Tường trình thực hành vi sinh (dành cho Đối tượng Đh dược)

KỸ THUẬT NHUỘM GRAM 1.Nguyên tắc của phương pháp nhuộm gram Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được phức hợp màu tím Gent

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ

KHOA DƯỢC

TƯỜNG TRÌNH THỰC HÀNH

VI SINH (Dành cho đối tượng ĐH Dược)

Cần Thơ, năm 2024

Thành viên nhóm 3

Bài 1 KỸ THUẬT NHUỘM GRAM 1.Nguyên tắc của phương pháp nhuộm gram

Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được phức hợp màu tím Gentian - iodine, không bị tẩy bởi alcohol, trong khi

vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp màu này Kết quả là vi khuẩn Gram dương sẽ

giữ được màu tím Gentian, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của Safranin

- Hơ qua ngọn lửa đèn cồn, để nguội, ghi mã số bệnh phẩm lên đầu lam

- Vẽ vòng tròn khu trú đường kính khoảng 1 x 2 cm ở giữa lam (nếu lam chưa được đánh dấu sẵn)

- Ghi mã số bệnh phẩm ở một đầu lam

Bước 2: Lấy bệnh phẩm và trải đều

- Bệnh phẩm trực tiếp từ bệnh nhân: lấy một vòng cấy bệnh phẩm (nếu bệnh phẩm là phân, máu, nước tiểu, đàm) hoặc lăn nhẹ que tăm bông (dịch tiết sinh dục, mủ, BP khác lấy bằng que) lên lam, trong vòng tròn khu trú

-Từ môi trường nuôi cấy: lấy một vòng cấy bệnh phẩm từ môi trường lỏng hoặc nếu lấy khúm khuẩn trên trường thạch đặc (chọn khúm thuần thiết) thì ta phải cho vòng cấy nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) lên lam trước khi đặt vi khuẩn vào

-Trải đều bệnh phẩm hoặc vi khuẩn trên lam trong diện tích vòng khu trú

Bước 3: Cố định tiêu bản

- Để tiêu bản khô tự nhiên, cố định vi khuẩn lên lam bằng cách cách hơ mặt dưới tiêu bản nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 1 - 4 lần

3.2 Kỹ thuật nhuộm Gram

Bước 1: Phủ tím Gentian lên phết vi khuẩn để yên 30 giây -1 phút, rửa nước

Bước 2: Phủ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn để yên 30 giây -1 phút, rửa nước Bước 3: Tẩy màu bằng cồn 96o đến khi giọt nước chảy xuống không còn màu tím (thời gian thay đổi tùy theo độ dày mỏng tiêu bản), rửa nước

Bước 4: Phủ đỏ Safranin lên phết vi khuẩn để yên 30 giây -1 phút, rửa nước

Bước 5: Để lam khô tự nhiên (máy sấy lam, giấy thấm lam)

Bước 6: Nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản, quan sát dưới KHV ở vật kính dầu

(100X)

4.Đọc kết quả

- Xác định hình dạng: cầu khuẩn (tròn, bầu dục, hình hạt đậu), trực khuẩn (hình que)

- Tính chất Gram: Gram âm (vi khuẩn bắt màu đỏ), Gram dương (vi khuẩn bắt màu

tím)

- Cách sắp xếp: đơn, đôi, chuỗi, chùm, dãy, bó, đám, …

Cầu khuẩn Gram dương, Cầu khuẩn Gram dương, sắp xếp chuỗi sắp xếp chùm

Trực khuẩn Gram âm Trực khuẩn Gram duơng

Lậu cầu (Neisseria gonorhoroae)

Song cầu Gram âm Sắp xếp thành đôi, giống như hạt cafe, 2 phần lõm hướng vào nhau Vi khuẩn nằm trong tế bào bạch cầu gọi là nội bào (khi bệnh nhân ở giai đoạn bệnh cấp tính), vi khuẩn nằm ngoài tế bào bạch cầu gọi là ngoại bào (khi bệnh nhân ở giai đoạn bệnh mãn tính)

Song cầu khuẩn Gram âm, nội bào

5 Trả lời câu hỏi

5.1 Vì sao có sự khác biệt trong tính chất bắt màu của vi khuẩn gram âm và gram dương? -Vì khi nhuộm với tím Gentian cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) đều bắt màu do tím gentian và iod tạo phức hợp trong tế bào chất vi khuẩn Tuy nhiên, vì vi khuẩn Gram âm

có nhiều lipid trong thành tế bào nên khi tẩy bằng cồn lipid sẽ bị lấy đi và để lại các lỗi trên thành tế bào Từ đó phức hợp màu tím gentian bị trôi ra làm vi khuẩn gram âm mất màu nhanh hơn vi khuẩn gram dương Khi nhượm lại bằng fuchsin vi khuẩn sẽ bắt được màu của tím gentian do đó không bắt màu fuchsin nữa

