Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết vỏ quả trúc (citrus hystrix dc ) Ở các giai Đoạn tăng trưởng

Phương pháp định tính sơ bộ các hợp chất trong dịch chiết EtOH vỏ quả Trúc .... Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của cao chiết đối với các chủng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây Trúc (Citrus hystrix DC.)

Cây Trúc có tên khoa học là Citrus hystrix DC thuộc họ Cam (Rutaceae) [5]

Cây Trúc, còn có tên gọi khác là Chanh Kaffir hay còn gọi là Chanh Thái, một loại trái cây nhiệt đới thuộc chi Citrus [6] Tại Việt Nam, cây Trúc còn được gọi với tên cây Trấp, cây Chúc, Chanh số 8,…[7]

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Trúc

Cây Trúc đã được đề cập đến trong văn học cổ, đây là một loài cây thuộc Họ Cam (Rutaceae) Cây Trúc được tìm thấy ở khắp Ấn Độ và khu vực Đông Nam Á Tại Ấn Độ, quả Trúc thường được sử dụng để làm nước giải khát và chất tạo chua tự nhiên trong các món cà ri [8] Tại Thái Lan và Malaysia, lá Trúc là một nguyên liệu phổ biến trong các món ăn truyền thống [9]

Trong hệ thống y học cổ truyền của Ấn Độ, vỏ quả và lá của cây Trúc được sử dụng để chữa các bệnh viêm nhiễm khác nhau Ngoài ra, các nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy trong quả Trúc có một số hợp chất có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, chống oxy hóa,… [8]

Vị trí phân loại của cây Trúc trong hệ thống phân loại thực vật được thể hiện cụ thể tại Bảng 1 [10, 11]

Bảng 1 Vị trí của cây Trúc trong hệ thống phân loại thực vật

Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Họ Cam (Rutaceae) Chi Cam chanh (Citrus) Loài Citrus hystrix DC

Cây Trúc là một loại cây bản địa nhiệt đới, phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, Thái Lan, Ấn Độ và miền Nam Trung Quốc Thái Lan giữ vị trí dẫn đầu về sản xuất và phân phối quả Trúc trên thị trường quốc tế [12] Ở Việt Nam, cây Trúc được trồng nhiều ở tỉnh An Giang và các tỉnh thuộc miền Đông Nam

Bộ Tuy nhiên ở nước ta, quả Trúc vẫn còn ít được sử dụng để làm thực phẩm vì quả có vị rất chua, nên thường được dùng để gội đầu, chữa đau bụng, tiêu chảy hay cảm mạo,… [7]

Cây Trúc là một loại cây thân gỗ nhỏ đến trung bình, sống lâu năm, có thân cứng, vỏ nhẵn, thân nhẵn, thân cây thường không thẳng mà cong, với những cành nhẵn có nhiều gai, mang hương thơm, cây cao khoảng 3 - 6 m [13, 14]

Lá kép màu xanh và có hình dáng đặc biệt [14],mép lá khía răng, chóp tròn hay lõm có khi nhọn, màu xanh thẫm, thùy kép, mọc đối, lá dài 7,5 - 10 cm, rộng 5 cm, cuống lá dài và mở rộng thành hình cánh nổi bật, lá có chứa tinh dầu nên cho mùi thơm nồng Mùi thơm của lá Trúc mạnh hơn so với lá chanh thường [7]

Nụ hoa hình cầu [15], hoa nhỏ với 4 – 6 cánh hoa [16], cánh hoa màu trắng dài 7 – 10 mm, viền tím, nhị hoa màu vàng xếp thành bó hay chùm nhị dài 24 – 30 mm [7]

Quả thường mọc đơn lẻ hoặc thành chùm [14], có hình tròn đến hình trứng và thường có hình dạng giống như núm rõ rệt ở gần đỉnh [6, 17] Đường kính quả từ 5,0 - 7,5 cm [16] Quả có vỏ dày, màu xanh đậm, sần sùi và nhăn nheo Khi quả già, màu sắc nhạt dần thành màu xanh nhạt hơn, hơi vàng và chuyển sang màu vàng sau khi chín hoàn toàn [6, 8], thịt quả màu vàng xanh, thường có từ 11 đến 13 múi [15], quả ít nước nhưng nước có vị the và rất chua [7, 17]

Tinh dầu được tìm thấy trong lá, hoa, quả; tinh dầu có nồng độ cao nhất ở phần vỏ xanh của quả [6] Bộ phận có giá trị của cây là lá và vỏ quả [13] Hàm lượng tinh dầu trong quả Trúc cao gấp 3 đến 5 lần so với các loại quả có múi khác cùng họ [6] Cây ra hoa quả quanh

4 năm, thời gian từ khi ra hoa đến khi thu hoạch khoảng 3 đến 4 tháng, cây cho năng suất cao và khá dễ trồng [7] Hình ảnh về quả, lá, vỏ quả [12] và hoa [16] được minh họa ở Hình 1

Hình 1 Quả (A), lá (B), vỏ quả (C) và hoa (D) của cây Trúc

Hầu hết các bộ phận như lá, quả, hạt và rễ đều được sử dụng để chữa bệnh [2, 6]

Các hợp chất tự nhiên được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây Trúc đã được phát hiện là có nhiều hoạt tính dược lý khác nhau như: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư… [2].

Trong y học cổ truyền, cây Trúc được sử dụng để điều trị cảm cúm, sốt, tăng huyết áp, đau bụng và tiêu chảy ở trẻ sơ sinh [8] Quả được dùng làm thuốc kích thích tiêu hóa, lọc máu, giảm huyết áp Ngoài ra, quả còn được sử dụng trong ẩm thực để tạo hương thơm và được dùng để sản xuất dầu gội đầu Bên cạnh đó, nước ép từ quả còn có tác dụng làm mềm da, có thể pha chung với nước tắm để khử mùi cơ thể [16] Ở Indonesia, lá và quả đều được dùng để xông hơi cho phụ nữ sau sinh, làm giảm đau đầu, thấp khớp, sốt và điều trị bệnh đái tháo đường [18]

Theo kinh nghiệm dân gian, thường xuyên chà lá tươi lên răng và nướu có thể cải thiện sức khỏe răng miệng Tinh dầu từ lá và quả được dùng làm nước hoa và các chế phẩm làm đẹp khác Chiết xuất acetone thô của rễ có hoạt tính chống lại enzyme protease HIV-1 Dịch chiết methanol của lá có tác dụng ức chế virus herpes và có tác dụng đuổi muỗi [8]

Hơn nữa, tinh dầu từ quả Trúc đã được báo cáo là có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống nhiễm trùng và chống ho [16]

Tinh dầu phân lập từ vỏ quả Trúc là một chất lỏng không màu hoặc màu vàng nhạt với mùi hương nồng, tươi mát của cam quýt [4], hòa tan trong dung môi hữu cơ và không hòa tan trong nước [12], có khả năng xua đuổi côn trùng và có nhiều lợi ích đối với sức khỏe [19] Thành phần hóa học thiết yếu có trong tinh dầu là β-pinene, limonene và terpinen-4-ol [4]

Tổng quan về vi khuẩn và khả năng kháng khuẩn

Vi khuẩn gram dương có thành tế bào peptidoglycan dày hơn so với vi khuẩn gram âm [24], sau khi nhuộm gram sẽ xuất hiện màu tím đặc biệt và không có lớp màng lipid bên ngoài

Vi khuẩn Gram dương bao gồm tất cả tụ cầu, tất cả liên cầu và một số loài listeria [25] 1.2.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Hình thái vi khuẩn S aureus được thể hiện ở Hình 5 [26]

Hình 5 Hình thái vi khuẩn Staphylococcus aureus

❖ Đặc điểm và khả năng gây bệnh

S aureus là một cầu khuẩn Gram dương, hiếu khí tùy tiện, đây là một trong những vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất, có khả năng gây ra nhiều loại bệnh khác nhau, thường khu trú ở da và đường hô hấp trên ở cả người và động vật [27]

Hầu hết tụ cầu khuẩn không gây hại nhưng đôi khi có thể gây nhiễm trùng Một số loại tụ cầu vàng có khả năng kháng lại các phương pháp điều trị bằng kháng sinh thông thường như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) [26]

Hình thái vi khuẩn B subtilis được thể hiện ở Hình 6 [28]

Hình 6 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis

❖ Đặc điểm và khả năng gây bệnh

Vi khuẩn B subtilis là một vi khuẩn hình que, Gram dương, thường được tìm thấy trong đất và cỏ khô, chúng có khả năng hình thành bào tử khi gặp điều kiện bất lợi (nhiệt độ cao, tia cực tím và bức xạ γ) B subtilis được phát hiện là một lợi khuẩn đường ruột có thể được sử dụng để chữa bệnh kiết lỵ và được sử dụng như một loại chế phẩm sinh học (probiotic) có đặc tính ngăn ngừa tình trạng viêm nhiễm ở đường ruột gây ra do các chủng vi khuẩn có hại [29]

Vi khuẩn Gram âm có thành tế bào peptidoglycan mỏng hơn nhiều so với vi khuẩn Gram dương, ngoài ra chúng còn có lớp màng lipid bên ngoài bao quanh tế bào Vi khuẩn Gram âm bao gồm các loài Enterobacter, các loài Salmonella và các loài Pseudomonas [25] 1.2.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli

Hình thái vi khuẩn E coli được thể hiện ở Hình 7 [30]

Hình 7 Hình thái vi khuẩn Escherichia coli

❖ Đặc điểm và khả năng gây bệnh

E coli là một loại vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, hình que, gram âm, được Theodor Escherich mô tả lần đầu tiên vào năm 1885 [31]

E coli thường được tìm thấy trong ruột của người và động vật máu nóng Hầu hết E coli đều vô hại và là một phần của đường ruột khỏe mạnh E coli giúp tiêu hóa thức ăn, sản xuất vitamin và bảo vệ chúng ta khỏi vi sinh vật có hại [30, 31] Tuy nhiên, một số chủng, chẳng hạn như E coli sản sinh độc tố Shiga (Shiga toxin - producing E coli - STEC), có thể gây bệnh nghiêm trọng như gây viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tăng ure huyết tán huyết để lại di chứng và đe dọa tính mạng ở người [31, 32]

Hình thái vi khuẩn S enterica được thể hiện ở Hình 8 [33]

Hình 8 Hình thái vi khuẩn Salmonella enterica

❖ Đặc điểm và khả năng gây bệnh

S enterica là vi khuẩn gram âm, hình que, kỵ khí tùy tiện Vi khuẩn có thể gây ra ba hội chứng chung, bao gồm sốt thương hàn, viêm ruột/tiêu chảy và nhiễm khuẩn huyết, cũng như các bệnh lây truyền không có triệu chứng Nhiễm khuẩn Salmonella không thương hàn thường có biểu hiện buồn nôn, nôn mửa, khó chịu ở bụng và tiêu chảy ra nước hoặc ra máu, viêm đại tràng cấp tính, với niêm mạc sung huyết, dễ bong tróc và loét,…Mầm bệnh thường lây nhiễm sang người qua thực phẩm bị nhiễm khuẩn như nước, cá, thịt, gia cầm, trứng, sữa, rau và trái cây,… [34]

Hình thái vi khuẩn P aeruginosa được mô tả như Hình 9 [33]

Hình 9 Hình thái vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

❖ Đặc điểm và khả năng gây bệnh

Pseudomonas là một nhóm trực khuẩn gram âm, hiếu khí, thường được tìm thấy trong môi trường như đất và nước Loại phổ biến nhất gây nhiễm trùng ở người là P aeruginosa, chúng có thể gây nhiễm trùng máu, viêm phổi, viêm đường tiết niệu hoặc các bộ phận khác của cơ thể sau phẫu thuật Bệnh nhân tại các cơ sở chăm sóc sức khỏe có nguy cơ nhiễm vi khuẩn P aeruginosa cao nhất, đặc biệt là những người đang sử dụng máy thở, ống thông, có vết thương hở do phẫu thuật hoặc vết bỏng,… P aeruginosa dễ dàng lây truyền khi chúng ta tiếp xúc với bề mặt hoặc thiết bị bị ô nhiễm, trong đất hoặc nước và giữa người với người bị nhiễm bệnh [33, 35]

Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn vẫn chưa rõ ràng, tuy nhiên hầu hết các chủng được phân lập đều sản sinh ra nội độc tố và có khả năng chống lại quá trình thực bào [35]

1.2.3 Tổng quan về khả năng kháng khuẩn

Chất kháng khuẩn là chất có tác dụng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật như vi khuẩn, nấm hoặc động vật nguyên sinh Hoạt tính kháng khuẩn của bất kỳ chất nào có thể được định nghĩa là khả năng ức chế vi khuẩn (kiềm khuẩn) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (diệt khuẩn) Hoạt tính kháng khuẩn rất có lợi cho cơ thể con người trong việc chống nhiễm trùng và các bệnh liên quan [20, 36]

