Báo cáo thực hành vi sinh vật bài 1 một số thiết bị và dụng cụ cơ bản sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật

Một số thiết bị Nồi hấp khử trùng: Khử trùng dụng cụ, môi trường nuôi cấy bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao nhiệt độ 121oC, thời gian tối... 5 Máy đo pH: Xác định và điều pH môi t

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

-○○○ - BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT

Giảng viên hướng dẫn: Bằng Hồng Lam Lớp DH24SH - Nhóm 3 – Nhóm thực hành III Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thảo Vy – DSH232785 Nguyễn Thị Thanh Xuân – DSH232795 Đặng Thị Ngọc Ý – DSH232789

Trần Quốc Toản – DSH232773 Tống Thị Hiền – DSH232721 Bùi Anh Đức – DSH232707

Võ Thanh Mẫn – DSH232735

Thứ Hai, 28/04/2024

BÀI 1: MỘT SỐ THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ CƠ BẢN SỬ DỤNG

TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT

I Một số thiết bị

Nồi hấp khử trùng: Khử trùng

dụng cụ, môi trường nuôi cấy

bằng hơi nước bão hòa ở áp suất

cao (nhiệt độ 121oC, thời gian tối

3

Tủ cấy vô trùng: Thực hiện các

thao tác, kỹ thuật cấy trong điều

kiện vô trùng như đổ môi trường,

phân lập, cấy truyền,

tủ ủ thấp hơn, bằng hoặc cao hơn

nhiệt độ môi trường.)

Cân phân tích (Cân điện tử 2 số

lẻ và 4 số lẻ): Cân khối lượng

thànhphần các hóa chất bổ sung

vào môi trường nuôi cấy

Kính hiển vi quang học: quan

sát tế bào vi sinh vật ở trạng thái

sống hoặc trạng thái nhuộm màu,

đếm trực tiếp mật số tế bào vi sinh

vật bằng buồng đếm hồng cầu,

Microwave: Làm tan chảy môi

trường thạch nuôi cấy

5

Máy đo pH: Xác định và điều pH

môi trường nuôi cấy cho phù hợp

với từng loại môi trường

Máy đếm khuẩn lạc: có 1 kính

lúp giúp phóng to hình ảnh khuẩn

lạc trên đĩa petri, khi chấm vào

khuẩn lạc, thiết bị sẽ tự ghi nhận

và hiển thị số điện tử

II.Một số dụng cụ:

Đèn cồn: Khử trùng dụng cụ cấy

(kẹp gắp, que cấy, kéo,…), khử

trùng bề mặt ngoài đĩa petri trong

quá trình cấy

Đĩa petri: Phân lập, nuôi cấy vi

sinh vật

Que chà: Phân bố (trãi) đều mẫu vi

sinh vật trên môi trường nuôi cấy

trong đĩa petri

7

Que cấy: Que cấy vòng: dùng để

cấy vi khuẩn, Que cấy móc: dùng

để cấy nấm, Que cấy thẳng: dùng

để cấy vi sinh vật kị khí nằm sâu

trong ống nghiệm

Kẹp gắp: Gắp mẫu, giữ cố định

mẫu khi cắt, cấy mẫu

Bình tam giác: Dùng để nuôi cấy

với số lượng lớn, nấu môi trường,

trữ môi trường

9

Cốc đông: Dùng để nấu môi

trường:nấu thịt bò, khoai tây để lấy

dịch trích

Ống nghiệm: Dùng để pha loãng

mẫu chứa vi sinh vật, nuôi cấy vi

sinh vật trong môi trường lỏng với

số lượng ít hoặc làm môi trường

thạch nghiêng trữ giống vi sinh vật

Lame và lamen: Lame: kính mang

vật (chứa mẫu vi sinh vật), Lamen:

kính đậy vật (đậy mẫu vi sinh vật)

III Kết quả thực hiện:

Sau khi được giảng viên hướng dẫn, sinh viên đã hiểu được công dụng, cách thức vận hành của các thiết bị và sử dụng được các thiết bị và dụng cụ cơ bản nghiên cứu

vi sinh vật

11

BÀI 2: CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

1 Môi trường khoai tây

1.1 Thành phần môi trường

1000 mL môi trường Ví dụ: 300 mL môi trường

Thành phần Khối lượng Thành phần Khối lượng

1 Khoai tây 200 g 1 Khoai tây 60 g

2 D- Glucose 20 g 2 D- Glucose 6 g

4 Nước cất 1000 mL 4 Nước cất 300 mL

1.2 Các bước pha môi trường (1000 mL)

Khoai tây → Rửa sạch → Gọt vỏ → Rửa sạch → Cân 200g → Xắc sợi → Cho vào Cốc chứa 1000 mL nước cất → Nấu 5 phút → Lược bằng vải lược → Lấy nước chiết (Bỏ cặn) → Cho vào bình tam giác đã chuẩn bị các hoá chất theo thành phần và khối

lượng đã xác định → Đậy kín bình tam giác bằng giấy bạc → Lắc đều → Đem hấp khử trùng ở 121 oC trong 30 phút

