M ở đầ u
Khả năng tồn tại và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào chất dinh dưỡng và các yếu tố sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy Trong phòng thí nghiệm, các nhà khoa học sử dụng nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau để nuôi cấy và nghiên cứu vi sinh vật Bài thí nghiệm này giúp sinh viên làm quen và thực hành các kỹ năng cần thiết trong việc nghiên cứu vi sinh vật.
- Chuẩn bị các loại môi trường và khửtrùng môi trường để gieo cấy vi sinh vật
Làm quen với các kỹ thuật cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh vật là rất quan trọng, bao gồm việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thực hiện các phương pháp gieo cấy vi sinh vật từ nhiều loại canh trường khác nhau Ngoài ra, cấy chuyền vi sinh vật từ canh trường vi khuẩn và nấm men sang môi trường mới cũng là một kỹ thuật thiết yếu cần nắm vững.
V ậ t li ệu và phương pháp
V ậ t li ệ u
- Canh trường chứa vi sinh vật
- Hoá chất pha môi trường Czapek (xem phụ lục thành phần môi trường)
Phương pháp tiế n hành
Hình 1.1 Sơ đồ thí nghi ệ m a Pha chế môi trường dinh dưỡng
- Cân đong chính xác theo đơn (tính thành phần cho 300 ml môi trường Czapek)
- Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước các chất có khối lượng nhỏ hơn các chất có khối lượng lớn, hoà tan
Để đảm bảo chất lượng môi trường, cần kiểm tra và hiệu chỉnh pH nếu cần thiết Sử dụng lượng nước còn lại để tráng rửa cổ bình, phễu và các dụng cụ khác Lưu ý rằng thể tích môi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể tích của bình.
Cân thành phần môi trường Hoà tan trong nước
Bổ sung chất đông tụ
Phân phối vào dụng cụđựng
Lọc, điều chỉnh pH nếu cần thiết Môi trường lỏng Môi trường đặc Đun nóng làm tan chất đông tụ
Phân phối vào dụng cụ đựng
Thanh trùng Để nguội Để nghiêng Đổ hộp petri
Môi trường lỏng Môi trường thạch đứng Môi trường thạch nghiêng
Một số thành phần môi trường có nồng độ thấp, do đó cần pha chế dung dịch có nồng độ lớn hơn để tính toán lượng thể tích cần sử dụng trong môi trường.
Một số thành phần dễ phân hủy bởi nhiệt như vitamin và kháng sinh không nên được bổ sung ngay từ đầu trong quá trình thanh trùng Thay vào đó, các thành phần này cần được pha thành dịch, lọc vô trùng và sau đó phối trộn vào môi trường sau khi đã hoàn tất quá trình thanh trùng.
- Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc
- Lọc bằng lòng trắng trứng
- Dùng phễu lọc nóng c Bổ sung chất đông dính
- Bổ sung chất đông dính 2% khối lượng theo thể tích môi trường
- Gia nhiệt cho tan chất đông dính, chú ý tránh để trào môi trường d Phân phối môi trường
- Môi trường thạch nghiêng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm (~ 5 -6 ml)
- Môi trường thạch đứng 1/3 thể tích ống nghiệm (~ 10 ml)
- Môi trường lỏng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm
- Chú ý: Môi trường trong hộp petri được phân phối sau khi đã thanh trùng môi trường, thể tích dịch từ 15 -20 ml)
Hình 1.2 Phân ph ối môi trườ ng vào d ụ ng c ụ đự ng d Khửtrùng môi trường b ằng hơi nướ c bão hòa áp su ấ t
- Xem phần hướng dẫn sử dụng nồi thanh trùng e Bảo quản và kiểm tra môi trường
- Bảo quản môi trường: Giữmôi trường ở nhiệt độ thấp 0-5 o C tránh quá khô, nóng, nhiều ánh sáng
Để kiểm tra môi trường nuôi cấy vi sinh vật, hãy đặt nó vào tủ ấm với nhiệt độ 30-32°C trong vài ngày Nếu môi trường xuất hiện tình trạng vẩn đục hoặc có sự phát triển của khuẩn lạc, cần phải loại bỏ ngay lập tức.
- Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối bằng cách thao tác xung quanh ngọn lửa đèn cồn hoặc trong các tủ cấy vô trùng
Ngọn lửa đèn cồn tạo dòng không khí nóng vô trùng đối lưu trong phạm vi khoảng 20 cm quanh ngọn lửa đèn cồn như trong hình sau:
Hình 1.3 Ph ạ m vi làm vi ệ c bên ng ọ n l ửa đèn cồ n
Một sốphương pháp gieo cấy
Vật liệu : canh trường chứa vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng vô trùng
Dụng cụ: Que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang
Khi chuyển vi sinh vật từ môi trường giống sang môi trường dinh dưỡng vô trùng, việc lựa chọn kỹ thuật cấy và dụng cụ cấy phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm, loại môi trường giống (lỏng hoặc đặc), cũng như loại và dụng cụ chứa môi trường dinh dưỡng như thạch đứng, thạch nghiêng, hộp Petri, ống nghiệm, hoặc bình tam giác Các bước cấy cần được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo kết quả thí nghiệm đạt yêu cầu.
+ Vệ sinh khu vực cấy, bật ngọn lửa đèn cồn (hoặc đèn khí nếu thao tác trong tủ cấy)
+ Khử trùng que cấy bằng cách đốt nóng đỏđầu que cấy, lướt nhẹ phần thân que cấy qua ngọn lửa đèn cồn
Chờ que cấy nguội, sau đó đưa que cấy đã vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống Chạm nhẹ đầu que cấy vào phần không chứa canh trường của ống giống để làm nguội que cấy Tiếp theo, lấy canh trường từ ống giống và chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng, thực hiện thao tác cấy theo hướng dẫn chi tiết bên dưới.
+ Lấy que cấy ra, khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và đặt tất cả lên giá
Chú ý : sau khi mở ống nghiệm và trước khi đóng lại, hơ miệng ống trên ngọn lửa đèn cồn
Gieo c ấy vào môi trườ ng l ỏ ng :
Trong quy trình cấy ghép vi sinh vật, sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng để lấy một lượng nhỏ mẫu từ canh trường đặc Sau đó, chuyển mẫu này sang môi trường dinh dưỡng lỏng bằng cách lắc que cấy hoặc cọ vào thành ống nghiệm hoặc bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng lỏng, giúp sinh khối từ que cấy hòa tan vào môi trường.
- Từ canh trường lỏng, sử dụng pipette (với đầu tip vô trùng) hút một lượng canh trường lỏng rồi bơm vào môi trường lỏng vô trùng
Gieo c ấ y trên m ặ t th ạ ch nghiêng :
Thạch nghiêng là phương pháp hiệu quả để bảo quản vi sinh vật lâu dài nhờ vào lớp thạch dày và bề mặt bay hơi thấp, giúp giảm thiểu sự thất thoát hơi nước trong quá trình lưu trữ so với môi trường trong hộp Petri.
Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, có thể sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng để đưa sinh khối vi sinh vật từ môi trường giống xuống đáy thạch Sau đó, dịch chuyển que cấy trên mặt thạch cho đến khi cách miệng ống nghiệm khoảng 0.5 – 1 cm Trong quá trình cấy, que cấy nên được di chuyển theo đường zigzag dày để phủ kín mặt thạch, hoặc theo đường thẳng và các đường song song Phương pháp này được gọi là cấy theo vết cấy cạn dần.
Dùng que c ấy đâm sâu vào thạch đứ ng :
Thạch đứng là môi trường nuôi cấy lý tưởng cho vi sinh vật kỵ khí tùy tiện và vi sinh vật vi hiếu khí Đối với vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, cần sử dụng các dụng cụ và kỹ thuật nuôi cấy đặc biệt Vi sinh vật kỵ khí thường phát triển ở đáy sâu của lớp thạch, trong khi vi sinh vật hiếu khí phát triển trên bề mặt thạch, nơi có nồng độ oxy cao hơn.
- Thạch đứng cũng được sử dụng đểxác định khảnăng di chuyển của vi sinh vật cần nghiên cứu
Vi sinh vật không có khả năng di động thường phát triển theo chiều dọc của đường cấy, trong khi vi sinh vật có khả năng di chuyển nhờ vào tiên mao có xu hướng phát triển từ đường cấy thẳng đứng ra phía thành ống nghiệm.
Hình 1.4: C ấy đâm sâu vào môi trườ ng th ạch đứng theo dõi đặ c tính di chuy ể n c ủ a vi sinh v ậ t
Sử dụng que cấy thẳng, lấy mẫu canh trường và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch đứng vô trùng Đặt que cấy ở vị trí trung tâm của mặt thạch, sau đó đâm sâu xuống đáy ống nghiệm bằng động tác dứt khoát và rút nhanh que cấy ra khỏi ống nghiệm.
Hộp Petri chứa một lớp mỏng môi trường dinh dưỡng từ 3 đến 5 mm, cho phép phân lập vi sinh vật nhờ bề mặt nuôi cấy lớn Kỹ thuật này yêu cầu tách các vi sinh vật để phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt Tuy nhiên, do lớp môi trường mỏng và bề mặt bay hơi lớn, hộp Petri không phù hợp để bảo quản vi sinh vật trong thời gian dài như các canh trường trong thạch nghiêng.
Khi gieo cấy vi sinh vật lên hộp Petri, có thể sử dụng các cách sau :
Sử dụng que cấy vòng (tránh que cấy thẳng để không làm xước mặt thạch), tiến hành cấy theo bốn đường zigzag ở bốn góc hộp hoặc theo các đường song song, nhằm giảm dần mật độ tế bào vi sinh vật từ góc cấy đầu tiên đến góc cấy cuối cùng Nếu cần, có thể đốt nóng que cấy để tiêu diệt một phần vi sinh vật sau mỗi góc cấy, sau đó sử dụng que cấy vô trùng để kéo vi sinh vật từ góc cấy trước sang góc cấy tiếp theo (kỹ thuật streak).
Hình 1.5: Cách c ấ y trên h ộ p petri b ằng phương pháp vế t c ấ y c ạ n d ầ n
Một số cách cấy khác trên môi trường hộp petri như (các cách này sẽđược thực hành ở các bài sau)
+ Cấy chẩm điểm : sử dụng que cấy móc, lấy canh trường giống rồi cấy chấm điểm lên 3, 4 hoặc
5 điểm trên môi trường trong hộp Petri thành 3 cạnh của tam giác đều, 4 đỉnh của hình vuông, hoặc
4 đỉnh của hình vuông và một điểm tâm hình vuông
Khi chuyển mẫu từ môi trường lỏng sang môi trường thạch trong hộp Petri, hãy sử dụng pipette để hút một lượng canh trường từ 50 đến 100 µl và nhỏ lên bề mặt thạch Sau đó, sử dụng que trang để trải đều canh trường trên bề mặt thạch cho đến khi mặt thạch se lại.
Báo cáo thí nghi ệ m
1 Mục đích của bài thí nghiệm:
2 Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu a Dụng cụ thí nghiệm b Phương pháp nghiên cứu
3 Kết quả và thảo luận
Quan sát các khuẩn lạc từ nhiều góc độ, bao gồm từ trên xuống và từ bên cạnh, là rất quan trọng Cần chú ý đến kích thước và hình dạng của khuẩn lạc, cũng như hình dạng mép và bề mặt Độ dày, sự hiện diện của núm, độ trong và màu sắc (cả trên và dưới) cũng cần được ghi nhận, cùng với việc xác định xem khuẩn lạc có khuếch tán ra môi trường hay không.
Hình 1.6: Nh ận xét đặc điể m hình thái khu ẩ n l ạ c
PHÂN L Ậ P VI SINH V Ậ T- Phân l ậ p vi sinh v ậ t hi ế u khí có kh ả năng sinh tổ ng h ợ p amylase 12 1 M ở đầ u
Phương pháp
- Chuẩn bị dụng cụvà môi trường
+ 02 Bình tam giác chứa 99 mL nước muối sinh lý
+ 01 Ống falcon 50 mL chứa 40 mL nước muối sinh lý
+ 120 mL Môi trường Czapek đặc thay đường saccharose bằng tinh bột tan
+ Tất cả bình tam giác, ống falcon, môi trường, hộp đầu côn, ống effendorf, que trang cần thanh trùng tại 110 o C, 30 phút
+ Sau thanh trùng, sinh viên chuẩn bị 06 hộp petri chứa môi trường Czapek-tinh bột
+ Đối với mẫu bánh men cần nghiền nhỏtrước khi thực hiện
+ Lấy 1 lượng bánh men hoặc tương bần cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 99 mL nước đã vô trùng, lắc đều
+ Pha loãng trong ống effendorf (nồng độ pha loãng thảo luận trên lớp) Pha loãng theo hệ số 10
+ Sử dụng pipette hút 100 L ra hộp petri chứa môi trường Czapek-tinh bột, sử dụng que trang trang đều
+ Nuôi cấy trên trong tủnuôi tĩnh tại 30 o C, 2 ngày, quan sát khuẩn lạc, nhận xét
Hình 2.1 : Sơ đồ phân l ậ p vi sinh v ậ t hi ế u khí
Sau khi thực hiện các thao tác phân lập, chúng ta sẽ thu được canh trường tập trung chứa các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột Để đạt được canh trường thuần khiết, cần tiến hành cấy tách riêng từng khuẩn lạc vi sinh vật quan tâm trên môi trường riêng và kiểm tra độ thuần khiết của chúng.
Trong quá trình phân lập vi sinh vật, việc bổ sung kháng sinh là cần thiết để ức chế các loài không mong muốn Cụ thể, cycloheximide có thể được sử dụng để ức chế nấm, trong khi tetracycline được dùng để ức chế vi khuẩn.
1 Mục đích của bài thí nghiệm
2 Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
3 Kết quả và thảo luận
- Vẽ hình/chụp ảnh đĩa petri có chứa các khuẩn lạc
Tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ nhiều góc độ, bao gồm từ trên xuống và từ bên cạnh Cần chú ý đến các đặc điểm như kích thước, hình dạng, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, sự xuất hiện của núm, độ trong suốt và màu sắc cả trên và dưới khuẩn lạc, cũng như khả năng khuếch tán ra môi trường xung quanh.
- Kết luận rút ra từ bài thí nghiệm
PHÂN L Ậ P VI SINH V Ậ T- Phân l ậ p vi sinh v ậ t y ế m khí
- Một trong những yếu tố quan trọng mà vi khuẩn và nhiều loại vi sinh vật khá nhạy cảm đó là sự có mặt của oxy
+ Những vi sinh vật chỉ phát triển khi có O 2 được gọi là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc
+ Vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện sẽ phát triểnngay cả khi có O2 nhưng chúng thường phát triển tốt hơn khi không có khí này
+ Vi sinh vật kỵ khí nghiêm ngặt sẽ chỉ phát triển khí không có O 2
- Trong bài thí nghiệm này, sinh viên sẽ làm quen với việc phân lập vi sinh vật yếm khí tuỳ tiện; sử dụng phương pháp đổ thạch hai lớp.
V ậ t li ệ u và phương pháp
Phương pháp thự c hi ệ n
Chuẩn bị dụng cụvà môi trường nuôi cấy
- Chuẩn bị môi trường MRS cho 6 hộp Petri (~120 ml), thanh trùng
- Môi trường thạch Agar 1.5% (~ 60 mL), sau thanh trùng và giữấm tại 45-50 0 C trong bểổn nhiệt
- Dụng cụ bao gồm effendorf, đầu côn, que trang, nước được thanh trùng trước khi tiến hành thí nghiệm
- 40 ml nước muối sinh lý trong ống falcon 50 ml, thanh trùng
- Hút vào các ống effendorf, mỗi ống 0,9 mL nước muối sinh lý đã vô trùng
- Hút 0,1 mL sữa chua vào ống effendorf đã chứa 0,9 mL nước muối sinh lý vô trùng; tiến hành pha loãng tới nồng độ 10 -1 , 10 -2 ,10 -3
Hình 3.1 : Sơ đồ phân l ậ p vi sinh y ế m khí
- Sử dụng pipette để cấy 100 l dịch đã pha loãng lên bề mặt hộp petri, sử dụng que trang trang đều
- Đổ lên trên lớp thạch dinh dưỡng thứ nhất, lớp thứ hai thach agar, đợi thạch đông
- Nuôi cấy 37 o C trong vòng 2-4 ngày
1 Mục đích của bài thí nghiệm
2 Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
3 Kết quả và thảo luận
- Vẽ hình/chụp ảnh đĩa petri có chứa các khuẩn lạc
Quan sát các khuẩn lạc từ nhiều góc độ, bao gồm từ trên xuống và từ bên cạnh, là rất quan trọng Chú ý đến kích thước, hình dạng, và mép của khuẩn lạc, cũng như bề mặt và độ dày Cần xác định xem khuẩn lạc có núm hay không, độ trong suốt, màu sắc ở cả phía trên và dưới, và liệu có sự khuếch tán ra môi trường xung quanh hay không.