Trước tình hình gia tăng đáng kể các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, việc phát triển dược phẩm và thuốc có nguồn gốc từ thực vật đang được quan tâm và phát triển rộng rãi vì chúng không chỉ mang lại tác dụng điều trị hiệu quả mà còn giúp làm giảm các tác dụng không mong muốn gây ra cho người bệnh Các bộ phận khác nhau của cây Trúc, đặc biệt là quả và lá, có thành phần kháng khuẩn làm giảm sự phát triển của vi khuẩn Ngoài ra, sự hiện

14 diện của các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính còn có tác dụng như chất kháng khuẩn và chống oxy hóa tự nhiên, có thể đóng góp đáng kể cho ngành Dược phẩm [20]

Một số phương pháp dùng để đánh giá khả năng kháng khuẩn thường được áp dụng hiện nay bao gồm:

- Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

- Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

- Phương pháp khuếch tán giấy trên đĩa thạch [37]

1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn của một số hợp chất tự nhiên có trong thực vật

Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất tự nhiên từ thực vật bao gồm: sự phá vỡ màng và cấu trúc tế bào, dẫn đến sự gián đoạn quá trình sinh tổng hợp và chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian của tế bào, làm đông tụ các thành phần của tế bào chất và gây gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế bào vi khuẩn [38]

1.2.5 Cơ chế kháng khuẩn của Amoxicillin

Amoxicillin là một loại kháng sinh thuốc nhóm beta-lactam được sử dụng rộng rãi, được chỉ định để điều trị nhiễm trùng do các chủng vi khuẩn nhạy cảm gây ra, có hiệu quả chống lại nhiều loại vi khuẩn Gram dương và một số chủng vi khuẩn Gram âm

Cơ chế kháng khuẩn: Amoxicillin thuộc nhóm beta-lactam Beta-lactam gắn kết với một hoặc nhiều protein liên kết penicillin của vi khuẩn, ức chế quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan, kích hoạt các enzyme tự phân hủy trong thành tế bào vi khuẩn, dẫn đến sự phân hủy thành tế bào và phá hủy tế bào vi khuẩn Cơ chế này là cơ chế diệt khuẩn [39]

1.2.6 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Trúc (Citrus hystrix DC.)

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Trần Thị Kim Ngân và cộng sự (2019) đã nghiên cứu sơ lược đặc tính hóa lý của tinh dầu vỏ quả Trúc (Citrus hystrix DC.) trồng ở tỉnh An Giang, Việt Nam Vỏ quả Trúc được sử dụng để chiết tinh dầu, sử dụng phương pháp chưng cất hơi nước và đánh giá các đặc tính lý hóa Kết quả cho thấy, hiệu suất chiết tinh dầu là 1,80 % Các thông số lý hóa trung bình lần lượt là: trọng lượng riêng (0,858 g/cm 3 ), chỉ số acid (0,667 mg KOH/g), chỉ số este (4,203 mg KOH/g),… Có 23 hợp chất được phân lập từ tinh dầu vỏ quả Trúc Kết quả sắc ký khí – khối phổ (GC - MS) cho thấy trong tinh dầu cực kỳ giàu α-pinene (35,540 %), eucalyptol (20,902 %), camphene (4,384 %), caryophyllene (1,225 %),… [41] Đỗ Minh Long và cộng sự (2023) đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu vỏ quả Trúc (Citrus hystrix DC.), có nguồn gốc từ Tịnh Biên, tỉnh An Giang (Việt Nam), sử dụng phương pháp chưng cất hơi nước Nghiên cứu cho thấy các hợp chất như β-pinene (30,19 %), D-limonene (22,15 %), sabinene (21,37 %) có đặc tính chống oxy hóa và kháng khuẩn nên có hàm lượng tương đối cao Tinh dầu cũng cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, bao gồm Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Salmonella typhimurium (ATCC 13311) và Bacillus cereus (ATCC 11778) [6]

1.3.2 Các nghiên cứu nước ngoài

Abirami và cộng sự (2014) đã nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng y học của cây Trúc Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy rằng quả Trúc có chứa nhiều thành phần khác nhau như glycerolglycolipids, tannin, furanocoumarins, flavonoid và alkaloid

Các nghiên cứu tiền lâm sàng đã chỉ ra rằng một số chất chuyển hóa thứ cấp của cây Trúc có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, ngăn ngừa ung thư, chống oxy hóa, kháng cholinesterase, tim mạch và bảo vệ gan [8]

Habsari và cộng sự (2017) đã nghiên cứu các hợp chất hóa học có trong tinh dầu quả Trúc có tác dụng kháng lại vi khuẩn E coli Tinh dầu được thu nhận bằng phương pháp chưng cất phân đoạn Hoạt tính kháng khuẩn được khảo sát sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch được tiến hành ở ba nồng độ (500, 300 và 100 àL/mL) Kết quả cho thấy hoạt tớnh khỏng khuẩn thể hiện rừ nhất ở nồng độ 500 àL/mL Thành phần chớnh của tinh dầu là các monoterpen có oxy như citronella 74,94 %; linalool 20,13 %; và isopulegol 3,08 % [1]

Sreepian và cộng sự (2019) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu chiết xuất từ vỏ quả Trúc (Citrus hystrix DC.) ở mô hình in vitro Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán giấy trên đĩa thạch Kết quả cho thấy, tinh dầu vỏ quả Trúc có tác dụng ức chế đối với tất cả các chủng vi khuẩn được thử nghiệm ngoại trừ Klebsiella pneumoniae, Salmonella paratyphi A, Salmonella enteritidis, Edwardsiella tarda và Pseudomonas aeruginosa Vi khuẩn Gram dương thường nhạy cảm hơn so với vi khuẩn

Mohideen và cộng sự (2022) đã nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn của tinh dầu chiết xuất từ vỏ quả Trúc (Citrus hystrix) Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đối với 4 chủng vi khuẩn: 2 chủng vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923 và Staphylococcus epidermidis ATCC 12228) và 2 chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC 25922 và Shigella dysenteriae

ATCC 13313) Kết quả cho thấy vi khuẩn Gram dương nhạy cảm hơn với tinh dầu (đường kính vùng ức chế trung bình: S aureus = 19,3 ± 1,5 mm và S epidermidis = 19,3 ± 0,6 mm) so với vi khuẩn Gram âm (đường kính vùng ức chế trung bình: E coli = 8,3 ± 0,6 mm và

