh giá thông qua khả năng làm giảm độ hấp thụ bước sóng 517 nm của dung dịch DPPH theo phương pháp của Shacter và cộng sự (2000) [14]

Thêm 0,5 mL dung dịch cao chiết vào 0,75 mL dung dịch DPPH (40 µg/mL trong methanol 80%) và ủ 30 phút trong tối ở nhiệt độ phòng

Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức: [100* (A–B)]/A Với A là giá trị OD517 của mẫu không (thay mẫu bằng dung dịch methanol 80%) và B là giá trị OD517 của mẫu

2.3.3.4 Phương pháp khảo sát năng lực khử Fe

Phương pháp khử sắt dựa trên nguyên tắc khi có sự hiện diện của chất kháng oxy hóa thì K3Fe(CN)6 sẽ phản ứng với chất kháng oxy hóa tạo thành phức K4Fe(CN)6 Sau đó, K4Fe(CN)6 tiếp tục phản ứng với FeCl3 tạo thành KFe[Fe(CN)6] phức này

mL dung dịch TCA 10%, lắc đều, hút 0,8 mL dịch nổi vào 2 mL nước cất, thêm vào 0,4

mL FeCl3 1% Sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 700 nm bằng UV spectrophotometer

2.3.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

2.3.4.1 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Các chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) được pha loãng ở nồng độ 106CFU/ml và trải đều lên bề mặt thạch MHA Các lỗ kích thuốc đường kính 3 mm được đục trên bề mặt thạch ở mỗi đĩa petri Lần lượt nhỏ 100µl dịch cao chiết MSE ở các nồng độ 100 - 800 mg/ml và đối chứng nước vào mỗi lỗ thạch Đối chứng (kháng sinh)

đặt ở trung tâm đĩa; Ampicillin/sulbacta (As) cho S.aureus, Clindamycin (cL) và Ceftazidime (Cz) cho Hydrophila, Meropenem (Me) và Imipenem (Im) cho E coli,

E.fergusonii, Piperacillin (Pt) và Cefotaxime (Ct) cho M catarrhalis Đĩa petri sau cấy

được đặt vào tủ lạnh trong 5 giờ để kháng sinh và cao chiết khuếch tán đều vào môi trường thạch Tiếp tục chuyển đĩa thạch sang tủ ấm (Memmert IN55, Đức) ở 37oC trong

24 đến 48 giờ Kết quả được đọc sau 24 giờ nuôi cấy Lặp lại 3 lần với mỗi thí nghiệm

2.3.4.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)

Dùng pipet lấy 50μl dịch VSVKĐ nồng độ 106 CFU/ml nhỏ lần lượt vào 8 giếng chứa môi trường MHA lỏng, thêm vào 50μl dịch MSE ở các nồng độ pha loãng khác nhau từ 3,125-200 mg/ml vào 8 giếng trên Giếng đối chứng dương chứa dịch VSVKĐ

và môi trường MHA Giếng đối chứng âm chứa cao chiết MSE và môi trường MHA Ủ qua đêm ở 37oC Sau 24 giờ, thêm vào mỗi giếng 30μl chất chỉ thị màu resazurin pha loãng 0,015% Ủ ở 37oC, theo dõi và ghi nhận sự thay đổi màu sắc ở mỗi giếng Ghi nhận giá trị tại giếng có nồng độ thấp nhất trong dãy thử nghiệm không có

sự đổi màu resazurin, giá trị MIC được xác định bằng ½ nồng độ cao chiết tại giếng đó Tiếp tục xác định MBC bằng phương pháp trải đĩa Lấy 100μl dung dịch trong các giếng

ở trên mà không có sự đổi màu bởi resazurin, cấy dàn đều dung dịch đó lên các đĩa thạch rắn MHA, ủ đĩa trong tủ ấm 37oC, ghi nhận sự xuất hiện khuẩn lạc sau 24 giờ MBC