- Giả thuyết khác cho rằng vi khuẩn Gram dương có nhiều peptidoglycan trong thành tế bào nên bắt giữ được phức hợp tím gentian- iod, còn vi khuẩn Gram âm thì mất phức hợp này khi tẩy cồn

5.3 Các yếu tố cần trả lời kết quả khi quan sát tiêu bản nhuộm Gram?

- Hình dạng: cầu khuẩn (tròn, bầu dục, hình hạt đậu), trực khuẩn (hình que)

- Tính chất bắt màu: Gram âm ( đỏ), Gram dương ( tím)

- Cách sắp xếp: đơn, đôi, chuỗi, chùm, hàng, đám, …

5.4 Nêu các nguyên nhân sai lầm về kỹ thuật có thể làm thay đổi tính chất Gram của vi khuẩn?

- Thời gian tẩy cồn không đúng: Khi tẩy cồn quá lâu, lớp peptidoglycan của vi khuẩn

Gram dương có thể bị phá vỡ, làm mất màu và khiến chúng nhuộm lại màu đỏ hồng (như Gram âm) Ngược lại, nếu tẩy cồn quá ngắn, vi khuẩn Gram âm có thể vẫn giữ màu tím

từ thuốc nhuộm đầu tiên, cho kết quả sai

- Sử dụng thuốc nhuộm hoặc hóa chất không đúng cách: Nếu thuốc nhuộm, cồn tẩy

hoặc thuốc nhuộm đối xứng (safranin) được sử dụng không đạt chất lượng hoặc đã hết hạn, kết quả có thể bị sai lệch

- Nhuộm trong thời gian không phù hợp: Nếu thời gian ngâm thuốc nhuộm hoặc

thuốc nhuộm đối xứng quá ngắn hoặc quá dài, vi khuẩn có thể không giữ đúng màu cần

thiết Điều này có thể khiến vi khuẩn Gram dương mất màu và nhuộm màu safranin, trông như Gram âm

- Lượng vi khuẩn không đồng đều: Lớp vi khuẩn quá dày hoặc quá mỏng trên lam

kính cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng giữ màu, làm kết quả bị sai lệch

- Kỹ thuật cố định mẫu: Nếu quá trình cố định mẫu không đủ hoặc quá mạnh (ví dụ,

cố định quá lâu hoặc dùng nhiệt độ quá cao), cấu trúc của màng tế bào và thành tế bào của vi khuẩn có thể bị thay đổi, làm ảnh hưởng đến khả năng nhuộm màu

6 Hình ảnh tiêu bản nhuộm gram

Trực khuẩn, gram âm, sắp xếp Cầu khuẩn, gram dương, sắp xếp đơn, đôi, đám đơn, đôi, chuỗi chùm

Trực khuẩn, gram âm, sắp xếp đơn Song cầu khuẩn, gram âm,

Bài 2 KỸ THUẬT NHUỘM KHÁNG ACID

1 Nguyên tắc

Vách tế bào một số Mycobacteria có một lượng lớn acid mycolic nên khó bắt màu với thuốc nhuộm thông thường và có tính kháng cồn - acid Nhưng với đỏ Carbonfuchsin, nếu nhuộm với thời gian 10 - 30 phút (nhuộm lạnh) hoặc đun nóng (nhuộm nóng) thì vi khuẩn sẽ ăn màu rất chắc và không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh như cồn - acid Ngược lại, nền của phiến phết và các loại vi khuẩn khác sẽ bị tẩy màu một cách dễ dàng và sẽ bắt màu xanh methylen tạo sự tương phản giúp dễ dàng quan sát vi khuẩn

2 Chuẩn bị dụng cụ hoá chất

-Trang thiết bị: Tủ an toàn sinh học (ATSH), kính hiển vi quang học, máy ly tâm, máy vortex

- Dụng cụ: lam kính, đèn cồn (đèn tia lửa điện), vòng cấy, giá để lam, giá

nhuộm, bút chì, giấy thấm, giấy lau kính, đồng hồ bấm giây

- Hóa chất: bộ thuốc nhuộm (Carbonfuchsin (0,3%), xanh Methylene (0,3%), cồn - acid (3%), cồn sát khuẩn, dầu soi kính