Vào năm 2023, Sreepian và cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của tinh dầu

Citrus hystrix đối với các chủng Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicillin (MSSA) và Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) trên lâm sàng Kết quả sàng lọc kháng

17 khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa đã chứng minh rằng riêng tinh dầu Trúc có hoạt tính kháng khuẩn nhất định đối với tất cả các chủng MSSA (IZD: 16,0 ± 4,7 mm) và các chủng MRSA (IZD: 16,5 ± 4,2 mm) Giá trị MIC của tinh dầu Trúc là 18,3 ± 6,1 mg/mL ở chủng MSSA và 17,9 ± 6,9 mg/mL ở chủng MRSA [42]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Quả Trúc tươi ở 3 giai đoạn tăng trưởng khác nhau, được thu hái ở thị xã Tịnh Biên, tỉnh

An Giang vào tháng 05 năm 2024 Mẫu quả Trúc được định danh là Citrus hystrix DC bởi

TS Lê Văn Út – Viện Đào tạo và Nghiên cứu Dược học, Trường Đại học Bình Dương

Phân loại mẫu theo từng giai đoạn dựa vào cảm quan, phương pháp đo trọng lượng, đo kích thước quả và các phần của quả [43]

Trong nghiên cứu này, quả Trúc được khảo sát ở 3 giai đoạn khác nhau, gồm:

- Giai đoạn quả non: quả khoảng 3 tháng tuổi, đường kính trung bình từ 3 đến 4 cm, trọng lượng quả từ 25 đến 32 g, vỏ ngoài màu xanh đậm, bóng, ít nếp nhăn, phần đỉnh quả chưa xuất hiện hình núm, lớp thịt vỏ mỏng, quả ít nước

- Giai đoạn quả vừa: quả khoảng 3,5 tháng tuổi, đường kính trung bình từ 4 đến 5 cm, trọng lượng quả từ 32 đến 37 g, vỏ ngoài màu xanh đậm, sần sùi và nhăn nheo, bắt đầu xuất hiện hình núm ở phần đỉnh quả, lớp thịt vỏ dày, quả nhiều nước và nhiều hạt

- Giai đoạn quả chín: quả khoảng 4 tháng tuổi, đường kính trung bình từ 5 đến 7 cm, trọng lượng quả từ 37 đến 45 g, vỏ ngoài màu xanh nhạt đến vàng, sần sùi và nhăn nheo, xuất hiện hình núm rõ rệt ở phần đỉnh quả, lớp thịt vỏ dày, quả nhiều nước và nhiều hạt Quả Trúc do tác giả chụp trong quá trình nghiên cứu được mô tả theo Hình 10

Hình 10 Quả Trúc tươi ở 3 giai đoạn tăng trưởng

Lưu mẫu tại bộ môn Sinh học Dược – Thực vật Dược – Dược liệu cổ truyền, Viện Dược học, Trường Đại học Bình Dương

Vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi Viện Dược học – Trường Đại học Bình Dương, bao gồm:

- Dòng vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 29213 và Bacillus subtilis ATCC 6051)

- Dòng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica subsp enterica (ex Kauffmann và Edwards) Le Minor và Popoff serovar Typhi ATCC 19430 và Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853)

- Các dung môi bao gồm: Ethanol 96 %, nước cất (H2O), n-hexane, EA, n-butanol, DMSO

- Đối chứng dương: Amoxicillin (Merck – Đức) được sử dụng làm đối chứng dương [44]

- Đối chứng âm: Dung môi pha cao (EtOH 5 % và DMSO 1 %)

- Môi trường nuôi vi khuẩn, bao gồm:

+ Yeast extract (Ấn Độ RM027-500G Himedia)

Các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích

- Cân điện tử Vibra SJ

- Cân sấy ẩm hồng ngoại Ohaus MB27

- Máy cô quay chân không Model: R-1001VN Hãng TaisiteLab

- Lò nung cách thủy Memmert

- Nồi hấp tiệt trùng ALP – Nhật Bản

- Tủ cấy vi sinh cấp 1

- Bình chiết, bình lắng gạn

- Micropipette và đầu típ 100 μL và 1000 μL

- Ống đục giếng thạch đường kính 6 mm

- Que cấy, que trải khuẩn

- Ống nghiệm, giá ống nghiệm

- Găng tay y tế, bông không thấm nước, gạc y tế, giấy báo,…

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu

- Quả Trúc sau khi được rửa sạch sẽ, để ráo, vỏ được tách và cắt thành từng miếng nhỏ có kích thước khoảng 3 - 4 cm

- Vỏ sau đó được sấy khô (ở nhiệt độ 40 o C) đến khối lượng không đổi Mẫu vỏ khô sau khi sấy sẽ được xay nhuyễn thành bột và rây qua rây có kích thước lỗ rây 2 mm Xác định khối lượng bột dược liệu

- Hàm lượng ẩm được xác định bằng cân sấy ẩm hồng ngoại OHAUS MB27 (Bộ môn Dược liệu, Viện Dược học, Trường Đại học Bình Dương) Độ ẩm bột dược liệu không vượt quá 13 % theo qui định của Dược điển Việt Nam V [45]

- Mẫu bột dược liệu được cho vào bao bì kín, chống ẩm, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát, chuẩn bị cho các công đoạn tiếp theo

Mẫu vỏ Trúc qua các giai đoạn xử lý được thể hiện cụ thể ở Hình 11

Hình 11 Vỏ tươi, vỏ khô và bột quả Trúc

Quả non (A), Quả vừa (B), Quả chín (C) 2.2.2 Phương pháp điều chế cao chiết toàn phần ethanol

- Sử dụng phương pháp ngâm lạnh với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:10 (khối lượng (g) : thể tích (mL)) Mẫu bột dược liệu được làm ẩm với EtOH 96 % trong 2 giờ, sau đó được cho vào bình chiết và thêm lượng dung môi còn lại theo đúng tỷ lệ, để yên trong vòng

24 giờ ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, thu dịch chiết và lọc, dịch chiết được gom lại và cô quay chân không để thu hồi dung môi EtOH đến khối lượng không đổi, thu được cao toàn phần EtOH [46]

- Độ ẩm của cao được xác định bằng cách sấy ở nhiệt độ 105 o C đến khối lượng không đổi Độ ẩm cao đặc không quá 20 % theo qui định của Dược điển Việt Nam V [45]

- Xác định khối lượng cao toàn phần Tính hiệu suất chiết cao

Hiệu suất chiết cao được tính theo công thức:

Hiệu suất H (%) = Khối lượng cao thu được

Khối lượng dược liệu sử dụng × 100 [45, 47]

2.2.3 Phương pháp định tính sơ bộ các hợp chất trong dịch chiết EtOH vỏ quả Trúc

Các hợp chất có trong dịch chiết vỏ quả Trúc được định tính sơ bộ bằng các phương pháp phản ứng màu trong ống nghiệm.

