thực tập vi sinh học đại cương bài 1 môi trường dinh dưỡng phương pháp khử trùng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINHKHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

THỰC TẬP

VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNGBiên soạn: Th.S Nguyễn Minh Hiền

Người viết báo cáoTên: Nguyễn Hữu Lực

Lớp: DH21DD Mssv: 21129742

Nhóm lý thuyết: 24 T7 tiết 4; Nhóm thực hành: 24-02Nhóm viết báo cáo: 06

NỘI DUNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNGGIỚI THIỆU CHUNG

1 Giáo trình phục vụ môn học

SV có thể sử dụng bất kỳ giáo trình nào về Thực hành Vi sinh đại cương

2 Nội dung học

Các thiết bị trong PTN Vi sinh, chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, phương pháp khử trùng Phân lập, cấy chuyền VSV

Làm tiêu bản, quan sát tế bào VSV

Đếm tế bào men bằng buồng đếm hồng cầu Khảo sát 1 số phản ứng sinh hoá của vi khuẩn

3 Yêu cầu của GV với SV

Yêu cầu kiến thức: Chuẩn bị bài trước khi đến phòng thí nghiệm GV sẽ kiểm tra bài, nếu bất kỳ SV nào trong nhóm không chuẩn bị bài, cả nhóm sẽ bị nghỉ buổi học đó và không được dạy và học lại.

Sau khi kết thúc môn học, SV có 5 -10 ngày để viết báo cáo Nộp bài cho 1 bạn (có chỉ định) trong nhóm Bài báo cáo ghi rõ họ tên, nhóm, tổ Bài báo cáo SV có thể đánh máy hoặc viết tay.

Yêu cầu kỹ năng: quan sát GV thực hiện thao tác và làm đúng các yêu cầu khi thực hiện thao tác nuôi cấy VSV, làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi (KHV)

Yêu cầu thái độ: nghiêm túc, nhanh nhẹn, thực hiện đúng quy định trong PTN và các yêu cầu của GV Tham gia tích cực trả lời câu hỏi của GV cũng như đặt câu hỏi trong buổi học

BÀI 1:

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG

1.1.Các thiết bị trong PTN Vi sinh

Sinh viên quan sát và tìm hiểu Sau đó, liệt kê đầy đủ thông tin vào Bảng 1.

Bảng 1 Một số thiết bị trong PTN vi sinh

1 Máy đếm khuẩn lạc Dùng để đếm các khuẩn lạc trên đĩa

2 Bếp khuấy từ Dùng để trộn chất lỏng, chủ yếu để khuấy hỗn hợp chất lỏng có độ nhớt thấp

3 Nồi hấp tiệt trùng Dùng để khử trùng, tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm 4 Tủ ủ Dùng để ủ, nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ mong muốn

5 Tủ sấy Dùng để sấy khô, hoặc khử trùng dụng cụ thí nghiệm

6 Máy ly tâm Dùng để phân tách hỗn hợp có khối lượng riêng khác nhau, thu sinh khối

Kính hiển vi Dùng để quan sát ví sinh vật, nấm men, nấm mốc

8 Cân phân tích Dùng để cân hóa chất, môi trường

9 Buồn đếm hồng cầu Xác điṇh số lượng của các nhóm VSV có kích thước lớn như nấm men, nấm mốc đếm trực tiếp trên kính hiển vi Không sử dụng để đếm vi khuẩn

10 Máy đồng nhất mẫu Giúp nghiền, đồng hóa những loại mẫu đến dung dịch huyền phù, có kích thước rất nhỏ

1.2.Môi trường nuôi cấy VSV1.2.1 Khái niệm:

- Là hỗn hợp các chất dinh dưỡng cần thiết, và có pH phù hợp cần cho sự sinh trưởng và phát

triển của các vi sinh vật

1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV

- Đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết - Độ pH thích hợp

- Độ nhớt nhất định - Hoàn toàn vô trùng

- Không chứa các yếu tố độc hại

1.2.3 Phân loại

1.2.3.1 Phân loại môi trường theo thành phần

- Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên Thành phần hoá học của

loại môi trường không được xác định chính xác do sự không ổn định của sản phẩm tự nhiên VD: Môi trường mạch nha, Luria-Bertani, thịt agar (MEA),…

- Môi trường tổng hợp: chứa các chất hoá học mà thành phần của chúng được xác định và

định lượng một cách cụ thể và chính xác.