- Bệnh phẩm lâm sàng nghi ngờ có chứa Mycobacteria như: đàm, dịch phế

quản, dịch não tủy, một số loại dịch khác, mô, cặn bệnh phẩm sau ly tâm hoặc khuẩn lạc (khúm khuẩn) từ lứa cấy thuần

3 Kỹ thuật tiến hành nhuộm nóng Ziehl-Neelson

Bước 1: Đặt tiêu bản lên giá nhuộm (mặt tiêu bản quay lên trên), phủ đầy

Carbonfuchsin 0,3% kín toàn bộ bề mặt lam kính

Bước 2: Hơ nóng tiêu bản từ phía dưới đến khi Carbonfuchsin bốc hơi (không

để sôi), để ít nhất 5 phút Rửa nước

Lưu ý: Khi hơ lam không để thuốc nhuộm cạn đi, nếu cần thì phủ thêm phẩm nhuộm lên lam và hơ nóng lại

Bước 3: Phủ đầy dung dịch acid - cồn lên tiêu bản, để 3 phút, tẩy màu cho tới

khi tiêu bản hết màu hồng, rửa nước

Bước 4: Nhuộm lại bằng xanh Methylen 0,3% hoặc tím Gentian (1 phút )

Bước 5: Rửa nước - thấm khô lam - xem bằng vật kính dầu (X100)

4 Đọc kết quả

- Trực khuẩn kháng acid có hình dài, mãnh, màu hồng hoặc đỏ, còn vi khuẩn

khác, các tế bào biểu mô hay bạch cầu đều bắt màu xanh lơ của xanh methylen Chỉ trả lời có hay không có trực khuẩn kháng acid và đếm số lượng vi khuẩn

quan sát được

- Cách soi tiêu bản: cần phải hệ thống và chuẩn hóa, soi dòng giữa từ trái

sang phải tương đương 100 QT), cần soi kỹ từ ngoại vi vào trung tâm vi trường để phát hiện AFB Khi cần đọc >100 vi trường thì duy chuyển dòng kế tiếp từ phải qua trái như hình vẽ

-Vi khuẩn kháng acid- cồn bắt màu hồng còn vi khuẩn không kháng acid- cồn bắt màu màu xanh

5 Trả lời câu hỏi

5.1 Mục đích của kỹ thuật nhuộm kháng acid?

Một số vi khuẩn nhất là nhóm Mycobacterium chứa nhiều lipid đặc biệt ở thành tế bào

vì vậy rất khó nhuộm màu bằng phương pháp thông thường Sự nhuộm màu sẽ dễ dàng hơn với tác nhân nhuộm màu mạnh, nồng độ cao hoặc tác động của nhiệt Tuy nhiên, khi vi khuẩn đã bắt màu lại khó tẩy bởi các nhân tẩy mạnh như cồn pha acid loãng, trong khi các vi khuẩn khác bị mất màu nhanh chóng, do vậy nhóm vi khuẩn này được

gọi là vi khuẩn kháng acid cồn Phương pháp này dùng để phân biệt vi khuẩn

kháng acid- cồn với các vi khuẩn thường, ví dụ được dùng để tìm vi khuẩn lao

5.2 Mục đích của việc hơ nóng lam khi nhuộm Ziehl-Neelson?

Hơ nóng lam khi nhuộm Ziehl-Neelsen có mục đích chính là để tăng cường khả năng thẩm thấu của thuốc nhuộm vào tế bào vi khuẩn, đặc biệt là Mycobacterium

tuberculosis Quá trình này giúp làm nóng các tế bào, làm cho thành tế bào trở nên mềm hơn, từ đó giúp thuốc nhuộm (thường là carbol fuchsin) dễ dàng xâm nhập và nhuộm vi khuẩn Hơn nữa, nhiệt cũng giúp cố định thuốc nhuộm trên mẫu, cải thiện độ tương phản và giúp dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi

6 Hình ảnh tiêu bản nhuộm kháng acid

Trực khuẩn kháng acid dương tính Trực khuẩn kháng acid dương tính

Âm tính với trực khuẩn kháng acid

BÀI 3 CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI KHUẨN

1 Kỹ thuật cấy vạch ba chiều

1.1 Mục đích

Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nuôi cấy định danh vi khuẩn Mục đích của phương pháp phân lập là tách riêng từng loại vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các khúm thuần khiết để khảo sát và định loại Kỹ thuật này được thực hiện bằng cách cấy chữ chi trên mặt môi trường thạch đặc