Flavonoid trong dịch chiết vỏ quả Trúc được định tính bằng phương pháp phản ứng cyanidin và phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid (FeCl3) tạo ra các phức màu

Phản ứng với muối sắt (III): Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3

5 %, quan sát hiện tượng Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu xanh rêu đến xanh đen

Phản ứng cyanidin: Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesium bằng hạt đậu, sau đó thêm từ từ 0,5 mL HCl đậm đặc vào ống nghiệm Quan sát hiện tượng Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu hồng tới đỏ [48]

Coumarin trong dịch chiết vỏ quả Trúc được định tính dựa trên phản ứng đóng – mở vòng lacton đặc trưng: Cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống nghiệm 2 mL dịch chiết: Ống nghiệm 1: Thêm 4 mL nước cất, lắc đều, dung dịch trở nên đục hơn Ống nghiệm 2: Thêm 0,5 mL NaOH 10 %, đun trên bếp cách thủy 2 -3 phút Thêm nước cất vào ống 2 để đạt thể tích như ống nghiệm 1 Lắc đều và quan sát sẽ thấy ống nghiệm 2 trong hơn ống nghiệm 1 Ống nghiệm 3: Thực hiện tương tự như ống nghiệm 2 Sau đó, tiếp tục acid hóa dung dịch bằng vài giọt HCl đậm đặc, quan sát thấy ống nghiệm này đục hơn ống nghiệm 2 và đục tương tự như ống nghiệm 1

Phản ứng dương tính nếu ống 3 trong như ống 2 và khi acid hóa ống này trở nên đục hơn ống 2 và đục tương đương ống 1 [48]

Tannin trong dịch chiết vỏ quả Trúc được định tính dựa trên phản ứng với dung dịch gelatine muối Lấy 2 mL dịch chiết được cho vào ống nghiệm và tiến hành thêm vài giọt dung dịch gelatine 1 % có NaCl 10 %, quan sát hiện tượng Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông [48]

Saponin trong dịch chiết vỏ quả Trúc được định tính dựa trên phản ứng tạo bọt Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm có sẵn 10 mL nước cất, lắc mạnh trong 1 phút (30 lần), quan sát hiện tượng Phản ứng dương tính khi xuất hiện lớp bọt cao và bền ít nhất 15 phút [48]

2.2.4 Phương pháp điều chế các cao phân đoạn

Cao toàn phần EtOH 96 % được pha loãng với một lượng nước cất vừa đủ để tạo thành dạng hỗn dịch Sau đó tiến hành thêm dung môi với dãy dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexane, ethyl acetate, n-butanol (với tỷ lệ cao/dung môi là 1:50 g/mL) và lắc trong bình lắng gạn để thu được cao phân đoạn n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và cao nước Với mỗi loại dung môi, cao được lắc nhiều lần cho đến khi thử trên mặt kính đồng hồ không còn vết Quy trình điều chế cao chiết phân đoạn được thể hiện cụ thể ở Hình 12

Hình 12 Quy trình điều chế cao chiết phân đoạn

Tất cả các cao phân đoạn được cô quay chân không để loại bỏ hết dung môi và thu được các cao phân đoạn tương ứng

Tất cả các cao chiết (bao gồm cao toàn phần EtOH và các cao phân đoạn) đều được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 o C để chuẩn bị cho các công đoạn tiếp theo

2.2.5 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Công thức môi trường LB Broth cơ bản:

▪ Nước cất vừa đủ 1000 mL [49]

Tiến hành cân các chất trong lọ thủy tinh, thêm nước cất vừa đủ, bịt kín miệng lọ và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 o C trong vòng 2 giờ, sau đó đưa vào tủ cấy để sử dụng

2.2.6 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết được thực hiện theo phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [6, 50]

Nguyên tắc: Các hợp chất có khả năng kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi khuẩn thử nghiệm Nếu cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung quanh các giếng thạch Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết quả Trúc bằng cách đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn (mm) [51]

- Môi trường thử nghiệm thạch LB Broth: được nấu chảy và đổ vào đĩa petri sao cho có được lớp thạch dày khoảng 3 - 4 mm (khoảng 10 mL) Nếu bề mặt thạch bị đọng nước cần phải ủ khô bề mặt thạch bằng cách mở nắp đĩa và để trong tủ cấy trong 15 - 30 phút

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chiết dược liệu và định tính sơ bộ

Sau khi xử lý sơ bộ, vỏ quả Trúc tươi được sấy khô và xay thành bột có thể qua rây 2 mm, khối lượng dược liệu vỏ quả Trúc ở các giai đoạn và hiệu suất chiết cao được thể hiện cụ thể tại Bảng 5

Bảng 5 Thông số của cao chiết ở các giai đoạn tăng trưởng

Khối lượng (g) Độ ẩm bột (%) Độ ẩm cao (%)

Cả quả Vỏ tươi Bột Cao EtOH

Nhận xét: Sau khi cô quay dịch chiết, khối lượng cao toàn phần thu được từ 640 g bột dược liệu vỏ quả Trúc là 135,2 g Trong đó có 18,54 g cao chiết giai đoạn quả non; 56,49 g cao chiết giai đoạn quả vừa và 60,17 g cao chiết giai đoạn quả chín

Cao thu được có màu nâu đen, đặc sệt, vị đắng và mùi thơm đặc trưng của dược liệu, cao chiết EtOH 96 % được tác giả chụp trong quá trình nghiên cứu được mô tả như Hình 15

Hình 15 Cao chiết toàn phần ethanol 96 % vỏ quả Trúc

Nhận xét: Độ ẩm của cao ở 3 giai đoạn đều thấp hơn 20 %, đạt tiêu chuẩn cao đặc theo quy định của DĐVN V

3.1.2 Định tính sơ bộ các hợp chất có trong dịch chiết

Kết quả định tính sơ bộ các hợp chất có trong dịch chiết toàn phần EtOH vỏ quả Trúc được thể hiện cụ thể ở Bảng 6 và Phụ lục 1

