Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm bài 1 môi trường sinh dưỡng – các phương pháp gieo cấy

Dụng cụ thí nghiệm − Mẫu vi sinh vật hiếu khí: nước tương bần − Môi trường phân lập vi sinh vật hiếu khí: môi trường Czapek trên hộp petri thay đường saccharose bằng tinh bột tan − Mẫu v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT THỰC PHẨM

(Mã học phần BF3501)

Giảng viên hướng dẫn: Trần Liên Hà

Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hường

- Biết cách gieo cấy vi sinh vật trên các môi trường lỏng và đặc (thạch agar)bằng các cách khác nhau (ống đứng, ống nghiêng, hộp petri)

II Vật liệu, phương pháp tiến hành

- Cân đo chính xác khối lượng các chất để cho vào môi trường theo công thứccho 1l dung dịch như sau:

● Các chất khối lượng nhỏ hơn cho vào trước, chất khối lượng lớn cho vào sau

● Vừa pha chế vừa khuấy đều cho các chất tan hết trong nước trước khi chochất khác vào

- Đổ lượng nước còn lại từ ống đong vào bình tam giác trên

b) Phân phối môi trường:

- Lấy khoảng 50ml môi trường vừa pha chế phân phối vào 4 ống nghiệm sạch(PTN đã chuẩn bị) và nút đầu ống nghiệm lại bằng bông (rót qua phễu sạch)

→ thu được các ống nghiệm chứa môi trường lỏng

● Nút bông khi nút vào đầu ống nghiệm sau khoảng 1 – 1,5cm

- Còn lại 200ml môi trường, bổ sung 2% agar (= 4g agar)

- Sau khi cho agar vào, tiến hành đun nóng trên bếp và khuấy đều đến khi agartan hết (xuất hiện các bọt khí sủi trên bề mặt).

- Tắt bếp và phân phối môi trường vào 8 ống nghiệm còn lại (PTN đã chuẩn bị)qua phễu thủy tinh và nút lại bằng bông

Lưu ý:

● Rót nhanh để tránh môi trường bị đông khi nguội

● Tránh môi trường dính vào miệng dụng cụ hoặc nút bông

● Đối với môi trường thạch đứng: lượng môi trường rót vào ống nghiệmkhông vượt quá 1/3 thể tích ống nghiệm

● Đối với môi trường thạch nghiêng: lượng môi trường rót vào ống nghiệmkhông vượt quá ¼ thể tích ống nghiệm

- Phần môi trường còn lại trong bình cốc có mỏ (khoảng 50ml) đổ vào bình tamgiác và nút lại bằng bông

- Bọc kín đầu các ống nghiệm bằng báo và đem thanh trùng bằng phương pháp

áp suất hơi bão hòa ở nhiệt độ 110 oC trong 30 phút

c) Thanh trùng môi trường bằng hơi nước bão hòa áp suất ở 110℃ trong 30 phút:

- Nguyên tắc: Dựa trên khả năng tăng nhiệt độ sôi của các chất lỏng khi áp suấttăng Người ta gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn

áp suất khí quyển Khi áp suất tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo Người takhống chế nhiệt độ thanh trùng thông qua điều khiển áp suất

- Cách vận hành nồi hấp áp lực:

+ Kiểm tra mức nước của thiết bị thông qua mức nước ở ống thủy, khoảng từ1/3 đến ½ poongas thủy Nếu thiếu phải bổ sung nước Nước thêm vào phải lànước mềm như nước cất, nước ngưng hoặc nước đã loại bỏ bớt phần cứng bằngcách đun sôi để nguội

+ Đặt môi trường, vật cần thanh trùng vào nồi trong sao cho nút bông hướngvào giữa nồi Lưu ý vật liệu cần thanh trùng chỉ chiếm 2/3 thể tích

+ Khi kim áp kế đạt chế độ khử trùng thì bắt đầu tính thời gian và duy trì chế

độ này suốt thời gian thanh trùng

+ Sau thời gian khử trùng ngắt cầu giao điện, chờ kim áp kế trở về 0, mởvan ,xả đáy và chờ nhiệt độ thiết bị hạ xuống khoảng 70 rồi mở lắp thiết bị và℃ rồi mở lắp thiết bị vàlấy vật liệu đã khử trùng ra

* Lưu ý:

+ kiểm tra mức nước trước khi vận hành thiết bị

+ tuyệt đối không mở nắp thiết bị khi kim áp kế chưa về 0

- Ưu điểm: Nhiệt độ thanh trùng không làm biến tính các sản phẩm có bên trong,tốn ít thời gian hiệu quả thanh trùng tương đối triệt để Trong phòng thí nghiệmtường kết hợp phương pháp này với phương pháp tyndal để thanh trùng các môitrường dinh dưỡng

- Nhược điểm: không tiêu diệt được các tế bào sinh bào tử

d) Tạo môi trường thạch nghiêng và phân phối môi trường vào hộp peptri:

- Tạo môi trường thạch nghiêng: đặt nghiêng các ống nghiệm để làm môi trườngthạch nghiêng sao cho lượng môi trường cách nút bông tối thiểu 2cm; đợi môitrường nguội → thu được môi trường thạch nghiêng

- Phân phối môi trường vào hộp peptri: tay thuận cầm bình tam giác, tay khôngthuận cầm hộp peptri → dùng ngón trỏ hé mở nắp hộp → mở nút bông bình tamgiác (chú ý chờ nhiệt độ gần hạ về nhiệt độ đông đặc mới bắt đầu rót để tránh tối

đa lượng hơi nước bốc hơi bám trên nắp hộp) → rót từ từ một lượng môi trườngvào hộp → nắp hộp lại, đồng thời nút bông bình tam giác lại → gõ nhẹ hộp chomôi trường dàn đều trong hộp

Lưu ý: lượng môi trường trong hộp dày khoảng 2 – 3mm.