VD: MacConkey (MAC), Tryptic Soy Agar (TSA), Gause,…

- Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hoá học lẫn các sản phẩm tự nhiên.

VD: Môi trường BHI, Môi trường TSB, Môi trường Nutrient Agar,…

1.2.3.2 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lý

- Môi trường rắn: môi trường này chứa 1,5– 2% agar hoặc 10– 20% gelatin Môi trường

này được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật.

VD: Hektoen Enteric Agar (HE), Sabouraud Dextrose Agar, Lowenstein-Jensen (LJ),…

- Môi trường bán rắn: chỉ chứa 0,3– 0,7% agar

VD: Blood Agar, Tryptic Soy Agar (TSA), Cystine Tryptic Agar (CTA),…

- Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được sử dụng để

nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật.

VD: Sabouraud Dextrose Broth (SDB), Tryptic Soy Broth (TSB), Thioglycollate,…

1.2.3.3 Phân loại môi trường theo công dụng

- Môi trường cơ bản: là một môi trường đơn giản chứa các thành phần cơ bản cần thiết và

phù hợp với hầu hết các vi sinh vật.

VD: Nutrient Broth, Luria-Bertani (LB), Sabouraud Dextrose,…

- Môi trường tăng sinh: là một loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật, được sử dụng để tăng tốc

quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật bổ sung các yếu tố bổ sung như các loại chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng,…

VD: Tryptic Soy Broth (TSB), YPD (Yeast extract-Peptone-Dextrose), Brain Heart Infusion (BHI),…

- Môi trường chọn lọc: là loại môi trường được sử dụng cho từng nhóm vi sinh vật riêng biệt.

VD: Eosin Methyene Blue, Ashby, Baird-Parker,…

- Môi trường phân biệt: Sử dụng trong việc giám định, phân biệt hai hoặc nhiều loại vi

khuẩn cùng sinh trưởng trên một môi trường dựa vào tính chất hóa sinh của sinh vật VD: Blood Agar, Mannitol Agar, Eosin Methylene Blue,…

1.2.4 Công thức môi trường

Ví dụ: Môi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng để nuôi cấy men, mốc

Các thông tin có trong công thức môi trường (GV chỉ định loại môi trường)

-Tên môi trường: KIA (Kligler Iron Agar)

-Công dụng: Môi trường KIA thường được sử dụng để xác định khả năng chuyển hóa đường lactose và glucose, cũng như khả năng sản xuất khí.

- Final pH: 7,4

-Chế độ khử trùng: 121 ℃ /15’/ 0.1 Mpa -Thành phần hóa học:

Beef extract 3gm/l Yeast extract 3gm/l Peptone 15gm/l Proteose peptone 5gm/l Lactose 10gm/l Glucose 1gm/l

Ferrous sulfate 0,2gm/l Sodium chloride 5gm/l Sodium thiosulfat 0,3gm/l Phenol red 0,024gm/l Agar 12gm/l

1.2.5 Các bước để nấu môi trường (GV hướng dẫn cách làm)

Bước 1: Cân môi trường vào giấy bạc 7×7

Bước 2: Cho môi trường vào buồng chứa ( nước), ( cho môi trường vào trước cho nước vào

sau có tác dụng làm tan một phần môi trường có sẵn trong bình), nước có thể tráng môi trường trên giấy bạc

TH1: Cho môi trong trong ống nghiệm

Ca/cốc thuỳ tinh /nhựa-> hoà tan hoàn toàn môi trường-> phân phối vào ống nghiệm->Nồi hấp tiệt trùng