2 Môi trường thịt bò

2.1 Thành phần môi trường

1000 mL môi trường Ví dụ: 300 mL môi trường

2.2 Các bước pha môi trường (1000 mL)

Thịt bò nạc → Rửa sạch → Cân 250g → Xắc sợi → Cho vào Cốc chứa 1000 mL nước cất → nấu 5 phút → Lược bằng vải lược → Lấy nước chiết (Bỏ cặn) → Cho vào bình tam giác đã chuẩn bị các hoá chất theo thành phần và khối lượng đã xác định → Đậy kín bình tam giác bằng giấy lọc → Lắc đều → Đem hấp khử trùng ở

121oC trong 30 phút

3 Kết quả thực hiện:

13

BÀI 3 : PHÂN LẬP VI SINH VẬT

1 Chuẩn bị mẫu

- Thu nhập mẫu đất và mẫu nấm rơm

-Vệ sinh tủ cấy bằng cồn 70°, chiếu tia UV tủ cấy

-Môi trường khoai tây và môi tường thịt bò đã hấp khử trùng được làm tan chảy và

đổ vào đĩa petri vô trùng, chờ đông đặc lại

và thời gian thích hợp

2.2 Phân lập nấm

- Khử trùng mẫu : Mẫu nấm được gọt sạch bên ngoài vỏ  Khử trùng bằng cách ngâm trong chlorin 3% trong 5 phút  Rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần  Đưa mẫu nấm đã khử trùng vào không gian tủ cấy vô trùng  Chẻ đôi nấm và tách lấy phần lõi bên trong  Cắt nhỏ lõi thành các khối vuông với cạnh dài khoảng 2mm

- Tiến hành cấy mẫu lên môi trường khoai tây trong đĩa petri: Khử trùng không gia ngoài của đĩa petri bằng ngọn lửa đèn cồn  Mở nắp đĩa và dùng kẹp gắp 5 mẫu nấm cấy vào 5 vị trí trên mặt môi trường ( 4 góc đĩa và giữa đĩa ) Đậy nắp đĩa và khử trùng mặt ngoài của đĩa  Úp ngược đĩa  Ghi tên mẫu ,tên người thực hiện , ngày cấy vào mặt dưới của đĩa  Cho vào túi nilon buộc kín  Đem ủ ở nhiệt độ

và thời gian thích hợp

3 Kết quả thực hiên:

* Đối với vi khuẩn:

Ở các nồng độ đã trải trên đĩa petri đều có sự phát triển của vi khuẩn từ 10-1 đến 10-7

Có 4 loại khuẩn lạc phát triển trên đĩa cấy

Mô tả đặc điểm các loại khuẩn Lạc phát triển trên đĩa petri:

Nhận xét: Có 2 mẫu nấm bị nhiễm VSV do thực hiện không đúng nguyên tắc cấy,

nên mẫu bị nhiễm

17

BÀI 4 : CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT 1.Chuẩn bị mẫu

- Vệ sinh tủ cấy bằng cồn 70o, chiếu tia UV tủ cấy

- Môi trường khoai tây và môi trường thịt bò đã hấp khử trùng được làm tan chảy và

đổ vào đĩa petri vô trùng, chờ đong đặc lại

2 Phương pháp tiến hành

2.1 Cấy truyền vi khuẩn

Tiến hành cấy truyền 2 loại khuẩn lạc sang 2 đĩa khác nhau:

Khử trùng mặt ngoài đĩa petri chứa khuẩn lạc cần cấy truyền bằng ngọn lửa đèn cồn

 Làm nguội đầu que cấy  Lấy 1 ít sinh khối của khuẩn lạc đơn cấy truyền sang đĩa petri mới bằng phương pháp vạch trên bề mặt đĩa petri  Khử trùng mặt ngoài đĩa petri sau khi cấy xong  Úp ngược đĩa  Ghi chú tên mẫu, tên người thực hiện, ngày cấy vào mặt dưới của đĩa petri  Cho vào túi nilon buộc kính  Đem ủ ở nhiệt

3 Kết quả thực hiện:

* Đối với vi khuẩn:

Vi khuẩn có phát triển đường cấy Màu sắc khuẩn Lạc không giống với màu sắc khuẩn Lạc ban đầu Có nhiễm các VSV lạ

Mô tả đặc điểm của các khuẩn Lạc:

Khuẩn Lạc 1 Khuẩn Lạc 2 Khuẩn Lạc 3 Khuẩn Lạc 4

Đường

kính

*Nhận xét: Do đổ môi trường, do quá trình cấy, thao tác chưa chính xác, thao tác

lấy khuẩn Lạc lấy dính khuẩn Lạc khác nên mẫu bị nhiễm

* Đối với nấm:

Nhóm Tỷ lệ mẫu nấm phát triển

tốt (%)

Tỷ lệ mẫu nấm phát triển nhưng bị nhiễm VSV lạ (%)

Tỷ lệ mẫu nấm không phát triển (%)

*Nhận xét: Mẫu nấm có phát triển ở các vị trí đã cấy trên đĩa petri Màu sắc tơ

nấm giống với màu sắc tơ nấm ban đầu đã lấy ở đĩa phân lập Không bị nhiễm VSV lạ

Bài 5: Đếm Mật Số Tế Bào Vi Sinh Vật

1 Chuẩn bị mẫu

- Mẫu VSV được pha loãng bậc 10 liên tiếp nhiều lần để có độ pha loãng thích hợp ( Số tế bào VSV trong 1 ô vuông nhỏ từ 5-10 tế bào )

- Buồng đếm hồng cầu tráng bạc: là 1 phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành

3 khoảng ngang Khoảng cách giữa chia thành 2 khoảng nhỏ Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ 1 lưới đếm, gồm 25 ô vuông lớn Mỗi 1 ô vuông lớn lại được chia thành 16 ô vuông nhỏ, 1 ô vuông nhỏ có diện tích 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10 mm Như vậy thể tích của 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 Buồng đếm có lá kính để đậy

2 Phương pháp tiến hành

- Lắc đều ống nghiệm đã pha loãng mẫu

- Đậy lá kính lên lưới đếm

- Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho 1 giọt mẫu vào mép lá kính, do sức mao dẫn dung dịch mẫu sẽ dàn vào mặt trên lưới đếm

*Chú ý:

- Không để hình thành bọt khí trong lưới đếm

- Đặt lưới đếm lên bàn kính hiển vi và tiến hành đếm số tế bào VSV trong 5 ô vuông lớn (Trong 1 ô vuông lớn thì đếm lần lượt từ ô nhỏ 1 đến ô nhỏ 16) ở vật kính 40X

Hình 1: Lưới đếm ở vật kính 10X

A: Số tế bào VSV trong 1 mL mẫu (tb/mL)

a: Số tế bào đếm được trong 5 ô vuông lớn

b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (5x16 = 80 ô vuông nhỏ)

BÀI 6: NHUỘM TẾ BÀO VI SINH VẬT

1 Chuẩn bị mẫu

- Kính hiển vi, lame, thuốc nhuộm gram, cồn 96 0 ,…

- Mẫu VSV được phân lập thuần chủng

2 Phương pháp tiến hành

Lame được lau sạch (bằng cồn 96 0 ) Dùng micropipette lấy 1 giọt nước cất vô trùng cho lên lame Khử trùng đầu que cấy vòng trên ngọn lửa đèn cồn Làm nguội đầu que cấy Lấy 1 ít sinh khối ở khuẩn lạc đơn trong đĩa petri chứa VSV cần nhuộm

Tán đều mẫu vào giọt nước cất Hơ khô mẫu trên ngọn lửa đèn cồn để cố định

mẫu Nhỏ thuốc nhuộm tím crystal violet lên mẫu, giữ 1 phút Rửa mẫu bằng nước cất Hơ khô Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu, giữ 1 phút Rửa mẫu bằng

bằng cồn 96 o Rửa mẫu bằng nước cất Hơ khô Nhỏ thuốc nhuộm hồng

Safranin lên mẫu, giữ 1 phút Rửa mẫu bằng nước cất Hơ khô Nhỏ 1 giọt dầu xem kính (dầu soi) lên mẫu và đặt lên khay đựng mẫu của kính hiển vi Quan sát mẫu

ở vật kính 10X và 100X

3 Kết quả thực hiện

23

Vi khuẩn gram âm có màu hồng,có hình que (trực khuẩn)

*Nhận xét: Do quá trình thực hiện, khi lấy sinh khối ở khuẩn Lạc đơn quá dày nên khi

quan sát khó thấy VSV Nên chỉ thấy được Trực Khuẩn Gram Âm.