1.2 Nguyên tắc

Trong phương pháp cấy vạch 3 chiều, cứ mỗi lần đổi chiều cấy là làm thưa dần số lượng

vi khuẩn (làm cạn dần mầm cấy) và sau khi ủ với điều kiện thích hợp sẽ có những khúm khuẩn riêng lẻ được tách rời

1.3 Chuẩn bị dụng cụ - môi trường

- Môi trường đĩa petri: NA (Nutrient Agar), MC, SS, EMB, BA

Tùy vào mục đích nuôi cấy và loại bệnh phẩm để tiến hành lựa chọn các phương pháp nuôi cấy khác nhau

- Mẫu bệnh phẩm, hỗn hợp vi khuẩn

- Đèn cồn, vòng cấy

1.4 Kỹ thuật tiến hành

- Lấy bệnh phẩm: khử trùng vòng cấy, để nguội, lấy mầm cấy

- Cấy zich-zắc hết diện tích vùng 1, cấy khoảng 1/3 đường kính hộp thạch

- Xoay hộp thạch 60o - Đốt đỏ vòng cấy, để nguội, đặt vòng cấy vào vùng 1 nơi đã cấy

vi khuẩn, cấy zich-zắc từ vùng 1 sang vùng 2 giống như lần cấy thứ nhất nhưng đường cấy thưa hơn

- Xoay hộp thạch 60o

- Đốt đỏ vòng cấy, để nguội Đặt vòng cấy vào vùng 2, nơi đã cấy vi khuẩn, cấy zich-zắc

từ vùng 2 sang vùng 3 Lần này ta cấy trên khắp diện tích mặt thạch còn lại

- Cấy xong, đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ấm ủ 37oC/ 18-24 giờ

- Có bao nhiêu loại khúm khuẩn

- Đặc điểm khúm khuẩn:

+ Đường viền (trơn láng, nhăn nheo, gợn sóng ),

+ Bề mặt (lồi, phẳng, dẹt, lõm, trơn hay nhăn);

+ Màu sắc của khuẩn lạc;

+ Độ đục trong của khuẩn lạc

- Đặc tính riêng trên một số loại môi trường: BA (đặc điểm tiêu huyết), MC, EMB (tính chất lên men đường lactose), SS (tính chất lên men đường lactose, sinh khí H2S)

1.6 Hình ảnh cấy vạch ba chiều

2 Kỹ thuật cấy vào môi trường trong ống nghiệm

2.1 Các loại môi trường trong ống nghiệm

Phân loại theo tính chất môi trường, gồm có 4 dạng sau: môi trường dạng lỏng, bán lỏng, nghiêng, nghiêng đứng

2.2 Kỹ thuật cấy vào các loại môi trường trong ống nghiệm

2.2.1 Môi trường lỏng

Bước 1: Khử trùng vòng cấy, để nguội Lấy bệnh phẩm

Bước 2: Cấy vi khuẩn Mở nắp ống nghiệm, khử trùng miệng ống nghiệm, cấy vi khuẩn

lên thành ống nghiệm (nếu cấy từ khúm khuẩn đặc)

Nhúng và khuấy nhẹ nhàng que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy

Bước 3: Khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nắp ống nghiệm, ủ 370C/18-24h

Bước 4: khử trùng kim cấy hay vòng cấy, để lên giá

2.2.2 Môi trường thạch nghiêng

Bước 1: khử trùng vòng cấy trên ngọn đèn cồn, để nguội Lấy bệnh phẩm

Bước 2:

- Mở nắp ống nghiệm, khử trùng miệng ống nghiệm

- Dùng vòng cấy cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên mặt thạch nghiêng

Bước 3: khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nắp ống nghiệm, để lên giá

Bước 4: khử trùng kim cấy hay vòng cấy, để lên giá

2.2.3 Môi trường thạch nghiêng đứng

Bước 1: khử trùng kim cấy trên ngọn đèn cồn, để nguội Lấy bệnh phẩm

Bước 2: cấy vi khuẩn

- Mở nắp ống nghiệm, khử trùng miệng ống nghiệm

- Dùng kim cấy đâm xuống một đường ở giữa mặt môi trường hết phần thạch đứng, tiếp tục cấy zich-zăc ở phần nghiêng của môi trường