TH2:Cho môi trong trên đĩa

Bình sholt, bình có nắp đậy-> Nồi hấp tiệt trùng (tránh vón cục)-> Phân phối ra đĩa Dung tích tối đa có thể cho vào trong ống nghiệm là 2/3

1.3 Phương pháp khử trùng

1.3.1 Khử trùng môi trường

Bảng 2 Khử trùng môi trường bằng phương pháp nhiệt ẩm, lọc, tia U.V,…Phương phápNhiệt độ/ thời gianNguyên lý tiêu diệt VSV

Ánh sáng tia cực tím có khả năng phá huỷ DNA của vi sinh vật và ngăn chặn vi sinh vật phát triển tiếp theo.

1.3.2 Khử trùng dụng cụ

Dụng cụ thuỷ tinh: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ), nhiệt khô ( tủ sấy ) Dụng cụ nhựa: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ).

Khử trùng PTN: phun hơi độc, đèn UV, fomon

2.1 Kết quả thực hành

Các hình ảnh về minh chứng em xin phép để ở trang cuối

(hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng)

Môi trường……… Môi trường……… Môi trường………

2.1.3 Phương pháp phân lập (GV hướng dẫn thao tác) VSVDụng cụMôi trườngPhương pháp Vi khuẩn Đĩa petri, nồi hấp

VSVDụng cụMôi trườngPhương pháp

Nấm mốc mẫu được chuẩn

2.2.3 Phương pháp cấy chuyền (GV hướng dẫn thao tác)

Nấm men Que cấy vòng hoặc thẳng

-Hơ kỹ que cấy đến nóng đỏ vài phút, mở nút xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.

- Làm nguội que cấy bằng cách áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội Nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống Hơ nóng miệng ống nghiệm

- Đầu que cấy giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn.

+Thạch đứng: sử dụng que cấy thẳng đưa vuông góc

xuống cách đáy 1cm ( để kiểm tra chức năng di chuyển của vi khuẩn vết cấy sẽ lan xuống

+Thạch nghiêng sâu: dùng que cấy thẳng, đưa vuông

góc xuống phần thấp hơn cách 1cm để kiểm tra tính di chuyển của vi khuẩn, phần cao hơn cấy ziczac để giữ giống

+Thạch nghiêng: sử dụng que cấy vòng, cấy zikzak

trên bề mặt nghiêng

+Đĩa: sử dụng que cấy vòng chia đáy đĩa ra 4 phần, cấy

ziczac phần 1 -> hơ que cấy-> gióng cấy các đường song song qua p2->hơ que cấy-> gióng và cấy các đường song song qua p3-> hơ que cấy->p4 cấy zikzak nhưng ít đường hơn p1 Đường cấy của các phần ko

Các hình ảnh về minh chứng em xin phép để ở trang cuối

(hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng)

Cấy phân lập……… Cấy chuyền……… Cấy chuyền………

Dòng thuần, không bị tạp nhiễm, vi sinh vật còn non,… Yêu cầu thời gian đọc kết quả: Sau khoảng24h nuôi cấy

3.3 Một số phản ứng sinh hóa cơ bản

Mục đíchThành phần môi trườngKết quả - giải thích – hình minh chứng

Giúp phân biệt các loài bacillus đường ruột.

-Tên môi trường: Kligler Iron Agar (KIA)

- pH : 7.4 +/- 0.2 ở 25ºC -Chỉ thị màu: Phenol Red -Đặc điểm đổi màu:

-Trường hợp không lên men được đường glucose, lactose thì sản phẩm có màu đỏ

-Trường hợp chỉ lên men glucose, chỉ thị phenol red chuyển từ đỏ sang vàng (dưới vàng phía trên sẽ đỏ)

-Trường hợp lên men lactose sau khi sử dụng hết glucose, tạo sản phẩm có tính acid, nên vẫn giữ pH ở mức thấp thạch sẽ có màu vàng hết.

