Tài liệu thí nghiệm vi sinh vật đại cương (trường đh bách khoa hà nội)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN VI SINH - HOÁ SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ TÀI LIỆU THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNG (tài liệu lưu hành nội cho sinh viên thực thí nghiệm vi sinh vật) Hà nội, 2021 MỤC LỤC NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT Mở đầu Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu: 2.2 Phương pháp tiến hành Báo cáo thí nghiệm 11 PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật hiếu khí có khả sinh tổng hợp amylase 12 Mở đầu 12 Vật liệu phương pháp 12 2.1 Vật liệu 12 2.2 Phương pháp 12 Báo cáo thí nghiệm 14 PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật yếm khí 15 Mở đầu: 15 Vật liệu phương pháp 15 2.1 Vật liệu 15 2.2 Phương pháp thực .15 Chuẩn bị dụng cụ môi trường nuôi cấy 15 Báo cáo thí nghiệm 17 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT: PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI TRÊN ĐĨA THẠCH (SPREAD PLATE TECHNIQUE) 18 Mở đầu 18 Vật liệu phương pháp 18 2.1 Vật liệu 18 2.2 Phương pháp 18 Báo cáo thí nghiệm: 20 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – PHƯƠNG PHÁP MPN 21 Mở đầu 21 Vật liệu phương pháp 22 2.1 Vật liệu 22 2.2 Phương pháp 22 Báo cáo thí nghiệm: 25 ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 27 Mở đầu 27 Vật liệu phương pháp 28 2.1 Vật liệu 28 2.2 Phương pháp 28 Báo cáo thí nghiệm: 30 QUAN SÁT NẤM MEN – tiêu giọt ép (wet mount slide) 31 Mục đích 31 Vật liệu phương pháp 31 2.1 Vật liệu: 31 2.2 Tiến hành 31 Báo cáo thí nghiệm 33 QUAN SÁT vi khuẩn – tiêu vi sinh vật cố định (smear slide) 34 Mục tiêu: 34 Vật liệu phương pháp 34 2.1 Vật liệu: 34 2.2 Phương pháp tiến hành .34 Báo cáo thí nghiệm 37 NHUỘM GRAM – PHÂN BIỆT VI KHUẨN GRAM + VÀ VI KHUẨN GRAM - 38 Mục tiêu: 38 Vật liệu phương pháp 38 2.1 Vật liệu: 38 2.1 Phương pháp tiến hành .38 Báo cáo thí nghiệm 40 10 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ỐNG DUHAM 41 Mở đầu 41 2.1 Vật liệu: 41 2.2 Phương pháp tiến hành .42 Báo cáo thí nghiệm 42 11 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASES 43 Mở đầu 43 Vật liệu phương pháp 43 2.1 Vật liệu: 43 2.2 Phương pháp tiến hành .44 Báo cáo thí nghiệm 44 MỘT SỐ THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG 45 Nồi hấp trùng 45 Tủ vô trùng dạng thổi đứng – clean bench 46 Tủ cấy an toàn sinh học cấp – Biosafety Cabinet 48 Tủ nuôi tĩnh 49 Tủ nuôi lắc Labtech LSI-3016R 50 Kính hiển vi 50 6.1 Cấu tạo kính hiển vi .51 b Cách sử dụng 52 Điều chỉnh ánh sáng 52 Quan sát tiêu 53 c Cách bảo quản 53 THÀNH PHẦN MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 54 NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM Những quy định chung Giữ gìn trật tự, vệ sinh phịng Bảo đảm vơ trùng tuyệt đối cấy truyền vi sinh vật Tuyệt đối khơng ăn uống, hút thuốc phịng thí nghiệm Tuyệt đối khơng để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây quần áo, sách vở, dụng cụ cá nhân Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm chưa phép chưa hướng dẫn Kết thúc thí nghiệm thực hành, dụng cụ, thiết bị, hoá chất vừa sử dụng xong phải vệ sinh theo quy trình xếp vào nơi quy định Ghi nhật ký sử dụng thiết bị đầy đủ theo yêu cầu Khi rời phịng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nước, khố cửa Những quy định an toàn Khi sử dụng hoá chất cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng tuân theo hướng dẫn kỹ thuật viên, cán phịng thí nghiệm Sinh viên sử dụng áo blouse thực thí nghiệm Những hố chất độc hại phải xử lý riêng, tuân theo yêu cầu quản lý PTN - Chất thải sinh học (vi sinh vật) phải xử lý nhiệt (thanh trùng 121oC 30 phút) trước thải môi trường - Chất thải lỏng cần phân loại (axit, bazơ, dung mơi, dung dịch có kim loại nặng) chứa vào thùng đựng chất thải riêng biệt - Chất thải rắn (hoá chất, lọ đựng hoá chất) có tính chất độc hại phải để tủ hút xử lý theo lịch riêng nhà trường - Các dung môi độc hại, dễ bay phải tiến hành tủ hút Trước rời phòng thí nghiệm phải rửa tay MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT Mở đầu Khả tồn phát triển vi sinh vật phụ thuộc lớn vào chất dinh dưỡng yếu tố sinh trưởng mơi trường ni cấy Trong phịng thí nghiệm, nhà khoa học sử dụng nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác để nuôi cấy nghiên cứu vi sinh vật Trong thí nghiệm này, sinh viên giới thiệu thực hành kỹ sau đây: - Chuẩn bị loại môi trường khử trùng môi trường để gieo cấy vi sinh vật - Làm quen với kỹ thuật thường quy phịng thí nghiệm vi sinh vật bao gồm việc chuẩn bị môi trường phương pháp gieo cấy vi sinh vật từ nhiều loại canh trường khác nhau, cấy chuyền vi sinh vật từ canh trường vi khuẩn nấm men sang môi trường Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu: - Canh trường chứa vi sinh vật - Bình tam giác - Ống nghiệm - Đĩa Petri - Que cấy - Que trang - Đèn cồn - Hố chất pha mơi trường Czapek (xem phụ lục thành phần môi trường) - Cân điện tử 2.2 Phương pháp tiến hành Cân thành phần môi trường Hoà tan nước Lọc, điều chỉnh pH cần thiết Môi trường lỏng Môi trường đặc Phân phối vào dụng cụ đựng Bổ sung chất đông tụ Đun nóng làm tan chất đơng tụ Phân phối vào dụng cụ đựng Thanh trùng Để nguội Môi trường lỏng Để nghiêng Môi trường thạch đứng Môi trường thạch nghiêng Đổ hộp petri Mơi trường hộp Petri Hình 1.1 Sơ đồ thí nghiệm a Pha chế mơi trường dinh dưỡng - Cân đong xác theo đơn (tính thành phần cho 300 ml mơi trường Czapek) - Cho vào bình sấy khơ 1/3 lượng nước cần thiết, hịa tan trước chất có khối lượng nhỏ chất có khối lượng lớn, hồ tan - Kiểm tra hiệu chỉnh pH môi trường (trong trường hợp cần thiết) Dùng lượng nước cịn lại tráng rửa cổ bình, phễu, v.v Thể tích mơi trường phải nhỏ 1/2 thể tích bình Chú ý: - Một số thành phần mơi trường có thành phần nhỏ nên pha tạo dung dịch có nồng lớn sau tính lượng thể tích cần sử dụng môi trường - Một số thành phần dễ phân huỷ nhiệt vitamine, kháng sinh khơng nên bổ sung từ đầu trước q trình trùng Các thành phần pha thành dịch, lọc vô trùng phối trộn vào môi trường sau trùng b Lọc môi trường - Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc - Lọc lòng trắng trứng - Dùng phễu lọc nóng c Bổ sung chất đơng dính - Bổ sung chất đơng dính 2% khối lượng theo thể tích mơi trường - Gia nhiệt cho tan chất đơng dính, ý tránh để trào mơi trường d Phân phối môi trường - Môi trường thạch nghiêng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm (~ -6 ml) - Mơi trường thạch đứng 1/3 thể tích ống nghiệm (~ 10 ml) - Môi trường lỏng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm - Chú ý: Môi trường hộp petri phân phối sau trùng mơi trường, thể tích dịch từ 15 -20 ml) Hình 1.2 Phân phối mơi trường vào dụng cụ đựng d Khử trùng môi trường nước bão hòa áp suất - Xem phần hướng dẫn sử dụng nồi trùng e Bảo quản kiểm tra môi trường - Bảo quản môi trường: Giữ môi trường nhiệt độ thấp 0-5oC tránh q khơ, nóng, nhiều ánh sáng - Kiểm tra cách để môi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32oC vài ngày Nếu thấy mơi trường bị vẩn đục có khuẩn lạc phát triển loại bỏ f Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật - Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối cách thao tác xung quanh lửa đèn cồn tủ cấy vơ trùng Ngọn lửa đèn cồn tạo dịng khơng khí nóng vơ trùng đối lưu phạm vi khoảng 20 cm quanh lửa đèn cồn hình sau: Hình 1.3 Phạm vi làm việc bên lửa đèn cồn Một số phương pháp gieo cấy Vật liệu : canh trường chứa vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng vơ trùng Dụng cụ: Que cấy vịng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang Khi gieo cấy vi sinh vật từ canh trường giống sang mội trường dinh dưỡng vơ trùng, tùy vào mục đích thí nghiệm, loại canh trường giống (lỏng đặc), loại dụng cụ chứa môi trường dinh dưỡng (thạch đứng, thạch nghiêng, môi trường hộp Petri, môi trường lỏng ống nghiệm, mơi trường lỏng bình tam giác) mà dụng cụ cấy kỹ thuật cấy khác sử dụng Các bước cấy thực sau : + Vệ sinh khu vực cấy, bật lửa đèn cồn (hoặc đèn khí thao tác tủ cấy) + Khử trùng que cấy cách đốt nóng đỏ đầu que cấy, lướt nhẹ phần thân que cấy qua lửa đèn cồn + Chờ que cấy nguội, đưa que cấy vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống, chạm nhẹ đầu que cấy vào phần không chứa canh trường ống giống để làm nguội que cấy Lấy canh trường từ ống giống chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng thực thao tác cấy mô tả chi tiết + Lấy que cấy ra, khử trùng que cấy lửa đèn cồn đặt tất lên giá Chú ý : sau mở ống nghiệm trước đóng lại, hơ miệng ống lửa đèn cồn Gieo cấy vào môi trường lỏng : - Từ canh trường đặc, sử dụng que cấy vòng que cấy thẳng lấy lượng nhỏ canh trường, chuyển sang môi trường dinh dưỡng lỏng lắc que cấy cọ vào thành ống nghiệm bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng lỏng để sinh khối từ que cấy vào môi trường - Từ canh trường lỏng, sử dụng pipette (với đầu tip vô trùng) hút lượng canh trường lỏng bơm vào môi trường lỏng vô trùng Gieo cấy mặt thạch nghiêng : - Thạch nghiêng thường sử dụng để lưu giữ vi sinh vật thời gian dài thạch nghiêng có lớp thạch dày bề mặt bay thấp, nước thất q trình bảo quản lâu dài so với canh trường hộp Petri - Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, que cấy vịng que cấy thẳng sử dụng, đưa que cấy có sinh khối vi sinh vật từ canh trường giống xuống đáy thạch nghiêng, dịch chuyển que cấy dần mặt thạch đến cách phần thạch gần miệng ống nghiệm khoảng 0.5 – cm Khi cấy, đưa que cấy theo đường zigzag dày để canh trường sau phủ kín mặt thạch, theo đường thẳng, đường song song Phương pháp cấy gọi cấy theo vết cấy cạn dần Dùng que cấy đâm sâu vào thạch đứng : - Thạch đứng dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí tùy tiện vi sinh vật vi hiếu khí (đối với vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, dụng cụ ni cấy kỹ thuật nuôi cấy đặc biệt cần sử dụng), vi sinh vật kỵ khí có xu hướng phát triển đáy sâu lớp thạch, vi sinh vật hiếu khí phát triển bề mặt thạch, nơi có oxy khuếch tán nhiều - Thạch đứng sử dụng để xác định khả di chuyển vi sinh vật cần nghiên cứu Vi sinh vật khả di động có xu hướng phát triển đường cấy thẳng đứng Vi sinh vật có khả di chuyển (nhờ có tiên mao) có xu hướng phát triển từ đường cấy thẳng đứng phía thành ống nghiệm Hình 1.4: Cấy đâm sâu vào mơi trường thạch đứng theo dõi đặc tính di chuyển vi sinh vật - Sử dụng que cấy thẳng lấy canh trường đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch đứng vơ trùng, vị trí trung tâm mặt thạch, đâm sâu xuống đáy ống nghiệm động tác dứt khoát rút nhanh que cấy khỏi ống nghiệm d Cấy thạch hộp - Hộp Petri chứa lớp mỏng môi trường dinh dưỡng (3 – mm) Nhờ có bề mặt ni cấy lớn, hộp Petri sử dụng để phân lập vi sinh vật (kỹ thuật yêu cầu tách vi sinh vật khỏi phát triển thành khuẩn lạc riêng biệt) Tuy nhiên lớp môi trường mỏng bề mặt bay lớn, hộp Petri không sử dụng để giữ vi sinh vật thời gian dài canh trường thạch nghiêng Khi gieo cấy vi sinh vật lên hộp Petri, sử dụng cách sau : + Sử dụng que cấy vòng (que cấy thẳng cào xước mặt thạch nên không sử dụng), cấy theo bốn đường zigzag bốn góc hộp, theo đường song song, cho mật độ tế bào vi sinh vật cấy giảm dần từ góc cấy đến góc cấy cuối Nếu cần thiết, cần đốt nóng que cấy để diệt bớt vi sinh vật sau góc cấy, que cấy vơ trùng sau dùng để kéo vi sinh vật từ góc cấy trước sang góc cấy (Streak technique) Hình 1.5: Cách cấy hộp petri phương pháp vết cấy cạn dần Một số cách cấy khác môi trường hộp petri (các cách thực hành sau) + Cấy chẩm điểm : sử dụng que cấy móc, lấy canh trường giống cấy chấm điểm lên 3, điểm môi trường hộp Petri thành cạnh tam giác đều, đỉnh hình vng, đỉnh hình vng điểm tâm hình vng + Dùng que trang : cấy từ canh trường lỏng sang môi trường thạch hộp Petri, dùng pipette hút lượng canh trường (50 – 100 µl) lên mặt thạch, dùng que trang vô trùng dàn đến mặt thạch se lại Canh trường cấy cần nuôi điều kiện thích hợp (về nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxy) thời gian để vi sinh vật phát triển Kiểm tra canh trường trước cất bảo quản nhiệt độ thấp (4- 10oC) 10 Báo cáo thí nghiệm - Bài báo cáo thí nghiệm gồm phần: + Mục đích thí nghiệm + Cách tiến hành thí nghiệm + Kết - thảo luận: phần sinh viên cần ghi nhận lại đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn; màu sắc tế bào sau nhuộm Gram kết luận loại Gram canh trường vi khuẩn 40 10 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ỐNG DUHAM Mở đầu Quá trình lên men rượu sử dụng nấm men tạo hai sản phẩm rượu ethylic khí CO2 Vì vậy, để xác định hoạt lực lên men nấm men nhà nghiên cứu dựa vào khả khí CO2 q trình lên men Ống Durham ống thuỷ tinh nhỏ sử dụng để thu khí CO2 tạo trình lên men rượu Các chủng nấm men khác có cường độ lên men khác nhau, đó, phương pháp đo chiều cao cột khí CO2 ống Durham sở ban đầu để tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men rượu cao Trong thí nghiệm này, sinh viên thực hành: - Chuẩn bị môi trường lên men rượu chứa đường saccharose - So sánh, đánh giá định tính khả lên men chủng nấm men thông qua khả tạo khí CO2 mơi trường chứa đường saccharose - Lượng khí CO2 sinh so sánh thơng qua chiều cao cột khí ống Duham Hình 10.1: Ống Duham (a), khí tích tụ ống Duham (b) Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu: - Các chủng nấm men - Môi trường nuôi cấy tế bào nấm men: môi trường Crapek - Ống nghiệm, ống nghiệm Duham - Tủ nuôi lắc - Pipet đầu côn, hộp đầu côn 1000 L; 100 L 41 2.2 Phương pháp tiến hành a Chế tạo canh trường nấm men - Pha chế môi trường Crapek lỏng, phân phối vào ống nghiệm ống nghiệm chứa 10 mL Thanh trùng môi trường 110oC 30 phút Làm nguội mơi trường đến nhiệt độ phịng - Sử dụng que cấy, mỗi ống nghiệm 01 chủng nấm men, nuôi cấy tủ lắc nhiệt độ 30oC vòng 24-36 h b Chế tạo môi trường lên men - Pha chế môi trường lên men lỏng, phân phối vào ống nghiệm ống nghiệm chứa 10 mL, ống nghiệm 01 ống Duham úp ngược (Hình 10.1 (a)) Thanh trùng môi trường 110 oC 30 phút Làm nguội môi trường - Sử dụng pipette lấy lượng từ 5-10 % v/v thể tích canh trường ni cấy nấm men chuyển vào ống nghiệm có ống Duham, ni cấy tĩnh nhiệt độ 30ºC từ 24h-48h; sử dụng thước đo xác định độ cao cột khí ống Duham Báo cáo thí nghiệm - Bài báo cáo thí nghiệm gồm phần: + Mục đích thí nghiệm + Cách tiến hành thí nghiệm + Kết - thảo luận: phần sinh viên cần ghi nhận lại chiều cao cột khí ống Duham, so sánh chiều cao cột khí để kết luận khả lên men chủng nấm men so sánh 42 11 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASES Mở đầu Các phân tử tinh bột thường có kích thước lớn khó thâm nhập qua màng tế bào vi sinh vật, có vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme -amylase ngoại bào thuỷ phân tinh bột thành hợp chất nhỏ (dextrin, maltose, glucose) Một số nôi dung thí nghiệm là: - So sánh, đánh giá khả sinh enzyme -amylase chủng vi sinh vật sử dụng môi trường chọn lọc chứa tinh bột - Khả sinh tổng hợp enzyme đánh giá thơng qua xác định đường kính vịng trịn thuỷ phân tạo môi trường tinh bột nhờ phản ứng màu tinh bột iot Hình 1.1: Hình ảnh khuẩn lạc vịng trịn phân giải sau nhuộm màu Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu: - Các chủng vi sinh vật cần đánh gía khả sinh tổng hợp amylase - Mơi trường đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme amylase môi trường Czapek, thay nguồn saccharose tinh bột - Ống petri - Tủ ni tĩnh - Que cấy đầu móc - Đèn cồn - Dung dịch iot (1 g I2, g KI, 300 mL nước cất) 43 2.2 Phương pháp tiến hành a Chế tạo canh trường đánh giá hoạt tính emzyme amylase hộp petri - Pha chế môi trường Czapek thay nguồn đường saccharose tinh bột Thanh trùng môi trường 110oC 30 phút Đổ môi trường vào hộp petri b Đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme -amylase - Sử dụng que cấy đầu móc cấy chấm điểm chủng vi sinh vật cần đánh giá hoạt tính sinh -amylase - Ni cấy tủ nuôi tĩnh ngày nhiệt độ 30 oC - Quan sát đặc điểm khuẩn lạc chủng vi sinh vật hộp petri, sử dụng dịch lugol iot % đổ vào hộp petri cho bao phủ toàn bề mặt hộp, để yên 3-5 phút, loại bỏ dung dịch dư vào rửa lại nước - Quan sát ghi nhận đường kính vịng trịn phân giải, đường kính khuẩn lạc, so sánh tỉ lệ Đường kính vịng trịn thuỷ phân/đường kính khuẩn lạc Báo cáo thí nghiệm - Bài báo cáo thí nghiệm gồm phần: + Mục đích thí nghiệm + Cách tiến hành thí nghiệm + Kết - thảo luận: phần sinh viên cần ghi nhận lại đường kính khuẩn lạc, đường kính vịng trịn phân giải, so sánh tỉ lệ hai đường kính để rút kết luận khả sinh tổng hợp enzyme amylase chủng vi sinh vật 44 MỘT SỐ THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG Nồi hấp trùng - Nguyên tắc: gia nhiệt vật nước bão hòa áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất nước tăng lên nhiệt độ tăng theo - Cấu tạo: Nồi hấp áp lực thiết bị hai vỏ, có khả chịu áp suất cao Nước chứa khoang riêng, cấp nhiệt trực tiếp nhờ sợi đốt để chuyển hóa thành có áp suất cao di chuyển vào buồng hấp Hơi nước tiếp xúc với bề mặt vật liệu cần khử trùng, truyền nhiệt cho vật liệu cần khử trùng ngưng tụ lại, nước ngưng cuối xả qua van xả nước ngưng đáy nồi Sơ đồ nguyên lý cấu tạo nồi hấp áp lực: Hình 0.1 Cấu tạo nồi hấp áp lực Các giai đoạn hoạt động trình khử trùng nồi hấp áp lực: 45 Hình 0.2: Các giai đoạn hoạt động trình khử trùng nồi hấp áp lực Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực: + Đưa vật liệu, môi trường cần khử trùng vào nồi hấp, vật liệu cần bao gói hợp lý Chỉ vật liệu, môi trường chịu áp lực áp suất cao khử trùng phương pháp + Kiểm tra mực nước nồi, bổ sung nước cất nước mềm cần thiết + Đặt điều kiện khử trùng (áp suất, thời gian, v.v.) +Đóng nắp nồi hấp, mở van xả đáy + Bật nồi hấp + Khi nước thoát nhiều từ van xả đáy khoảng 1-2 phút để đóng van xả đáy lại Lúc này, khí khơng ngưng hết khỏi không gian buồng hấp + Khi van xả đáy đóng, nước vào buồng hấp giữ lại, áp suất tăng cao đến áp suất đặt trước bắt đầu tính thời gian khử trùng Trong suốt thời gian khử trùng, áp suất nước bão hòa trì áp suất đặt trước + Kết thúc thời gian khử trùng, tắt nồi hấp, đợi áp suất buồng hấp giảm 0, mở van xả đáy, đợi nhiệt độ giảm xuống 70 – 80oC (trong trường hợp nồi hấp có đồng hồ nhiệt độ) mở nắp nồi hấp lấy dụng cụ, môi trường cần khử trùng Chú ý: trường hợp chuẩn bị môi trường hộp Petri, người ta thường pha chứa mơi trường bình tam giác, khử trùng (như mô tả bước 4) đổ môi trường vào hộp Petri (như mô tả bước 3) mơi trường cịn trạng thái lỏng Tủ vô trùng dạng thổi đứng – clean bench 46 Hình 0.3: Tủ vơ trùng dịng khí thổi đứng chiều dịng khí Đặc điểm: - Dịng khơng khí làm thơng qua lọc HEPA đặt phía tủ, từ xuống phía người làm việc - Tủ vơ trùng cung cấp khí để bảo vệ sản phẩm, sử dụng thao tác với vi sinh vật an tồn, khơng sinh bào tử, phản ứng PCR Hướng dẫn sử dụng: - Nâng kính chắn lên vị trí an toàn (safe height), máy bắt đầu bật máy thổi khí để làm tủ phút, sau phút kết thúc máy tự động bật đèn lên, vệ sinh cồn 70o - Cho mẫu dụng cụ thực hành vào (nếu cần vô trùng mẫu dụng cụ, hạ kính bật đèn UV) - Thực hành thao tác cấy vi sinh vật Trong q trình làm việc: Có thể bật/tắt đèn chiếu sáng phím Có thể cấp điện cho thiết bị dùng tủ cấy (cân, vortex, ) phím - Sau kết thúc dọn đề, vệ sinh tủ cồn 70o, sau hạ kính xuống, bật UV để vệ sinh tủ - Vệ sinh khu vực xung quanh chỗ làm ghi nhật ký sử dụng - Nếu q trình làm có sử dụng đèn gaz cần khố bình gaz sau sử dụng Chú ý: Chỉ đốt đèn cồn (dùng đèn inoc tránh nứt vỡ đèn gây cháy) cần để nung nóng que cấy, que trang, miệng ống nghiệm, miệng bình ni (tuyệt đối khơng đốt đèn cồn đóng cửa tủ cấy để đấy) Đèn UV tự động tắt sau 30 phút sau bật 47 Không tắt quạt sử dụng đèn cồn đèn gas Khi đóng cửa buồng cấy hoàn toàn, quạt tự động tắt Trong thời gian khởi động đếm ngược phút, không kéo cửa buồng cấy xuống Tủ cấy an toàn sinh học cấp – Biosafety Cabinet Hình 0.4 Tủ an tồn sinh học cấp chiều dịng khí Đặc điểm: - Dịng khơng khí làm thơng qua lọc HEPA đặt phía tủ, từ xuống hút vào phía sau tủ - Tủ an toàn sinh học câos bảo vệ sản phẩm người làm việc, sử dụng chủng vi sinh vật có bào tử vi khuẩn sinh bào tử, nấm Hướng dẫn sử dụng: - Kéo cửa kính lên vị trí "SASH HEIGHT" (chấm đen) Quạt tự động chạy hình hiển thị phút đếm ngược Sau phút làm việc với tủ - Vệ sinh tủ cồn 700 Cho mẫu dụng cụ thực hành vào (nếu cần vô trùng mẫu dụng cụ, hạ kính bật đèn UV) Trong q trình làm việc: Có thể bật/tắt đèn chiếu sáng phím ( ) Có thể cấp điện cho thiết bị dùng tủ cấy (cân, vortex, ) phím ( ) - Sau kết thúc dọn đề, vệ sinh tủ cồn 70o, sau hạ kính xuống, bật UV để vệ sinh tủ - Vệ sinh khu vực xung quanh chỗ làm ghi nhật ký sử dụng 48 - Chú ý: q trình làm có sử dụng đèn gaz cần khố bình gaz sau sử dụng Chú ý: Chỉ đốt đèn cồn (dùng đèn inoc tránh nứt vỡ đèn gây cháy) cần để nung nóng que cấy, que trang, miệng ống nghiệm, miệng bình ni (tuyệt đối khơng đốt đèn cồn đóng cửa tủ cấy để đấy) Đèn UV tự động tắt sau 30 phút sau bật Không tắt quạt sử dụng đèn cồn đèn gas Khi đóng cửa buồng cấy hồn tồn, quạt tự động tắt Trong thời gian khởi động đếm ngược phút, không kéo cửa buồng cấy xuống Tủ nuôi tĩnh Hình 0.5 Tủ ni tĩnh FOC215E Đặc điểm: - Tủ ni tĩnh có nhiệt độ làm việc từ 3-50 oC - Sử dụng để nuôi tĩnh vi sinh vật dải nhiệt độ làm việc tủ Hướng dẫn sử dụng: - Bật máy, cài đặt nhiệt độ mong muốn - Đưa mẫu vào nuôi - Ghi nhật ký sử dụng thiết bị 49 Tủ nuôi lắc Labtech LSI-3016R Hình 0.6Tủ ni lắc LSI-3016R Đặc điểm: - Tủ ni có lắc, tốc độ lắc 0-300 v/phút, nhiệt độ nuôi từ 10oC-60oC - Sử dụng tủ nuôi để nuôi vi sinh vật hiếu khí Hướng dẫn sử dụng: - Bật máy cơng tắc, đặt vị trí an toàn 70 (Safely) - Mở cửa tủ lên đưa bình mẫu vào tủ, ý thí nghiệm nuôi lắc, cần xếp mẫu trạng thái cân bằng, đối xứng - Chọn nhiệt độ, tốc độ lắc cách bấm nút Set sau cài đặt điều kiện nuôi cấy biểu tượng Temp, PRM, Time với việc chọn mũi tên ► ◄ - Nếu muốn nhiệt độ thí nghiệm nhỏ nhiệt độ mơi trường nhấn nút Cool - Sau xác nhận chế độ chọn cách ấn lại nút Set - Chọn nhiệt độ tốc độ lắc phải phù hợp với cơng suất thiết bị mục đích thí nghiệm - Đóng kín tủ sử dụng, bật đèn điều kiện cần thiết, ghi nhật ký sử dụng vào sổ thiết bị Kính hiển vi Kính hiển vi hệ thống quang học dùng để phóng đại ảnh vật cần quan sát Kính hiển vi có nhiều loại tùy thuộc vào ánh sáng mà người ta sử dụng như: kính hiển vi quang học, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử, v.v 50 6.1 Cấu tạo kính hiển vi Kính hiển vi quang học gồm hai phận chức năng: học quang học Hình 0.7:Cấu tạo kính hiển vi quang học a Bộ phận học: có cấu tạo đơn giản gồm giá kính, ống kính khay kính - Giá kính: có cấu tạo vững để lắp phận khác kính Nó gồm đế kính thân kính - Giá đỡ mẫu: hình trịn hình vng nơi đặt tiêu Hai bên có ốc để chuyển dịch theo hai chiều khác có hai kẹp thép để giữ tiêu - Ống kính: ống trịn (kính mắt) hay hai ống trịn (kính hai mắt) Nhờ ốc cố định bên cạnh ta xoay ống kính theo hướng thuận với người quan sát người quan sát Đầu ống kính lắp thị kính, đầu gắn với bàn xoay có lắp nhiều vật kính khác xoay quanh trục giá kính Ống kính di chuyển lên, xuống nhờ ốc điều chỉnh quay tự theo hai chiều ngược Ốc di chuyển nhanh (ốc điều chỉnh thô) dùng để tìm ảnh vật cịn ốc di chuyển chậm (ốc điều chỉnh tinh) dùng để điều chỉnh cho ảnh vật rõ nét b Bộ phận quang học Bộ phận quang học phận quan trọng kính hiển vi gồm: vật kính, thị kính, kính tụ quang nguồn sáng - Vật kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại Mỗi vật kính đèu có ghi số phóng đại bên cạnh (8x, 20x, 40x, 90x, 100x) Những vật kính có độ phóng đại vừa nhỏ (8x, 20x, 40x) dùng không cho dầu nên gọi vật kính khơ Những vật kính có độ phóng đại lớn (90x, 100x) dùng cần nhỏ trước giọt dầu lên tiêu nên gọi vật kính dầu Dầu phải suốt, trung tính có chiết suất (độ chiết quang) tương đương với chiết suất 51 thủy tinh (1,52) Nhờ thủy tinh dầu tạo thành môi trường tương đối đồng nên ánh sáng qua không bị khúc xạ mà rọi thẳng vào vật kính Mỗi vật kính có khoảng làm việc (khoảng cách từ tiêu tới vật kính cho phép thấy rõ ảnh mẫu vật) định (WD: working distance), cụ thể là: vật kính 8x - 8,53 mm; 40x - 0,4 mm; 90x - 0,1mm Hình 0.8: (a) Các loại vật kính, (b) Vị trí vật kính kính hiển vi - Thị kính: lắp đầu ống kính, cấu tạo từ hai thấu kính Mỗi loại thị kính có độ phóng đại khác ghi mặt ngồi thị kính (7x, 10x, 15x) - Độ phóng đại kính hiển vi Khi quan sát ta ảnh ảo, ngược với vật có độ phóng đại tích số độ phóng đại vật kính thị kính sử dụng; số kính phần truyền quang vật kính thị kính có hệ số phóng đại; độ phóng đại kính hiển vi: Độ phóng đại kính = độ phóng đại vật kính x độ phóng đại thị kính x độ phóng đại phận truyền quang - Kính tụ quang: lắp khay kính, gồm hệ thống thấu kính ghép lại, có tác dụng tập trung ánh sáng để chiếu vào tiêu Kính tụ quang di chuyển lên, xuống nhờ ốc điều chỉnh bên cạnh Dưới kính tụ quang hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng vào nhiều hay - Nguồn sáng: lắp kính tụ quang dùng để cung cấp ánh sáng cho kính hiển vi, cường độ chiếu sáng điều chỉnh b Cách sử dụng Điều chỉnh ánh sáng - Bật công tắc nguồn sáng, điều chỉnh cường độ ánh sáng cho không chói tối q - Điều chỉnh kính tụ quang: Muốn chiếu sáng vừa hạ kính tụ quang, mở chắn sáng vừa phải Muốn chiếu sáng nhiều nâng tụ quang lên, mở rộng chắn sáng 52 Quan sát tiêu - Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách vật kính khay kính - Xoay vật kính định sử dụng vào trục Đặt tiêu lên khay kính, chỉnh vị trí cần quan sát thẳng với vật kính - Nếu dùng vật kính dầu nhỏ giọt dầu lên tiêu - Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu vật kính - Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng, thấy ảnh vật dừng lại dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét c Cách bảo quản Bảo quản sau sử dụng kính - Nâng vật kính lên, lấy tiêu ra, đưa khay kính vị trí cũ - Nếu dùng vật kính dầu dùng bơng tẩm dung môi hữu xilen hay toluen lau nhẹ đầu vật kính cho thật - Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu - Xoay điểm hai vật kính gần vào trục Xếp khăn lại, đặt lên khay kính hạ vật kính chạm sát khăn - Cho kính vào hộp phủ kính bao nilon Chuyển kính vào tủ lớ có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc bụi bẩn Bảo quản thơng thường định kỳ - Giữ kính nơi khô - Trong thời gian khơng dùng tháo thị kính đậy nắp ống kính - Làm kính thị kính khăn mềm, chổi lơng - Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính - Chỉ di chuyển kính thật cần thiết thao tác di chuyển phải thận trọng: tay cầm thân kính, tay đỡ đế kính 53 THÀNH PHẦN MỘT SỐ MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG Môi trường Tryptic Soy Agar Pancreatic Digest of Casein Peptic Digest of Soybean Meal NaCl Agar Nước pH 7.3 ± 0.2 Môi trường Czapek Saccharose NaNO3 KCl KH2PO4 MgSO4 FeSO4 Nước pH 7.3 ± 0.2 Môi trường MRS Peptone Cao thịt Cao nấm men Glucose Na acetat.3H20 Tween 80 K2HP04 (NH4)3 citrate MgS04.7H20 MnS04.7H20 Nước pH 6.2 15 g 5g 5g 15 g 1L 30 g 2g 0.5 g 1g 0.5 g 0.01 g 1L 10 g 10 g 4g 20 g 5g 1g 2g 2g 0.02 g 0.005% 1L 54