Bảng 6 Kết quả định tính sơ bộ các hợp chất có trong dịch chiết vỏ quả Trúc

STT Hợp chất Phương pháp Phản ứng dương tính Kết quả

Phản ứng cyanidin Sau vài phút dịch cao chiết chuyển sang màu đỏ +

Phản ứng với dung dịch

FeCl3 5% Xuất hiện màu xanh đen +

2 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton

Dung dịch đục hơn trong môi trường acid và trong hơn trong môi trường kiềm

3 Tannin Phản ứng với gelatine muối Xuất hiện tủa bông +

4 Saponin Phản ứng tạo bọt Xuất hiện lớp bọt cao và bền -

*Chú thích: (+): phản ứng có xảy ra; (-): phản ứng không xảy ra

Nhận xét: Từ kết quả định tính sơ bộ có thể thấy trong dịch chiết vỏ quả Trúc có chứa các nhóm hợp chất như flavonoid, coumarin và tannin Tuy nhiên, không ghi nhận có saponin

Sau khi thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của cao chiết toàn phần EtOH 96 % dược liệu ở ba giai đoạn tăng trưởng và xác định được giai đoạn quả non cho hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất, phần cao còn lại được tiến hành lắc phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần, lần lượt là n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và nước để thu được các cao phân đoạn tương ứng Hiệu suất thu cao phân đoạn được thể hiện cụ thể ở Bảng 7

Bảng 7 Hiệu suất thu cao phân đoạn

Cao phân đoạn Khối lượng cao ban đầu (g)

Khối lượng cao thu được (g)

Nhận xét: Từ cao toàn phần EtOH 96 % vỏ quả Trúc giai đoạn quả non, sử dụng phương pháp chiết với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần, sau khi chiết hiệu suất thu cao phân đoạn lần lượt là 15,64 % (n-hexane); 18,77 % (EA); 27,18 % (n-butanol) và 33,76 % (nước) Tổng hiệu suất chiết cao phân đoạn của cả quá trình chiết là 95,35 %.

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao toàn phần EtOH 96 %

3.2.1 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

Sau khi thu được cao toàn phần EtOH 96 % vỏ quả Trúc ở 3 giai đoạn tăng trưởng, tiến hành xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết đối với 5 chủng vi khuẩn khảo sát bao gồm 2 chủng vi khuẩn Gram dương (S aureus và B subtilis) và 3 chủng vi khuẩn Gram âm (E coli, S enterica và P aeruginosa) bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Kết quả thống kê của các phép thử được thể hiện cụ thể tại Phụ lục 2

Cao chiết dược liệu quả Trúc ở ba giai đoạn tăng trưởng khác nhau, khảo sát ở nồng độ 40 mg/mL và 80 mg/mL xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn rõ rệt Trong đó, cao chiết ở giai đoạn quả non cho kết quả kháng khuẩn hiệu quả nhất Đối với vi khuẩn Gram dương, cao chiết vỏ quả Trúc thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vừa phải đối với cả hai chủng vi khuẩn S aureus và B subtilis Đối với vi khuẩn Gram âm, cao chiết vỏ quả Trúc thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu đối với chủng vi khuẩn E coli và hoạt tính kháng khuẩn vừa phải đối với chủng vi khuẩn S enterica và P aeruginosa

❖ Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết đối với chủng S aureus được thể hiện cụ thể tại Hình 16 và Bảng 8

Hình 16 Đường kính vùng ức chế S aureus của cao chiết toàn phần ethanol

*Chú thích: (1): Cao chiết giai đoạn quả non, (2): cao chiết giai đoạn quả vừa, (3): cao chiết giai đoạn quả chín, (-): EtOH 5 % đối chứng âm và (+): Amoxicillin đối chứng dương

Nhận xét: Cao chiết toàn phần EtOH 96 % vỏ quả Trúc ở 2 nồng độ 40 mg/mL và 80 mg/mL đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn S aureus với đường kính kháng khuẩn dao động từ 11,33 đến 15,33 mm Đường kính kháng khuẩn của cao chiết ở cả 2 nồng độ đều lớn hơn so với Amoxicillin (50 μg/mL) Trong đó, cao chiết giai đoạn quả non cho hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất và có sự khác biệt về mặt thống kê so với cao chiết ở hai giai đoạn còn lại (Bảng 8)

Bảng 8 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn của cao chiết toàn phần ethanol đối với chủng S aureus Đường kính vùng ức chế vi khuẩn IZD (mm) Nồng độ 40 mg/mL Nồng độ 80 mg/mL Cao chiết EtOH quả non 14,67  0,58 a 15,33  1,15 a

Cao chiết EtOH quả vừa 12,67  1,15 b 13,67  0,58 b

Cao chiết EtOH quả chín 11,33  1,15 b 12,67  0,58 b Đối chứng dương (Amoxicillin) 8,17  0,76 c 8,33  0,58 c Đối chứng âm (EtOH 5 %) 6,00  0,00 d 6,00  0,00 d

*Chú thích: Các giá trị được biểu thị bằng đường kính kháng khuẩn trung bình ± SD của các thí nghiệm được lặp lại ba lần Các kí tự a, b, c, d được thêm vào để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa giữa các phép thử với p = 0,05 Tiêu chí giải thích về hoạt tính kháng khuẩn: IZD = 6 mm là không có hoạt tính kháng khuẩn,

6 mm < IZD ≤ 12 mm là hoạt tính kháng khuẩn yếu, 12 mm < IZD < 20 mm là hoạt tính kháng khuẩn vừa phải và IZD  20 mm là hoạt tính kháng khuẩn mạnh [20, 42]

Nhận xét: Cao chiết dược liệu ở giai đoạn quả non thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vừa phải chống lại vi khuẩn S aureus với đường kính vùng ức chế là 14,67  0,58 mm (ở nồng độ

40 mg/mL) và 15,33  1,15 mm (ở nồng độ 80 mg/mL)

❖ Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết đối với chủng B subtilis được thể hiện cụ thể tại Hình 17 và Bảng 9

Hình 17 Đường kính vùng ức chế B subtilis của cao chiết toàn phần ethanol

*Chú thích: (1): Cao chiết giai đoạn quả non, (2): cao chiết giai đoạn quả vừa, (3): cao chiết giai đoạn quả chín, (-): EtOH 5 % đối chứng âm và (+): Amoxicillin đối chứng dương

