Bài báo cáo thực hành vi sinh vật trong thực phẩm bài 1 Định lượng tổng số vi khuẩn coliform trong thực phẩm

Nguyên tắc Đối với mẫu bánh mì là mẫu rắn - Cấy một lượng huyền phù ban đầu và các dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu vào các đĩa kép môi trường thạch VRBL.. * Cấy mẫu - Dùng

Trường Đại học Quy Nhơn Ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Thành viên nhóm:

Bùi Thị Thu Thảo

Nguyễn Thị Thu Hương

Lâm Vân Ánh

Đỗ Thị Thanh Thơ

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN COLIFORM TRONG THỰC

PHẨM – TCVN 6848 : 2007

1 Khái niệm vi khuẩn Coliform

Vi khuẩn Coliform là Vi khuẩn Gram âm hình que không có nội bào tử và là vi khuẩn di chuyển được hoặc không di chuyển được Chúng thường được sử dụng như là một chỉ số

về chất lượng vệ sinh của thực phẩm và nước Coliforms có thể được tìm thấy trong môi trường nước, trong đất và trên thảm thực vật; chúng có mặt phổ biến với số lượng lớn trong phân của động vật máu nóng

2 Phạm vi áp dụng

- Định lượng vi khuẩn phát triển và hình thành khuẩn lạc trong môi trường VRBL ở

370C ± 10C

- Áp dụng cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

3 Nguyên tắc

Đối với mẫu bánh mì là mẫu rắn

- Cấy một lượng huyền phù ban đầu và các dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu vào các đĩa kép môi trường thạch VRBL Sử dụng phương pháp đổ đĩa

- Các đĩa này được ủ ở 370C ± 10C trong 24h ± 2h rồi kiểm tra để phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc

- Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên g/mL mẫu

4 Thiết bị, dụng cụ

- Thiết bị

+ Tủ ấm 370C ± 10C

+ Tủ ấm 1700C ± 100C

+ Nồi hấp tiệt trùng 1210C ± 30C

+ Máy đo pH ± 0,10C (250C)

+ Bếp cách thủy 450C ± 10C

+ Máy dập mẫu

- Dụng cụ

+ Ống nghiệm, bình chai

+ Đĩa peptri đường kính 90mm

+ Pipet 1mL, micropipet 100 – 1000 µl

+ Kẹp, kéo, dao inox

+ Túi dập mẫu

5 Môi trường nuôi cấy, dịch pha loãng

* Môi trường nuôi cấy: Violet Red Bile Agar ( VRBL)

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym 7g

* Dịch pha loãng: Dung dịch muối pepton (SPW) – theo TCVN 6507 – 1 : 2019

- Pepton 1,0g

- Natri clorua (NaCl) 8,5g

- Nước cất 100ml

Hòa tan các thành phần trên trong 1 lít nước cất, chỉnh pH sao cho sau khi hấp pH đạt 7,0 ± 0,2 ở 250C

6 Chuẩn bị mẫu, cấy và ủ mẫu

* Chuẩn bị mẫu

Mẫu rắn (mẫu bánh mì): Cân 10g mẫu bánh mì, cân bổ sung SPW cho đến khi tổng lượng mẫu bánh mì và SPW được 100g, dập mẫu trong 2 phút -> 10-1 ( huyền phù ban

đầu), từ huyền phù ban đầu 10-1 pha loãng tiếp tục đến 10-2,…(nếu cần), sử dụng một đầu tip pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng

* Cấy mẫu

- Dùng pipet vô trùng 1mL huyền phù ban đầu vào 2 đĩa peptri vô trùng, lặp lại quy trình trên cho các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi

độ pha loãng

- Rót vào mỗi đĩa peptri khoảng 12ml – 15ml môi trường VRBL được làm nguội ở 44°C - 47°C trên nồi cách thủy

- Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa petri trên mặt phẳng nằm ngang

- Thời gian tính từ khi chuẩn bị dịch pha loãng 10-1 đến khi rót môi trường không được quá 45 phút

- Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa petri, để hỗn hợp đông đặc lại hoàn toàn

- Lật ngược các đĩa và để vào tủ ấm 30°C ± 1°C trong 72h ± 3h

7 Đếm khuẩn lạc và tính kết quả

* Đếm khuẩn lạc

Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch Chọn các điểm từ

10-300 khuẩn lạc

* Tính kết quả

Mẫu rắn: bánh mì

- Công thức chung: N = (CFU/g)

Trong đó: ΣΑ tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được giữ lại

d là độ pha loãng thứ nhất

V thể tích cấy ở mỗi độ pha loãng (ml) n1 và n2: số đĩa được giữ lại ở 2 nồng độ liên tiếp

- Nếu 2 đĩa của huyền phù có từ 1 – 3 khuẩn lạc: N < 4.1d (CFU/g)

Trong đó: d là hệ số pha loãng của huyền phù (10-1)

- Nếu 2 đĩa của huyền phù không chứa khuẩn lạc nào: N < 1d (CFU/g)

Trong đó: d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu (10-1)

* Kết quả thu được

Bánh mì A n1 n2 V d Coliform (CFU/g)

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

TCVN 4884-1:2015

1 Khái niệm vi khuẩn hiếu khí

- Vi sinh vật hiếu khí là những loại vi sinh sinh học cần lượng lớn không khí (cụ thể là oxy) để hô hấp và tạo điều kiện phản ứng phân hủy các chất hữu cơ hòa tan trong nước thải Cùng với tác dụng của O₂, vi sinh vật hiếu khí sẽ phân hủy các chất hữu cơ hòa tan thành CO₂ và H₂O, không tạo ra các chất trung gian gây mùi khó chịu Quá trình phân hủy trên cũng sinh ra năng lượng làm chất dinh dưỡng cho vi sinh vật tiếp tục sinh trưởng

và tăng sinh tế bào

2 Phạm vi áp dụng

- Định lượng vi khuẩn phát triển và hình thành khuẩn lạc trong môi trường PCA ở 30°C

± 1°C

- Trong thực tế, có thể áp dụng cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi,…

- Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi tiến hành định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí trên mẫu: bánh mì

3 Nguyên tắc

- Đối với mẫu bánh mì là mẫu rắn: Cấy một lượng huyền phù ban đầu và các dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu vào các đĩa kép môi trường thạch PCA

- Sử dụng phương pháp đổ đĩa

- Các đĩa này được ủ ở 30°C ± 1°C trong 72h ± 3h rồi kiểm tra để phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc

- Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên g/mL mẫu

4 Thiết bị, dụng cụ

* Thiết bị

Tủ ấm 30°C ± 1°C

Tủ sấy 170°C ± 10°C

Nồi hấp tiệt trùng 121°C ± 3°C

Máy đo pH ± 0,05 (25°C)

Bếp cách thủy 45°C ± 1°C

Máy dập mẫu

*Dụng cụ

Ống nghiệm, bình, chai

Đĩa petri đường kính 90 mm

Pipet 1mL, micropipet 100-1000µl

Kẹp, kéo, dao inox

Túi dập mẫu

5 Môi trường nuôi cấy, dịch pha loãng

* Môi trường nuôi cấy: plate count agar (PCA)

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 5,0g

* Dịch pha loãng: Dung dịch muối pepton (SPW) - theo TCVN 6507-1: 2019

Hòa tan các thành phần trên trong 1 lít nước cất, chỉnh pH sao cho sau khi hấp pH đạt 7,0 ± 0,2 ở 25°C

6 Chuẩn bị mẫu, cấy và ủ mẫu

* Chuẩn bị môi trường cấy:

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hòa chỉnh khô vào nước, đun nóng (nếu cần)