2 Gieo cấy vi sinh vật lên môi trường

Tiến hành gieo cấy vi sinh vật trên cả 4 loại môi trường: thạch đứng, thạch nghiêng, môitrường lỏng và hộp peptri

- Sử dụng gieo cấy vi sinh vật bằng 3 loại que cấy:

Que cấy

nhọn

thường dùngcấy kiểu hìnhchữ chỉ, cấyđường songsong,…

Que cấy

vòng thường dùngcho môi

trường thạchđứng (cấyđâm xuyên)

Que cấy

móc thường dùngcho cấy chấm

Lấy vi sinh vật từ canh trường thuần khiết

- Tiến hành cấy vi sinh vật vào các môi trường như sau:

Hơ đỏ đầu que cấy, lướt nhẹ phần thân trên ngọn lửa đèn cồn trước khi lấy vi sinh vật.Lưu ý khi lấy vi sinh vật phải đợi que cấy nguội bớt mới tiến hành lấy

● Môi trường thạch đứng:

+ Thạch đứng dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí tùy tiện hoặc vi sinh vật hiếukhí (đối với vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, các dụng cụ nuôi cấy và các kỹ thuật nuôicấy đặc biệt cần được sử dụng), vi sinh vật kỵ khí có xu hướng phát triển ở đáysâu của lớp thạch, vi sinh vật hiếu khí phát triển trên bề mặt thạch, nơi có oxykhuếch tán nhiều hơn

+ Thạch đứng cũng được sử dụng để xác định khả năng di chuyển của vi sinh vậtcần nghiên cứu Vi sinh vật không có khả năng di động có xu hướng phát triểnngay ở đường cấy thẳng đứng Vi sinh vật có khả năng di chuyển (nhờ có tiênmao) có xu hướng phát triển từ đường cấy thẳng đứng ra phía thành ống nghiệm.+ Sử dụng que cấy thẳng lấy canh trường rồi đưa vào ống nghiệm chứa môi trườngthạch đứng vô trùng, tại vị trí trung tâm của mặt thạch, rồi đâm sâu xuống đáy ốngnghiệm bằng động tác dứt khoát rồi rút nhanh que cấy khỏi ống nghiệm

● Môi trường thạch nghiêng:

+ Thạch nghiêng thường được sử dụng để lưu giữ vi sinh vật trong thời gian dài dothạch nghiêng có lớp thạch dày và bề mặt bay hơi thấp, hơi nước thất thoát trongquá trình bảo quản lâu dài ít hơn so với canh trường trong hộp Petri

+ Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, que cấy vòng hoặc que cấy thẳng cóthể được sử dụng, đưa que cấy có sinh khối vi sinh vật từ canh trường giống xuốngđáy thạch nghiêng, dịch chuyển que cấy dần trên mặt thạch đến khi cách phầnthạch ở gần miệng ống nghiệm khoảng 0.5 – 1 cm Khi cấy, đưa que cấy theođường zigzag dày để canh trường sau đó phủ kín mặt thạch, hoặc có thể theođường thẳng, hoặc những đường song song Phương pháp cấy này được gọi là cấytheo vết cấy cạn dần

● Môi trường hộp peptri:

+ Từ đặc sang đặc:

Cấy chấm điểm: dùng que cấy móc lấy mẫu vi sinh vật (thao tác tương tự) → dùngtay không thuận mở nắp hộp, tay thuận cầm que cấy → chấm que cấy lên bề mặtmôi trường trong hộp → rút que cấy ra đậy nắp hộp lại

Cấy chữ chỉ hoặc đường song song: dùng que cấy vòng lấy mẫu vi sinh vật (các

thao tác còn lại tiến hành tương tự) Lưu ý: chỉ cấy trên bề mặt môi trường, khôngđâm sâu que cấy vào môi trường

+ Từ lỏng sang đặc: Dùng que trang, khi cấy từ canh trường lỏng sang môi trường

thạch trong hộp Petri, dùng pipette hút một lượng canh trường (50 – 100 µl) lênmặt thạch, rồi dùng que trang vô trùng dàn đều đến khi mặt thạch se lại

III Kết quả và thảo luận

1 Kết quả

Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng

Cấy trên thạch hộp

2 Thảo luận

- Tạo được môi trường dinh dưỡng theo đúng yêu cầu (môi trường Czapek)

- Biết thực hiện cơ bản thao tác cấy tuy nhiên vẫn còn chưa thành thạo

- Trong quá trình thí nghiệm còn xảy ra một số sai sót như:

+ Quên không hơ đầu ống nghiệm mỗi khi mở hoặc đóng nút bông

+ Thao tác cầm hộp petri còn ngượng

+ Khoảng cách vượt quá 20cm so với ngọn lửa đèn cồn

+ Lượng môi trường khi đổ vào petri hộp dày, hộp mỏng

⇨ Cách khắc phục: thực hiện thao tác nhiều lần

BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT

− Thực hành cấy vi khuẩn trên bề mặt thạch bằng que trang

II Phương pháp nghiên cứu

− Với vi sinh vật hiếu khí: sử sụng phương pháp phân lập nuôi cấy trên môi trường chọn lọc chứa tinh bột

− Với vi sinh vật kị khí: sẽ làm que

− với việc phân lập vi sinh vật yếm khí tùy tiện, sử dụng phương pháp đổ thạch 2 lớp để nuôi cấy

+ Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, thao tác dễ thực hiện

+ Nhược điểm: Chỉ sử dụng cho các vi sinh vật yếm khí không bắt buộc và các vi sinh vật có thể chịu được nhiệt độ 50-55oC

III Dụng cụ thí nghiệm và cách thức tiến hành

1 Dụng cụ thí nghiệm

− Mẫu vi sinh vật hiếu khí: nước tương bần

− Môi trường phân lập vi sinh vật hiếu khí: môi trường Czapek trên hộp petri thay đường saccharose bằng tinh bột tan

− Mẫu vi sinh vật kị khí: Lactobacillus trong Probiotic

− Môi trường phân lập vi sinh vật kỵ khí: môi trường MRS

2.1 Phân lập vi sinh vật hiếu khí

a Chuẩn bị môi trường

* Pha nước muối sinh lý 0,9% (dùng cho cả phân lập vi sinh vật kỵ khí)

− Cân 9g NaCl cho vào 1 cốc dung tích 1000ml

− Định mức đến 1000ml rồi chia ra 7 bình tam giác (99ml) và 7 ống falcon (40

ml) bọc lại đem thanh trùng

* Chuẩn bị môi trường Czapek trên hộp petri thay đường Sacharose bằng tinh bột tan (120ml)

− Đong 120ml nước cất vào ống đong cỡ 500ml

− Cho vào bình tam giác đã sấy khô, nút kín bằng bông 1/3 lượng nước ở ống đong trên Cân đong, hòa tan từ các chất có khối lượng nhỏ hơn đến các chất

có khối lượng lớn hơn theo công thức như sau:

● Các chất khối lượng nhỏ hơn cho vào trước, chất khối lượng lớn cho vào sau.

● Vừa pha chế vừa khuấy đều cho các chất tan hết trong nước trước khi chochất khác vào

− Đổ lượng nước còn lại từ ống đong vào bình tam giác trên

− Đặt lên bếp đun, dùng đũa thủy tinh khuấy đều liên tục cho tới khi sôi nhẹ đểthạch nóng chảy và quyện với hóa chất khác

− Bọc kín đầu bình và đem thanh trùng bằng phương pháp áp suất hơi bão hòa ở nhiệt độ 110 oC trong 30 phút

b Phân lập vi sinh vật hiếu khí

− Pha loãng dung dịch mẫu

+ Lấy 1ml nước tương bần cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 99ml nước

muối sinh lý 0,9%, ta thu được dung dịch pha loãng 10-2, lắc đều

+ Tiến hành pha loãng tiếp bằng cách cho 0,9ml nước muối sinh lý vào 4 ống

Eppendorf, sau đó lấy 0,1 ml dung dịch từ bình tam giác cho vào ống Eppendorf đầu tiên sau đó Votex để thu được dung dịch pha loãng 10-3, đánh dấu ống

+ Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-3 cho vào 1 ống Eppendorf đang chứa nước muối sinh lý, Votex đều thu được dung dịch pha loãng 10-4, đánhdấu ống

+ Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-4 cho vào ống Eppendorf đang chứa nước muối sinh lý, Votex đều thu được dung dịch pha loãng 10-5, đánhdấu ống

+ Lấy 0,1ml dung dịch từ ống pha loãng 10-5 cho vào ống Eppendorf đang chứa nước muối sinh lý, Votex đều thu được dung dịch pha loãng 10-6, đánhdấu ống.

− Phân lập vi sinh vật bằng nuôi cấy trên môi trường đặc

+ Sử dụng 3 hộp petri đã vô trùng và có chứa sẵn môi trường dinh dưỡng để

tiến hành nuôi cấy

+ Dùng pipet lấy 0,1 ml dung dịch từ ống Eppendorf 10-4 cho vào hộp petri, sau đó dung que trang đã vô trùng để trang đều phần dịch mẫu vi sinh vật lên đầu khắp mặt thạch, vừa trang vừa xoay hộp petri

+ Sau khi thấy dung dịch mẫu đã được ria đều khắp mặt thạch để hộp petri

này sang 1 bên

+ Làm tương tự với các mẫu pha loãng 10-5, 10-6

+ Sau khi cấy xong 3 hộp petri này xong, lật ngược lại ghi nồng độ dung dịch

10-4, 10-5, 10-6 ở dưới đáy hộp

+ Rồi bọc kín lại bằng giấy báo, ghi tên mẫu, nhóm và ngày nuôi cấy lại, cho

lên tủ cấy vi sinh vật, sau 2 hôm tới xem kết quả nuôi cấy

❖ Lưu ý khi phân lập vi sinh vật hiếu khí:

+ Pha loãng dung dịch mẫu đến 1 nồng độ nhất định để đảm bảo lượng vi

sinh vật là ít nhất khi lấy mẫu để nuôi cấy

+ Tất cả quá trình nuôi cấy phải đặt gần ngọn lửa đèn cồn để vô trùng

+ Hộp petri khi cấy không được cầm lên mà phải để trên mặt bàn, mở hé chú

không được mở toang ra

+ Phải đặt ngược hộp petri khi nuôi cấy trong tủ nuôi

+ Mẫu là nước tương bần đặc nên rất khó lấy, cần phải cắt to phần đầu côn,

thao tác nhanh dứt khoát

+ Sau các thao tác phân lập ở trên sẽ thu được canh trường tập trung chứa cácchủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột ; để thu được canh trường thuần khiết cần tiến hành thêm bước cấy tách riêng từng khuẩn lạc vi sinh vật quan tâm trên môi trường riêng và tiến hành kiểm tra độ thuần khiết

+ Trong quá trình phân lập để hướng tới thu riêng từng loại vi sinh vật như vi khuẩn, hoặc nấm có thể bổ sung kháng sinh để ức chế các loài không quan tâm : bổ sung cycloheximide ức chế nấm ; bổ sung tetracycline ức chế vi khuẩn.

2.2 Phân lập vi sinh vật kị khí

a Chuẩn bị môi trường

* Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật kị khí: MRS Agar

− Chuẩn bị 1 bình tam giác

− Chuẩn bị 1 bình tam giác

− Cân mỗi bình 0,9g agar

− Đổ nước cất định mức đến 60ml

− Bọc kín đầu bình và đem thanh trùng theo phương pháp áp suất hơi bão hòa ở nhiệt độ 110 oC trong 30 phút

b Phân lập vi sinh vật kị khí

− Pha loãng dung dịch mẫu:

+ Chuẩn bị 8 ống Eppendorf chứa 9ml nước muối sinh lý 0,9% để trên giá + Lấy 0,1 ml dung dịch mẫu Probiotic cho vào ống Eppendorf đầu tiên, sau

đó Votex ta được mẫu pha loãng 10-1, đánh dấu ống

+ Lấy 0,1 ml dung dịch của ống 10-1 cho vào ống Eppendorf, sau đó đem Votex đều ta thu được mẫu ph loãng 10-2, đánh dấu ống

+ Tiếp tục làm như vậy đến khi làm xong ống pha loãng 10-8

− Phân lâp vi sinh vật kị khí

+ Chuẩn bị 3 hộp petri đã vô trùng chứa môi trường MRS + Lấy 0,1 ml dịch mẫu từ ống Eppendorf 10-8 cho vào hộp Petri, dùng que trang đã vô trùng ria đều dung dịch mẫu ra khắp mặt thạch, vừa trang vừa xoay hộp petri

+ Sau khi làm xong với hộp petri 10-8, để hộp này sang 1 bên thao tác tương

tự với 2 hộp petri 10-7 và 10-6

− Đổ thạch lớp thạch trên cùng:

+ Mở hé nắp hộp petri sau đó đổ dịch thạch đã chuẩn bị sẵn, sau đó nghiêng

hộp petri để thạch dàn đều khắp bề mặt hộp petri

+ Làm tương tự với 2 hộp petri còn lại + Đợi thạch đông lại, sau đó lật ngược hộp petri ghi nồng độ 10-8, 10-7, 10-6

vào dưới đáy hộp petri

+ Gói lại bằng giấy, ghi tên nhóm, mẫu và ngày nuôi cấy sau đó để lên tủ

nuôi, đợi 2 hôm sau đến xem kết quả

❖ Lưu ý khi phân lập vi sinh vật kị khí

+ Phải thao tác thật nhanh tránh để nhiễm oxi vào+ Đổ thạch sau khi thạch đã thanh trùng, nhiệt độ thạch vào khoảng 50-55oC+ Phải đợi thạch đông hoàng toàn mới lật ngược hộp petri

III Kết quả và thảo luận:

1 Phân lập vi sinh vật hiếu khí

● Mẫu 10 -2

3 Phân lập vi sinh vật kị khí

● Mẫu 10 -5

Mặt sau

- Ta thu được các khuẩn lạc có kích thước (từ 0,4 -0,6 cm), màu khác nhau (nâu đen, vàng) có hình dạng khác nhau (hình cầu, hình thoi, và có khuẩn lạc không xácđịnh), mép nhăn 🡺 nhiều loại khuẩn lạc có trong mẫu Lớp thạch bị tạo bọt khí

- Thu được 1 vài khuẩn lạc có kích thước nhỏ, màu vàng đục, có hình dạng không xác định Xuất hiện 1 vài vi sinh vật là, có thể là bị nhiễm khuẩn trong quá trình thao tác