Nhận xét: Cao chiết toàn phần EtOH 96 % vỏ quả Trúc ở 2 nồng độ 40 mg/mL và 80 mg/mL đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn B subtilis với đường kính kháng khuẩn dao động từ 10,33 đến 13,33 mm Tuy nhiên, đường kính kháng khuẩn của cao chiết ở cả 2 nồng độ đều nhỏ hơn so với Amoxicillin (50 μg/mL) Ở nồng độ 40 mg/mL, cao chiết giai đoạn quả non có sự khác biệt so với cao chiết giai đoạn quả chín, tuy nhiên không có sự khác biệt về mặt thống kê so với cao chiết giai đoạn quả vừa Ở nồng độ 80 mg/mL cao chiết ở cả ba giai đoạn tăng trưởng cho kết quả kháng khuẩn tương đồng nhau về mặt thống kê (Bảng 9)

Bảng 9 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn của cao chiết toàn phần ethanol đối với chủng B subtilis Đường kính vùng ức chế vi khuẩn IZD (mm) Nồng độ 40 mg/mL Nồng độ 80 mg/mL Cao chiết EtOH quả non 12,67  0,58 b 13,33  1,53 b

Cao chiết EtOH quả vừa 12,33  0,58 b 12,67  0,58 b

Cao chiết EtOH quả chín 10,33  0,58 c 12,67  0,58 b Đối chứng dương (Amoxicillin) 17,67  0,58 a 18,33  0,58 a Đối chứng âm (EtOH 5 %) 6,00  0,00 d 6,00  0,00 c

*Chú thích: Các giá trị được biểu thị bằng đường kính kháng khuẩn trung bình ± SD của các thí nghiệm được lặp lại ba lần Các kí tự a, b, c, d được thêm vào để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa giữa các phép thử với p = 0,05 Tiêu chí giải thích về hoạt tính kháng khuẩn: IZD = 6 mm là không có hoạt tính kháng khuẩn,

6 mm < IZD ≤ 12 mm là hoạt tính kháng khuẩn yếu, 12 mm < IZD < 20 mm là hoạt tính kháng khuẩn vừa phải và IZD  20 mm là hoạt tính kháng khuẩn mạnh [20, 42]

Nhận xét: Cao chiết dược liệu ở giai đoạn quả non thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vừa phải chống lại vi khuẩn B subtilis với đường kính vùng ức chế là 12,67  0,58 mm (ở nồng độ

40 mg/mL) và 13,33  1,53 mm (ở nồng độ 80 mg/mL)

❖ Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết đối với chủng E coli được thể hiện cụ thể tại Hình 18 và Bảng 10

Hình 18 Đường kính vùng ức chế E coli của cao chiết toàn phần ethanol

*Chú thích: (1): Cao chiết giai đoạn quả non, (2): cao chiết giai đoạn quả vừa, (3): cao chiết giai đoạn quả chín, (-): EtOH 5 % đối chứng âm và (+): Amoxicillin đối chứng dương

Nhận xét: Cao chiết toàn phần EtOH 96 % vỏ quả Trúc ở 2 nồng độ 40 mg/mL và 80 mg/mL đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn E coli với đường kính kháng khuẩn dao động từ 9,67 đến 11,33 mm Tuy nhiên đường kính kháng khuẩn của cao chiết ở cả 2 nồng độ vẫn nhỏ hơn nhiều so với Amoxicillin (50 μg/mL) Ở nồng độ 40 mg/mL cao chiết giai đoạn quả non có khác biệt về mặt thống kê so với cao chiết ở giai đoạn quả chín, cao chiết giai đoạn quả vừa không có sự khác biệt về mặt thống kê so với cao chiết ở

2 giai đoạn còn lại Ở nồng độ 80 mg/mL cao chiết ở cả ba giai đoạn tăng trưởng cho kết quả kháng khuẩn tương đồng nhau về mặt thống kê (Bảng 10)

Bảng 10 Đường kính vùng ức chế vi khuẩn của cao chiết toàn phần ethanol đối với chủng E coli Đường kính vùng ức chế vi khuẩn IZD (mm) Nồng độ 40 mg/mL Nồng độ 80 mg/mL Cao chiết EtOH quả non 10,67  0,58 b 11,33  1,53 b

Cao chiết EtOH quả vừa 10,33  0,58 bc 10,50  1,32 b

Cao chiết EtOH quả chín 9,67  0,58 c 10,17  0,76 b Đối chứng dương (Amoxicillin) 23,33  0,58 a 23,16  0,76 a Đối chứng âm (EtOH 5 %) 6,00  0,00 d 6,00  0,00 c

*Chú thích: Các giá trị được biểu thị bằng đường kính kháng khuẩn trung bình ± SD của các thí nghiệm được lặp lại ba lần Các kí tự a, b, c, d được thêm vào để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa giữa các phép thử với p = 0,05 Tiêu chí giải thích về hoạt tính kháng khuẩn: IZD = 6 mm là không có hoạt tính kháng khuẩn,

6 mm < IZD ≤ 12 mm là hoạt tính kháng khuẩn yếu, 12 mm < IZD < 20 mm là hoạt tính kháng khuẩn vừa phải và IZD  20 mm là hoạt tính kháng khuẩn mạnh [20, 42]

Nhận xét: Cao chiết dược liệu ở giai đoạn quả non thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu chống lại vi khuẩn E coli với đường kính vùng ức chế là 10,67  0,58 mm (ở nồng độ 40 mg/mL) và 11,33  1,53 mm (ở nồng độ 80 mg/mL)

❖ Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết đối với chủng S enterica được thể hiện cụ thể tại Hình 19 và Bảng 11

Hình 19 Đường kính vùng ức chế S enterica của cao chiết toàn phần ethanol

*Chú thích: (1): Cao chiết giai đoạn quả non, (2): cao chiết giai đoạn quả vừa, (3): cao chiết giai đoạn quả chín, (-): EtOH 5 % đối chứng âm và (+): Amoxicillin đối chứng dương

Nhận xét: Cao chiết toàn phần EtOH 96 % vỏ quả Trúc ở 2 nồng độ 40 mg/mL và 80 mg/mL đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn S enterica với đường kính kháng khuẩn dao động từ 10,67 đến 14,67 mm Ở nồng độ 80 mg/mL đường kính của cao chiết ở cả 3 giai đoạn tăng trưởng đều cao hơn so với Amoxicillin (50 μg/mL) Ở cả 2 nồng độ 40 mg/mL và 80 mg/mL cao chiết giai đoạn quả non có sự khác biệt về mặt thống kê so với cao chiết giai đoạn quả chín, tuy nhiên cao chiết giai đoạn quả vừa cho kết quả tương đồng về mặt thống kê so với cao chiết ở 2 giai đoạn còn lại (Bảng 11)