-Trường hợp có sinh khí biến dưỡng acid amin, tạo NH3 thạch sẽ có thêm những khoảng khí và có thể bị nứt-Trường hợp xuất hiện thêm vật chất màu đen là do H2S sinh ra từ thiosulfid

Mục đíchThành phần môi trườngKết quả - giải thích – hình minh chứng

Môi trường nuôi

-Vi khuẩn đường ruột Clostridium difficile: Thường gây ra một mảng màu vàng đặc trưng trên bề mặt môi trường SCA.

-Vi khuẩn đường ruột Bacteroides fragilis: Thường dẫn đến một mảng màu đen hoặc xám trên bề mặt môi trường SCA.

-Vi khuẩn đường ruột Lactobacillus : Thường không dẫn đến bất kỳ thay đổi màu sắc nào trên môi trường SCA Nhóm 6 bọn em làm vi khuẩn E.coli và không có hiện tượng màu sắc nào Vết cấy đã có vi khuẩn phát triển.

-Tên môi trường: Plate Count Agar ( PCA)

Cả 4 phần đều phát triển trong môi trường nhừng số vi khuẩn giảm dần trên từng phần

BÀI 4:

LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT

4.1 Quan sát đại thể

Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi

Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên môi trường phân lập chọn lọc giúp dự đoán được đó là VSV nào (phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm người quan sát)

Mô tả khuẩn lạc VSV đã phân lập ở Bài 2:

Các hình ảnh về minh chứng em xin phép để ở trang cuối

(hình ảnh minh chứng)

Khuẩn lạc của nấm men Trên môi trường PCA …

Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi (KHV) để thấy được:

Màu sắc,hình dạng, mọc lồi hay lõm, phần rìa láng bóng hay hình răng cưa, cách sắp xếp đôi hay đơn.

4.2.1 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn Mục đích:

Phương pháp nhuộm đơn: thường áp dụng cho nấm men Khi sử dụng phương pháp này để nhuộm màu vi khuẩn thì lúc quan sát KHV sẽ chỉ thấy được: hình dạng, cách sắp xếp, kích thước tế bào

Cách tiến hành:

Bước 1: Ghi tên Vi sinh vât Làm vết bôi

-Hơ kỹ que cấy đến nóng đỏ vài phút, mở nút xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.

- Làm nguội que cấy bằng cách áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội Nhúng que cấy vào môi trường lỏng lấy mẫu, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống Hơ nóng miệng ống nghiệm Giữ que cấy bên ngọn lửa đèn cồn trong bán kính khoảng 5cm

Bước 2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đèn cồn đảo tay qua lại đến khi vết bôi khô Mục

đích cố định vết bôi:

+ Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm

+ Gắn chặt VSV trên lame + Giúp VSV không bị trôi khi rửa nước

Bước 3: Nhuộm màu (sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant violet, Fuschin,

Xanh metylen, Xanh coton ) Nhỏ thuốc nhuộm vào vết bôi đã cố định, để 1 phút, rửa nước

Bước 4: Quan sát tiêu bản dưới KHV Khi thực hiện thao tác, sử dụng thuốc nhuộm màu gì

thì tế bào sẽ bắt màu đó.

4.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép (GV hướng dẫn thao tác)Mục đích:

Có thể quan sát được hình dạng, cách sắp xếp, kích thước tế bào, và phân biệt được vi khuẩn gram âm và gram dương

Cách tiến hành:

Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi

-Hơ kỹ que cấy đến nóng đỏ vài phút, mở nút xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.

- Làm nguội que cấy bằng cách áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội Nhúng que cấy vào môi trường lỏng lấy mẫu, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống Hơ nóng miệng ống nghiệm Giữ que cấy bên ngọn lửa đèn cồn trong bán kính khoảng 5cm Bước 2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đèn cồn đảo tay qua lại đến khi vết bôi khô Mục đích cố định vết bôi:

+ Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm

+ Gắn chặt VSV trên lame + Giúp VSV không bị trôi khi rửa nước Bước 3: Nhuộm màu

Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet) Để 1 phút Rửa nước Nhỏ Lugol Để 1 phút Rửa nước Tấy cồn Rửa nước

Nhỏ thuốc nhuộm Safranin Để 30 giây Rửa nước Bước 4: Quan sát KHV vật kính 10 (vật kính đầu).