Phân phối vào các bình chai có dung tích phù hợp

Khử trùng trong nồi hấp áp lực ở 121°C trong 15 phút

Duy trì nhiệt độ từ 44°C đến 47°C trước khi sử dụng

Sử dụng môi trường thạch tan chảy càng sớm càng tốt, không nên để quá 4h

Bảo quản nơi tối ở nhiệt độ (5 ± 3)°C không quá 3 tháng

* Chuẩn bị mẫu

Mẫu bánh mì: Cân 10g mẫu bánh mì, cân bổ sung SPW cho đến khi tổng lượng mẫu

và SPW được 100g, dập mẫu trong 2 phút -> 10-1 (huyền phù ban đầu), từ huyền phù ban đầu 10-1 pha loãng tiếp tục đến 10-2,từ huyền phù ban đầu 10-2 pha loãng tiếp tục đến 10-3,

sử dụng một đầu tip pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng

* Cấy mẫu:

- Dùng pipet vô trùng hút 1mL huyền phù ban đầu vào 2 đĩa petri vô trùng, lặp lại qui

trình trên cho các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi

độ pha loãng

- Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 12mL - 15mL môi trường PCA được làm nguội ở

44°C - 47°C trên nồi cách thủy

- Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa petri trên mặt phẳng nằm ngang

- Thời gian tính từ khi chuẩn bị dịch pha loãng 10-1 đến khi rót môi trường không được quá 45 phút

- Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa petri, để hỗn hợp đông đặc lại hoàn toàn

- Lật ngược các đĩa và để vào tủ ấm 30°C ± 1°C trong 72h ± 3h

7 Đếm khuẩn lạc và tính kết quả

* Đếm khuẩn lạc

Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch Chọn các điểm từ

10-300 khuẩn lạc

* Tính kết quả

- Công thức chung: N= (CFU/g)

- Trong đó:

+ d là độ pha loãng thứ nhất

+ ∑A: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được giữ lại

+ V: thể tích cấy (mL); n1, n2: số đĩa được giữ lại ở 2 nồng độ liên tiếp

- Nếu 2 đĩa của huyền phù có từ 1 – 3 khuẩn lạc: N < 4x 1

d (CFU/g) Trong đó: d là hệ số pha loãng của huyền phù (10-1)

- Nếu 2 đĩa của huyền phù không chứa khuẩn lạc nào: N < 1d (CFU/g)

Trong đó: d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu (10-1)

* Kết quả thu được

(CFU/g)

10-2 12; 7

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN VÀ NẤM MỐC TRONG THỰC PHẨM -TCVN 8275 - 1: 2010 - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC TRONG CÁC SẢN PHẨM

CÓ HOẠT ĐỘ NƯỚC LỚN HƠN 0,95

1 Khái niệm nấm men và nấm mốc

- Nấm men: Nấm men là những tế bào có hình trụ, hình elip hoặc kéo dài Nấm men giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, vì chúng sinh ra enzyme xúc tác cho phản ứng sinh hóa áp dụng trong sản xuất: lên men bánh mì, sản xuất cồn,… Nấm men

có màu đỏ, cam, vàng, màu cà rốt

- Nấm mốc: Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, có thể mọc chìm hoặc nhô lên trên thực phẩm Một số nấm mốc là mong muốn vì chúng là sản phẩm làm tăng mùi vị của thực phẩm Nấm mốc thuộc họ nấm và là sinh vật đa bào Nấm mốc chứa sợi nấm, hoặc sợi giống như sợi, mọc trên bề mặt thực phẩm và đồ uống và nhân lên thông qua sinh sản sinh dưỡng

2 Phạm vi áp dụng

- Định lượng nấm men và nấm mốc phát triển và hình thành khuẩn lạc trên môi trường thạch DG18 ở 25°C ± 1°C

- Áp dụng cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

3 Nguyên tắc

- Cấy một lượng huyền phù ban đầu và dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu vào các đĩa môi trường thạch DRBC Sử dụng phương pháp cấy trang

- Các đĩa này được ủ ở 25oC ± 1oC trong 5 ngày rồi kiểm tra để phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc

- Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên g/mL mẫu

4 Thiết bị, dụng cụ

*Thiết bị:

- Tủ ấm 25oC ± 1oC

- Tủ sấy 170oC ± 10oC

- Nồi hấp tiệt trùng 121oC ± 3oC

- Máy đo pH ± 0,1oC (25oC)

- Bếp cách thủy 45oC ± 1oC

- Máy dập mẫu

* Dụng cụ:

- Ống nghiệm, bình chai

- Đĩa petri đường kính 90mm

- Pipet 1mL, micropipet 100-1000µl

- Kẹp, kéo, dao inox

- Túi dập mẫu

- Que cấy trang

5 Môi trường nuôi cấy, dịch pha loãng

* Môi trường nuôi cấy: Thạch dicloran glycerol 18% (DG18)

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzyme 5,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g

Dichioran(2,6-dicloro-4-nitroanilin) 0,002 g

Nước cất hoặc nước đá loại ion 100 ml

Tùy vào sức đông của thạch

Chuẩn bị:

- Hòa các thành phần trên vào nước và đun sôi để hòa tan hoàn toàn, trừ Chloramphenicol Chỉnh pH (6.4) sao cho sau khi khử trùng pH là 5,6 ± 0,2 ở 25oC, nếu cần

- Cho 10ml dung dịch Chloramphenicol 1% (nồng độ khối lượng) vào etanol và trộn Phân phối môi trường này với các lượng vào các vật chứa có dung tích thích hợp (6,5) Khử trùng 15min bằng hấp áp lực ở 121oC

- Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy (6.3) được duy trì từ 44oC đến 47oC Làm nguội đến dưới 50oC và phân phối các lượng 15ml vào các đĩa Petri vô trùng

- Để yên cho môi trường đông đặc và làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần), nếu cần

- Sử dụng ngay hoặc bảo quản nơi tối theo TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần) cho đến khi sử dụng

* Dịch pha loãng: Nước pepton 0,1% (PW0,1%) - theo TCVN 8275 - 1 : 2010

- Pepton 1,0g

- Nước cất 1000ml

Hòa tan các thành phần trên trong 1 lít nước cất, chỉnh pH sao cho sau khi hấp pH đạt 7,0 ± 0,2 ở 25oC, phân phối vào các bình và ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 9ml, hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút

6 Chuẩn bị mẫu, cấy và ủ mẫu

* Chuẩn bị mẫu:

Mẫu rắn (phở khô): Cân 10g mẫu, cân bổ sung PW0,1% cho đến khi tổng lượng mẫu

và PW0,1% được 100g, dập mẫu trong 2 phút -> 10-1 (huyền phù ban đầu), từ huyền phù ban đầu 10-1 pha loãng tiếp tục đến 10-2 , (nếu cần), sử dụng một đầu tip pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng

* Cấy mẫu:

- Dùng pipet vô trùng hút 1mL huyền phù ban đầu vào 3 đĩa DG18 đã hong khô bề mặt, lặp lại cho quy trình trên cho các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng

- Dùng que cấy trang dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt thạch cho đến khi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường

- Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên trong tủ ấm ở

25oC ± 1oC trong 5 ngày

7 Đếm khuẩn lạc và tính kết quả

* Đếm khuẩn lạc:

Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch Chọn các đĩa từ 10

-150 khuẩn lạc nấm men và nấm mốc

- Nấm men: KL trong, bóng hoặc mở, mép viền đều, bề mặt lồi, trắng đục

- Nấm mốc: Khuẩn lạc to, mọc lan, có lông tơ, nhiều màu sắc

* Tính kết quả

- Công thức chung:

(CFU/g) Trong đó: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các điểm được giữa lại

d là nồng độ pha loãng; V: thể tích cấy ở mỗi độ pha loãng (ml)

n1 và n2: Số lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng được giữ lại

- Nếu các đĩa của huyền phù ban đầu có từ 1 - 3 khuẩn lạc: N < 4.1d (CFU/g)

Trong đó: d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu (10-1)

- Nếu đĩa của huyền phù ban đầu không chứa khuẩn lạc nào: N < 1d (CFU/g)

Trong đó: d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu (10-1)

* Kết quả thu được

(CFU/g)

10-1 43; 73; 14

10-2 15; 7; 9