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết phân đoạn

3.3.1 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

Các cao phân đoạn (n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và nước) được tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn trên 4 chủng vi khuẩn, bao gồm 1 chủng vi khuẩn gram dương (S aureus) và 3 chủng vi khuẩn gram âm (E coli, S enterica và P aeruginosa) ở các nồng độ giảm dần theo cơ số 2 từ 20 – 1,25 mg/mL bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Đường kính vùng ức chế vi khuẩn dao động từ 7,00 mm đến 13,00 mm tùy vào loại vi khuẩn và các loại cao chiết phân đoạn khác nhau Qua đó xác định được cao phân đoạn EA cho hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất Kết quả đường kính vùng kháng khuẩn của các cao chiết phân đoạn giai đoạn quả non được thể hiện cụ thể ở Phụ lục 1 và Phụ lục 2 Trong đó, cao chiết phân đoạn EA cho hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất đối với chủng S aureus (IZD = 13,00 mm) và kém nhất đối với chủng E coli (IZD = 7,00 mm) ở nồng độ 20 mg/mL Cao chiết nước không cho hoạt tính kháng khuẩn ở tất cả các nồng độ khảo sát

Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các cao chiết phân đoạn vỏ quả Trúc giai đoạn non cho thấy, cao chiết phân đoạn EA cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất Nguyên nhân có thể được giải thích là do hàm lượng flavonoid có trong cao chiết phân đoạn EA cao hơn so với các loại cao chiết phân đoạn còn lại Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Wijaya và cộng sự (2017), nghiên cứu về các hợp chất phenolic của các cao chiết phân đoạn từ vỏ quả Trúc Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết phân đoạn ethyl acetate sở hữu hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng flavonoid cao nhất so với các cao chiết n-hexane, n-butanol và

43 cao nước [54] Do đó, cao chiết phân đoạn EA được lựa chọn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm

3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Sau khi đã khảo sát khả năng kháng khuẩn của các cao chiết phân đoạn vỏ quả Trúc ở giai đoạn quả non, cao chiết phân đoạn EA được lựa chọn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm Tiến hành pha loãng mẫu cao phân đoạn EA của cao chiết giai đoạn quả non trong DMSO 1 % để được dãy nồng độ giảm dần theo cơ số 2 từ 20 – 0,625 mg/mL Kết quả được thể hiện cụ thể ở Hình 23 và Bảng 14

Hình 23 Kết quả MIC của cao chiết phân đoạn ethyl acetate giai đoạn quả non đối với 4 chủng vi khuẩn khảo sát

S aureus (A), E coli (B), S enterica (C) và P aeruginosa (D)

*Chú thích: Các hình được sắp xếp theo thứ tự dãy nồng độ pha loãng giảm dần theo cơ số 2 từ 20 – 0,625 mg/mL; (+): Amoxicillin 50 μg/mL được sử dụng làm đối chứng dương; (-): DMSO 1 % được sử dụng làm đối chứng âm Ở mỗi nồng độ, thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Bảng 14 Kết quả MIC của cao chiết phân đoạn ethyl acetate đối với 4 chủng vi khuẩn khảo sát

Cao phân đoạn EA giai đoạn quả non

*Chú thích: (-): vi khuẩn không mọc; (+): vi khuẩn có mọc

Nhận xét: Kết quả cho thấy cao chiết phân đoạn EA vỏ quả Trúc giai đoạn quả non có tác động ức chế S enterica và P aeruginosa ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 1,25 mg/mL và có tác động ức chế S aureus và E coli ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 2,5 mg/mL Amoxicillin cũng ghi nhận là có hiệu quả kháng khuẩn đối với tất cả 4 chủng vi khuẩn được thử nghiệm

Ngoài ra, đối với cao chiết giai đoạn quả non, khả năng ức chế vi khuẩn mạnh nhất đối với

S aureus (IZD = 14,67  1,15 mm) và yếu nhất đối với E coli (IZD = 11,33  1,53 mm) ở nồng độ 80 mg/mL (Bảng 8 và Bảng 10) Bên cạnh đó, cao chiết phân đoạn EA cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất đối với 4 chủng vi khuẩn khảo sát (Phụ lục 1 và Phụ lục 2) Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng S aureus (IZD = 13,00 mm) và yếu nhất đối với chủng E coli (IZD = 7,00 mm) ở nồng độ 20 mg/mL, tương đồng với nghiên cứu của Ajithkumar và cộng sự (2011), nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ 2 loài Citrus hystrix và Citrus limon Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết methanol từ vỏ quả Trúc (Citrus hystrix DC.) cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng S aureus (IZD = 22,00 mm) và yếu nhất đối với chủng E coli (IZD = 16,00 mm) [3] Từ các kết quả trên, có thể thấy rằng vi khuẩn Gram dương nhạy cảm với cao chiết vỏ quả Trúc hơn so với vi khuẩn Gram âm ở cùng loại cao và cùng nồng độ khảo sát

Bên cạnh đó, tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát đều bị ảnh hưởng bởi đối chứng dương (Amoxicillin) Khả năng ức chế của Amoxicillin (50 μg/mL) theo thứ tự tăng dần như sau:

S aureus, P aeruginosa, S enterica, B subtilis, E coli Đường kính vùng ức chế vi khuẩn trung bình của Amoxicillin dao động từ 8,33 đến 23,33 mm Kết quả thu được chỉ ra rằng các vi khuẩn được thử nghiệm, bao gồm S aureus, S enterica và P aeruginosa (đường kính ức chế từ 8,00 đến 12,00 mm) đều nhạy cảm với Amoxicillin, trong khi E coli và B subtilis (đường kính ức chế từ 17,00 đến 24,00 mm) rất nhạy cảm với Amoxicillin Trong đó, Amoxicillin cho tác dụng kháng khuẩn tốt nhất đối với chủng E coli (IZD = 23,33  0,52 mm) và cho tác dụng kháng khuẩn kém nhất đối với chủng S aureus (IZD = 8,33  0,52 mm) ở nồng độ 50 μg/mL (Phụ lục 2)

Nhìn chung, cao chiết quả Trúc sở hữu hoạt tính kháng khuẩn tốt, với khả năng ức chế cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm