báo cáo thí nghiệm vi sinh vật đại cương mã học phần bf3701

Phân phối vào 6 ống thạch đứng không quá 1/3 thể tích; 6 ống thạch nghiêng không quá 1/4 thể tích; môi trường trong hộp petri được phân phối sau khi đã thanh trùng môi trường khoảng 20mL

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẦM

- Chuẩn bị các loại môi trường và khử trùng môi trường để gieo cấy vi sinh vật.

- Thực hiện được cơ bản các thao tác gieo cấy vi sinh vật

II Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu

2 Phương pháp nghiên cứu

a) Pha chế môi trường dinh dưỡng

- Thành phần môi trường Czapek

+ FeSO4: 0.01g (do lượng quá nhỏ nên FeSO4 được pha vào nước rồi lấy thể tích tương ứng với nồng độ)

+ H2O: 1000mL

- Cách tiến hành:

+ Cân đong chính xác theo đơn (chia tỷ lệ cho 250mL nước)

+ Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước các chất có khối lượng nhỏ hơn các chất có khối lượng lớn hơn rồi đến dung dịch Dùng lượng nước còn lại tráng rửa bình, phễu… Thể tích của môi trường nhỏ hơn 1/2 thể tích dụng cụ chứa + Phân phối 50mL dung dịch lỏng vào 6 ống nghiệm (không quá 1/2 thể tích), còn 200mL còn lại cho 2% agar vào, đun và khuấy đều trên bếp điện đến khi tan hoàn toàn Phân phối vào 6 ống thạch đứng (không quá 1/3 thể tích); 6 ống thạch nghiêng (không quá 1/4 thể tích); môi trường trong hộp petri được phân phối sau khi đã thanh trùng môi trường (khoảng 20mL)

+ Dùng nút bông (không thấm nước) đậy kín

+ Ghi tên lên môi trường rồi đem đi tiến hành thanh trùng

b) Cách làm nút bông

- Lấy một lượng bông vừa đủ, gấp gọn phần rìa ở xung quanh vào phía bên trong Nhấn phần giữa đồng thời túm gọn xung quanh lại để được một hình thon dài và phần đầu nút phải dày Tiến hành đậy nút, chú ý dùng lực tương đối, không nên ấn quá mạnh vì có thể làm vỡ bình, trong lúc ấn kết hợp với xoay để nút vào dễ dàng hơn Nút đậy đạt yêu cầu khi rút bông ra có thể nghe được tiếng vang

c) Khử trùng môi trường bằng hơi nước bão hòa áp suất

- Nguyên tắc: Dựa trên khả năng tăng nhiệt độ sôi của các chất lỏng khi áp suất tăng Gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất khí quyển Khi áp suất tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo Người ta khống chế nhiệt độ thanh trùng thông qua điều khiển áp suất

- Cách vận hành nồi hấp áp lực:

+ Kiểm tra mức nước của thiết bị thông qua mức nước ở ống thủy, khoảng từ 1/3 đến 1/2 ống thủy Nếu thiếu phải bổ sung nước Nước thêm vào phải là nước mềm như nước cất, nước ngưng hoặc nước đã loại bỏ bớt phần cứng bằng cách đun sôi để nguội

+ Đặt môi trường, vật cần thanh trùng vào nồi trong sao cho nút bông hướng vào giữa nồi Lưu ý vật liệu cần thanh trùng chỉ chiếm 2/3 thể tích

+ Đặt chế dộ thanh trùng

+ Đóng nắp thiết bị mở van xả đáy và đóng cầu dao điện để gia nhiệt thiết bị

3

+ Khi thấy nước trong nồi sôi, hơi nước thoát ra theo van xả đáy thành luồng mạnh trong

2 đến 3 phút chứng tỏ không khí đã bị loại, trong nồi chỉ còn hơi nước bão hòa thì đóng van xả đáy Theo dõi sự gia tăng áp suất và nhiệt độ ở đông hồ áp kế

+ Khi kim áp kế đạt chế độ khử trùng thì bắt đầu tính thời gian và duy trì chế độ này suốt thời gian thanh trùng

+ Sau thời gian khử trùng ngắt cầu giao điện, chờ kim áp kế trở về 0 và nhiệt độ thiết bị

hạ xuống khoảng 70 mở van xả đáy rồi mở lắp thiết bị và lấy vật liệu đã khử trùng ra.℃

- Lưu ý:

+ Kiểm tra mức nước trước khi vận hành thiết bị

+ Tuyệt đối không mở nắp thiết bị khi kim áp kế chưa về 0

- Ưu điểm: nhiệt độ thanh trùng không làm biến tính các sản phẩm có bên trong, tốn ít thời gian hiệu quả thanh trùng tương đối triệt để Trong phòng thí nghiệm tường kết hợp phương pháp này với phương pháp Tyndal để thanh trùng các môi trường dinh dưỡng.Nhược điểm: không tiêu diệt được các tế bào sinh bào tử

d) Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

- Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối bằng cách thao tác xung quanh ngọn lửa đèncồn hoặc trong các tủ cấy vô trùng

- Một số phương pháp gieo cấy:

+ Vật liệu: canh trường chứa vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng vô trùng

+ Dụng cụ: que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang

+ Vệ sinh khu vực cấy, bật ngọn lửa đèn cồn

+ Khử trùng que cấy bằng cách đốt nóng đỏ đầu que cấy, lướt nhẹ phần thân que cấy qua ngọn lửa đèn cồn

+ Đưa que cấy đã vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống, chạm nhẹ đầu que cấy vào phần không chứa canh trường của ống giống để làm nguội que cấy Lấy canh trường từ ống giống và chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng và thực hiện thao tác cấy:

Gieo cấy vào môi trường lỏng:

Từ canh trường đặc, sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng lấy một lượng nhỏcanh trường, lắc que cấy hoặc cọ vào thành ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng lỏng để sinh khối từ que cấy đi vào môi trường

Từ canh trường lỏng, sử dụng pipette (đầu tip vô trùng) hút một lượng canh trường lỏng rồi bơm vào môi trường lỏng vô trùng

4

Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng:

Sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng, đưa que cấy có sinh khối vi sinh vật từcanh trường giống xuống đáy thạch nghiêng, dịch chuyển que cấy dần trên mặt thạch đến khi cách phần thạch ở gần miệng ống nghiệm khoảng 0,5 – 1cm Khi cấy, đưa que cấy theo đường zigzag dày để canh trường đó phủ kín mặt thạch.Gieo cấy vào môi trường thạch đứng:

Sử dụng que cấy thẳng lấy canh trường rồi đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch đứng đã thanh trùng, tại vị trí trung tâm của mặt thạch, đâm sâu xuống đáy ống nghiệm bằng động tác dứt khoát rồi rút nhanh que cấy ra khỏi ống nghiệm.Gieo cấy trên thạch hộp: Khi gieo cấy vi sinh vật lên hộp petri có thể sử dụng các cách sau:

+ Cấy cạn dần: sử dụng que cấy vòng cấy theo bốn đường zigzag ở bốn góc hộp hoặc theo các đường thẳng song song, sao cho mật độ tế bào vi sinh vật được cấy giảm dần từ góc cấy đầu tiền đến góc cấy cuối cùng

+ Cấy chấm điểm: sử dụng que cấy móc, lấy canh trường giống rồi cấy chấm điểm lên 3, 4 hoặc 5 điểm trên môi trường trong hộp petri thành 3 cạnh của tam giác đều,

4 đỉnh của hình vuông hoặc 4 điểm hình vuông và một điểm tâm hình vuông.+ Dùng que trang: khi cấy từ canh trường lỏng sang môi trường thạch trong hộp petri, dùng pipette hút một lượng canh trường (50 – 100µl) lên mặt thạch rồi dùng que trang vô trùng dàn đều đến khi mặt thạch se lại

- Canh trường mới được cấy cần nuôi trong điều kiện thích hợp (về nhiệt độ, độ ẩm, nồng

độ oxi) một thời gian để vi sinh vật phát triển

III Kết quả và thảo luận

- Tạo được môi trường dinh dưỡng theo đúng yêu cầu (môi trường Czapek)

- Biết thực hiện cơ bản thao tác cấy tuy nhiên vẫn còn chưa thành thạo: trong quá trình cấy còn gây xước bề mặt của môi trường trong hộp petri, và đường gieo cấy còn ngắn nên mật độ vi sinh vật nhỏ

- Cách khắc phục: thực hiện thao tác nhiều

5

- Mẫu phân lập: tương bần, sữa chua uống Yakult.

- Môi trường phân lập trên hộp petri: môi trường Czapek thay saccharose bằng tinh bột, môi trường MRS, môi trường thạch agar 1,5%

a) Chuẩn bị dụng cụ và môi trường nuôi cấy

- 2 bình tam giác chứa 99mL nước muối sinh lý

- 60mL môi trường Czapek đặc thay đường saccharose bằng tinh bột tan

- 60mL môi trường MRS

- 30mL môi trường thạch agar thanh trùng và giữ ấm tại 45 – 50 C trong bể ổn nhiệt.o

- Bình tam giác, ống Falcon, Eppendorf, hộp đầu côn, que trang, môi trường cần thanh trùng ở 110 C trong 30 phút.o

- Sau thanh trùng, phân phối môi trường vào 6 hộp petri (3 Czapek, 3 MRS)

6

b) Phân lập

- Phân lập vi sinh vật hiếu khí trong tương bần (hình 1)

+ Lấy 1mL tương bần cho vào bình tam giác chứa sẵn 99mL nước muối đã vô trùng, lắc đều

+ Pha loãng trong ống Eppendorf theo hệ số 10 Pha loãng đến 10 (hút 0,1mL của dịch -6pha loãng trước vào ống Eppendorf chứa nước muối sinh lý mới)

+ Sử dụng pipette hút 0,1mL dịch ra hộp petri chứa môi trường Czapek – tinh bột, sử dụng que trang trang đều

+ Nuôi cấy trong tủ nuôi tĩnh tại 30 C trong 2 ngày.o

+ Lưu ý khi phân lập vi sinh vật hiếu khí:

Cả quá trình nuôi cấy phải đặt gần ngọn lửa đèn cồn để vô trùng

Hộp petri khi cấy không được cầm lên mà phải để trên mặt bàn, mở hé chú khôngđược mở toang ra

Phải đặt ngược hộp petri khi nuôi cấy trong tủ nuôi

Mẫu là nước tương bần đặc nên rất khó lấy, cần phải cắt to phần đầu ống pipette,thao tác nhanh dứt khoát

- Phân lập vi sinh vật kỵ khí trong Yakult (hình 2)

+ Hút vào các ống Eppendorf mỗi ống 0,9mL nước muối sinh lý vô trùng

+ Hút 0,1mL sữa chua vào ống Eppendorf chứa 0,9mL nước muối, pha loãng tới nồng độ

10-3 (hút 0,1mL của dịch pha loãng trước vào ống Eppendorf chứa nước muối sinh lý mới)

+ Sử dụng pipette hút 0,1mL dịch ra hộp petri chứa môi trường MRS, sử dụng que trang trang đều

+ Đổ lên trên một lớp thạch agar, đợi thạch đông

+ Nuôi cấy trong tủ nuôi tĩnh tại 30 C trong 2 ngày.o

+ Lưu ý khi phân lập vi sinh vật kị khí:

Phải thao tác thật nhanh tránh để nhiễm oxi vào

Đổ thạch sau khi thạch đã thanh trùng, nhiệt độ thạch vào khoảng 50-55oC.Phải đợi thạch đông hoàn toàn mới lật ngược hộp petri

III Kết quả và thảo luận

- Mẫu vi khuẩn hiếu khí:

7

+ Ở hộp pha loãng 10 quan sát bằng mắt thường có 2 kiểu khuẩn lạc: khuẩn lạc tròn,trơn nhẵn màu trắng ngà; khuẩn lạc tròn nhỏ, hơi sần màu vàng cam.

+ Ở hộp pha loãng 10 chỉ có số ít khuẩn lạc trắng ngà nhỏ và phát triển ở gần mép hộp-4

do trang không đều

+ Ở hộp pha loãng 10 không quan sát được khuẩn lạc.-5

- Mẫu vi khuẩn kỵ khí: Cả 3 hộp đều thu được khuẩn lạc trắng, tròn, hơi lồi nhưng sốlượng không nhiều do thao tác pha loãng và cấy không đạt

- Thiếu hình ảnh do không chụp lại kết quả sau khi quan sát

- Khắc phục:

+ Pha loãng với nồng độ phù hợp, lắc đều trước khi tiến hành pha loãng và lấy dịch đểcấy

+ Thao tác trang tốt hơn, tập luyện nhiều

+ Khi thí nghiệm cần chú ý làm việc xung quanh ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm vi sinhvật từ bên ngoài

+ Để nguội thạch rồi mới đổ vào để tránh tiêu diệt hết vi sinh vật

8

- Mẫu nghiên cứu: mẫu đất, mẫu nước, mẫu khí

- Môi trường nuôi cấy: môi trường phổ dụng TSA

- Nước muối sinh lý

- Pipette 1000µl, 100µl (hộp đầu côn vô trùng)

a) Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

- Mỗi nhóm cần chuẩn bị 8 hộp môi trường để nuôi cấy vi sinh vật (2 hộp mẫu không khí,

3 hộp mẫu nước, 3 hộp mẫu đất), mỗi hộp cần khoảng 20mL môi trường → pha 250mL môi trường

- Môi trường TSA đã được phối trộn sẵn ở dạng bột, cân lượng đủ cho 250mL nước và hòatan rồi đổ vào bình tam giác

- 2 bình tam giác mỗi bình chứa 99mL nước muối sinh lý, ống Falcon chứa 40mL nước muối sinh lý

- Thanh trùng môi trường và dụng cụ thí nghiệm

b) Định lượng vi sinh vật

- Chuẩn bị và pha loãng mẫu:

+ Hút 0,9mL nước muối sinh lý đã vô trùng vào 8 ống Eppendorf

9

+ Cân 1g đất và hút 1mL nước lần lượt cho vào 2 bình tam giác chứa 99mL nước muối sinh lý vô trùng, lắc để vi sinh vật phân bố đều Lọc để loại bỏ tạp chất rắn không tan.+ Pha loãng lần lượt theo hệ số 10 vào các ống Eppendorf như bài 2 Mẫu nước pha loãngđến 10 ; mẫu đất pha loãng đến 10 Trộn mẫu trên máy Votex sau khi hút mẫu vào.-5 -7

- Cấy mẫu:

+ Đối với mẫu khí:

Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào đáy hộp petri chứa môi trường dinh dưỡng

Đặt hộp ra chỗ không khí định nghiên cứu, chú ý chọn vị trí không khí tĩnh và không

có gió

Mở nắp hộp trong 5 phút

Đậy nắp hộp và nuôi cấy trong tủ nuôi cấy tĩnh trong 2 ngày

+ Đối với mẫu đất và nước:

Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào đáy hộp petri chứa môi trường dinh dưỡng

Hút 0,1mL mẫu pha loãng vào trung tâm hộp petri, mỗi mẫu 3 hộp (10-3, -4, -5 đối với mẫu nước, 10-5, -6, -7 với mẫu đất)

Dử dụng que trang vô trùng trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt môi trường dinh dưỡng đến khi mặt thạch se lại

Lật ngược đĩa petri, đưa vào tủ nuôi cấy tĩnh nuôi trong 2 ngày

III Kết quả và thảo luận

a) Quan sát

- Mẫu khí:

10

+ Mẫu khí 1 có 12 khuẩn lạc.

+ Mẫu khí 2 có 14 khuẩn lạc

- Mẫu nước:

11

+ Có loại có kích thước 0,5-1cm, bề mặt bằng phẳng, không có hình dạng xác định.+ Theo như quan sát, các khuẩn lạc tách nhau riêng rẽ Tuy nhiên trên cả 2 mẫu đất và nước, số lượng khuẩn lạc trong đĩa đều < 30 → chưa đạt yêu cầu Mặt khác, kết quả này thuận lợi cho việc phân lập vi sinh vật.

13

+ Nguyên nhân:

Lượng vi sinh vật trong mẫu nhỏ, độ pha loãng lớn

Lượng mẫu nuôi cấy vào môi trường nhỏ

Thao tác cấy trang không tách được riêng biệt các tế bào vi sinh vật → các khuẩn lạc phát triển không tách rời nhau

Do thao tác thí nghiệm: que trang sau khí khử trùng bằng ngọn lửa đền cồn chưa được làm nguội đến nhiệt độ mà một số vi sinh vật chịu được → làm chết vi sinh vật

- Mẫu khí: hộp petri có diện tích 60cm , sau 1 giờ sẽ có một lượng vi sinh vật lắng xuống 2bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít không khí

+ Thời gian của thí nghiệm là 5 phút → lượng vi sinh vật trong 0,5 lít không khí = 500mL không khí

+ Vi sinh vật trong không khí vô cùng đa dạng Có cả vi khuẩn và nấm

- Ở đây 2 trong3 mẫu đất, nước và không khí đều không đạt yêu cầu thí nghiệm do số khuẩn lạc không nằm trong khoảng từ 30 đến 300

- Khuẩn lạc ít có thể do trong quá trình lắc bình tam giác và ống eppendorf không đều nên

vi khuẩn phân bố trong ống không đều

- Để cải thiện kết quả có thể sử dụng môi trường có độ pha loãng thấp hơn

14

Bài 4:

Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN

I Mục đích thí nghiệm

- Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN

- Định lượng sự có mặt của nhóm vi khuẩn sinh khí và acid trong mẫu nước

II Vật liệu và phương pháp

1 Vật liệu

- Mẫu nước hồ Tiền

- Môi trường lỏng Lactose nồng độ kép: 30mL

- Môi trường lỏng Lactose nồng độ đơn: 60mL

- Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong quá trình lên men Lactose

- Lấy 90mL nước cất vào bình tam giác cùng các ống chứa môi trường được bao gói, khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ 115°C trong vòng 40 phút.

- Lấy mẫu: (mẫu nước hồ Tiền)

+ Mẫu nước được chuẩn bị sẵn, chứa trong các bình được khử trùng trước, có nắp kín.+ Pha loãng 10 lần mẫu nước bằng cách lấy 10mL mẫu cho vào bình tam giác chứa 90mLnước đã vô trùng ở trên

- Cấy mẫu:

+ Trước khi cấy vào môi trường vô trùng, bình chứa mẫu nước được lắc đều để đảm bảo

vi sinh vật phân bố đồng đều

+ Dùng pipet 10mL cấy 10mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F1

+ Dùng micropipet cấy 1 mL mãu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong

tổ hợp 3 ống F2

+ Dùng micropipet lấy 0.1mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong

tổ hợp 3 ống F3

- Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35°C trong 48h

III.Kết quả và thảo luận

+ Ống F2:

+ Ống F3:

17

- Sau 2 ngày thu được kết quả số lượng ống dương tính ở:

- Sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị vì việc nuôi cấy rất đơn giản

- Bài này xác định bằng cách lên men lactose sinh axit và khí

- Môi trường chỉ thị: yếu tố lên men lactose kết hợp với ống Durham

- Phương pháp này có thể áp dụng cho mẫu có mật độ vi sinh vật thấp

18

- Áp dụng định lượng vi sinh vật không có khả năng phát triển tốt trong môi trường thạch, tuy nhiên tốn nhiều thời gian.

19

Bài 5 + 6:

Quan sát nấm men Định lượng vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu

I Mục đích thí nghiệm

- Thao tác sử dụng kính hiển vi, quan sát vi sinh vật

- Đánh giá chất lượng canh trường (độ thuần khiết, tỷ lệ tế bào sống/chết, tỷ lệ nảy chồi, mật độ tế bào,…)

- Định lượng vi sinh vật sử dụng phương pháp buồng đếm hồng cầu

II Vật liệu và phương pháp thí nghiệm

1 Làm tiêu bản vi sinh vật sống nhuộm đơn giản

a) Dụng cụ, hóa chất chuẩn bị thí nghiệm

- Canh trường nấm men (dạng lỏng)

- Kính hiển vi, phiến kính, lá kính

lá kính và phiến kính không kịp thoát sẽ tạo thành bọt khí

20