- Kết luận rút ra từ bài thí nghiệm
ĐỊNH LƯỢ NG VI SINH V ẬT: PHƯƠNG PHÁP CẤ Y TR ẢI TRÊN ĐĨA THẠ CH (SPREAD PLATE TECHNIQUE)
TRÊN ĐĨA THẠCH (SPREAD PLATE TECHNIQUE)
Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch là một kỹ thuật định lượng gián tiếp vi sinh vật, dựa vào sự phát triển của các khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng rắn Kỹ thuật này bao gồm hai phương pháp chính: cấy trải (spread plate technique) và cấy đổ (pour plate technique) Trong phương pháp cấy trải, mẫu nghiên cứu được trải đều trên bề mặt môi trường, trong khi ở phương pháp cấy đổ, mẫu được trộn với môi trường dinh dưỡng lỏng và sau đó đổ vào dụng cụ nuôi cấy để đông lại Mục tiêu của cả hai phương pháp này là xác định mật độ vi sinh vật sống có trong mẫu.
- Đơn vị của phép định lượng là số khuẩn lạc (CFU colony forming unit) /ml môi trường lỏng hoặc g môi trường rắn
Khi số lượng tế bào vi sinh vật trong mẫu phẩm đạt từ 10^5 đến 10^12 tế bào/ml, cần phải pha loãng mẫu nghiên cứu trước khi tiến hành trải đĩa hoặc đổ đĩa Mục tiêu là điều chỉnh mẫu sao cho số khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri 90 mm nằm trong khoảng từ 30 đến 300.
Để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu không khí, phương pháp đơn giản thường được sử dụng là phương pháp ước tính của Omelianxki Theo phương pháp này, khi mở một diện tích 100 cm² trong 5 phút, lượng vi sinh vật rơi xuống sẽ tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí.
V ậ t li ệu và phương pháp
Phương pháp
a Chuẩn bịmôi trường dinh dưỡng, vô trùng môi trường và dụng cụ cần thiết:
- Pha môi trường TSA và nước muối sinh lý để pha loãng như đã làm trong bài 2
- Các dụng cụ bao gồm ống Eppendorf, đầu tip, que trang đã được vô trùng trong nồi hấp áp lực và sấy khô
19 b Định lượng vi sinh vật trong mẫu vật rắn và lỏng
Hút 900 uL nước muối sinh lý đã được vô trùng vào từng ống Eppendorf 1.5 mL Số lượng ống Eppendorf cần chuẩn bị sẽ tùy thuộc vào sơ đồ pha loãng đã được thảo luận trong lớp học.
Cân 1 gram mẫu rắn hoặc hút 1 mL mẫu lỏng vào bình tam giác chứa 99 mL nước muối sinh lý vô trùng để pha loãng mẫu với tỷ lệ 1:100 Sau đó, lắc đều để trộn Đối với mẫu sinh vật kỵ khí, cần thực hiện bước pha loãng đầu tiên trong ống Eppendorf nhằm hạn chế vi sinh vật kỵ khí tiếp xúc với oxy Cuối cùng, lắc đều mẫu trong bình tam giác để đảm bảo vi sinh vật phân bố đồng đều trong dịch pha loãng.
Pha loãng mẫu theo hệ số 10 bằng cách hút 100 µL dịch pha loãng vào ống Eppendorf chứa nước muối sinh lý Sau khi hút mẫu, trộn đều bằng máy vortex ngay lập tức để đảm bảo mẫu được pha loãng đồng nhất.
Hình 4.1 Sơ đồ pha loãng và c ấ y m ẫ u ph ẩ m r ắ n M ức độ pha loãng tùy thu ộ c vào m ẫ u c ụ th ể đượ c s ử d ụ ng trong bu ổ i thí nghi ệ m
- Kí hiệu tên mẫu, độ pha loãng, tên nhóm thí nghiệm, ngày cấy mẫu vào đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng
- Hút 100 uL mẫu pha loãng vào trung tâm của đĩa Petri
- Sử dụng que trang vô trùng trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt môi trường dinh dưỡng đến khi mặt thạch se lại
- Lật ngược đĩa Petri sao cho đáy hộp Petri hướng lên phía trên, đưa vào tủ ấm để nuôi trong 24 –48h để khuẩn lạc hình thành
Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên đĩa thạch và lựa chọn những đĩa có số lượng khuẩn lạc từ 30 đến 300 để đảm bảo độ chính xác khi đếm Ghi lại số lượng khuẩn lạc trên đĩa tương ứng với độ pha loãng vào sổ thí nghiệm và sử dụng những giá trị này để thực hiện các phép tính cần thiết.
Để tính toán mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu, cần dựa vào số lượng khuẩn lạc và sơ đồ pha loãng Đối với mẫu không khí, phương pháp lắng của Omelianxki được áp dụng để xác định mật độ vi sinh vật.
- Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào phần đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng
- Đặt hộp Petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗkhông khí định nghiên cứu Chú ý lựa chọn những khu vực có không khí tĩnh, không có gió.
- Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút)
- Đậy nắp hộp, nuôi trong tủ ấm trong khoảng thời gian 24 – 48 giờ
- Đếm số khuẩn lạc có được trên mỗi đĩa thạch
- Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (πD 2 /4) rồi suy ra lượng vi sinh vật trong 1 lít hay 1 m 3 không khí theo ước tính của Omelianxki
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
2 Vật liệu và phương pháp
3 Kết quả và thảo luận: Sinh viên nhận xét chung về các khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch, báo cáo số lượng khuẩn lạc thu được trên mỗi đĩa, tính toán mật độ vi sinh vật trong mỗi mẫu
ĐỊNH LƯỢ NG VI SINH V Ậ T – PHƯƠNG PHÁP MPN
(SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) (MPN – MOST PROBABLE NUMBER) Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên
Phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN) là một kỹ thuật định lượng vi sinh vật phổ biến trong ngành thực phẩm và phân tích chất lượng môi trường MPN xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu một cách gián tiếp thông qua việc nuôi cấy trên môi trường lỏng trong các tổ hợp 3-5 ống nghiệm với độ pha loãng khác nhau Kết quả từ các ống dương tính cho phép tính toán giá trị mật độ vi sinh vật trong mẫu Bài viết này sẽ trình bày cách sinh viên kiểm tra ô nhiễm phân trong nước tự nhiên bằng phương pháp MPN.
Nước tự nhiên như sông, hồ là môi trường sống của nhiều vi sinh vật, bao gồm tảo và vi khuẩn Tuy nhiên, nước này có thể bị ô nhiễm phân qua nhiều con đường, đặc biệt là từ nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý, gây nguy hiểm khi sử dụng cho sinh hoạt hoặc thể thao Để đánh giá ô nhiễm phân, việc xác định vi sinh vật chỉ thị là cần thiết Coliform được coi là vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân vì chúng thường không có trong nước tự nhiên, tồn tại lâu hơn các vi sinh vật đường ruột khác, phần lớn không gây bệnh, và dễ phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy Coliform là nhóm vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, không sinh bào tử, có khả năng lên men lactose tạo acid và khí ở 35°C sau 48±2 giờ.
Để xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước, cần thực hiện ba bước xét nghiệm: thí nghiệm giả định, thí nghiệm xác nhận và thí nghiệm hoàn thành.
Thí nghiệm giả định (presumed test) là phương pháp cấy mẫu nước vào môi trường lactose nhằm xác định sự hiện diện của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose, tạo ra acid và khí sau 48±2 giờ ở nhiệt độ 35°C.
Thí nghiệm xác nhận (confirmed test) là quá trình chuyển mẫu từ môi trường trong ống dương tính sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm, chẳng hạn như môi trường thạch Eosin Methylene Blue (EMB) Mục đích của thí nghiệm này là để xác định việc lên men sinh khí không phải do vi khuẩn Gram dương, những loài cũng có khả năng thực hiện quá trình lên men sinh khí.
Trong thí nghiệm hoàn thành, các khuẩn lạc phát triển trên môi trường sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái để xác định xem chúng có phải là vi khuẩn Gram âm, hình que và không sinh bào tử, đặc trưng của vi khuẩn coliform hay không.
Trong bài thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành một thí nghiệm giả định nhằm định lượng vi khuẩn lên men lactose sinh khí Phương pháp được sử dụng là phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN - Most Probable Number), giúp xác định số lượng vi khuẩn một cách chính xác và hiệu quả.
Phương pháp MPN (Most Probable Number) được sử dụng để xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí bằng cách cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào 3-5 ống môi trường dinh dưỡng chứa lactose Số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng tính thống kê tiêu chuẩn Ngoài ra, MPN cũng có thể định lượng các loại vi sinh vật khác trong các mẫu môi trường khác nhau, với ưu điểm là không bị ảnh hưởng bởi các thành phần rắn lơ lửng, khác với phương pháp đếm trực tiếp hoặc đo quang.
2 Vật liệu và phương pháp
- Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL
- Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL
- Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong quá trình lên men lactose
Môi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công thức sau
B ả ng 5-1 Thành phần môi trường
Thành phần Nồng độ kép Nồng độđơn
Nước 1000 mL 1000 mL pH được điều chỉnh đến 6.8 ± 0.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp ngược theo hướng dẫn trong bảng sau:
B ả ng 5-2 Phân phối môi trường vào các ống nghiệm
Tổ hợp ống Môi trường Thể tích phân phối Sốlượng ống
Các ống chứa môi trường được đóng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 115°C trong 40 phút
Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN được thu thập theo tiêu chuẩn Việt Nam hoặc WHO Nước được chứa trong các bình đã được khử trùng, có nắp kín và được vận chuyển về phòng thí nghiệm, lưu giữ trong tủ lạnh cho đến khi phân tích Tùy thuộc vào loại nước và mức độ ô nhiễm dự đoán, các mẫu nước sẽ được pha loãng khác nhau trước khi cấy vào môi trường nuôi cấy.
Trước khi cấy vào môi trường vô trùng, bình chứa mẫu nước được lắc đều đểđảm bảo vi sinh vật phân bố đồng đều
Dùng pipette 10 mL cấy 10 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F1
Dùng micropipette cấy 1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F2
Dùng micropipette cấy 0.1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F3
Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35 o C
Hình 5.1 Sơ đồ pha loãng và c ấ y m ẫu nướ c vào các t ổ h ợ p ố ng ch ứa môi trườ ng lactose
Ki ể m tra k ế t qu ả và xác đị nh m ật độ vi khu ẩ n coliform trong m ẫu nướ c:
Sau 48 ± 2 giờ, kiểm tra số lượng ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống, với tiêu chí dương tính là có ít nhất 3 mm khí trong ống Durham Ghi lại số lượng ống dương tính để tạo thành bộ ba số, ví dụ, 3-2-2 cho các tổ hợp F1, F2 và F3 So sánh bộ số này với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn để xác định giá trị MPN trên 100 mL nước Nếu mẫu nước được pha loãng trước khi cấy, giá trị MPN sẽ được tính toán dựa vào hệ số pha loãng ban đầu.
B ả ng 5-3 Giá tr ị MPN trên 100 mL nướ c và gi ớ i h ạn độ tin c ậ y 95% khi b ộ ba ống đượ c c ấ y v ớ i 10 mL, 1 mL, và 0.1 mL m ẫu nướ c
Sốlượng ống cho kết quảdương tính
Giới hạn MPN ởđộ tin cậy 95%
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
2 Vật liệu và phương pháp
Kết quả nghiên cứu cho thấy số ống dương tính ở mỗi tổ hợp đã được báo cáo bởi sinh viên, từ đó suy ra giá trị MPN của nhóm vi khuẩn có khả năng lên men lactose sinh khí trong mẫu nước Điều này cho phép đánh giá mật độ của nhóm vi khuẩn này trong mẫu nước.
World Health Organization (1997) Annex 6: Multiple-tube method for thermotolerant (faecal) coliforms, In Guidelines for drinking-water quality, 2 nd Edition
Madigan MT, Martinko JM, Stahl DA & Clark DP (eds) (2011) Brock Biology of Microorganisms, 12 th edition Benjamin Cummings
Benson, T (2001) Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology 8th Edition, The McGraw-Hill, New York
ĐỊNH LƯỢ NG TR Ự C TI Ế P VI SINH V Ậ T - PHƯƠNG PHÁP BUỒNG ĐẾ M H Ồ NG C Ầ U
(Xác định chỉ tiêu chất lượng của canh trường nấm nem: mật độ tế bào nấm men)
- Định lượng trực tiếp là phương pháp đếm trực tiếp sốlượng tế bào vi sinh vật có trong tiêu bản chuẩn bị từ vật phẩm nghiên cứu
Phương pháp định lượng trực tiếp mang lại kết quả nhanh chóng, tuy nhiên, nó không thể cung cấp số liệu chính xác về số lượng vi sinh vật sống trong mẫu trước khi chuẩn bị tiêu bản.
- Trong bài này, mật độ tế bào nấm men được xác định bằng phương pháp trực tiếp sử dụng buồng đếm hồng cầu
- Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính thủy tinh dày có kích thước 30 x 70 mm và dày
Buồng đếm hồng cầu có kích thước 4 mm, được chia thành ba khu vực, với khu vực trung tâm chứa hai lưới đếm (lưới trên và lưới dưới) có độ sâu 0.1 mm Mẫu được đưa vào hai lưới này một cách độc lập Lưới đếm Neubauer, sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh, có kích thước 3 x 3 mm, chia thành 9 hình vuông 1 mm cạnh Hình vuông trung tâm được chia thành 25 hình vuông 0.2 mm cạnh, và mỗi hình vuông này lại chia thành 16 hình vuông nhỏ hơn 0.05 mm cạnh Hai thông số quan trọng của buồng đếm hồng cầu, bao gồm chiều sâu lưới đếm (0.1 mm) và diện tích ô nhỏ nhất (0.0025 mm²), được thể hiện ở khu vực bên trái của buồng đếm.
Hình 6.1 C ấ u t ạo và kích thướ c c ủ a bu ồng đế m h ồ ng c ầ u Neubauer
Hình 6.2 trình bày vị trí của lưới đếm cùng với hình ảnh quan sát được bằng mắt thường và qua các vật kính có độ phóng đại khác nhau (Nguồn: insilico.ehu.eus)
- Buồng đếm hồng cầu thường sử dụng để đếm tế bào máu, các vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc
2 Vật liệu và phương pháp
- Dung dịch H2SO4 10% hoặc NaOH 10%
- Buồng đếm hồng cầu, pipette thủy tinh, que cấy vòng, máy đếm cầm tay
Lắc đều canh trường nấm men cho đến khi không còn cặn sinh khối ở đáy ống Có thể sử dụng vortex để hỗ trợ quá trình này, nhưng cần lưu ý không để canh trường bắn lên nút bông.
- Làm việc trong điều kiện vô trùng, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường với
H2SO4 10% hoặc NaOH 10%, tùy canh trường mà mức độ pha loãng nhiều hay ít
- Vệ sinh buồng đếm hồng cầu và lá kính bằng cồn 70 o , để cồn bay hơi trước khi tiến hành thao tác tiếp theo
Sử dụng bông thấm nước và nước cất, nhẹ nhàng phết lên hai bên khoang của buồng đếm Sau đó, đặt lá kính lên và ấn nhẹ bằng ngón tay để lá kính dính chặt vào phiến kính Lưu ý để lá kính cách mép buồng đếm khoảng 1-2 mm, tạo khoảng không gian cho việc đưa canh trường vào lưới đếm.
- Đặt buồng đếm trên một mặt phẳng nằm ngang
Sử dụng pipet hoặc que cấy vòng để lấy canh trường đã pha loãng, sau đó chạm vào mép lá kính đã chuẩn bị trước Hãy để canh trường chảy từ từ vào lưới đếm; nếu dùng pipet, cần loại bỏ những canh trường đầu tiên.
Lưu ý rằng lượng canh trường cần được đưa vào một cách vừa đủ, tránh để canh trường tràn ra ngoài hoặc rơi xuống các rãnh Điều này cũng giúp ngăn chặn sự hình thành bọt khí trong lưới đếm.
- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút
- Sử dụng vật kính 10X để tìm khu vực có lưới đếm
- Xoay vật kính 40X vào vị trí sử dụng, chỉnh khay kính sao cho một ô có kích thước 0.2 x 0.2 mm nằm trọn trong kính trường
- Đếm số tế bào trong 5 ô chéo nhau, mỗi ô có kích thước 0.2 x 0.2 mm Hoặc có thể đếm 4 ô ở góc và 1 ô ở trung tâm
Chú ý: Nếu số lượng tế bào nấm men trong mỗi ô có kích thước 0.2 x 0.2 mm nằm ngoài khoảng giá trị 25 – 250 thì cần pha loãng lại canh trường
Với những tế bào nằm trên đường gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong ô đang đếm
- Tính giá trị trung bình và sai số của số lượng tế bào nấm men trong mỗi ô Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô
- Tính mật độ tế bào nấm men trong canh trường theo công thức 𝑎×1000×𝐷𝑓
𝑆×ℎ (tế bào/mL) Trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô
Df là hệ số pha loãng của canh trường h là bề sâu của lưới đếm
S là diện tích của ô tương ứng với số lượng tế bào trung bình đếm được
1000 là hệ số chuyển đổi 1mL = 1000 mm 3
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
2 Vật liệu và phương pháp
Trong phần kết quả và thảo luận, sinh viên cần mô tả tổng quát về tế bào nấm men đã quan sát, ghi lại số lượng tế bào đã đếm được và tính toán mật độ tế bào trong môi trường canh tác, bao gồm cả việc tính toán sai số Đồng thời, sinh viên cũng nên đưa ra nhận xét về mật độ tế bào trong môi trường canh tác đó.
M ục đích
Ti ế n hành
a Nuôi canh trường nấm men
Pha chế môi trường Crapek lỏng và phân phối 10 mL vào mỗi ống nghiệm Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 110 độ C trong 30 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Sử dụng que cấy, cấy nấm men vào trong ống nghiệm, nuôi 24-48 h tại 30 o C, lắc 150 rpm
32 b Tiêu bản giọt ép - đánh giá tỉ lệ tế bào sống chết của canh trường nấm men
Hình 7.1: quá trình làm tiêu b ả n gi ọ t ép
Để đảm bảo chất lượng khi sử dụng, hãy chuẩn bị phiến kính và lá kính sạch sẽ và khô Nếu cần thiết, bạn có thể dùng bông tẩm cồn để làm sạch chúng trước khi sử dụng.
- Cho vài giọt canh trường nấm men (đã chuẩn bị ở trên) lên trên phiến kính, thêm một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính (Hình 7.1-a)
- Sử dụng que cấy nhẹ nhàng trộn đều canh trường và thuốc nhuộm,
Đặt lá kính lên phiến kính với góc 45 độ, nhẹ nhàng đậy lá kính để tránh tạo bọt khí Để yên trong 2-3 phút trước khi quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40x.
- Quan sát tế bào nấm men sống và tế bào nấm men chế: tế bào chết bắt màu của thuốc nhuộm còn tế bào sống không màu
- Đếm lượng tế bào nấm men sống và tế bào nấm men chết ở 5 kính trường
+ Tỉ lệ tế bào nấm men chết
+ Tỉ lệ nấm men sống: c Tiêu bản giọt ép - đánh giá tỉ lệ tế bào nấm men nảy chồi
Để đảm bảo chất lượng công việc, hãy chuẩn bị phiến kính và lá kính sạch sẽ, khô ráo Nếu cần thiết, có thể sử dụng bông tẩm cồn để làm sạch chúng trước khi sử dụng.
- Cho vài giọt canh trường nấm men lên trên phiến kính và một giọt NaOH 10 % hoặc
- Sử dụng que cấy nhẹ nhàng trộn đều
- Lấy lá kính đặt lên phiến kính một góc 45 o , đậy nhẹ lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40 x
Tế bào nấm men nảy chồi được xác định qua việc quan sát tế bào con, trong đó tế bào con có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng một nửa kích thước của tế bào mẹ.
- Đếm lượng tế bào nấm men nảy chồi và tổng số tế bào nấm men ở 5 kính trường
+ Tỉ lệ tế bào nấm men nảy chồi: d Tiêu bản giọt ép - đánh giá khả năng nhiễm tạp của canh trường nấm men
Để đảm bảo chất lượng khi sử dụng, hãy chuẩn bị phiến kính và lá kính sạch sẽ và khô Nếu cần thiết, bạn có thể sử dụng bông tẩm cồn để làm sạch chúng trước khi sử dụng.
- Cho vài giọt canh trường nấm men lên trên phiến kính (a)
- Lấy lá kính đặt lên phiến kính một góc 45o, đậy nhẹ lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40 x
- Quan sát nếu thấy tất cả các tế bào trong canh trường có cùng đặc tính hình thái thì có thểsơ bộ kết luận độ sạch của canh trường
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần kết quả và thảo luận, sinh viên cần đánh giá khả năng nhiễm tạp của các canh trường nấm men đã sử dụng Cần ghi nhận đặc điểm hình thái tế bào nấm men, tính toán tỉ lệ tế bào sống, tỉ lệ tế bào chết và tỉ lệ tế bào nảy chồi Số liệu thu thập cần được xử lý thống kê để đưa ra các nhận định chính xác Cuối cùng, cần thảo luận về chất lượng của các canh trường nấm men đã quan sát được.
M ụ c tiêu
- Thực hành cách thức làm tiêu bản vi sinh vật cốđịnh và nhuộm màu đơn giản tiêu bản vi sinh vật để quan sát đặc điểm hình thái
- Quan sát đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn của một số canh trường
2 Vật liệu và phương pháp
- Vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus sp., Lactobacillus sp
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: môi trường TSA
- Thuốc nhuộm: xanh methylen 1% hoặc fusin 1%
- Ống nghiệm, bông, que cấy
- Kính hiển vi vật kính 40x, 100x, dầu soi vật kính, toluen
2.2 Phương pháp tiến hành a Nuôi canh trường vi khuẩn
Pha chế môi trường lỏng và phân phối vào từng ống nghiệm với thể tích 10 mL Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 110 độ C trong 30 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Sử dụng que cấy, cấy vi khuẩn vào trong ống nghiệm, nuôi 24-48 h tại 37 o C, lắc 120 rpm
35 b Làm tiêu bảo cố định vi sinh vật
Hình 8.1 Cách th ứ c làm v ế t bôi tiêu b ả n c ố đị nh vi sinh v ậ t
- Chuẩn bị một phiến kính sạch và khô
- Lấy canh trường vi sinh vật: thao tác tương tự như cách lấy giống vi sinh vật (hình 1)
- Nghiêng que cấy 10 - 15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra phiến kính; Làm xong, sát trùng que cấy để lên giá
- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải
- Vết bôi tròn, gọn và thật mỏng
- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều
Bước 2 Làm khô vết bôi
Để làm khô vết bôi, bạn có thể để nó khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên phần không khí nóng của đèn cồn Tránh việc đốt nóng trực tiếp, vì điều này có thể khiến tế bào mất nước và làm thay đổi cấu trúc của nó Đảm bảo vết bôi thật khô trước khi tiếp tục các bước tiếp theo.
Bước 3 Cố định vết bôi
M ục đích: Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
- Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là loại vi sinh vật gây bệnh)
- Gắn chặt vi sinh vật và phiến kính để lúc nhuộm, rửa chúng không bị trôi
+ Phương pháp dùng nhiệt: Là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất
Kẹp phiến kính giữa hai ngón tay các và trỏ, hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn đèn cồn, tránh không để tiêu bản nóng quá
Hình 8.2: C ố đị nh vi sinh v ậ t s ử d ụ ng ng ọ n l ửa đèn cồ n
Phương pháp sử dụng hóa chất để cố định tế bào là cần thiết trong nghiên cứu cấu trúc tế bào, vì việc hơ nóng có thể gây hại và làm biến dạng tế bào Hóa chất như rượu và axeton thường được sử dụng, giúp bảo tồn hình dạng và cấu trúc của tế bào mà không làm đứt các tiên mao.
Rượu etylic có thể được sử dụng để điều trị vết thương bằng cách nhỏ hoặc nhúng vết thương vào rượu Rượu tuyệt đối mang lại tác dụng ngay lập tức, trong khi rượu 95 độ cần ngâm từ 5 đến 15 phút; thời gian ngâm sẽ kéo dài hơn nếu rượu càng loãng.
- Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút
Bước 4: Nhuộm màu đơn giản tiêu bản vi sinh vật cốđịnh
Hình 8.3: Nhu ộ m màu và r ử a màu tiêu b ả n vi sinh v ậ t c ố đị nh
Để nhuộm màu hiệu quả, hãy nhỏ thuốc nhuộm đều lên vết bôi, chú ý không sử dụng quá nhiều Trong suốt quá trình nhuộm, luôn đảm bảo lớp thuốc nhuộm phủ đều trên vết bôi.
Trong quá trình nhuộm tiêu bản, thời gian và loại thuốc nhuộm sử dụng rất quan trọng Đối với thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl, cần để yên từ 1 đến 2 phút, trong khi đó thuốc nhuộm xanh metylen yêu cầu thời gian là 3 phút Tất cả các bước này cần được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ phòng để đảm bảo chất lượng tiêu bản.
Sau khi nhuộm, hãy đổ bỏ thuốc nhuộm và rửa sạch bằng cách nghiêng phiến kính, cho dòng nước chảy nhẹ qua Nước sẽ giúp cuốn trôi thuốc nhuộm Lưu ý không xối nước trực tiếp lên vết bôi để tránh làm trôi vi sinh vật.
- Vẩy nước, dùng giấy thấm khô hoặc hơ nhẹ trên đèn cồn
- Quan sát tiêu bản ử vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x100) soi dầu
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
+ Kết quả - thảo luận: trong phần này sinh viên cần ghi nhận lại đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn
V ậ t li ệu và phươn g pháp
Phương pháp tiế n hành
a Nuôi canh trường vi khuẩn
- Pha chế môi trường lỏng, phân phối vào ống nghiệm mỗi ống nghiệm chứa 10 mL Thanh trùng môi trường tại 110 o C trong 30 phút Làm nguội môi trường
- Sử dụng que cấy, cấy vi khuẩn vào trong ống nghiệm, nuôi 24 h tại 37 o C, lắc 120 rpm b Làm tiêu bảo cố định vi sinh vật c Nhuộm màu Gram 1
- Nhỏ dung dịch tím tinh thể phủ kín vết bôi đã khô, để trong thời gian 1 phút (Hình 1a)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất (Hình 1b)
1 Dựa theo Gram stain protocols – American society for microbiology
- Nhỏ dung dịch lugol phủ kín vết bôi, để trong thời gian 1 phút (Hình 1c)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất (Hình 1d)
- Ngâm trong dung dịch tẩy màu 15 s, hoặc nhỏ từng giọt dung dịch tẩy màu lên vết bôi đến khi dịch rửa có màu sáng (Hình 1e)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất (Hình 1f)
-Nhỏ dung dịch màu thứ hai (fusin) phủ kín vết bôi, để từ 30-60 s (Hình 1g)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất, sử dụng giấy thấm làm khô vết bôi (Hình 1h)
- Quan sát dưới kinh hiển vi bằng vật kính dầu (90x hoặc 100x) (Hình 1k)
Hình 9.1: Quy trình nhu ộ m Gram
- https://www.youtube.com/watch?v=AZS2wb7pMo4
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần kết quả và thảo luận, sinh viên cần ghi nhận đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn, bao gồm kích thước, hình dạng và cấu trúc bề mặt Đồng thời, cần mô tả màu sắc của tế bào sau khi nhuộm Gram, từ đó đưa ra kết luận về loại Gram của canh trường vi khuẩn, giúp xác định tính chất và phân loại vi khuẩn một cách chính xác.
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN – PHƯƠNG PHÁP SỬ D Ụ NG Ố NG DUHAM 41 1 M ở đầ u
Quá trình lên men rượu sử dụng nấm men tạo ra hai sản phẩm chính là rượu ethylic và khí CO 2
Để xác định hoạt lực lên men của nấm men, các nhà nghiên cứu có thể dựa vào khả năng thoát khí CO2 trong quá trình lên men Ống Durham, một ống thủy tinh nhỏ, được sử dụng để thu thập khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men rượu Các chủng nấm men khác nhau sẽ có cường độ lên men khác nhau, vì vậy việc đo chiều cao cột khí CO2 bằng ống Durham là phương pháp cơ bản để tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao.
Trong bài thí nghiệm này, sinh viên sẽ thực hành:
- Chuẩn bịmôi trường lên men rượu chứa đường saccharose
- So sánh, đánh giá định tính khảnăng lên men của các chủng nấm men thông qua khảnăng tạo khí CO2 trong môi trường chứa đường saccharose
- Lượng khí CO2 sinh ra được so sánh thông qua chiều cao cột khí trong ống Duham
Hình 10.1: Ố ng Duham (a), khí tích t ụ trong ố ng Duham (b)
2 V ậ t li ệu và phương pháp
- Môi trường nuôi cấy tế bào nấm men: môi trường Crapek
- Ống nghiệm, ống nghiệm Duham
- Pipet và đầu côn, hộp đầu côn 1000 L; 100 L
2.2 Phương pháp tiến hành a Chế tạo canh trường nấm men
Pha chế môi trường Crapek lỏng và phân phối vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 10 mL Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 110 độ C trong 30 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Sử dụng que cấy, mỗi mỗi ống nghiệm 01 chủng nấm men, nuôi cấy trong tủ lắc tại nhiệt độ 30 o C trong vòng 24-36 h b Chế tạo môi trường lên men
Pha chế môi trường lên men lỏng và phân phối vào từng ống nghiệm với dung tích 10 mL Mỗi ống nghiệm được trang bị một ống Duham úp ngược để theo dõi quá trình lên men Sau đó, tiến hành thanh trùng môi trường để đảm bảo tính vô trùng và hiệu quả của quá trình lên men.
110 o C trong 30 phút Làm nguội môi trường
Sử dụng pipette để lấy 5-10% v/v thể tích canh trường nuôi cấy nấm men và chuyển vào ống nghiệm có ống Duham Tiến hành nuôi cấy tĩnh tại nhiệt độ 30ºC trong khoảng 24-48 giờ Sử dụng thước đo để xác định độ cao của cột khí trong ống Duham.
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần thảo luận, sinh viên cần ghi nhận chiều cao của cột khí trong ống Duham và so sánh chiều cao này giữa các chủng nấm men Qua đó, có thể rút ra kết luận về khả năng lên men của từng chủng nấm men được so sánh.
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔ NG H Ợ P ENZYME AMYLASES
Các phân tử tinh bột có kích thước lớn, khó thâm nhập qua màng tế bào vi sinh vật, do đó chỉ những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme α-amylase ngoại bào mới có thể thủy phân tinh bột thành các hợp chất nhỏ hơn như dextrin, maltose hoặc glucose.
- So sánh, đánh giá khả năng sinh enzyme -amylase của các chủng vi sinh vật sử dụng môi trường chọn lọc chứa tinh bột
Khả năng sinh tổng hợp enzyme được đánh giá thông qua việc xác định đường kính vòng tròn thủy phân trên môi trường tinh bột, nhờ vào phản ứng màu giữa tinh bột và iot.
Hình 1.1: Hình ả nh khu ẩ n l ạ c và vòng tròn phân gi ả i sau khi nhu ộ m màu
2 Vật liệu và phương pháp
- Các chủng vi sinh vật cần đánh gía khả năng sinh tổng hợp amylase
- Môi trường đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase môi trường Czapek, thay nguồn saccharose bằng tinh bột
- Dung dịch iot (1 g I2, 2 g KI, 300 mL nước cất)
2.2 Phương pháp tiến hành a Chế tạo canh trường đánh giá hoạt tính emzyme amylase trong hộp petri
Môi trường Czapek được pha chế bằng cách thay thế nguồn đường saccharose bằng tinh bột và được thanh trùng ở nhiệt độ 110 o C trong 30 phút Sau đó, môi trường được đổ vào hộp petri để đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme -amylase.
- Sử dụng que cấy đầu móc cấy chấm điểm các chủng vi sinh vật cần đánh giá hoạt tính sinh -amylase
- Nuôi cấy trong tủ nuôi tĩnh 2 ngày tại nhiệt độ 30 o C
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật trên hộp petri bằng cách sử dụng dịch lugol hoặc iot 1% Đổ dung dịch này vào hộp petri để bao phủ toàn bộ bề mặt, để yên trong 3-5 phút, sau đó loại bỏ dung dịch dư và rửa lại bằng nước.
Quan sát và ghi nhận đường kính của vòng tròn phân giải cùng với đường kính khuẩn lạc, sau đó so sánh tỷ lệ giữa đường kính vòng tròn thủy phân và đường kính khuẩn lạc.
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần kết quả và thảo luận, sinh viên cần ghi lại đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng tròn phân giải Việc so sánh tỉ lệ giữa hai đường kính này sẽ giúp rút ra kết luận về khả năng tổng hợp enzyme amylase của các chủng vi sinh vật.
MỘT SỐ THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ
N ồ i h ấ p thanh trùng
Nguyên tắc gia nhiệt bằng hơi nước bão hòa dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển giúp tăng nhiệt độ hiệu quả Khi áp suất hơi nước tăng, nhiệt độ cũng sẽ tăng theo, tạo ra điều kiện lý tưởng cho quá trình gia nhiệt.
Nồi hấp áp lực là thiết bị hai vỏ có khả năng chịu áp suất cao, với nước được chứa trong khoang riêng và được làm nóng trực tiếp bởi sợi đốt để chuyển hóa thành hơi nước áp suất cao Hơi nước này tiếp xúc với bề mặt vật liệu cần khử trùng, truyền nhiệt và ngưng tụ lại, trong khi nước ngưng sẽ được xả qua van xả nước ngưng ở đáy nồi.
Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của nồi hấp áp lực:
Các giai đoạn hoạt động trong quá trình khử trùng bằng nồi hấp áp lực:
Hình 0.2 : Các giai đoạ n ho ạt độ ng trong quá trình kh ử trùng b ằ ng n ồ i h ấ p áp l ự c
Gi ớ i thi ệ u cách v ậ n hành n ồ i h ấ p áp l ự c:
Để khử trùng hiệu quả, cần đưa vật liệu và môi trường vào nồi hấp, đảm bảo các vật liệu được bao gói hợp lý Phương pháp khử trùng này chỉ áp dụng cho những vật liệu và môi trường có khả năng chịu được áp lực và nhiệt độ cao.
+ Kiểm tra mực nước trong nồi, bổ sung nước cất hoặc nước mềm nếu cần thiết
+ Đặt điều kiện khử trùng (áp suất, thời gian, v.v.)
+Đóng nắp nồi hấp, mở van xảđáy
+ Khi hơi nước thoát ra nhiều từ van xảđáy khoảng 1-2 phút thì để đóng van xảđáy lại Lúc này, khí không ngưng thoát hết khỏi không gian buồng hấp
Khi van xả đáy đóng, hơi nước được giữ lại trong buồng hấp, dẫn đến việc áp suất tăng cao đến mức đã được thiết lập trước đó Tại thời điểm này, quá trình tính toán thời gian khử trùng bắt đầu Trong suốt quá trình khử trùng, áp suất hơi nước bão hòa được duy trì ổn định ở mức áp suất đã định.
Sau khi kết thúc quá trình khử trùng, hãy tắt nồi hấp và chờ áp suất trong buồng hấp giảm về 0 Tiếp theo, mở van xả đáy và đợi nhiệt độ giảm xuống còn 70 – 80 độ C (nếu nồi hấp có đồng hồ chỉ nhiệt độ) Cuối cùng, mở nắp nồi hấp và lấy dụng cụ cùng môi trường cần khử trùng ra ngoài.
Khi chuẩn bị môi trường trong hộp Petri, cần pha và chứa môi trường trong bình tam giác, sau đó khử trùng trước khi đổ vào các hộp Petri khi môi trường còn ở dạng lỏng.
T ủ vô trùng d ạ ng th ổi đứ ng – clean bench
Hình 0.3: T ủ vô trùng dòng khí th ổi đứ ng và chi ề u dòng khí Đặc điểm:
- Dòng không khí được làm sạch thông qua bộ lọc HEPA đặt phía trên cùng của tủ, đi từ trên xuống và vềphía người làm việc
Tủ vô trùng được thiết kế để cung cấp khí sạch, nhằm bảo vệ sản phẩm trong quá trình làm việc Thiết bị này chỉ nên được sử dụng khi thao tác với vi sinh vật an toàn, không sinh bào tử, và trong các phản ứng PCR.
Để đảm bảo an toàn, hãy nâng kính chắn lên vị trí an toàn Máy sẽ tự động khởi động chức năng thổi khí để làm sạch tủ trong vòng 3 phút Sau khi thời gian này kết thúc, đèn sẽ tự động bật lên để báo hiệu và tiến hành vệ sinh bằng cồn.
- Cho mẫu và dụng cụ thực hành vào (nếu cần vô trùng mẫu và dụng cụ, hạ kính bật đèn
- Thực hành các thao tác cấy vi sinh vật Trong quá trình làm việc:
Có thể bật/tắt đèn chiếu sáng bằng phím
Có thể cấp điện cho các thiết bị dùng trong tủ cấy (cân, vortex, ) bằng phím
- Sau khi kết thúc dọn đề, vệ sinh tủ bằng cồn 70 o , sau đó hạ kính xuống, bật UV để vệ sinh tủ
- Vệ sinh khu vực xung quanh chỗ làm và ghi nhật ký sử dụng
- Nếu trong quá trình làm có sử dụng đèn gaz thì cần khoá bình gaz sau khi sử dụng
Chỉ nên sử dụng đèn cồn khi cần thiết để nung nóng que cấy, que trang, miệng ống nghiệm và miệng bình nuôi Lưu ý không được đốt đèn cồn rồi đóng cửa tủ cấy Đèn UV sẽ tự động tắt sau 30 phút kể từ khi bật.
Không được tắt quạt khi đang sử dụng đèn cồn hoặc đèn gas
Khi đóng cửa buồng cấy hoàn toàn, quạt sẽ tự động tắt
Trong thời gian khởi động đếm ngược 3 phút, không kéo cửa buồng cấy xuống
T ủ c ấ y an toàn sinh h ọ c c ấ p 2 – Biosafety Cabinet
Hình 0.4 T ủ an toàn sinh h ọ c c ấ p 2 và chi ề u dòng khí Đặc điểm:
- Dòng không khí được làm sạch thông qua bộ lọc HEPA đặt phía trên cùng của tủ, đi từ trên xuống và hút vào phía sau của tủ
Tủ an toàn sinh học cao cấp 2 không chỉ bảo vệ sản phẩm mà còn đảm bảo an toàn cho người làm việc Thiết bị này cho phép sử dụng các chủng vi sinh vật có bào tử, bao gồm vi khuẩn sinh bào tử và nấm, một cách hiệu quả và an toàn.
Kéo cửa kính đến vị trí "SASH HEIGHT" (chấm đen) để quạt tự động hoạt động Màn hình sẽ hiển thị đếm ngược 3 phút, sau thời gian này bạn có thể bắt đầu làm việc với tủ.
Để vệ sinh tủ, sử dụng cồn 70 độ và cho mẫu cùng dụng cụ thực hành vào bên trong Nếu cần vô trùng mẫu và dụng cụ, hãy hạ kính và bật đèn UV Trong suốt quá trình làm việc, cần đảm bảo tuân thủ các biện pháp an toàn vệ sinh.
Có thể bật/tắt đèn chiếu sáng bằng phím ( )
Có thể cấp điện cho các thiết bị dùng trong tủ cấy (cân, vortex, ) bằng phím ( )
- Sau khi kết thúc dọn đề, vệ sinh tủ bằng cồn 70 o , sau đó hạ kính xuống, bật UV để vệ sinh tủ
- Vệ sinh khu vực xung quanh chỗ làm và ghi nhật ký sử dụng
- Chú ý: nếu trong quá trình làm có sử dụng đèn gaz thì cần khoá bình gaz sau khi sử dụng
Chỉ nên sử dụng đèn cồn khi cần thiết để nung nóng que cấy, que trang, miệng ống nghiệm và miệng bình nuôi Cần lưu ý không được đốt đèn cồn rồi đóng cửa tủ cấy Đèn UV sẽ tự động tắt sau 30 phút kể từ khi bật.
Không được tắt quạt khi đang sử dụng đèn cồn hoặc đèn gas
Khi đóng cửa buồng cấy hoàn toàn, quạt sẽ tựđộng tắt
Trong thời gian khởi động đếm ngược 3 phút, không kéo cửa buồng cấy xuống
T ủ nuôi tĩnh
Hình 0.5 T ủ nuôi tĩnh FOC215E Đặc điểm:
- Tủ nuôi tĩnh có nhiệt độ làm việc từ 3-50 o C
- Sử dụng để nuôi tĩnh các vi sinh vật trong dải nhiệt độ làm việc của tủ
- Bật máy, cài đặt nhiệt độ mong muốn
- Ghi nhật ký sử dụng thiết bị
T ủ nuôi l ắ c Labtech LSI-3016R
Hình 0.6T ủ nuôi l ắ c LSI-3016R Đặc điểm:
- Tủ nuôi có lắc, tốc độ lắc 0-300 v/phút, nhiệt độ nuôi từ 10 o C-60 o C
- Sử dụng tủ nuôi để nuôi các vi sinh vật hiếu khí
- Bật máy bằng công tắc, đặt vị trí an toàn 70 (Safely)
- Mở cửa tủ lên và đưa bình mẫu vào tủ, chú ý đối với thí nghiệm nuôi lắc, cần sắp xếp mẫu ở trạng thái cân bằng, đối xứng nhau
Để chọn nhiệt độ và tốc độ lắc, hãy nhấn nút Set và thiết lập điều kiện nuôi cấy bằng các biểu tượng Temp, PRM, Time, sử dụng các mũi tên ► ◄ để điều chỉnh.
- Nếu muốn nhiệt độ thí nghiệm nhỏhơn nhiệt độmôi trường nhấn nút Cool
- Sau đó xác nhận chế độ chọn bằng cách ấn lại nút Set
- Chọn nhiệt độ và tốc độ lắc phải phù hợp với công suất của thiết bị và mục đích thí nghiệm
- Đóng kín tủ khi sử dụng, bật đèn trong điều kiện cần thiết, ghi nhật ký sử dụng vào sổ thiết bị.
Kính hi ể n vi
C ấ u t ạ o kính hi ể n vi
Kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận chức năng: cơ học và quang học
Hình 0.7:C ấ u t ạ o kính hi ể n vi quang h ọ c a Bộ phận cơ học: có cấu tạo khá đơn giản gồm giá kính, ống kính và khay kính
- Giá kính: có cấu tạo vững chắc để trên đó lắp các bộ phận khác của kính Nó gồm đế kính và thân kính
Giá đỡ mẫu hình tròn hoặc hình vuông là vị trí lý tưởng để đặt tiêu bản Thiết kế của nó bao gồm hai bên có ốc giúp chuyển dịch theo hai chiều khác nhau, cùng với hai kẹp bằng thép chắc chắn để giữ vững tiêu bản.
Ống kính là một thiết bị quang học hình tròn, có thể là một ống cho mắt đơn hoặc hai ống cho mắt kép Nhờ vào ốc cố định bên cạnh, người dùng có thể xoay ống kính theo hướng mong muốn Phần đầu trên của ống kính lắp thị kính, trong khi phần đầu dưới kết nối với bàn xoay chứa nhiều vật kính khác nhau, cho phép xoay quanh trục của giá kính Ống kính có khả năng di chuyển lên xuống nhờ các ốc điều chỉnh, trong đó ốc di chuyển nhanh (ốc điều chỉnh thô) giúp tìm ảnh vật, còn ốc di chuyển chậm (ốc điều chỉnh tinh) dùng để điều chỉnh ảnh rõ nét hơn.
Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi gồm: vật kính, thị kính, kính tụ quang và nguồn sáng
- V ậ t kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại Mỗi vật kính đèu có ghi số phóng đại bên cạnh
Các vật kính được phân loại thành hai nhóm dựa trên độ phóng đại: vật kính khô (8x, 20x, 40x) không sử dụng dầu, và vật kính dầu (90x, 100x) cần có một giọt dầu trên tiêu bản khi sử dụng Dầu dùng cho vật kính dầu phải trong suốt, trung tính và có độ chiết suất tương đương với chiết suất của kính.
Thủy tinh có chỉ số khúc xạ 1,52, giúp tạo ra môi trường đồng nhất giữa thủy tinh và dầu, cho phép ánh sáng đi qua mà không bị khúc xạ, chiếu thẳng vào vật kính Mỗi vật kính đều có khoảng làm việc cụ thể, từ tiêu bản đến vật kính, để hình ảnh mẫu vật được rõ nét nhất: vật kính 8x có khoảng làm việc 8,53 mm, 40x là 0,4 mm, và 90x là 0,1 mm.
Hình 0.8: (a) Các lo ạ i v ậ t kính, (b) V ị trí c ủ a v ậ t kính trong kính hi ể n vi
- Th ị kính: lắp ở đầu ống kính, cấu tạo từ hai thấu kính Mỗi loại thị kính cũng có độ phóng đại khác nhau và ghi ở mặt ngoài thị kính (7x, 10x, 15x)
- Độ phón g đạ i c ủ a kính hi ể n vi
Khi quan sát một ảnh ảo qua kính hiển vi, độ phóng đại của ảnh này được xác định bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính và thị kính Ngoài ra, một số bộ phận truyền quang giữa vật kính và thị kính cũng có hệ số phóng đại Do đó, công thức tính độ phóng đại của kính hiển vi là: Độ phóng đại của kính = độ phóng đại vật kính x độ phóng đại thị kính x độ phóng đại của bộ phận truyền quang.
Kính tụ quang là một thiết bị lắp đặt dưới khay kính, bao gồm một hệ thống thấu kính ghép lại, có chức năng tập trung ánh sáng để chiếu vào tiêu bản Thiết bị này có khả năng di chuyển lên xuống nhờ vào ốc điều chỉnh bên cạnh, giúp điều chỉnh độ sáng và độ rõ nét của hình ảnh quan sát.
Dưới kính tụ quang là hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng đi vào nhiều hay ít
Nguồn sáng là thiết bị lắp đặt dưới kính tụ quang, có chức năng cung cấp ánh sáng cho kính hiển vi Cường độ chiếu sáng của nguồn sáng có thể được điều chỉnh dễ dàng để phù hợp với nhu cầu quan sát Việc điều chỉnh ánh sáng là một bước quan trọng trong quá trình sử dụng kính hiển vi, giúp nâng cao chất lượng hình ảnh và độ rõ nét khi quan sát mẫu vật.
- Bật công tắc nguồn sáng, điều chỉnh cường độ ánh sáng sao cho không chói hoặc tối quá
Để điều chỉnh độ sáng khi sử dụng kính tụ quang, bạn cần hạ kính tụ quang và mở chắn sáng vừa phải nếu muốn chiếu sáng ít hoặc vừa Ngược lại, để tăng cường độ sáng, hãy nâng kính tụ quang lên và mở rộng chắn sáng.
- Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính
- Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa Đặt tiêu bản lên khay kính, chỉnh vị trí cần quan sát thẳng với vật kính
- Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản
- Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính
Để quan sát vật qua thị kính, hãy sử dụng ốc di chuyển nhanh để đưa vật kính đến khoảng làm việc phù hợp Khi nhìn thấy ảnh của vật, dừng lại và sử dụng ốc di chuyển chậm để điều chỉnh cho ảnh trở nên rõ nét Việc bảo quản thiết bị cũng rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất quan sát tốt nhất.
Bảo quản sau khi sử dụng kính
- Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ
- Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau nhẹ đầu vật kính cho thật sạch
- Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu
- Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục Xếp khăn lại, đặt lên khay kính rồi hạ vật kính chạm sát khăn
- Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon Chuyển kính vào tủ lớ có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn
Bảo quản thông thường và định kỳ
- Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo
- Trong thời gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính
- Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông
- Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính
- Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay cầm thân kính, một tay đỡđế kính.