⮚ Nhận xét về kết quả thí nghiệm

+ Có mẫu phân lập ở nồng độ 10-7 không có khuẩn lạc nào, có thể trong nồng

độ pha loãng hoặc đã sai xót trong quá trình tiến hành gieo cấy

+ Ở hộp peptri cho canh trường có nồng độ càng lớn thì xuất hiện càng nhiều khuẩn lạc; do nồng độ cao, số lượng vi sinh vật sẽ nhiều hơn nên sẽ tạo được nhiều khuẩn lạc hơn

3 Thảo luận về các sai lầm khi tiến hành quá trình thí nghiệm

− Thao tác chưa nhanh, chưa dứt khoát, chưa chuẩn xác theo yêu cầu

− Không cẩn thẩn làm vỡ thạch môi trường trong quá trình nuôi cấy

− Làm xa phần vô trùng của ngọn lửa đèn cồn

− Thao tác dùng pipet chưa chuẩn gây nên sai số khi hút dung dịch

− Ngày quan sát vi sinh vật cách ngày nuôi cấy là 3 ngày nên vi sinh vật phát triển quá nhanh không thể quan sát được sự phân tách khuẩn lạc

− Que chang có thể bị nhiễm tạp trong quá trình cấy do để ngoài không khí hoặc tay

cầm xờ phải

5 Các chú ý khi thực hiện tránh mắc lại các sai lầm

− Cấy vi sinh vật nhanh chóng, tránh tiếp xúc quá nhiều với môi trường không khí

− Thao tác gần ngọn lửa đèn cồn chuẩn xác.

− Quan sát sau 2 ngày nuôi cấy vi sinh vật

− Phải đợi lớp vi sinh vật cấy lên môi trường khô mới đổ lớp thạch lên Thao tác lâu

có thể chứa oxy ở trong lớp thạch

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

I Mục đích thí nghiệm

- Xác định số lượng khuẩn lạc, từ đó xác định được số lượng tế bào vi sinh vật cótrong vật phẩm nghiên cứu: mẫu đất, nước và không khí bằng phương pháp giántiếp

II Vật liệu và phương pháp

1 Vật liệu

- Mẫu nghiên cứu cần xác định hàm lượng vi sinh vật ở trạng thái: rắn, lỏng và khí

- Môi trường nuôi cấy: môi trường phổ dụng TSA

- NaCl

- Bình tam giác, micropipette 1 mL, 100 µL

- Ống Eppendorf 1.5 mL, đầu tip 1 mL, 100 µL vô trùng

- Que trang

2 Các phương pháp định lượng vi sinh vật.

- Định lượng vi sinh vật: là xác định số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiêncứu

- Trong bài thí nghiệm này ta chủ yếu tìm hiểu và thực hành phương pháp địnhlượng gián tiếp

a) Định lượng trực tiếp.

- Định lượng trực tiếp: là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật cótrên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu

+ Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng.

+Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm nhữ vậy ta đếm cả những tế bào đã chết

trước lúc làm tiêu bản

⮚ Các phương pháp định lượng trực tiếp:

+ Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tếbào có kích thước lớn như nấm men, bào tử nấm mốc

+ Phương pháp Brit: phương pháp này dùng để định lượng vi sinh vật có trong sữahay một số vật phẩm lỏng

+ Phương pháp Vinogratxki – Sungina: Phương pháp này thường dùng để địnhlượng vi sinh vật trong đất hay vật phẩm đặc, rắn

b) Định lượng gián tiếp

⮚ Định lượng gián tiếp là những phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieocấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường thức ăn thích hợp,nuôi trong 36 - 48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong mộtđơn vị vật phẩm ban đầu

+ Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn + Nhược điểm:

o Tốn thời gian, công sức

o Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy sốkhuẩn lạc chênh nhau 10 lần; vì thế để kết quả kiểm tra vi sinh vật có giá trị sosánh tốt nên sử dụng một độ pha loãng thống nhất đối với từng loại vật phẩm

o Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từngchuỗi, từng đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, mỗi chuỗi, mỗikhối đó chỉ tạo thành một khuẩn lạc

Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật có trongvật phẩm nghiên cứu

o Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vậtcùng phát triển

⮚ Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch

Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp

petri, nuôi ở nhiệt độ thích hợp Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả

III Tiến hành thí nghiệm

1 Chuẩn bị thí nghiệm

a) Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng.

Mỗi nhóm cần chuẩn bị 8 đĩa thạch để nuôi cấy vi sinh vật (mẫu không khí 2 đĩa, mẫu đất

3 đĩa, mẫu nước 3 đĩa) cần 56 hộp petri cho 7 nhóm, mỗi đĩa đổ 12-15ml môi trường

pha 750ml môi trường

Dùng bình tam giác 250ml, mỗi bình chỉ yêu cầu chứa khoảng 150ml môi trường cần 5

bình tam giác

Trong thí nghiệm này ta sử dụng môi trường phổ dụng TSA

Thành phần môi trường:

- Chuẩn bị 1 cốc dung tích 1000ml để pha 750ml môi trường

- Dùng ống đong đong 750ml nước cất, đổ vào cốc trên 250ml nước cất

- Cân 22,5g TSA bằng cân phân tích

- Đổ nước cất định mức đến 750ml

- Đặt lên bếp đun, dùng đũa thủy tinh khuấy đều liên tục cho tới khi sôi nhẹ đểthạch nóng chảy và quyện với hóa chất khác

- Phân phối môi trường vào các bình tam giác 250ml, mỗi bình 150ml môi trường

- Bọc kín đầu bình và đem thanh trùng bằng phương pháp áp suất hơi bão hòa ởnhiệt độ 110 oC trong 30 phút

- Sau khi thanh trùng, phân phối môi trường vào hộp petri, để nguội và chuẩn bịnuôi cấy vi sinh vật.

Yêu cầu: thao tác phân phối môi trường vào hộp petri gần ngọn lửa đèn cồn để hạn chế

tối đa sự nhiễm tạp của vi sinh vật từ môi trường xung quanh Đậy kín nắp hộp để giữmôi trường vô trùng

b) Pha nước muối sinh lý 0,9%

Yêu cầu: mỗi nhóm cần 99ml/bình tam giác x 2 bình + 40ml ống falcon ≈ 250ml

7 nhóm x 250ml/nhóm = 1750ml thì pha bằng 2 cốc dung tích 1000ml (mỗi cốc 900ml)

Cách pha: cân 8,1g NaCl hòa tan hoàn tan vào mỗi cốc có dung tích 1000ml trên, định

mức đến thể tích 900ml

Chia đều ra cốc cho mỗi nhóm 250ml dd NaCl 0,9%

- 2 bình tam giác, mỗi bình chứa 99ml dd NaCl 0,9%

- 1 ống falcon chứa 40ml dd NaCl 0,9%

Nước muối pha được khử trùng, đậy kín, làm nguội để chuẩn bị làm thí nghiệm

2 Nuôi cấy vi sinh vật

- Mẫu đất

Cân 1g mẫu đất, nghiền nhỏ, đều bằng cối đã được vô trùng, cho vào bình tam giác chứa99ml nước muối sinh lý (đã chuẩn bị trước đó) Lắc đều để tách các vi sinh vật có trongmẫu rời nhau

- Mẫu nước

Dùng pipet hút 1ml mẫu nước cho vào bình tam giác chứa 99ml nước muối sinh lý (đãchuẩn bị trước), lắc đều

Thao tác trên cũng chính là pha loãng mẫu 10-2

❖ Pha loãng đến các nồng độ tiếp theo (cách này áp dụng với cả 2 mẫu trên):

+ Lấy ống Eppendorf đã được vô trùng (đựng trong các cốc có bọc kín) xếp lên kệ.Các thao tác cần được làm quanh ngọn lửa đèn cồn để hạn chế tối đa vi sinh vậtnhiễm tạp

Dùng pipet hút 0,9ml dd NaCl 0,9% trong ống falcon cho vào mỗi ống Eppendorf

Trong thí nghiệm này, ta pha loãng đến 10-5 🡺 chuẩn bị 3 ống Eppendorf

+ Pha loãng 10-3: dùng pipet hút 0,1ml mẫu đã pha loãng 10-2 cho vào ốngEppendorf đã bổ sung 0,9ml nước muối, đậy kín nắp ống Eppendorf rồi lắc đềubằng máy lắc rung Vortex

+ Thao tác lặp lại tương tự với mẫu pha loãng:

o Với mẫu đất, pha loãng đến 10-4, 10-5, 10-6

o Với mẫu nước, pha loãng đến 10-4, 10-5, 10-6

Sau khi pha loãng mẫu, tiến hành gieo cấy vi sinh vật vào môi trường

+ Dùng pipet hút khoảng 0.1ml cho vào hộp thạch

+ Khử trùng que trang trên ngọn lửa đèn cồn, làm nguội và tiến hành trang đềumẫu trên bề mặt thạch cho đến khi mẫu được trải đều, cảm giác có độ dít khi trang

🡺 tách riêng biệt các tế bào vi sinh vật

+ Đậy kín, ghi đầy đủ thông tin, bọc và được đem đi nuôi ở điều kiện thích hợp

- Mẫu không khí

Phương pháp lắng của Omelianxki

Nguyên tắc: theo phương pháp lắng của Omelianxki ước tính trên một diện tích rộng 100

cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với lượng vi sinh vật

có trong 10 lít không khí

Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất thường dùng.

Nhược điểm: Không thật chính xác vì dựa trên cách ước tính.

Cách tiến hành:

- Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu

Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp và để vào

tủ ấm Sau 24 – 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc

- Tính toán: Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (πD2/4), rồi suy ra lượng vi sinh vật trong 1 lít hay 1m3 không khí theo ước tính của Omelianxki

🡺 Nuôi vi sinh vật ở điều kiện thích hợp trong khoảng 24 - 48 tiếng Theo nguyên tắcmỗi tế bào riêng biệt sẽ phát triển thành 1 khuẩn lạc riêng rẽ Đếm khuẩn lạc, tính toán ta

sẽ xác định được lượng vi sinh vật có trong mẫu thí nghiệm

IV Kết quả thí nghiệm, tính toán và nhận xét

Đối với 2 mẫu pha loãng (mẫu đất và mẫu nước) tiêu chuẩn kết quả: đĩa thạch có chứa từ30-300 khuẩn lạc (khoảng có ý nghĩa)

Nếu có 2-3 đĩa cho kết quả có nghĩa thì ta vẫn tính lượng vi sinh vật trong mẫu theo từngđĩa và lấy kết quả trung bình

✔ Ở mẫu pha loãng 10-4 đếm được: 8 Khuẩn lạc

✔ Ở mẫu pha loãng 10-3 đếm được: 31 khuẩn lạc

- Vì số khuẩn lạc có ý nghĩa nằm trong khoảng từ 30 -300 khuẩn lạc nên chỉ có mẫupha loãng 10-3 là nằm trong khoảng này

⇨ Mật độ tế bào có trong 1g mẫu đất là:

N = 31

0,1× 10−3 = 31.104 (CFU/g)

Nhận xét:

- Trên bề mặt mỗi hộp peptri có số lượng các khuẩn lạc riêng rẽ lớn nhỏ khác

nhau giảm dần theo chiều giảm dần của nồng độ

- Ở mẫu 10-5 có khuẩn lạc có kích thước từ 1-2 cm, màu trắng đục, viền tròn,

bề mặt phát triển bằng phẳng

- Ở các mẫu còn lại, các khuẩn lạc trắng đục có kích thước chấm nhỏ li ti, bề

mặt bằng phẳng.

� Theo như quan sát, số lượng khuẩn lạc ở mẫu đất không đều, thậm chí ở 2 nồng

độ 10-5, 10-4 quá ít khuẩn lạc, và số khuẩn lạc đang ngang bằng nhau

✔ Ở mẫu pha loãng 10-5 đếm được: 2 khuẩn lạc

✔ Ở mẫu pha loãng 10-4 đếm được: 3 khuẩn lạc

✔ Ở mẫu pha loãng 10-3 đếm được: 30 khuẩn lạc

- Vì số khuẩn lạc có ý nghĩa nằm trong khoảng từ 30 -300 khuẩn lạc nên chỉ có mẫupha loãng 10-3 là nằm trong khoảng này

⇨ Mật độ tế bào có trong 1ml mẫu nước là:

N = 30

0,1× 10−3= 30.104 (CFU/ml)

🡺 Nhận xét: có hai mẫu pha loãng 10-5, 10-4 không đạt yêu cầu, các khuẩn lạc phát triển

ít, thưa thớt, tách riêng được các khuẩn lạc Theo hình vẽ ta thấy:

+ có loại có kích thước nhỏ khoảng 1-2mm, màu trắng đục, giống như những chấm nhỏ li

ti, bề mặt bằng phẳng

+ có loại có kích thước 0,5-1cm, màu vàng , viền đều, bề mặt phát triển bằng phẳng

🡺 Theo như quan sát, số lượng khuẩn lạc ở mẫu nước thì không đều, thậm chí ở 2 nồng

độ 10-5, 10-6 quá ít khuẩn lạc, phát triển không đồng đều

🡺 Nguyên nhân:

- Đối với mẫu đất và nước độ pha loãng cao nên các khuẩn lạc phát triển khôngmạnh mẽ

- Lượng mẫu nuôi cấy vào môi trường nhỏ

- Do thao tác thí nghiệm: không trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt môi trường dinhdưỡng

- Khuẩn lạc ít hay nhiều có thể do trong quá trình lắc bình tam giác và ốngeppendorf không đều nên vi khuẩn phân bố trong ống không đều

3 Mẫu không khí

- Vị trí lấy mẫu: trên bàn sau cửa ra vào của phòng thí nghiệm (C4-401)

- Nhận xét:

Ước tính: hộp petri có diện tích 64cm2, sau 1 giờ sẽ có một lượng vi sinh vật lắngxuống bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít không khí.

Trong thí nghiệm lần này, ta để thời gian vi sinh vật lắng xuống trong 5 phút

lượng vi sinh vật trong 0,5 lít không khí = 500ml không khí

Mẫu 1: 8 khuẩn lạc

Mẫu 2: 7 khuẩn lạc

🡺 Trên một diện tích S=64cm2 có khoảng 7-8 khuẩn lạc

Vậy trên một diện tích 100 cm2 có khoảng 11-12 khuẩn lạc

� Trong 10l không khí có khoảng 11-12 khuẩn lạc

� Trong 1l không khí có khoảng 1-2 khuẩn lạc

4 Thảo luận

- Số mẫu nước, mẫu đất phát triển không mạnh mẽ, số khuẩn lạc không nằm trong

khoảng có nghĩa (30 -300 khuẩn lạc)

- Mẫu không khí có nhiều vi sinh vật => không khí trong PTN không sạch

⇨ Về cơ bản, nhóm không đạt được yêu cầu

⇨ Cách khắc phục: Cần chú ý thực hiện các thao tác trong phòng thí nghiệm nhiều

hơn để rèn luyện

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – PHƯƠNG PHÁP

MPN (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) (MPN – MOST PROBABLE NUMBER)

Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên

I Mục đích thí nghiệm

- Hiểu và nắm được phương pháp, thao tác của định lượng vi sinh gián tiếp bằng phương pháp MPN

- Xác định được lượng vi khuẩn coliform có trong mẫu nước tự nhiên

II Vật liệu và phương pháp

1 Vật liệu

- Mẫu vật nghiên cứu: nước Hồ Tiền

- Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30ml

- Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60ml

- Cốc thủy tinh dung tích 250ml

2.1 Cơ sở lý thuyết

Nước tự nhiên (sông, hồ) là môi trường sống của nhiều loài sinh vật Nước tự nhiên

có thể bị ô nhiễm phân bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó có việc tiếp nhận nướcthải sinh hoạt chưa qua xử lý Để đánh giá sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên, cần xác định sự có mặt của VSV chỉ thị

❖ Coliform được xem là VSV chỉ thị ô nhiễm phân do các nguyên nhân sau:

- Thường có mặt trong môi trường nước tự nhiên Môi trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường ruột của động vật máu nóng, kể cả con người

- Có khả năng sống lâu trong môi trường nước tự nhiên hơn các loài VSV khác

có nguồn gốc từ đường ruột

- Đa số các chủng Coliform không phải VSV gây bệnh

- Việc phát hiện chúng bằng kĩ thuật nuôi cấy khá đơn giản Colifrom là nhóm các vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, không sinh bào tử, có khả năng lên men lactose sinh acid và giải phóng khí ở 30℃ sau 48h

❖ Việc xác định sự có mặt của Coliform trong mẫu nước phải trải qua 3 thí nghiệm:

- Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose

để xác định sự có mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose sinh acid và khí sau 48h ở nhiệt độ 30℃

- Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính ở

thí nghiệm giả định được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vikhuẩn Gram âm để xác nhận việc lên men sinh khí không phải do vi khuẩn Gram dương (đối với những loài có khả năng lên men sinh khí)

- Thí nghiệm hoàn thành (completed test): các khuẩn lạc phát triển trên môi

trường ở thí nghiệm xác nhận được kiểm tra đặc tính hình thái kĩ hơn để xác định chúng có phải vi khuẩn Gram âm, hình que và không sinh bảo tử (đặc đi

m của vi khuẩn Colifrom)

Phương pháp MPN: xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào

việc cấy mẫu nước có thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào 3 -5 ống chứa môi trường dinh dưỡng chứa lactose Số lượng ống có kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng thống kê tiêu chuẩn sau:

Bảng 1: Giá trị MPN trên 100ml nước và giới hạn độ tin cậy 95% khi bộ ba ống được cấy với 10ml, 1ml và 0,1ml mẫu nước.

Số lượng ống cho kết quả dương tính

MPN/100ml

Giới hạn MPN ở độ tin cậy 95%

3 ống cấy

10ml

3 ống cấy 1ml

2.2 Nội dung thí nghiệm

❖ Chuẩn bị mẫu và môi trường

- Mẫu nước: nước Hồ Tiền

- Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: pha theo công thức với tổng thể tích 250ml cho cả lớp, mỗi nhóm sẽ lấy 30ml mẫu

- Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: mỗi nhóm pha theo công thức từ môi trường lỏng lactose kép với tổng thể tích 500ml cho cả lớp, mỗi nhóm sẽ lấy 60ml mẫu

- Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong quá trình lên men lactose

Bảng 2 Thành phần môi trường cho 1000ml

Cao thịt bò 6g 3g

❖ Phân phối môi trường

Môi trường được phân phối vào từng nhóm ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp ngược theo bảng sau:

Tổ hợp ống Môi trường Thể tích phân phối Số lượng ống

Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu nước vào các tổ hợp ống chứa môi trường lactozo

❖ Kiểm tra kết quả và xác định mật độ vi khuẩn coliform trong mẫu nước:

− Sau 48 ± 2 giờ, kiểm tra số lượng các ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống Các ống được coi là dương tính nếu ít nhất 3 mm khí được quan sát trong ống Durham.Ghi lại số lượng ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống, ta có bộ gồm 3 số Ví dụ: nếu số ống dương tính trong tổ hợp F1 là 3, tổ hợp ống F2 là 2 và tổ hợp ống F3 là

2, ta có bộ ba số 3-2-2

− Đối chiếu bộ số này với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn sau đây, giá trị MPN trên

100 mL nước sẽ được xác định Nếu mẫu nước được pha loãng trước khi cấy mẫu,giá trị MPN của mẫu nước thu thập sẽ được tính toán dựa vào hệ số pha loãng ban đầu

III Kết quả và thảo luận

1 Kết quả

+ Giới hạn MPN ở độ tin cậy 95% có mức dưới 150 và mức trên 4800

+ Và giá trị MPN ở mức tin cậy được

2 Thảo luận

- Bài này xác định lên men bằng cách lactose sinh axit và khí

- Môi trường chỉ thị: yếu tố lên men lactose kết hợp với ống Durham

- Áp dụng định lượng vi sinh vật không có khả năng phát triển tốt trong môi trường thạch, nếu có thì tốn nhiều thời gian

- Phương pháp làm trong PTN chỉ là giả định để kiểm tra xem có trong mẫu nước kiểm tra có vi khuẩn lên men lactose hay không? Để chứng minh chắc chắn có sự hiện diện của