4.2.3 Làm tiêu bản bằng phương pháp giọt épMục đích:

+) Đăc điểm của sơi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn +) Đăc sinh sản điểm của cơ quan sinh sản: hình dang, cách sắp xếp các bô ̣phân của cơ quan

+) Hình dang, cấu taọ , cách sắp xếp của bào tử.

Cách tiến hành:

B1: Dùng môt phiến kính khô và sạch đăt lên cầu rửa trong châu rửa.

B2: Dùng pipet hoăc que cấy lấy lên phiến kính một giot dịch huyền phù VSV B3: Đậy lá kính nhẹ ̣nhàng trên giot dịch huyền phù VSV, tránh tạo bọt khí B4: Thấm nhẹ ̣lớp dịch trào ra xung quanh lá kính bằng giấy thấm

B5: Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi Nếu cần soi ở hệ ̣kính dầu thì nhỏ lên lá kính một giọt dầu.

4.2.4 Làm tiêu bản bằng phương pháp giọt épMục đích:

+) Đăc điểm của sơi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn +) Đăc sinh sản điểm của cơ quan sinh sản: hình dang, cách sắp xếp các bô ̣phân của cơ quan

+) Hình dang, cấu taọ , cách sắp xếp của bào tử.

Cách tiến hành:

B1: Dùng môt phiến kính khô và sạch đăt lên cầu rửa trong châu rửa.

B2: Dùng pipet hoăc que cấy lấy lên phiến kính một giot dịch huyền phù VSV B3: Đậy lá kính nhẹ ̣nhàng trên giot dịch huyền phù VSV, tránh tạo bọt khí B4: Thấm nhẹ ̣lớp dịch trào ra xung quanh lá kính bằng giấy thấm

B5: Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi Nếu cần soi ở hệ ̣kính dầu thì nhỏ lên lá kính một giọt dầu

+ Màu sắc tế bào (nếu là vi khuẩn phải ghi rõ đó là vi khuẩn Gram (+) hay Gram (-)

Các hình ảnh về minh chứng em xin phép để ở trang cuối

(hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng) (hình ảnh minh chứng)

4.4.1 Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát kính hiển vi ở vật kính 100?

Vì dầu soi kính hiển vi là dầu trong suốt, có chỉ số khúc xạ cao, nên nó hỗ trợ làm tăng độ phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh khi quan sát rõ nét hơn.

4.4.2 Giải thích cơ chế bắt của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

Vi khuẩn Gram dương và Gram âm có cấu tạo vách tế bào khác nhau, do đó khi thực hiện nhuộm thì chúng sẽ bắt màu các thuốc nhuộm khác nhau

+ Vi khuẩn Gram (+): có màu tím + Vi khuẩn Gram (-): có màu hồng.

- Với vi khuẩn Gram dương: chúng có lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng lưới có khả năng bắt màu tím của thuốc nhuộm tím gentian tinh thể Cũng vì lớp vách dày nên việc tẩy cồn sẽ khó khăn hơn do đó vi khuẩn giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím Gentian - Với vi khuẩn Gram âm: lớp vách peptidoglycan mỏng hơn và nó có thêm lớp màng

lipopolysaccharide phía ngoài, khi tẩy cồn cồn hòa tan lớp màng và do lớp vách mỏng bị cồn tẩy dễ dàng nên nó không giữ được màu tím của thuốc nhuộm mà sẽ bắt màu thuốc nhuộm sau

4.4.3 So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép

Giống nhau

Đều phải cố định vết bôi rồi mới nhuộm để quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi.

Khác nhauvề quy trình

Chỉ cần nhuộm màu 1 lần (sử dụng một trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant violet,.V: Violet, iodine/Lugol

Phải nhuộm màu 2 lần Đầu tiên nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet) Sau đó nhỏ Lugol.Nhuộm them 1 lần nữa bằng thuốc