Đang tải... (xem toàn văn)
1 Bài 1 MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT A Môi trường dinh dưỡng I Khái niệm chung 1 Mục đích, ý nghĩa Môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nòi[.]
Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT A Môi trường dinh dưỡng I Khái niệm chung Mục đích, ý nghĩa: Mơi trường dinh dưỡng có ý nghĩa bảo tồn phát triển nòi giống vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng sử dụng khâu phân lập, nhân giống, giữ giống nghiên cứu hoạt động sinh hóa vi sinh vật Yêu cầu môi trường dinh dưỡng: Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp thức ăn cần thiết cho phát triển vi sinh vật Trong thành phần mơi trường dinh dưỡng cần phải có ngun tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro, Oxi, Nitơ), nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt, ), vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden, ) Những nguyên tố cần thiết phải dạng hợp chất dễ hấp thu vi sinh vật Cacbon vi sinh vật dị dưỡng hấp thu dễ dạng glucoza Ngồi glucoza, vi sinh vật dị dưỡng cịn hấp thu đường, rượu, axit hữu hợp chất khác Nguồn Nitơ chất đạm, pepton, axit amin, muối amon, nitrat Các nguyên tố lại dạng muối Mơi trường dinh dưỡng cịn cần phải có đủ chất kích thích sinh trưởng biotin, vitamin, đặc biệt axit amin không thay Môi trường dinh dưỡng cần phải cân đối thành phần (đẳng trương nồng độ chất hòa tan) có độ ẩm, độ nhớt, pH, áp suất thẩm thấu tối ưu Môi trường dinh dưỡng cần phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng II Phân loại môi trường Phân loại môi trường theo thành phần: Căn vào thành phần môi trường, người ta chia chúng thành loại sau a Môi trường tự nhiên chế tạo từ sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật thịt, trứng, sữa, nước chiết nấm men, nước quả, mạch nha, Thành phần hóa học môi trường phức tạp không xác định cụ thể Nó phụ thuộc vào thành phần nguyên liệu điều kiện tiến hành chế tạo môi trường Người ta sử dụng chúng để nuôi cấy vi sinh vật, tích lũy sinh khối, giữ giống sạch, mục đích dự đốn, chúng khơng lợi cho việc nghiên cứu sinh lý trình trao đổi chất b Môi trường tống hợp chế tạo từ hợp chất hóa học hữu vơ với nồng độ định trước cách xác Tùy theo cấu tử, mơi trường tơng hợp phức tạp (môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic) hay tương đối đơn giản (môi trường cho vi khuẩn tự dưỡng) Người ta dùng chủng để nghiên cứu trao đổi chất, quy luật phát triển hay sinh tổng hợp chất (VD: axit amin) Trong thực hành thường sử dụng môi trường tổng hợp Sapek để nuôi cấy nấm mốc c Môi trường bán tổng hợp môi trường chung hai loại Phân loại theo mục đích sử dụng a Mơi trường phổ dụng (môi trường sở hay môi trường chuẩn) mơi trường thích hợp để ni cấy nhiều loại vi sinh vật (VD: môi trường thịt pepton, môi trường nước mạch nha, ) b Môi trường riêng biệt hay môi trường chọn lọc: đảm bảo phát triển ưu lồi hay nhóm vi sinh vật đó, thuận lợi hồn tồn bất lợi phát triển vi sinh vật khác Mơi trường chọn lọc có chất mà nhóm vi sinh vật có khả sử dụng phát triển (ví dụ: môi trường chứa tinh bột nguồn carbon dùng để ni cấy vi sinh vật có khả sản sinh amylase), chứa chất ức chế phát triển số loài vi sinh vật không mong muốn (chất kháng nấm cycloheximide bổ sung vào mơi trường có tác dụng ức chế phát triển nấm, mơi trường chứa cycloheximide sử dụng để phân lập vi khuẩn) Các môi trường chọn lọc chủ yếu dùng để phân lập vi sinh vật từ môi trường sinh sống tự nhiên chúng dùng để ni cấy tích lũy VD: môi trường tinh bột – ammoniac dùng để nuôi cấy xạ khuẩn c Mơi trường chuẩn đốn phân biệt (môi trường thị) cho phép phân biệt nhanh chóng lồi vi sinh vật với lồi khác xác định giống khiết sở nghiên cứu tính chất sinh hóa chúng Các môi trường thị ứng dụng vi khuẩn học lâm sàng, nghiên cứu di truyền học việc định tên vi sinh vật Thông thường môi trường người ta cho vào số thành phần thị màu nhờ thay đổi chất mà người ta xác định lồi vi sinh vật VD: Trong q trình sống, vi sinh vật thường tiết loại enzyme định Dưới tác dụng enzyme hợp chất hữu phức tạp có mơi trường bị phân hủy thành dạng đơn giản axit muối chúng Các chất làm thay đổi độ pH mơi trường, dẫn đến thay đổi màu chất thị màu Phân loại theo tính chất lý học Tùy theo độ cứng môi trường người ta phân biệt môi trường lỏng, đặc, xốp a Môi trường lỏng môi trường thức ăn dạng dung dịch Nó ứng dụng để phát đặc điểm sinh lý – sinh hóa vi sinh vật, để tích lũy sinh khối sản phẩm trao đổi chất, để giữ bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển môi trường đặc b Môi trường đặc mơi trường lỏng có thêm chất đơng dính, ứng dụng để tách giống khiết (nhận khuẩn lạc riêng biệt, nghiên cứu định tên, xác định hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng), để giữ giống Để làm đông môi trường người ta dụng thạch, gelatine silica-gel Các chất không làm thay đổi thành phần môi trường, đồng thời đảm bảo độ suet môi trường Thạch loại polysaccarit phức tạp có độ bền vững cao, nhận từ số loại tảo biển họ Floridae Hầu hết vi sinh vật không sử dụng thạch nguồn chất dinh dưỡng Trong nước, thạch tạo thành dạng gel, nóng chảy 1000C đơng gần 400C Thạch có tính trung tính, khơng làm thay đổi pH mơi trường song bị ảnh hưởng pH mơi trường, mơi trường có độ axit pH thấp thạch khó đơng đặc hơn bị thủy phân phần Thạch thường bổ sung vào môi trường với số lượng 1,5 – 2% Trong trường hợp cần thiết nâng nồng độ thạch lên 3% Gelatin loại protein nhận ninh xương sụn động vật dễ bị vi sinh vật sử dụng nên dễ vữa so với thạch Mặt khác gelatine dễ làm ảnh hưởng tới pH mơi trường nên sử dụng thạch, Nhiệt độ nóng chảy gelatine 25-27oC đông đặc 18-20oC Thường để thu nhận khuẩn lạc lớn phân loại nấm men Bản silica-gel dùng làm chất đặc cho môi trường tổng hợp có thành phần xác định chặt chẽ có chất vơ Mơi trường xốp ứng dụng vi sinh vật học công nghiệp Thuộc loại có kê nấu nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng III Cách làm môi trường Quá trình tiến hành gồm bước sau: Pha chế Cân đong xác theo đơn Cho vào bình sấy khơ 1/3 lượng nước cần thiết, hịa tan trước chất có khối lượng nhỏ chất có khối lượng lớn sau chất đơng dính Thử pH mơi trường Dùng lượng nước cịn lại tráng rửa cổ bình, phễu, v.v Thể tích mơi trường phải nhỏ 1/2 thể tích bình Đóng miệng bình nút bơng bọc giấy để tránh bị ướt lúc trùng Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày người chuẩn bị Lọc Môi trường cần suốt nên sau pha chế phải tách cặn bã, bụi bẩn phương pháp sau: - Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc - Lọc lòng trắng trứng - Dùng phễu lọc nóng Phân phối mơi trường Mơi trường phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, v.v Thạch nghiêng khoảng 5ml Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm Hộp Petri tráng dầy 3mm Khử trùng môi trường Tất môi trường phải vô trùng, tùy loại môi trường, tùy yêu cầu thí nghiệm mà chọn chế độ trùng a Phương pháp Pasteur Chủ yếu dùng để diệt vi sinh vật khơng sinh bào tử cách đun nóng phân đoạn nhiệt độ 60-75oC 15 đến 30 phút hay 80oC thời gian 10-15 phút Phương pháp Pasteur ứng dụng cho sản phẩm hay môi trường tác động nhiệt độ cao bị ảnh hưởng sâu sắc, phẩm chất giá trị dinh dưỡng Nó dùng rộng rãi cơng nghiệp thực phẩm b Phương pháp Tinđan Tiến hành trùng nhiệt độ cao liên tục 3-4 ngày liền, ngày lần, lần cách 24 Trong thời gian hai lần hấp cần để mơi trường nhiệt độ thích hợp cho bào tử cịn sống sót phát triển thành dàng tế bào dinh dưỡng Trong lần trùng tế bào dinh dưỡng bị tiêu diệt Phương pháp cho hiệu suất vô trùng cao phương pháp Pasteur c Phương pháp trùng nước bão hòa áp suất Phương pháp dựa nguyên tắc làm gia nhiệt vật nước bão hòa áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất nước tăng lên nhiệt độ tăng theo Nồi hấp áp lực thiết bị hai vỏ, có khả chịu áp suất cao Nước chứa khoang riêng, cấp nhiệt trực tiếp nhờ sợi đốt để chuyển hóa thành có áp suất cao di chuyển vào buồng hấp Hơi nước tiếp xúc với bề mặt vật liệu cần khử trùng, truyền nhiệt cho vật liệu cần khử trùng ngưng tụ lại, nước ngưng cuối xả qua van xả nước ngưng đáy nồi Sơ đồ nguyên lý cấu tạo nồi hấp áp lực: Các giai đoạn hoạt động trình khử trùng nồi hấp áp lực: Gia nhiệt Khử trùng Áp suất (atm) Nhiệt độ (oC) 121 100 25 Làm nguội Đóng van xả đáy Thời gian Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực: + Bật nguồn, đặt điều kiện khử trùng (áp suất, thời gian, v.v.) + Đưa vật liệu, môi trường cần khử trùng vào nồi hấp, vật liệu cần bao gói hợp lý Chỉ vật liệu, mơi trường chịu áp lực áp suất cao khử trùng phương pháp + Đóng nắp nồi hấp, mở van xả đáy + Khi nước thoát nhiều từ van xả đáy khoảng 1-2 phút đóng van xả đáy lại Lúc này, khí khơng ngưng hết khỏi khơng gian buồng hấp Khí khơng ngưng làm cản trở trình truyền nhiệt từ nước bão hịa vào dụng cụ cần khử trùng, cần loại bỏ trước bắt đầu khử trùng + Khi van xả đáy đóng, nước vào buồng hấp giữ lại, áp suất tăng cao đến áp suất đặt trước bắt đầu tính thời gian khử trùng Trong suốt thời gian khử trùng, áp suất nước bão hịa trì áp suất đặt trước + Kết thúc thời gian khử trùng, tắt nồi hấp, đợi áp suất buồng hấp giảm 0, mở van xả đáy, đợi nhiệt độ giảm xuống 70 – 80oC mở nắp nồi hấp lấy dụng cụ, môi trường cần khử trùng Chú ý: trường hợp chuẩn bị môi trường hộp Petri, người ta thường pha chứa môi trường bình tam giác, khử trùng (như mơ tả bước 4) đổ môi trường vào hộp Petri (như mơ tả bước 3) mơi trường cịn trạng thái lỏng 5 Bảo quản kiểm tra môi trường Giữ môi trường nhiệt độ thấp 0-5oC tránh q khơ, nóng, nhiều ánh sáng Kiểm tra cách để mơi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32oC vài ngày Nếu thấy môi trường bị vẩn đục có khuẩn lạc phát triển loại bỏ B Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật Định nghĩa: Gieo cấy trình đưa vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục đích phát loại vi sinh vật có mặt thu nhận canh trường cần thiết cho nghiên cứu Cấy chuyền trình chuyển canh trường vi sinh vật từ môi trường sang mơi trường khác với mục đích nhận giống giữ giống Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối cách thao tác xung quanh lửa đèn cồn tủ cấy vô trùng Ngọn lửa đèn cồn tạo dịng khơng khí nóng vơ trùng đối lưu phạm vi khoảng 20 cm quanh lửa đèn cồn hình sau: Tủ cấy vơ trùng có loại với độ bảo vệ cho người thao tác cho mẫu vật mức độ khác nhau: tủ cấy cấp 1, cấp cấp Các tủ cấy sử dụng phịng thí nghiệm vi sinh viện CNSH-CNTP bao gồm tủ cấy cấp cấp 2, khơng khí qua màng lọc HEPA lọc vi khuẩn Tủ cấy cấp bảo vệ mẫu không bị nhiễm tạp thao tác, không bảo vệ người thao tác nên không sử dụng để gieo cấy vi sinh vật gây bệnh Tủ cấy cấp bảo vệ mẫu vật người thao tác, sử dụng thao tác vi sinh vật gây bệnh Một số phương pháp gieo cấy Vật liệu : canh trường chứa vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng vô trùng Dụng cụ: Que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang Khi gieo cấy vi sinh vật từ canh trường giống sang mội trường dinh dưỡng vô trùng, tùy vào mục đích thí nghiệm, loại canh trường giống (lỏng đặc), loại dụng cụ chứa môi trường dinh dưỡng (thạch đứng, thạch nghiêng, môi trường hộp Petri, môi trường lỏng ống nghiệm, môi trường lỏng bình tam giác) mà dụng cụ cấy kỹ thuật cấy khác sử dụng Các bước cấy thực sau : + Vệ sinh khu vực cấy, bật lửa đèn cồn (hoặc đèn khí thao tác tủ cấy) + Khử trùng que cấy cách đốt nóng đỏ đầu que cấy, lướt nhẹ phần thân que cấy qua lửa đèn cồn + Chờ que cấy nguội, đưa que cấy vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống, chạm nhẹ đầu que cấy vào phần không chứa canh trường ống giống để làm nguội que cấy Lấy canh trường từ ống giống chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng thực thao tác cấy mô tả chi tiết + Lấy que cấy ra, khử trùng que cấy lửa đèn cồn đặt tất lên giá Chú ý : sau mở ống nghiệm trước đóng lại, hơ miệng ống lửa đèn cồn a Gieo cấy vào môi trường lỏng : Từ canh trường đặc, sử dụng que cấy vòng que cấy thẳng lấy lượng nhỏ canh trường, chuyển sang môi trường dinh dưỡng lỏng lắc que cấy cọ vào thành ống nghiệm bình tam giác chứa mơi trường dinh dưỡng lỏng để sinh khối từ que cấy vào môi trường Từ canh trường lỏng, sử dụng pipette (với đầu tip vô trùng) hút lượng canh trường lỏng bơm vào môi trường lỏng vô trùng b Gieo cấy mặt thạch nghiêng : Thạch nghiêng thường sử dụng để lưu giữ vi sinh vật thời gian dài thạch nghiêng có lớp thạch dày bề mặt bay thấp, nước thất thoát q trình bảo quản lâu dài so với canh trường hộp Petri Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, que cấy vòng que cấy thẳng sử dụng, đưa que cấy có sinh khối vi sinh vật từ canh trường giống xuống đáy thạch nghiêng, dịch chuyển que cấy dần mặt thạch đến cách phần thạch gần miệng ống nghiệm khoảng 0.5 – cm Khi cấy, đưa que cấy theo đường zigzag dày để canh trường sau phủ kín mặt thạch, theo đường thẳng, đường song song c Dùng que cấy đâm sâu vào thạch đứng : Thạch đứng dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí tùy tiện vi sinh vật vi hiếu khí (đối với vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, dụng cụ ni cấy kỹ thuật nuôi cấy đặc biệt cần sử dụng), vi sinh vật kỵ khí có xu hướng phát triển đáy sâu lớp thạch, vi sinh vật hiếu khí phát triển bề mặt thạch, nơi có oxy khuếch tán nhiều Thạch đứng sử dụng để xác định khả di chuyển vi sinh vật cần nghiên cứu Vi sinh vật khơng có khả di động có xu hướng phát triển đường cấy thẳng đứng Vi sinh vật có khả di chuyển (nhờ có tiên mao) có xu hướng phát triển từ đường cấy thẳng đứng phía thành ống nghiệm Môi trường + VSV không di động + VSV di động Sử dụng que cấy thẳng lấy canh trường đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch đứng vơ trùng, vị trí trung tâm mặt thạch, đâm sâu xuống đáy ống nghiệm động tác dứt khoát rút nhanh que cấy khỏi ống nghiệm d Cấy thạch hộp Hộp Petri chứa lớp mỏng môi trường dinh dưỡng (3 – mm) Nhờ có bề mặt ni cấy lớn, hộp Petri sử dụng để phân lập vi sinh vật (kỹ thuật yêu cầu tách vi sinh vật khỏi phát triển thành khuẩn lạc riêng biệt) Tuy nhiên lớp môi trường mỏng bề mặt bay lớn, hộp Petri không sử dụng để giữ vi sinh vật thời gian dài canh trường thạch nghiêng Khi gieo cấy vi sinh vật lên hộp Petri, sử dụng cách sau : + Sử dụng que cấy vòng (que cấy thẳng cào xước mặt thạch nên không sử dụng), cấy theo bốn đường zigzag bốn góc hộp, theo đường song song, cho mật độ tế bào vi sinh vật cấy giảm dần từ góc cấy đến góc cấy cuối Nếu cần thiết, cần đốt nóng que cấy để diệt bớt vi sinh vật sau góc cấy, que cấy vơ trùng sau dùng để kéo vi sinh vật từ góc cấy trước sang góc cấy (Streak technique) + Khi canh trường cấy nấm mốc, sử dụng que cấy móc, lấy canh trường giống cấy chấm điểm lên 3, điểm môi trường hộp Petri thành cạnh tam giác đều, đỉnh hình vng, đỉnh hình vng điểm tâm hình vng + Dùng que trang : cấy từ canh trường lỏng sang môi trường thạch hộp Petri, dùng pipette hút lượng canh trường (50 – 100 µl) lên mặt thạch, dùng que trang vơ trùng dàn đến mặt thạch se lại Canh trường cấy cần nuôi điều kiện thích hợp (về nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxy) thời gian để vi sinh vật phát triển Kiểm tra canh trường trước cất bảo quản nhiệt độ thấp (4- 10oC) Phụ lục : Thành phần số môi trường dinh dưỡng Môi trường Tryptic Soy Agar Pancreatic Digest of Casein Peptic Digest of Soybean Meal NaCl Agar Nước pH 7.3 ± 0.2 15 g 5g 5g 15 g 1L Môi trường Czapek Saccharose 30 g NaNO3 2g KCl 0.5 g KH2PO4 1g MgSO4 0.5 g FeSO4 0.01 g Nước 1L Mơi trường Czapek bổ sung peptone với hàm lượng 5% Môi trường MRS Proteose peptone Beef extract Yeast extract Dextrose (glucose) Polysorbate 80 Ammonium citrate Natri acetate MgSO4 MnSO4 K2HPO4 Agar Nước pH 6.5 ± 0.2 10 g 10 g 5g 20 g 1g 2g 5g 0.1 g 0.05 g 2g 12 g 1L Bài 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT Vi sinh vật thường tồn thiên nhiên vật phẩm nghiên cứu dạng hỗn hợp gồm nhiều loại khác Muốn nghiên cứu sử dụng vào thực tế loài ta phải phân lập để thu canh trường chứa loài Q trình tách vi sinh vật khỏi hỗn hợp gọi phân lập Tùy mức độ khiết mà người ta phân biệt canh trường tập trung hay canh trường khiết I Canh trường tập trung Định nghĩa Canh trường tập trung canh trường lồi (hoặc vài lồi) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hẳn số lượng Từ canh trường tập trung ta phân lập canh trường khiết sử dụng sản xuất thí nghiệm Phương pháp phân lập canh trường tập trung Sử dụng môi trường chọn lọc điều kiện chọn lọc, tức môi trường điều kiện thích hợp cho lồi vi sinh vật định, cịn lồi khác khơng thể khó phát triển Để có mơi trường chọn lọc, ta thay đổi thành phần, nguồn bon, nitơ, độ pH, nhiệt độ môi trường, lưu lượng khí cấp Ví dụ: để tạo canh trường tập trung chứa vi sinh vật có khả phân hủy cellulose, môi trường dinh đưỡng dùng để tạo canh trường tập trung chứa cellulose làm nguồn carbon nhất, không chứa thành phần chứa carbon dễ sử dụng glucose, saccharose, aminoacids có peptone sản phẩm thủy phân peptone Tách vi sinh vật ưa nóng lạnh cách ni nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng 50-600C 10-150, để tách vi sinh vật yếm khí khỏi vi sinh vật hiếu khí, ta ni điều kiện yếm khí Tuỳ đặc tính sinh lý lồi mà ta có mơi trường điều kiện chọn lọc khác II Canh trường khiết Định nghĩa Canh trường khiết canh trường mà tất vi sinh vật sinh từ tế bào ban đầu Việc phân lập canh trường khiết thường thực từ canh trường tập trung Nguyên tắc việc phân lập vi sinh vật tạo canh trường khiết tách tế bào khỏi hỗn hợp tế bào mẫu vật nghiên cứu, để từ tế bào riêng biệt phát triển thành canh trường khiết chứa tế bào sinh Việc tách tế bào để tế bào riêng lẻ phát triển thành canh trường khiết thực phương pháp Các phương pháp phân lập canh trường khiết a Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng Phương pháp Pasteur đưa đầu tiên, tiến hành sau: - Lấy số ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn 10 - Dùng que cấy pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ - Đánh tan lắc cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai - Lặp lại với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn Cuối ta thu ống nghiệm chứa tế bào Tế bào tổ tiên cho canh trường khiết Phương pháp đơn giản dễ làm khơng phải bảo đảm, thường dùng giai đoạn đầu phương pháp phân lập khác b Phương pháp gieo cấy môi trường đặc Nguyên tắc phương pháp tách tế bào mẫu vật thành tế bào riêng lẻ môi trường đặc, sau từ tế bào phát triển thành khuẩn lạc mọc riêng lẻ Cách tiến hành sau: - Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan pha loãng dần đến mức độ định ống nghiệm chứa nước muối sinh lý (0.85%) vô trùng Tuỳ trường hợp mà pha lỗng nhiều hay khơng pha lỗng Nói chung nên pha lỗng để tế bào tách rời gieo cấy khuẩn lạc mọc tách biệt Đem vật phẩm pha lỗng cấy mơi trường thạch hộp vơ khuẩn theo cách sau: + Dùng que cấy vịng cấy cấy mơ tả + Dùng pipet đưa lượng canh trường định vào hộp petri, sau dùng que trang dàn vật gieo cấy mặt thạch hộp, mô tả + Trộn vật gieo cấy vào ống thạch vô trùng làm nguội đến 450C, sau đổ vào hộp Petri Phương pháp này, khuẩn lạc phát triển bề mặt thạch lớp thạch, áp 11 dụng để phân lập vi sinh vật có nhu cầu oxy thấp Hạn chế phương pháp không dùng để phân lập vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ Trong ba cách hai cách sau hay dùng thường cho khuẩn lạc riêng biệt Gieo cấy xong, ni điều kiện thích hợp cho loài vi sinh vật định phân lập Sau - ngày, đem quan sát chọn khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy vi sinh vật khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch Mỗi khuẩn lạc cấy lên ống Sau ni nhiệt độ thích hợp ta canh trường khiết - Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết tương đối đảm bảo - Nhược điểm cách khắc phục: Khuẩn lạc khơng phải phát sinh từ tế bào ban đầu mà nhiều tế bào dính với từ lúc đầu Các khuẩn lạc lúc mọc riêng lẻ để để thời gian chúng lại dính liền khắc phục cách phân lập vài lần, đồng thời làm tiêu để kiểm tra đồng khuẩn lạc tách Khi nuôi vi sinh vật đĩa Petri, đĩa Petri đặt cho phần đáy nhỏ chứa thạch hướng lên để vị trí ngược lại, nước sinh q trình ni ngưng tụ nắp đĩa Petri rơi xuống bề mặt thạch, làm loang khuẩn lạc khắp mặt thạch khơng cịn khuẩn lạc riêng biệt c Phương pháp tách tế bào Thường dùng để tách vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn nấm men, bào tử nấm mốc Có thể thực theo cách sau: + Tách giọt chứa tế bào có kiểm tra kính hiển vi: + Pha loãng canh trường vi sinh vật ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn Pha lỗng đến mức giọt nhỏ có hai tế bào vi sinh vật + Tách tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulator) Micromanipulator dụng cụ tương đối phức tạp, làm việc kiểm tra trực tiếp qua kính hiển vi Nó bao gồm kim nhỏ, micropipet, giá đỡ phận học tinh vi di chuyển kim pipet để lấy riêng tế bào vi sinh vật giọt canh trường đem nuôi cấy riêng biệt ta canh trường khiết Ưu điểm: Phương pháp tương đối nhanh chóng, xác địi hỏi cẩn thận, khéo léo III Phân lập vi sinh vật yếm khí Có thể phân lập theo phương pháp ni điều kiện yếm khí Dùng pipet Pasteur - Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ định - Lấy giọt canh trường pha loãng cuối cho vào ống thạch (đã đun chảy trước làm nguội đến 45 – 500C lắc - Hút mơi trường trộn vi sinh vật nói vào pipet Pasteur dùng đèn cồn hàn kín đầu nhỏ pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp 12 - Sau - ngày khuẩn lạc vi sinh vật mọc ống thạch - Lấy pipet ra, đánh vỡ lấy cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào mơi trường ni cấy thích hợp Động tác phải tiến hành điều kiện hồn tồn vơ trùng, ngồi ra, để nhận biết vùng có vi sinh vật yếm khí phát triển người ta thêm vào ống thạch 0,2% indigocacmin Những vùng có vi sinh vật phát triển indigocacmin bị khử chuyển thành màu vàng Dùng hộp petri lộn ngược - Pha loãng cho vào ống thạch - Lắc đổ hộp petri đậy ngược đáy nhỏ hộp lên lớp thạch, sau dùng paraphin bơi xung quanh mép hộp (Hộp petri vô trùng đặt lộn ngược trước) - Đặt vào tủ ấm, sau - ngày lấy tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào mơi trường thích hợp 13 Bài – – ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT Định nghĩa: Định lượng vi sinh vật xác định số tế bào vi sinh vật có vật phẩm nghiên cứu Có hai nhóm phương pháp dùng để định lượng vi sinh vật: định lượng trực tiếp định lượng gián tiếp I Định lượng trực tiếp Định nghĩa: Định lượng trực tiếp phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có tiêu làm từ vật phẩm nghiên cứu Ưu điểm: Cho kết nhanh chóng Nhược điểm: Kém xác đếm nhữ ta đếm tế bào chết trước lúc làm tiêu Các phương pháp định lượng trực tiếp Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thước lớn nấm men, bào tử nấm mốc Mô tả buồng đếm hồng cầu: Đó phiến kính dày có đục bốn rãnh chia thành ba khoang ngang, khoang thấp hai khoang bên 0,1 mm chia thành hai khoang nhỏ nhờ rãnh dọc; khoang nhỏ có kẻ lưới đếm gồm nhiều vuông lớn, số ô vuông lớn lại chia thành vng nhỏ (thường 16) có cạnh dài 1/20 mm diện tích 1/400 mm2; chiều cao 0,1 mm thể tích 1/4000 mm3 Mỗi buồng đếm có kèm theo kính Cấu tạo buồng đếm hồng cầu kích thước lưới đếm 14 Cách tiến hành: - Lắc canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường (với H2SO4 10% NaOH 10%), tùy canh trường mà mức độ pha lỗng nhiều hay (10, 100 lần) - Dùng bơng thấm nước, tẩm nước cất phết nhẹ lên hai khoang bên buồng đếm, đặt kính lên dùng ngón tay ấn nhẹ cho kính dính chặt vào phiến kính - Dùng pipet lấy canh trường pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống lưới đếm kính (nên bỏ vài giọt đầu) Chú ý không để canh trường tràn khoang đếm, rơi xuống rãnh tránh tạo thành bọt khí - Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên - phút tiến hành đếm ô lớn chéo tức 80 vng nhỏ Hoặc đếm vuông lớn tức 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọn vị trí khác nhau) Tính số tế bào trung bình Chú ý: - Cần làm lặp lại 3-4 lần - Với tế bào nằm đường gạch đếm tế bào có 1/2 phần nằm đếm - Trước sau dùng, buồng đếm kính phải rửa kỹ nước cất dùng lau để khô - Khi số tế bào ô lớn nằm khoảng 25 – 250 độ pha lỗng canh trường hợp lý Tính toán: Số tế bào ml canh trường là: đó: 𝑎 ×1000 ×𝑓 ℎ ×𝑆 a số tế bào trung bình có nhỏ f hệ số pha loãng canh trường h bề sâu lưới đếm S diện tích ô nhỏ 1000 hệ số chuyển đổi 1ml = 1000 mm3 Phương pháp Brit Phạm vi sử dụng: Phương pháp dùng để định lượng vi sinh vật có sữa hay số vật phẩm lỏng Cách tiến hành: - Đo đường kính kính trường hệ thống kính định dùng quan sát 15 - Dùng micropipet vơ trùng lấy xác 0,01 ml vật phẩm nghiên cứu Cho dàn lên phiến kính với diện tích định (2 - cm2) - Để khô, cố định nhuộm đơn xanh metylen - Để khơ quan sát kính hiển vi Đếm số tế bào - 10 kính trường, lấy trung bình suy số tế bào đơn vị diện tích vết bơi cuối số tế bào đơn vị vật phẩm nghiên cứu Phương pháp Vinogratxki - Sungina Phạm vi sử dụng: Phương pháp thường dùng để định lượng vi sinh vật đất hay vật phẩm đặc, rắn Cách tiến hành: - Cân lượng định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ cối thủy tinh chuyển tất vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch Lắc phút để yên - giây - Dùng micropipet vơ trùng lấy xác 0,01 ml hỗn dịch chuẩn bị dàn diện tích định phiến kính (4 - cm2) để tránh vi sinh vật dồn lại đầu pipet, động tác phải làm nhanh, lượng hỗn dịch hút vào pipet không nên nhiều lúc chưa dàn kịp phải giữ pipet vị trí nằm ngang - Để khô đổ lên vết bôi lớp thạch mỏng, lỗng (0,1%) Lại để khơ cố định cồn tuyệt đối phút - Nhuộm dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - Trong trình nhuộm phải theo dõi để thuốc nhuộm vết bôi không bị khô - Rửa sạch, để khô đem quan sát vật kính dầu Cách đếm tính kết gần giống phương pháp Brit II Định lượng gián tiếp Định nghĩa: Định lượng gián tiếp phương pháp định lượng vi sinh vật cách gieo cấy lượng định vật phẩm nghiên cứu lên mơi trường thức ăn thích hợp, ni 36 48 giờ, sau đếm số khuẩn lạc suy số tế bào có đơn vị vật phẩm ban đầu Ưu điểm: Chỉ đếm tế bào vi sinh vật sống nên kết xác Nhược điểm: - Tốn thời gian, cơng sức - Khi cấy từ vật phẩm pha loãng chênh 10 lần không thấy số khuẩn lạc chênh 10 lần; để kết kiểm tra vi sinh vật có giá trị so sánh tốt nên sử dụng độ pha loãng thống loại vật phẩm - Đối với vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với thành chuỗi, đơi, khối phát triển mơi trường, chuỗi, khối tạo thành khuẩn lạc Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh xác số tế bào vi sinh vật có vật phẩm nghiên cớu 16 - Khơng có loại mơi trường dinh dưỡng cho phép tất nhóm vi sinh vật phát triển Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển môi trường thạch Nguyên tắc: Gieo cấy lượng vật phẩm định lên môi trường đặc hộp Petri, ni nhiệt độ thích hợp Sau đếm số khuẩn lạc mọc lên suy kết Cách tiến hành: + Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng tiến hành pha loãng theo tỷ lệ 1/10 phương pháp pha loãng Pasteur + Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng lỏng cách: Cân g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ chuyển tất vào bình tam giác dung tích 250 ml chứa sẵn 99 ml nước vô trùng Lắc phút, để lắng 30 giây tiếp tục pha loãng + Gieo cấy lượng vật phẩm nghiên cứu định (0,1 ml) từ ống nghiệm pha loãng cuối lên hộp petri chứa sẵn môi trường vô trùng + Ni nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc + Đọc kết - Nếu số khuẩn lạc không nhiều ta đếm trực tiếp tất khuẩn lạc có hộp - Nếu số khuẩn lạc nhiều ta dùng kính đếm Lafa kính hình vng có kích thước 15 x 15 cm Mặt kính chia thành có diện tích (1 cm2) Đếm số khuẩn lạc - 10 ô Lấy trung bình cho (ký hiệu a tế bào) Đếm xong đo đường kính đáy hộp (ký hiệu D) Suy số khuẩn lạc toàn hộp a x D2/4 + Để giá trị tính tốn có ý nghĩa xác suất thống kê, đĩa thạnh có số lượng khuẩn lạc nằm khoảng 30 – 300 dùng để tính toán mật độ vi sinh vật mẫu vật ban đầu Định lượng vi sinh vật khơng khí phương pháp lắng Omelianxki Nguyên tắc: Theo Omelianxki ước tính: diện tích rộng 100 cm2, mở phút lượng vi sinh vật rơI xuống tương đương với lượng vi sinh vật có 10 lít khơng khí Ưu điểm: Đây phương pháp đơn giản thường dùng Nhược điểm: Khơng thật xác dựa cách ước tính Cách tiến hành: Đặt hộp petri có mơi trường đặc vơ trùng chỗ khơng khí định nghiên cứu Mở nắp hộp thời gian xác đinh (thường phút) đậy nắp hộp để vào tủ ấm Sau 24 – 48 đem ra, đếm số khuẩn lạc Tính tốn: Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (D2/4) suy lượng vi sinh vật lít hay m3 khơng khí theo ước tính Omelianxki Ngồi cịn ước tính sau: Hộp petri có diện tích 60 cm2 Sau có lượng vi sinh vật lắng xuống lượng vi sinh vật có lít khơng khí 17 Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform mẫu nước tự nhiên phương pháp nhiều ống (số có xác suất lớn nhất) (MPN – Most Probable Number) Cơ sở lý thuyết: Nước tự nhiên (sông, hồ) mơi trường sống nhiều lồi vi sinh vật khác tảo, động vật nguyên sinh, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, v.v Nước tự nhiên bị nhiễm phân (faecal contamination) nhiều đường khác nhau, có việc tiếp nhận nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý, trở nên đặc biệt nguy hiểm sử dụng làm nước sinh hoạt dành cho hoạt động thể dục thể thao Để đánh giá ô nhiễm phân nước tự nhiên, việc xác định có mặt vi sinh vật thị tiến hành Coliform xem vi sinh vật thị ô nhiễm phân do: (1) chúng thường khơng có mặt mơi trường nước tự nhiên, môi trường sống tự nhiên chúng hệ đường ruột động vật máu nóng, có người, (2) Chúng có khả sống lâu môi trường nước tự nhiên lồi vi sinh vật khác có nguồn gốc từ đường ruột, (3) đa số chủng coliform vi sinh vật gây bệnh, (4) việc phát chúng kỹ thuật nuôi cấy đơn giản Coliform nhóm vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, khơng sinh bào tử, có khả lên men lactose sinh acid giải phóng khí 35°C sau 48h Việc xác định có mặt coliform mẫu nước phải trải qua ba xét nghiệm: (1) thí nghiệm giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, (3) thí nghiệm hồn thành + Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định có mặt vi khuẩn coliform có khả lên men lactose sinh acid khí sau 48h nhiệt độ 35°C + Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường ống dương tính thí nghiệm giả định cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm (ví dụ: mơi trường thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để xác nhận việc lên men sinh khí khơng phải vi khuẩn Gram dương (những lồi có khả lên men sinh khí Clostridium Bacillus) + Thí nghiệm hồn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển mơi trường thí nghiệm xác nhận kiểm tra đặc tính hình thái kỹ để xác định chúng có phải vi khuẩn Gram âm, hình que, khơng sinh bào tử (đặc điểm vi khuẩn coliform) Trong thí nghiệm này, thí nghiệm giả định tiến hành để định lượng vi khuẩn lên men lactose sinh khí phương pháp số có xác suất lớn (MPN-Most Probable Number) Phương pháp MPN xác định có mặt vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng chứa lactose, số lượng ống cho kết dương tính xác định đối chiếu với bảng tính thống kê tiêu chuẩn MPN sử dụng để định lượng loại vi sinh vật khác mẫu mơi trường khác nhau, phương pháp có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp phương pháp đo quang thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởng đến kết định lượng Nguyên liệu dụng cụ: Mẫu nước Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL 18 Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL Môi trường chứa ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh trình lên men lactose Quy trình thí nghiệm Chuẩn bị mơi trường Mơi trường lỏng lactose: môi trường chuẩn bị nồng độ đơn nồng độ kép theo công thức sau Bảng Thành phần môi trường Thành phần Nồng độ kép Nồng độ đơn Peptone 10g 5g Lactose 10g 5g Cao thịt bò 6g 3g Nước 1000 mL 1000 mL pH điều chỉnh đến 6.8 ± 0.2, phân phối vào ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp ngược theo hướng dẫn bảng sau: Bảng Phân phối môi trường vào ống nghiệm Tổ hợp ống F1 F2 F3 Môi trường Nồng độ kép Nồng độ đơn Nồng độ đơn Thể tích phân phối 10 mL 10 mL 10 mL Số lượng ống 3 Các ống chứa mơi trường đóng nắp, khử trùng nhiệt độ 115°C 40 phút Lấy mẫu: Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật phương pháp MPN thu thập theo tiêu chuẩn Việt Nam quốc tế (WHO – World Health Organization) lấy mẫu nước Nước chứa bình khử trùng trước, có nắp kín, vận chuyển phịng thí nghiệm lưu giữ tủ lạnh phân tích Tùy vào loại nước mức độ nhiễm dự đốn nước mà chúng pha lỗng khác trước cấy vào môi trường nuôi cấy Cấy mẫu: Trước cấy vào môi trường vô trùng, bình chứa mẫu nước lắc để đảm bảo vi sinh vật phân bố đồng Dùng pipette 10 mL cấy 10 mL mẫu nước cần kiểm tra vào ống chứa môi trường tổ hợp ống F1 Dùng micropipette cấy mL mẫu nước cần kiểm tra vào ống chứa môi trường tổ hợp ống F2 Dùng micropipette cấy 0.1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào ống chứa môi trường tổ hợp ống F3 19 Nuôi ống cấy mẫu nước tủ ấm 35oC 48h Sơ đồ pha loãng cấy mẫu nước vào tổ hợp ống chứa môi trường lactose Kiểm tra kết xác định mật độ vi khuẩn coliform mẫu nước: Sau 48h, kiểm tra số lượng ống dương tính tổ hợp ống Các ống coi dương tính mm khí quan sát ống Durham Ghi lại số lượng ống dương tính tổ hợp ống, ta có gồm số Ví dụ: số ống dương tính tổ hợp F1 3, tổ hợp ống F2 tổ hợp ống F3 2, ta có ba số 3-2-2 Đối chiếu số với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn sau đây, giá trị MPN 100 mL nước xác định Nếu mẫu nước pha loãng trước cấy mẫu, giá trị MPN mẫu nước thu thập tính tốn dựa vào hệ số pha lỗng ban đầu Bảng Giá trị MPN 100 mL nước giới hạn độ tin cậy 95% ba ống cấy với 10 mL, mL, 0.1 mL mẫu nước Số lượng ống cho kết dương tính ống cấy 10 mL 0 1 1 ống cấy mL 0 1 ống cấy 0.1 mL 0 1 0 MPN/100 mL 3 7 11 11 Giới hạn MPN độ tin cậy 95% Dưới Trên