Bước 3: khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nắp ống nghiệm, để lên giá Bước 4: khử

trùng kim cấy, để lên giá

2.2.4 Môi trường bán lỏng

Bước 1: khử trùng kim cấy trên ngọn đèn cồn, để nguội Lấy bệnh phẩm

Bước 2: mở nắp ống nghiệm, khử trùng miệng ống nghiệm, sau đó dùng kim cấy đâm xuống một đường ở giữa mặt môi trường khoảng 2/3 chiều cao của cột thạch Bước 3:

khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nắp ống nghiệm, để lên giá

3 Trả lời câu hỏi

3.1 Mục đích và ứng dụng của kỹ thuật cấy vạch ba chiều

Mục đích: thu được các dòng vi khuẩn thuần chủng, định danh vi khuẩn, đếm số lượng

vi khuẩn, nghiên cứu được đặc tính sinh lí hóa của vi khuẩn

Ứng dụng : Chuẩn đoán bệnh, nghiên cứu vaccine, nghiên cứu kháng sinh,nghiên cứu

về công nghệ thực phẩm , sinh thái vi sinh vật,

3.2 Các yếu tố cần xác định khi đọc kết quả cấy vạch ba chiều?

- Các yếu tố cần xác định khi đọc kết quả cấy vạch ba chiều: Kích thước vi khuẩn, màu sắc, bền mặt thạch, có ngoại nhiễm hay không

BÀI 4 KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ

1 Kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán trên thạch (Kirby-bauer)

1.1 Nguyên tắc:

Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt

thạch chung quanh, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Đường kính vòng vô

khuẩn diễn đạt được tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh Trường hợp không

có vòng vô khuẩn, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh

1.2 Chuẩn bị:

a Đĩa kháng sinh:

Là những đĩa giấy có đường kính 6mm được tẩm một dung dich thuốc kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn Đĩa kháng sinh phải được cất giữ trong các ống có chứa các chất chống ẩm ở nhiệt độ ≤ -4oC Khi chuẩn bị dùng thì lấy ra và để ở nhiệt độ từ 2-8°C Khi thực nghiệm kháng sinh đồ, các ống chứa đĩa kháng sinh phải được lấy ra khỏi

tủ lạnh, để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ trước khi mở nắp Các đĩa kháng sinh phải được kiểm tra hoạt lực trên vi khuẩn chuẩn trước mỗi lần dùng

b Môi trường:

Môi trường tiêu chuẩn để thực hiện kháng sinh đồ là môi trường Muller Hinton

agar (MHA) Môi trường MHA sẽ được thêm các chất bổ sung khi có yêu cầu, ví dụ: để làm thử nghiệm cho Streptococci, cần thềm vào 5% máu người hoặc máu động vật Ngoài ra có thể dùng môi trường: Trypticase soy Agar hay môi trường thạch máu Môi trường được đổ vào hộp petri với bề dày thạch là 4 mm, bảo quản trong các túi plastic và để trong tủ lạnh Không được dùng sau 7 ngày Trước khi dùng, phải lấy ra khỏi tủ lạnh và để cho đến khi đạt nhiệt độ phòng

c Vi khuẩn:

Vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách lấy 3-5 khóm vi khuẩn cấy trên

5ml canh thang Mueller – Hinton hay Tryptic Soy Broth trong 2-6 giờ ở 37oC sao cho

độ đục vượt quá McFarland 0,5 rồi pha loãng với canh thang sao cho độ đục ngang bằng với

độ đục chuẩn của ống McFarland 0,5 (1-3.108 vi khuẩn/ml) Dùng ngay trong vòng 15 phút sau khi chuẩn độ đục

1.3 Kỹ thuật:

- Môi trường được nấu chảy, đổ hộp Để cho thạch đông

- Trải vi khuẩn: dùng que bông vô trùng nhúng vào canh cấy vi khuẩn, xoay que trên thành ống để ép cho ráo nước, rồi quét trên mặt thạch thật đều và kín Khi quét được hơn

½ hộp, xoay hộp 60° và quét lần thứ 2 Xoay hộp 60° và quét lần thứ 3 Cuối cùng dùng que bông quét 1 vòng xung quanh, sát thành hộp

- Sau khi trải vi khuẩn, ấp khô mặt thạch ở 37°C trong không quá 15 phút

- Đặt kháng sinh: dùng kẹp được tiệt khuẩn (đốt trên đèn, làm nguội) cặp khoanh giấy rồi đặt lên mặt thạch sao cho tiếp xúc đều, các đĩa cách nhau tối thiểu 2,5 cm và cách thành hộp tối thiểu 2 cm Không xê dịch đĩa sau khi đã đặt Chỉ được phép đặt đĩa khi mặt thạch đã khô

- Ủ 37°C trong 24 giờ