KÍNH HIỂN VI
Tóm tắt lý thuyết
Kính hiển vi là một dụng cụ quang học thiết yếu để quan sát các vật thể nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được Độ phóng đại của kính hiển vi được tính bằng cách nhân độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính.
2.1 Các bộ phận quang học:
Các bộ phận quang học bao gồm: thị kính, vật kính, bộ phận tụ quang, nguồn sáng
- Vật kính : quyết định khả năng nhìn rõ mẫu vật Trên thị kính có khắc độ phóng đại của vật kính (x4, x10, x40 và x100)
Vật kính x100 thường sử dụng với dầu soi kính
- Thị kính : gắn ở đầu trên của ống kính
Thị kính có cấu tạo đơn giản hơn vật kính Trên thị kính có độ phóng đại x5, x6, x10 hoặc x15
Bộ phận tụ quang là một thành phần quan trọng trong hệ thống quang học, giúp điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua Tụ quang tập trung các tia sáng và hướng chúng vào tiêu bản cần quan sát Vị trí của tụ quang nằm giữa gương và bàn để tiêu bản, cho phép người dùng dễ dàng điều chỉnh độ chiếu sáng bằng cách di chuyển tụ quang lên xuống.
- Nguồn sáng : Nguồn sáng được sử dụng là đèn hoặc gương
2.2 Các bộ phận cơ học:
Các bộ phận cơ học: ốc thứ cấp, vi cấp, thân kính, bàn kính cùng thước kẹp tiêu bản, ống kính, đầu xoay, ốc chỉnh tụ quang
- Ốc thứ cấp (núm điều chỉnh thô), vi cấp (núm điều chỉnh tinh): giúp người sử dụng chủ động điều chỉnh khi quan sát
Ốc chỉnh tụ quang bao gồm núm điều chỉnh giúp nâng hạ tụ quang và núm điều chỉnh độ tập trung ánh sáng, hỗ trợ tối ưu hóa việc tập trung ánh sáng cho các nhu cầu sử dụng khác nhau.
Hình 1.1 Cấu tạo kính hiển vi
Thân kính hiển vi sinh học có cấu tạo cong, trong khi đó kính soi nổi có thân thẳng Bộ phận này được thiết kế cố định, giúp tăng cường độ chắc chắn của kính trong quá trình sử dụng.
- Bàn tiêu bản: là vị trí đặt vật mẫu Vị trí này cố định giúp quá trình thực hiện theo dõi hình ảnh vật mẫu trở nên dễ dàng
- Kẹp tiêu bản giúp kẹp giữ vật mẫu hỗ trợ trong việc thao tác chủ động nhất
3 Sử dụng kính hiển vi: Để bảo vệ kính hiển vi và tiêu bản, khi dùng kính phải thận trọng, vặn ốc phải từ từ, nhẹ nhàng và tiến hành theo thứ tự sau:
- Cắm điện, bật công tắc Nhìn vào thị kính để điều chỉnh nguồn sáng điện chiếu để ánh sáng đều thị trường
- Quan sát mẫu vật với thị kính có độ phóng đại nhỏ trước (x4 hoặc x10)
- Đặt tiêu bản lên bàn nâng và kẹp vào kẹp tiêu bản để cố định tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng tâm nguồn sáng
Khi quan sát tiêu bản (lame), hãy vặn nhẹ ốc thứ cấp cho đến khi đầu vật kính gần chạm vào tiêu bản hoặc dừng lại khi kính hiển vi đã chạm vào bộ phận cản an toàn.
Nhìn qua thị kính và điều chỉnh nhẹ ốc thứ cấp cho đến khi hình ảnh mẫu vật trở nên rõ nét Nếu hình ảnh vẫn chưa rõ, hãy nhẹ nhàng điều chỉnh ốc vi cấp cho đến khi đạt được độ rõ mong muốn.
Để xem ở độ phóng đại lớn hơn, bạn cần đặt phần muốn quan sát vào giữa thị trường Sau đó, hãy nhìn vào lame và vặn đầu xoay để chuyển đến vật kính lớn hơn (x40), đảm bảo không chạm vào lame Cuối cùng, điều chỉnh ốc vi cấp cho đến khi hình ảnh trở nên rõ nét.
Sinh viên cần kiên nhẫn khi sử dụng kính hiển vi quang học, thực hiện các động tác một cách nhẹ nhàng và không tự ý tháo rời các bộ phận hoặc bật, tắt công tắc làm cháy bóng đèn Sau khi sử dụng, cần vệ sinh kính sạch sẽ, tắt điện và sắp xếp kính hiển vi đúng chỗ, ngay ngắn.
- Khi quan sát cần nhấp nháy ốc vi cấp thường xuyên để thấy được đầy đủ các mặt phẳng khác nhau của tiêu bản
Ốc vi cấp có khả năng chuyển động linh hoạt cả hai chiều Khi gặp tình trạng kẹt trong quá trình vặn, bạn nên dừng lại và vặn theo chiều ngược lại Tránh việc sử dụng sức mạnh để tiếp tục vặn, vì điều này có thể gây hỏng hóc cho bộ phận Để điều chỉnh một cách hiệu quả, bạn có thể nâng hoặc hạ bàn nâng cho phù hợp trước khi tiếp tục chỉnh bằng ốc vi cấp.
Hình ảnh quan sát qua kính hiển vi luôn hiển thị ngược chiều với vật thể Để xem đúng chiều, cần đặt lame mang tiêu bản theo hướng ngược lại với chiều mong muốn Tương tự, có thể điều chỉnh vị trí của kẹp tiêu bản theo chiều ngược lại với hướng cần quan sát.
Để vẽ hình hiệu quả, hãy sử dụng cả hai mắt để quan sát Mắt trái nên nhìn vào kính, trong khi mắt phải nhìn vào giấy vẽ bên phải kính; nếu bạn thuận tay trái, có thể thực hiện ngược lại Điều này giúp bạn vừa quan sát vừa vẽ mà không cần nhắm một mắt.
- Nên chia vị trí trên thị trường giống như đồng hồ để dễ theo dõi
- Sử dụng độ phóng đại càng lớn, nguồn sáng càng cần nhiều
4 Bảo quản kính hiển vi: Kính hiển vi phải được bảo quản ở nhiệt độ mát và khô ráo
Cần đậy kỹ để tránh bụi bám vào vật kính và thị kính.
Vật liệu và hóa chất
Bảng 1.1 Vật liệu và hóa chất cần dùng
Vật liệu tươi Hóa chất
Củ hành tím Dung dịch Thuốc thử Lugol
Khoai tây Dung dịch NaCl 8%
Phương pháp thực hiện thí nghiệm
1 Phương pháp thí nghiệm chung:
- Cắm điện, bật công tắc Nhìn vào thị kính để điều chỉnh nguồn sáng sao cho ánh sáng chiếu đều trên thị trường
- Đặt vật kính có độ phóng đại nhỏ trước (x4 hoặc x10)
- Đặt lên lame một giọt nước hoặc một giọt glycerine
- Đặt mẫu vật cần quan sát vào giọt nước/glycerine
- Quan sát dưới vật kính lần lượt x4, x10 và x40
2 Thực hành trên từng mẫu vật:
2.1 Tế bào động vật: Tế bào biểu mô miệng
Sử dụng tăm tre sạch để nhẹ nhàng cạo lên niêm mạc miệng, sau đó nhúng đầu tăm vào một giọt Lugol trên một lam sạch Đậy lamelle và quan sát mẫu dưới kính hiển vi với vật kính x10 và x40.
Sử dụng dao lam để tách một vài mảnh biểu bì từ củ hành tím và ngâm chúng trong nước Chọn một số mảnh mỏng, đặt chúng lên lam kính với một giọt nước, sau đó đậy lamelle lại và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x10 và x40.
- Dùng giấy thấm rút nước dưới lamelle, nhỏ 1 - 2 giọt NaCl 8% vào cạnh của lamelle Qua kính hiển vi, quan sát hiện tượng xảy ra trên mảnh biểu bì
Sử dụng giấy thấm để rút dung dịch NaCl dưới lamelle, sau đó nhỏ 1 - 2 giọt nước cất vào một cạnh của lamelle Quan sát hiện tượng xảy ra trên mảnh biểu bì qua kính hiển vi.
2.3 Tế bào vi sinh vật: Tế bào nấm men
Nhỏ một giọt canh trường nấm men lên lame Đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x10, x40 Có thể nhuộm với 1 giọt lugol/xanh methylene
Sử dụng kim mũi giáo để cạo nhẹ trên lát khoai tây, khoai lang, hạt đậu xanh hoặc đậu trắng Sau đó, đặt một lượng rất nhỏ bột này lên lamelle cùng với một giọt nước Đậy lamelle lại và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x10 và x40 Lắc nhẹ ốc vi cấp để quan sát vòng tròn đồng tâm trong hạt tinh bột.
Lưu ý: không lấy mẫu quá dày vì sẽ rất khó quan sát do các tế bào xếp chồng lên nhau.
Kết quả thí nghiệm và giải thích hiện tượng
1 Tế bào động vật: Tế bào biểu mô miệng
Hình 1.2 Hình ảnh quan sát tế bào biểu mô miệng
- Tế bào biểu mô miệng người khó quan sát được ở vật kính x10 mà chỉ có thể quan sát rõ ở vật kính x40
- Do tế bào biểu mô miệng không màu nên dung dịch nhuộm Lugol giúp việc quan sát dễ dàng hơn
Sau khi nhuộm, dưới kính hiển vi, các tế bào biểu mô miệng cho thấy hình dạng rất đa dạng Sự không đồng nhất này xuất phát từ việc các tế bào động vật không có vách tế bào, dẫn đến việc chúng không có hình dạng cố định, chủ yếu là các tế bào chết.
Sau khi phóng to, có thể phân biệt rõ ràng các thành phần của tế bào như nhân, nguyên sinh chất, các bào quan nhỏ màu đen (chưa xác định) và màng ngoài tế bào Tuy nhiên, do hình ảnh vẫn còn mờ và kích thước nhỏ, nên việc xác định các thành phần này chỉ mang tính tương đối.
2 Tế bào thực vật: Tế bào vảy hành và hiện tượng co nguyên sinh
2.1 Kết quả quan sát tế bào vảy hành:
Tế bào vảy hành tím trong điều kiện bình thường có cấu trúc đều đặn, tương tự như các viên gạch xếp cạnh nhau Hình dạng của chúng khá đồng nhất nhờ vào sự hiện diện của vách tế bào trong tế bào thực vật.
- Độ đậm nhạt giữa các tế bào là khác nhau, điều này có thể giải thích bởi lượng sắc tố ở từng tế bào là không giống nhau
Hình 1.3 Hình ảnh quan sát tế bào vảy hành
2.3 Hiện tượng co và phản co nguyên sinh:
Hiện tượng co nguyên sinh xảy ra khi tế bào được đặt trong môi trường ưu trương, nơi nồng độ chất tan bên ngoài cao hơn trong tế bào Khi đó, nước sẽ di chuyển ra ngoài tế bào qua cơ chế thẩm thấu, dẫn đến việc tế bào mất nước và co lại Kết quả là tạo ra khoảng không giữa vách tế bào và màng tế bào.
Phản co nguyên sinh là hiện tượng xảy ra khi tế bào ở trong môi trường nhược trương, tức là nồng độ chất tan bên trong tế bào cao hơn so với môi trường xung quanh Trong tình huống này, nước sẽ thẩm thấu từ môi trường vào tế bào, khiến tế bào ngậm nước và trương lên.
3 Tế bào vi sinh vật: nấm men
Hình 1.4 Hiện tượng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh
Co nguyên sinh Phản co nguyên sinh
Hình 1.5 Hình ảnh nấm men bánh mì x10 x40
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình dạng cầu hoặc hình trứng, kích thước nhỏ từ 5-6 đến 10-14 µm, và sinh sản thông qua quá trình tạo chồi và tạo bào tử.
- Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng amino acid và muối amon như nguồn nitơ
4 Hạt tinh bột: Hạt tinh bột khoai tây
Hạt tinh bột khoai tây có kích thước và hình dạng đa dạng, thường là hình trứng hoặc quả lê với kích thước từ 30 - 100 µm, và hình tròn từ 10 - 35 µm Chúng có thể tập hợp thành các đám từ 2 - 4 hạt Rốn của hạt thường không nằm ở giữa, và bề mặt của hạt có vân tăng trưởng đồng tâm rõ rệt, tạo hình dạng giống như vỏ sò.
Hình 1.6 Hình ảnh quan sát hạt tinh bột khoai tây
MÀNG NGUYÊN SINH CHẤT
Phương pháp tiến hành thí nghiệm
1.1 Dụng cụ: Chuẩn bị 7 ống nghiệm, đánh số từ 1 - 7
- Ống 1 - 6: 15ml nước cất/ống
- Ống 7: 15ml cồn tuyệt đối (đậy kín, tránh bay hơi)
1.2 Mẫu vật: Cắt củ dền thành 7 miếng đều nhau có kích thước 4 cm x 1 cm x 0,5 cm
Cho các miếng củ dền vào becher và rửa dưới dòng nước chảy trong vài phút để lôi đi
Màng tế bào được cấu tạo từ các sắc tố có nguồn gốc từ những tế bào bị vỡ, quá trình này dừng lại khi nước rửa không còn sắc tố Sau đó, mẫu được ngâm vào nước sạch để loại bỏ tạp chất.
Xử lý nhiệt: xử lý nhiệt 5 miếng củ dền ở các nhiệt độ 40, 50, 70, 100 và - 5C
Để xử lý nhiệt củ dền, bạn hãy cho mỗi miếng củ dền vào một túi nylon nhỏ, sau đó bấm miệng túi lại bằng kim bấm Tiếp theo, nhúng túi củ dền vào nước có nhiệt độ chỉ định và giữ trong 10 phút.
Lưu ý: đuổi hết không khí trong túi để miếng củ dền ép sát vào túi nylon
- Cho mẫu vào ống nghiệm: ngâm các miếng củ dền sau khi xử lý nhiệt vào các ống nghiệm đã đánh số:
+ Ống 1: cho vào miếng dền đã xử lý ở - 5C
+ Ống 2: cho miếng củ dền không qua xử lý nhiệt (ống chuẩn)
+ Ống 3: cho vào miếng dền đã xử lý ở 40C
+ Ống 4: cho vào miếng dền đã xử lý ở 50C
+ Ống 5: cho vào miếng dền đã xử lý ở 70C
+ Ống 6: cho vào miếng dền đã xử lý ở 100C
+ Ống 7: cho miếng củ dền không qua xử lý nhiệt
Đặt tất cả ống nghiệm vào giá và để yên trong 15 phút Sau đó, loại bỏ miếng dền, lắc đều các ống nghiệm và so sánh màu dung dịch trong các ống nghiệm với ống chuẩn.
Kết quả thí nghiệm
Bảng 2.2 Cường độ màu của từng ống nghiệm sau thí nghiệm Ống 1 2 3 4 5 6 7
Giải thích kết quả thí nghiệm
Bản chất của sự sai khác cường độ màu của từng ống nghiệm phụ thuộc vào mức độ bị phá hủy màng tế bào của mẫu vật
Khi màng bị tổn thương, protein trên màng sẽ bị biến tính và duỗi ra, tạo ra các lỗ trống Điều này dẫn đến việc các sắc tố thoát ra ngoài, làm tăng cường độ màu thu.
Ống 1 được đặt ở nhiệt độ -5C, nơi mà các phân tử ít dao động nhất, nhưng màu sắc lại đậm hơn so với ống 2, 3 và 4 Ở nhiệt độ dưới 0C, các phân tử nước trong tế bào chuyển sang trạng thái rắn, tạo thành các tinh thể hình kim nhọn có hai đầu Những tinh thể này đâm thủng màng tế bào, và càng nhiều tinh thể hình thành thì mức độ tổn thương càng cao, dẫn đến cường độ màu sắc tăng lên.
Ở ba mức nhiệt độ: phòng, 40°C và 50°C, các protein trên màng vẫn giữ được tính bền vững với nhiệt, chưa bị biến tính hay thay đổi cấu trúc không gian Do đó, màng tế bào cơ bản vẫn chưa bị tổn thương, dẫn đến cường độ màu cơ bản tương tự nhau.
Tại mức nhiệt độ 70C, ống 5 cho thấy sự khác biệt rõ rệt về cường độ màu so với ống ở 50C Ở nhiệt độ này, protein màng đã bị biến tính, dẫn đến sự xuất hiện của các lỗ trống trên màng, làm cho sắc tố thoát ra nhiều hơn và tạo ra màu sắc đậm hơn.
Tại mức nhiệt 100°C, protein trong ống 6 bị biến tính nhiều hơn khi nhiệt độ tăng, dẫn đến sự gia tăng số lượng lỗ trống và cường độ màu sắc đậm hơn Tuy nhiên, màu sắc chuyển sang cam do sắc tố Betalain trong củ dền không bền nhiệt và bị phân hủy, trong khi màu quan sát được chủ yếu là màu của Caroten.
Cồn là một dung môi phân cực kém, có khả năng hòa tan các thành phần phân cực kém hoặc không phân cực trên màng tế bào, dẫn đến việc tế bào bị vỡ và toàn bộ sắc tố thoát ra, tạo ra màu sắc đậm nhất Hiện tượng này cũng giải thích tại sao mẫu củ dền teo nhỏ lại, do các tế bào bên ngoài tiếp xúc trực tiếp với cồn đã bị phá vỡ.
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TẾ BÀO
Carbohydrate
Tinh bột và glycogen là hai dạng carbohydrate dự trữ, với tinh bột tồn tại ở thực vật và glycogen ở động vật Chúng có thể được phát hiện bằng thuốc thử Lugol, tạo màu xanh tím với tinh bột và đỏ với glycogen Để phân biệt glycogen với dextrin, cần xem xét một số đặc tính khác như độ đục của dung dịch glycogen và sự tạo trầm hiện Những carbohydrate này sẽ được thủy phân thành monosaccharide, cung cấp năng lượng cho các hoạt động chuyển hóa của tế bào, chẳng hạn như trong quá trình nảy mầm của hạt.
Đường khử là các monosaccharide có gốc C=O trong cấu trúc, được nhận biết qua dung dịch Fehling Khi đun nóng trong môi trường kiềm của dung dịch Fehling, các monosaccharide này sẽ khử ion Cu²⁺ thành Cu⁺, tạo ra trầm tích màu đỏ (Cu₂O) hoặc vàng (CuOH).
Lipid
Lipid tồn tại trong tế bào dưới nhiều dạng khác nhau, bao gồm triglyceride (mỡ, dầu), phospholipid, glycolipid và steroid Những giọt dầu dễ quan sát nhất thường xuất hiện trong các mô dự trữ của thực vật hoặc trong các hạt chứa dầu như cơm dừa và đậu phộng Đặc biệt, lipid có thể được nhuộm màu cam bằng thuốc thử Soudan III để dễ dàng nhận diện.
Protein
Protein được cấu tạo từ các amino acid liên kết với nhau qua liên kết peptide Chúng có thể được xác định bằng nhiều loại thuốc thử, tạo ra phản ứng màu với sự hiện diện của amino acid hoặc amino acid vòng Trong môi trường kiềm, protein và các hợp chất chứa nhiều nhóm peptide (-CONH-) sẽ tạo ra các phản ứng đặc trưng.
Hình 3.1 Cấu trúc tinh bột và Glycogen
II Vật liệu và hóa chất:
Bảng 3.1 Vật liệu và hóa chất cần dùng
Vật liệu tươi Hóa chất
Khoai tây Thuốc thử Fehling Đậu xanh ngâm nước Thuốc thử Lugol
Cây mầm đậu xanh (giá) Thuốc thử Soudan III Đậu trắng ngâm nước NaOH 30%
Dung dịch lòng trắng trứng
III Phương pháp tiến hành thí nghiệm:
Tinh bột
- Ống 1: nghiền 01 mẫu khoai tây nhỏ với 10 ml nước cất, loại bỏ bã bằng vải lọc Cho dịch dưới lọc vào ống nghiệm
- Ống 2: chứa 10 ml nước cất
Nhỏ vào mỗi ống nghiệm 01 giọt Lugol Lắc đều Quan sát và ghi nhận hiện tượng.
Đường khử
Để ly trích đường tan từ mầm đậu xanh, bạn cần giã nát 20 cây mầm đậu xanh trong cối, sau đó thêm 20 ml nước và khuấy đều Để hỗn hợp lắng trong 10 phút rồi lọc qua vải lọc Tiếp theo, thực hiện tương tự với 20 hạt đậu xanh đã được ngâm nước trong 1 giờ.
- Trắc nghiệm đường khử: Chuẩn bị 3 ống nghiệm Ống nghiệm Dd Fehling (ml) Nước cất (ml)
Dịch lọc từ cây mầm giá (ml)
Dịch lọc từ hạt đậu xanh (ml)
- Đặt cả 3 ống trong nước sôi 5 phút Quan sát hiện tượng xảy ra ở các ống nghiệm.
Lipid
- Ống 1: chứa 2 ml nước cất
- Ống 2: chứa 2 ml dầu ăn
Nhỏ vào mỗi ống nghiệm 5 giọt soudan III Quan sát hiện tượng ở cả 2 ống nghiệm.
Protein
4.1 Thực vật: Đặt 01 lát cắt dày hột đậu trắng đã ngâm nước lên lame Nhỏ 02 giọt CuSO4 và đậy lại bằng lamelle Sau 10 phút dở lamelle lên, nhỏ 01 giọt NaOH Quan sát màu xuất hiện trên lát cắt
- Ống 1: chứa 5 ml dung dịch lòng trắng trứng
- Ống 3: chứa 5 ml nước cất
Nhỏ vào mỗi ống nghiệm 5 giọt CuSO4, để yên 5 phút, tiếp theo cho vào 2 giọt NaOH Lắc nhẹ Quan sát sự thay đổi màu sắc
IV Kết quả thí nghiệm và giải thích hiện tượng:
1.1 Kết quả thí nghiệm: Ống nghiệm chứa tinh bột chuyển sang màu xanh tím
- Trong khoai tây có chứa tinh bột Tinh bột bao gồm amylose có hình dạng vòng lò xo hay xoắn ốc và amylopectin có dạng mạch nhánh
Dung dịch Lugol là dung dịch chứa 0.3% Iod trong KI 3%, trong đó có sự hiện diện của ion triiodine (I3-), một ion đa halogen tồn tại dưới dạng đường thẳng Phản ứng hình thành ion I3- diễn ra trong dung dịch này.
Hình 3.2 Ống tinh bột và nước sau khi nhỏ Lugol
Ion I3- khi kết hợp với tinh bột sẽ bị mắc kẹt trong cấu trúc xoắn ốc của amylose do kích thước và hình dạng phù hợp, tạo thành phức hợp tinh bột - I3- với màu xanh tím đặc trưng.
- Ống 1: Dung dịch chứa nước cất vẫn màu xanh lam
- Ống 2: Dung dịch chuyển màu vàng cam
- Ống 3: Dung dịch chuyển màu xanh tím
Phản ứng với thuốc thử Fehling là phản ứng dùng để định tính, xác định sự có mặt của đường khử trong dung dịch
- Ống 1: chỉ chứa nước cất, nên khi đun nóng không xảy ra hiện tượng Vẫn giữ màu xanh của dung dịch thuốc thử
Ống 2 chứa dịch lọc từ cây mầm giá, sau khi đun nóng ống nghiệm, màu sắc chuyển sang vàng cam, cho thấy sự hình thành kết tủa CuOH, một trong hai sản phẩm của Cu+ Sự tạo ra Cu2O hoặc CuOH phụ thuộc vào nồng độ và tỉ lệ pha của dung dịch thuốc thử Fehling ban đầu.
Hình 3.3 Kết quả định tính đường khử
Dịch lọc từ cây mầm giá chứa đường có tính khử, điều này được giải thích bởi quá trình nảy mầm, trong đó polysaccharide trong hạt được enzyme thủy phân thành monosaccharide, cung cấp năng lượng cho các hoạt động chuyển hóa của tế bào.
- Ống 3: chứa dịch lọc từ hạt đậu xanh, ống chuyển sang màu xanh tím
Giống như mầm giá, ống chứa hạt đậu xanh cũng có chứa đường khử nhưng với lượng khá ít Khi ngâm nước trong 1 giờ, hạt đậu xanh bắt đầu quá trình nảy mầm, làm phá vỡ trạng thái ngủ của hạt Trong giai đoạn này, quá trình phân giải tinh bột bởi enzyme mới chỉ bắt đầu, do đó dịch chiết chủ yếu vẫn chứa tinh bột Kết quả là, dịch chiết này vẫn phản ứng với thuốc thử Fehling, nhưng lượng kết tủa tạo ra rất ít, khiến cho việc quan sát trở nên khó khăn.
Dịch chiết hạt đậu xanh chứa nhiều thành phần quan trọng như tế bào và enzyme, chủ yếu là protein Khi phản ứng với dung dịch Fehling, bao gồm Kali natri tartrat, NaOH và CuSO4, sẽ xảy ra phản ứng Biuret, dẫn đến sự chuyển màu tím của dung dịch, cho thấy sự hiện diện của protein.
3.1 Kết quả thí nghiệm: Ống nghiệm chứa dầu ăn khi nhỏ Soudan III → dung dịch chuyển sang màu nâu đỏ
Hình 3.4 Kết quả định tính Lipid
- Ống 1: thuốc thử Soudan III không phản ứng với nước, ống có màu đỏ cam của thuốc thử
- Ống 2: dung dịch chuyển sang màu nâu đỏ, chứng tỏ sự hiện diện của lipid trong ống nghiệm
4.1.1 Kết quả thí nghiệm: Xuất hiện màu xanh tím trên bề mặt cắt của hạt đậu trắng
Bề mặt cắt hạt đậu chuyển sang màu xanh tím, chứng tỏ phản ứng màu biuret đã xảy ra → chứng minh sự tồn tại protein trong hạt đậu
Các vị trí không cắt và không đổi màu là do lớp cutin dày bên ngoài, khiến CuSO4 không thẩm thấu vào tế bào Điều này dẫn đến việc không tiếp xúc với protein và không xảy ra phản ứng Biuret, một phản ứng định tính.
- Ống 1: chứa dịch lòng trắng trứng có màu tím đậm
- Ống 2: chứa sữa, có màu tím nhạt
- Ống 3: chứa nước cất, dung dịch có màu xanh lam
Hình 3.5 Hạt đậu sau thí nghiệm
4.2.2 Giải thích hiện tượng: Đây là phản ứng bán định lượng, vừa để nhận biết sự tồn tại của protein trong các mẫu vừa quan tâm đến mẫu nào có nhiều protein
- Ống 3: dung dịch vẫn màu xanh lam → nước không phản ứng màu biuret
- Ống 1, 2: dung dịch chuyển sang màu tím, chứng tỏ phản ứng màu biuret đã xảy ra
→ mẫu có protein Tuy nhiên, ống nghiệm chứa lòng trắng trứng có màu tím đậm hơn
→ protein trong ống chứa dịch lòng trắng trứng nhiều hơn trong ống chứa sữa
Hình 3.6 Kết quả thí nghiệm Protein động vật
Tất cả các phản ứng trong tế bào, bao gồm tổng hợp và thoái biến, đều được xúc tác bởi enzyme, giúp tăng tốc độ phản ứng Enzyme có bản chất protein, nên chúng dễ bị biến tính bởi các yếu tố như nhiệt độ cao, acid, kiềm mạnh, dung môi hữu cơ và kim loại nặng, dẫn đến mất hoạt tính Ngoài ra, tốc độ phản ứng enzyme còn bị ảnh hưởng bởi nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ và pH.
Cơ chế hoạt động của enzyme: Gồm 3 giai đoạn
Giai đoạn đầu tiên của quá trình xúc tác enzyme diễn ra khi enzyme kết hợp với cơ chất thông qua các liên kết yếu, tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất (ES) Sự hình thành các liên kết, đặc biệt là liên kết hydrogen, làm thay đổi cấu trúc không gian của cơ chất, dẫn đến sự biến đổi trong động năng và thế năng của nó Kết quả là, phân tử cơ chất trở nên linh hoạt hơn, giúp nó tham gia vào phản ứng một cách dễ dàng.
- Giai đoạn thứ hai: Xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng
- Giai đoạn thứ ba: Enzyme xúc tác lên cơ chất tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do
Amylase trong hạt nảy mầm là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành glucose:
(C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6 Để chứng minh hoạt tính amylase, người ta thường dùng chất chỉ thị là thuốc thử Lugol Thuốc thử này tạo màu xanh tím với tinh bột
Hình 4.1 Cơ chế hoạt động (xúc tác) của enzyme
ENZYME
Ly trích amylase
Giã nát 20 hạt đậu xanh lên mầm, thêm vào 20 ml nước, dùng chày cà đều trong cối Lọc, chứa trong ống nghiệm Chất lọc chứa enzyme amylase.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trên hoạt tính amylase
Chuẩn bị 4 ống nghiệm ghi số 1, 2, 3, 4 Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột
- Ống 1: nước đá tan (khoảng 5°C)
- Ống 2: nhiệt độ phòng (khoảng 30°C)
Sau 10 phút, thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch có chứa amylase trong khi vẫn tiếp tục để các ống ở nhiệt độ thí nghiệm trong 15 phút Sau đó, lấy các ống nghiệm để vào giá (lưu ý: đặt ống 4 vào 1 ly nước để làm nguội) Dùng thuốc thử Lugol (1 giọt) trắc nghiệm sự có mặt của tinh bột trong các ống nghiệm
Lưu ý : Thuốc thử Lugol được nhỏ vào các ống nghiệm CÙNG LÚC Lắc đều và đọc kết quả NGAY LẬP TỨC
IV Kết quả thí nghiệm và giải thích hiện tượng:
Kết quả thí nghiệm
Giải thích hiện tượng
Nhiệt độ ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme, với tốc độ phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng lên Tuy nhiên, tốc độ phản ứng không luôn tỉ lệ thuận với nhiệt độ, mà chỉ gia tăng đến một giới hạn nhất định Khi vượt quá nhiệt độ tối ưu, tốc độ phản ứng sẽ giảm và enzyme có thể bị vô hoạt Nhiệt độ tối ưu là mức nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng cao nhất của enzyme.
Giải thích sự tạo thành màu xanh tím : Dung dịch Lugol là dung dịch Iod 0,3% trong
Ion triiodine (I3-) trong dung dịch KI 3% là một ion đa halogen có cấu trúc đường thẳng Khi hòa tan với tinh bột, ion I3- nhờ kích thước và hình dạng phù hợp sẽ bị mắc kẹt trong cấu trúc xoắn ốc của amylose, tạo thành phức hợp tinh bột - I3- với màu xanh tím đặc trưng.
- Ở 5C: enzyme ít hoạt động, tinh bột rất ít bị thủy phân nên khi thêm thuốc thử Lugol dung dịch xuất hiện màu xanh tím
Ở nhiệt độ 30C, hoạt tính của enzyme gia tăng đáng kể, dẫn đến quá trình thủy phân tinh bột diễn ra mạnh mẽ hơn Khi thêm thuốc thử Lugol, màu sắc của dung dịch trở nên nhạt hơn rõ rệt so với ống 1 và 4.
Ở nhiệt độ 50C, enzyme hoạt động hiệu quả nhất, dẫn đến quá trình thủy phân tinh bột gần như hoàn toàn, khiến dung dịch khi thêm thuốc thử Lugol có màu rất nhạt.
Ở nhiệt độ 100C, enzyme bị biến tính và cấu trúc của nó thay đổi, dẫn đến tình trạng bất hoạt Khi enzyme không còn khả năng liên kết với cơ chất, tinh bột sẽ không bị thủy phân, do đó, khi thêm thuốc thử Lugol, dung dịch sẽ xuất hiện màu xanh tím đậm.
Bảng 4.2 Cường độ màu của từng ống nghiệm sau thí nghiệm Ống 1 2 3 4
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme amylase
HÔ HẤP
Hô hấp hiếu khí
Trong điều kiện hiếu khí, glucose được oxy hoá hoàn toàn thành CO2, nước, năng lượng dưới dạng ATP đồng thời toả nhiệt
Trong quá trình hô hấp, ngoài carbohydrate, cơ chất còn bao gồm protein, lipid và axit hữu cơ Sự thải CO2 trong hoạt động hô hấp có thể được chứng minh qua khả năng hấp thụ CO2 của KOH hoặc thông qua phản ứng kết hợp giữa CO2 và Ba(OH)2, tạo thành tủa BaCO3.
2 Hô hấp kỵ khí (hoạt động lên men):
Trong điều kiện thiếu oxy, tế bào nấm men và tế bào thực vật thực hiện quá trình lên men, chuyển hóa glucose thành rượu ethylic, CO2, nước và một lượng nhỏ năng lượng dưới dạng ATP.
II Vật liệu và hóa chất:
Bảng 5.1 Vật liệu và hóa chất cần dùng
Vật liệu tươi Hóa chất Đậu xanh lên mầm Saccharose 30%
Nấm men Ba(OH)2 bão hòa
III Phương pháp tiến hành thí nghiệm:
Cho một nắm hạt đậu xanh nảy mầm vào bình Erlen, sau đó đậy kín bằng nắp cao su có ống thủy tinh và phễu Bịt kín đầu còn lại của ống thủy tinh và phễu bằng bông gòn thấm nước để ngăn CO2 thoát ra Để hệ thống yên trong 90 phút, sau đó nhanh chóng bỏ bông gòn và cho đầu ống thủy tinh vào ống nghiệm chứa Ba(OH)2 Để quan sát nhanh hơn, có thể đổ nước vào bình Erlen qua phễu thủy tinh để đẩy khí CO2 sang ống nghiệm và tiến hành quan sát hiện tượng.
- Ống 1: 5 ml dung dịch saccharose và 5 ml nước cất
- Ống 2: 5 ml dung dịch saccharose và 5 ml canh trường nấm men
IV Kết quả thí nghiệm và giải thích hiện tượng:
- Ống nghiệm bị vẩn đục
- Trong điều kiện đủ khí oxy, quá trình hô hấp hiếu khí xảy ra, một trong những sản phẩm của quá trình là khí
- Khi sục khí CO2 sinh ra từ quá trình hô hấp hiếu khí vào dung dịch Ba(OH)2 tạo thành kết tủa trắng (BaCO3) trong ống nghiệm
- Tuy nghiệm, do nhóm sử dụng khá nhiều dung dịch
Ba(OH)2 nên khi cắm vào ống khí dẫn ngập sâu trong ống nghiệm → BaCO3 kết tủa trong lòng ống dẫn khí.
Hô hấp kị khí
- Ống 1: Không có hiện tượng xảy ra, bong bóng không căng
- Ống 2: Bong bóng căng lên
- Ống 3: Bong bóng căng rất ít, có ít khí xuất hiện trong bong bóng
Trong điều kiện không có O2, các vi sinh vật sẽ tiến hành hô hấp kị khí để tạo năng lượng
Ống 1 chứa saccharose và nước cất, cung cấp nguyên liệu cho hoạt động hô hấp nhưng không cho phép đối tượng thực hiện quá trình này, dẫn đến việc hô hấp không diễn ra và không tạo ra bọt khí.
Ống 2 chứa nấm men và saccharose, tạo điều kiện lý tưởng cho quá trình hô hấp kỵ khí Nấm men trong dung dịch thực hiện hô hấp mạnh mẽ, sinh ra nhiều bọt khí CO2, làm cho bong bóng căng lên Khi tháo bong bóng ra, có thể ngửi thấy mùi rượu nhẹ, cho thấy quá trình lên men đang diễn ra.
Hình 5.1 Kết quả thí nghiệm
Hình 5.2 Kết quả thí nghiệm
1 2 3 quá trình lên men Tuy nhiên, lượng khí thực tế sinh ra không nhiều rất có thể nguyên nhân đến từ canh trường nấm men
Ống 3 chứa đối tượng thực hiện quá trình hô hấp nhưng không cung cấp nguyên liệu hô hấp, do đó, về nguyên tắc, quá trình hô hấp sẽ không xảy ra Tuy nhiên, nấm men là tế bào sống với dự trữ dinh dưỡng trong tế bào, cho phép chúng lấy dinh dưỡng để hô hấp và duy trì hoạt động sống Mặc dù vậy, lượng dinh dưỡng dự trữ là hạn chế, dẫn đến quá trình hô hấp yếu và sản lượng khí thấp.
Thực vật xanh, hay còn gọi là thực vật quang tự dưỡng, có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời để tổng hợp các chất hữu cơ giàu năng lượng thông qua quá trình quang hợp Quá trình này phụ thuộc vào sự hiện diện của diệp lục tố, một sắc tố đặc biệt có trong lục lạp - bào quan chuyên biệt cho chức năng quang hợp.
Cường độ quang hợp chịu ảnh hưởng bởi cường độ và bước sóng của ánh sáng Màu xanh của lá cây được tạo ra từ hỗn hợp sắc tố diệp lục a, diệp lục b và carotenoid như beta caroten và xanthophyll Các sắc tố này có thể được phân tích thông qua phương pháp sắc ký, bao gồm sắc ký cột và sắc ký giấy.
Sắc ký là phương pháp tách biệt các thành phần trong hỗn hợp chất, dựa trên sự phân bố không đồng đều giữa pha tĩnh và pha động Quá trình này diễn ra khi các chất di chuyển qua pha tĩnh, cho phép phân tích và định lượng các thành phần khác nhau.
Nguyên tắc cơ bản của tất cả các phương pháp sắc ký là dựa vào sự phân bố của các chất giữa hai pha: pha tĩnh (stationary phase) thường cố định và pha động (mobile phase) chuyển động.
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký giấy:
Phương pháp này dựa trên sự khác biệt về độ hòa tan của các chất trong hỗn hợp khi tiếp xúc với dung môi Giấy thấm đặc biệt được sử dụng làm nền pha cố định, trong đó pha này bao gồm nước từ không khí hoặc nước trong dung môi, được giữ lại nhờ các phân tử cellulose trong giấy Dung môi di chuyển là một loại dung môi không hòa tan trong nước.
Hỗn hợp sắc tố được đặt trên giấy thấm tạo thành vệt hoặc chấm, gọi là đường gốc Khi dung môi di chuyển, nó sẽ kéo theo các sắc tố, trong đó sắc tố dễ hòa tan trong dung môi sẽ di chuyển xa hơn so với các sắc tố dễ hòa tan trong nước Vị trí của các sắc tố trên giấy sắc ký được thể hiện bằng trị số Rf.
Rf = Đoạn đường di chuyển của chất Đoạn đường di chuyển của dung môi
II Vật liệu và hóa chất:
Bảng 6.1 Vật liệu và hóa chất cần dùng
Vật liệu tươi Hóa chất
QUANG HỢP
Phân tích thành phần sắc tố lá cây bằng phương pháp sắc ký
Giã 3g lá xanh trong cối sạch và khô, sau đó thêm 20 ml acetone và khuấy đều Lọc dung dịch qua giấy lọc và thu nhận dịch lọc vào ống nghiệm sạch, đậy kín nắp Cuối cùng, quan sát màu dung dịch dưới ánh sáng truyền suốt và ánh sáng phản xạ.
- Chuẩn bị giấy sắc ký, thực hiện đường gốc:
Cắt một mẫu giấy có kích thước 10 x 10 cm, sau đó dùng bút chì kẻ một đường thẳng song song với một cạnh, cách bìa khoảng 1 cm Tiếp theo, cuốn tờ giấy thành hình ống và giữ chặt bằng hai kim bấm ở hai đầu ống, đảm bảo hai mép giấy không chồng lên nhau.
Để thực hiện quá trình sắc ký, đầu tiên, đổ dung dịch sắc tố vào hộp petri và nhúng đầu ống giấy có vạch bút chì vào dung dịch Nhờ hiện tượng mao dẫn, sắc tố sẽ thấm lên ống giấy Khi sắc tố chạm đến vạch bút chì, nhanh chóng lấy ra và sấy khô bằng máy sấy tóc hoặc trước quạt Sau khi vệt sắc tố khô, tiếp tục nhúng đầu ống giấy vào dung dịch sắc tố trong đĩa Petri và chờ đến khi mực sắc tố chạm vạch bút chì, rồi lại sấy khô Lặp lại quy trình này tổng cộng 5 lần Khi lần tẩm cuối cùng đã khô hoàn toàn, ta sẽ có "đường gốc" trên tờ sắc ký để tiến hành phân tích hỗn hợp.
+ Dung môi di chuyển: chuẩn bị 30 ml dung môi di chuyển ether dầu hỏa và benzene (9:1) Cho dung môi này vào một đĩa Petri
Để thực hiện sắc ký, đầu tiên hãy đặt ống giấy sắc ký với đường gốc thật khô vào đĩa Petri chứa dung môi di chuyển, đảm bảo mặt thoáng của dung môi thấp hơn vạch bút chì vài mm Sau đó, dùng ly thủy tinh úp kín toàn bộ đĩa dung môi và ống sắc ký nhằm tạo ra một khí quyển bên trong bão hòa dung môi.
Để tiến hành sắc ký, đặt tờ giấy sắc ký vào dung môi cho đến khi dung môi ngấm lên khoảng 2 cm từ cạnh giấy Sau đó, lấy tờ giấy ra, đánh dấu vị trí dung môi và sấy khô Đánh số "vạch gốc" là 0 và vạch dung môi cao nhất là 10 Chia khoảng di chuyển của dung môi thành 10 băng, đánh số từ 1 đến 10 để xác định vị trí.
Chứng minh hoạt động quang hợp thải khí O 2
Để thực hiện thí nghiệm, hãy úp ngược một cái phễu lên vài cọng rong trong một chậu nước, đảm bảo rằng mặt cắt của cọng rong hướng về cuống phễu Sau đó, đặt một ống nghiệm nhỏ đã được đổ đầy nước lên cuống phễu.
- Đặt hệ thống dưới ánh sáng mặt trời hoặc nguồn sáng mạnh Quan sát sự thoát bọt khí từ vết cắt của cọng rong
- Sau 45 phút, lấy ngón tay bịt miệng ống nghiệm, dốc ngược lên và đưa một đầu diêm gần tàn đến miệng ống nghiệm Ghi nhận hiện tượng.
Chứng minh quang hợp sử dụng CO 2
- Chuẩn bị 2 chai thủy tinh đánh số 1 và 2
3.1 Thổi khí từ miệng vào 2 chai, đậy kín bằng nắp cao su
- Chai 1: Dùng kim tiêm bơm 10 ml dung dịch Ba(OH)2 bão hòa Lắc nhẹ
- Chai 2: Dùng kim tiêm bơm 10 ml nước cất Lắc nhẹ
Quan sát và ghi nhận hiện tượng ở cả hai chai
3.2 Cho vào chai số 2 một nhánh cây còn tươi
Thổi vào hai chai và đậy kín nắp, sau đó đặt dưới nguồn sáng mạnh Sau 90 phút, sử dụng kim tiêm bơm 10 ml dung dịch Ba(OH)2 bão hòa vào mỗi chai, lắc nhẹ và quan sát hiện tượng.
IV Kết quả thí nghiệm và giải thích hiện tượng:
1 Phân tích thành phần sắc tố lá cây bằng phương pháp sắc ký:
1.1.1 Kết quả thí nghiệm: Ánh sáng truyền suốt
Hình 6.1 Quan sát dịch trích dưới ánh sáng Ánh sáng phản xạ
Sắc tố thực vật bao gồm nhiều loại phân tử đa dạng, có khả năng hấp thu chọn lọc các bước sóng ánh sáng nhất định và phản xạ các bước sóng khác Phần ánh sáng bị hấp thu được sử dụng để cung cấp năng lượng cho các phản ứng hóa học trong thực vật, trong khi các bước sóng bị phản xạ quyết định màu sắc của sắc tố mà chúng ta thấy.
Diệp lục hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở hai vùng quang phổ: ánh sáng đỏ và ánh sáng xanh tím Trong khi đó, ánh sáng xanh lá cây không được diệp lục hấp thụ mà được phản xạ, do đó chúng ta có thể nhìn thấy màu xanh lá cây dưới ánh sáng tự nhiên.
Carotenoid là một loại sắc tố phụ có khả năng phản xạ ánh sáng màu đỏ và cam Khi ánh sáng chiếu vào, các bước sóng phù hợp với vùng hấp thụ của carotenoid sẽ tạo ra màu đỏ và một chút cam, giúp chúng ta quan sát được màu sắc đặc trưng này.
Hình 6.2 Bảng sắc ký giấy
Bảng 6.2 Giá trị Rf của các chất trong lá xanh
Sắc tố Vệt màu Rf
Mức độ phân cực của các sắc tố thực vật được sắp xếp theo thứ tự: carotene < xanthophyll < chlorophyll a < chlorophyll b, dẫn đến khả năng tan trong dung môi ether dầu hỏa + benzene theo thứ tự: carotene > xanthophyll > chlorophyll a > chlorophyll b Nguyên tắc của phương pháp sắc ký là sắc tố dễ hòa tan trong dung môi sẽ di chuyển xa hơn so với sắc tố hòa tan trong nước, do đó, kết quả sắc ký sẽ cho thấy thứ tự di chuyển từ dưới lên là chlorophyll b → chlorophyll a → xanthophyll → carotene.
Chứng minh hoạt động quang hợp thải O 2
- Xuất hiện bọt khí dưới đáy ống nghiệm, có những giọt khí nhỏ li ti di chuyển dần về giọt khí lớn
Trong môi trường có đủ ánh sáng và sắc tố quang hợp, cây thủy sinh (rong) tiến hành quang hợp, tạo ra sản phẩm chứa khí O2.
Hình 6.3 Bọt khí trong đáy ống nghiệm
Chứng minh hoạt động quang hợp sử dụng CO 2
3.1 Thổi khí từ miệng vào 2 chai, đậy kín bằng nắp cao su
- Chai 1: chứa khí CO2, sau khi bơm Ba(OH)2, phản ứng giữa 2 chất sẽ xảy ra theo phương trình bên dưới tạo kết tủa BaCO3
- Chai 2: H2CO3 là một axit yếu và không bền (sau khi tạo thành sẽ phân hủy ngay thành
CO2 và H2O) nên trong khí nghiệm không quan sát thấy hiện tượng gì
3.2 Cho vào chai số 2 một nhánh cây còn tươi
Hình 6.4 Chai 1 bị vẩn đục và chai 2 không xảy ra hiện tượng