Môi trường dinh dưỡng – các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng Trang 8 Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN- Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vô khuẩn - Dùng que cấy hoặc pipette c

1 Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT A Môi trường dinh dưỡng I Khái niệm chung Mục đích, ý nghĩa: Mơi trường dinh dưỡng có ý nghĩa bảo tồn phát triển nịi giống vi sinh vật Mơi trường dinh dưỡng sử dụng khâu phân lập, nhân giống, giữ giống nghiên cứu hoạt động sinh hóa vi sinh vật Yêu cầu môi trường dinh dưỡng: - Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp thức ăn cần thiết cho phát triển vi sinh vật Trong thành phần môi trường dinh dưỡng cần phải có nguyên tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro, Oxi, Nitơ), nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt, ), vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden, ) Những nguyên tố cần thiết phải dạng hợp chất dễ hấp thu vi sinh vật Cacbon vi sinh vật dị dưỡng hấp thu dễ dạng glucoza Ngoài glucoza, vi sinh vật dị dưỡng hấp thu đường, rượu, axit hữu hợp chất khác Nguồn Nitơ chất đạm, pepton, axit amin, muối amon, nitrat Các nguyên tố lại dạng muối Mơi trường dinh dưỡng cịn cần phải có đủ chất kích thích sinh trưởng biotin, vitamin, đặc biệt axit amin không thay - Môi trường dinh dưỡng cần phải cân đối thành phần (đẳng trương nồng độ chất hịa tan) có độ ẩm, độ nhớt, pH, áp suất thẩm thấu tối ưu - Môi trường dinh dưỡng cần phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng Cách gọi tên - Môi trường dinh dưỡng thường gọi tên theo tên tác giả - người phát Thí dụ: Mơi trường Sapek, Saburo, Song gọi tên theo nguồn thức ăn N C Thí dụ mơi trường thạch thịt – pepton, môi trường Xenlluloza II Phân loại môi trường Phân loại môi trường theo thành phần: Căn vào thành phần môi trường, người ta chia chúng thành loại sau Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT a Môi trường tự nhiên chế tạo từ sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật thịt, trứng, sữa, nước chiết nấm men, nước quả, mạch nha, Thành phần hóa học môi trường phức tạp không xác định cụ thể Nó phụ thuộc vào thành phần nguyên liệu điều kiện tiến hành chế tạo môi trường Người ta sử dụng chúng để nuôi cấy vi sinh vật, tích lũy sinh khối, giữ giống sạch, mục đích dự đốn, chúng khơng lợi cho việc nghiên cứu sinh lý trình trao đổi chất b Môi trường tống hợp chế tạo từ hợp chất hóa học hữu vơ với nồng độ định trước cách xác Tùy theo cấu tử, môi trường tông hợp phức tạp (mơi trường ni cấy vi khuẩn lactic) hay tương đối đơn giản (môi trường cho vi khuẩn tự dưỡng) Người ta dùng chủng để nghiên cứu trao đổi chất, quy luật phát triển hay sinh tổng hợp chất (VD: axit amin) Trong thực hành thường sử dụng môi trường tổng hợp Sapek để nuôi cấy nấm mốc c Môi trường bán tổng hợp môi trường chung hai loại Phân loại theo mục đích sử dụng a Mơi trường phổ dụng (môi trường sở hay môi trường chuẩn) mơi trường thích hợp để ni cấy nhiều loại vi sinh vật (VD: môi trường thịt pepton, môi trường nước mạch nha, ) b Môi trường riêng biệt hay môi trường chọn lọc: đảm bảo phát triển ưu lồi hay nhóm vi sinh vật đó, thuận lợi hồn tồn bất lợi phát triển vi sinh vật khác Các môi trường chọn lọc chủ yếu dùng để phân lập vi sinh vật từ môi trường sinh sống tự nhiên chúng dùng để ni cấy tích lũy VD: mơi trường tinh bột – ammoniac dùng để nuôi cấy xạ khuẩn c Mơi trường chuẩn đốn phân biệt (mơi trường thị) cho phép phân biệt nhanh chóng lồi vi sinh vật với loài khác xác định giống khiết sở nghiên cứu tính chất sinh hóa chúng Các mơi trường thị ứng dụng vi khuẩn học lâm sàng, nghiên cứu di truyền học việc định tên vi sinh vật Thông thường môi trường người ta cho vào số thành phần thị màu nhờ thay đổi chất mà người ta xác định lồi vi sinh vật VD: Trong trình sống, vi sinh vật thường tiết loại enzyme định Dưới tác dụng enzyme hợp chất hữu phức tạp có mơi trường bị phân hủy thành dạng đơn giản axit muối chúng Các chất làm thay đổi độ pH mơi trường, dẫn đến thay đổi màu chất thị màu Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT Phân loại theo tính chất lý học Tùy theo độ cứng môi trường người ta phân biệt môi trường lỏng, đặc, xốp a Môi trường lỏng môi trường thức ăn dạng dung dịch Nó ứng dụng để phát đặc điểm sinh lý – sinh hóa vi sinh vật, để tích lũy sinh khối sản phẩm trao đổi chất, để giữ bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển môi trường đặc b Mơi trường đặc mơi trường lỏng có thêm chất đơng dính, ứng dụng để tách giống khiết (nhận khuẩn lạc riêng biệt, nghiên cứu định tên, xác định hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng), để giữ giống Để làm đông môi trường người ta dụng thạch, gelatine silica-gel Các chất không làm thay đổi thành phần môi trường, đồng thời đảm bảo độ suet môi trường - Thạch loại polysaccarit phức tạp có độ bền vững cao, nhận từ số loại tảo biển họ Floridae Hầu hết vi sinh vật không sử dụng thạch nguồn chất dinh dưỡng Trong nước, thạch tạo thành dạng gel, nóng chảy 1000C đơng gần 400C Thạch có tính trung tính, khơng làm thay đổi pH mơi trường song bị ảnh hưởng pH mơi trường, mơi trường có độ axit pH thấp thạch khó đơng đặc hơn bị thủy phân phần Thạch thường bổ sung vào môi trường với số lượng 1,5 – 2% Trong trường hợp cần thiết nâng nồng độ thạch lên 3% - Gelatin loại protein nhận ninh xương sụn động vật dễ bị vi sinh vật sử dụng nên dễ vữa so với thạch Mặt khác gelatine dễ làm ảnh hưởng tới pH môi trường nên sử dụng thạch, Nhiệt độ nóng chảy gelatine 25-27OC đơng đặc 18-20OC Thường để thu nhận khuẩn lạc lớn phân loại nấm men - Bản silica-gel dùng làm chất đặc cho mơi trường tổng hợp có thành phần xác định chặt chẽ có chất vô - Môi trường xốp ứng dụng vi sinh vật học công nghiệp Thuộc loại có kê nấu nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng III Cách làm mơi trường Q trình tiến hành gồm bước sau: Pha chế Cân đong xác theo đơn Cho vào bình sấy khơ 1/3 lượng nước cần thiết, hịa tan trước chất có khối lượng nhỏ chất có khối lượng lớn sau chất đơng dính Thử pH mơi trường Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT Dùng lượng nước lại tráng rửa cổ bình, phễu, Thể tích mơi trường phải nhỏ 1/2 thể tích bình Đóng miệng bình nút bọc giấy để tránh bị ướt lúc trùng Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày người chuẩn bị Lọc Môi trường cần suốt nên sau pha chế phải tách cặn bã, bụi bẩn phương pháp sau: - Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc - Lọc lịng trắng trứng - Dùng phễu lọc nóng Phân phối môi trường Môi trường phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, sau trùng vào ống nghiệm hộp petri Thạch nghiêng khoảng 5ml Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm Hộp petri tráng dầy 3mm Khử trùng môi trường Tất môi trường phải vô trùng, tùy loại môi trường, tùy yêu cầu thí nghiệm mà chọn chế độ trùng a Phương pháp Pasteur Chủ yếu dùng để diệt vi sinh vật không sinh bào tử cách đun nóng phân đoạn nhiệt độ 60-750C 15 đến 30 phút hay 800C thời gian 10-15 phút Phương pháp Pasteur ứng dụng cho sản phẩm hay môi trường tác động nhiệt độ cao bị ảnh hưởng sâu sắc, phẩm chất giá trị dinh dưỡng Nó dùng rộng rãi công nghiệp thực phẩm b Phương pháp Tinđan Tiến hành trùng nhiệt độ cao liên tục 3-4 ngày liền, ngày lần, lần cách 24 Trong thời gian hai lần hấp cần để mơi trường nhiệt độ thích hợp cho bào tử cịn sống sót phát triển thành dàng tế bào dinh dưỡng Trong lần trùng Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT tế bào dinh dưỡng bị tiêu diệt Phương pháp cho hiệu suất vô trùng cao phương pháp Pasteur c Phương pháp trùng nước bão hòa áp suất Phương pháp dựa nguyên tắc làm gia nhiệt vật nước bão hòa áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất nước tăng lên nhiệt độ tăng theo - Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực Bảo quản kiểm tra môi trường Giữ môi trường nhiệt độ thấp 0-50C tránh q khơ, nóng, nhiều ánh sáng Kiểm tra cách để mơi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-320C vài ngày Nếu thấy môi trường bị vẩn đục có khuẩn lạc phát triển loại bỏ Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT B Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật Định nghĩa: Gieo cấy trình đưa vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục đích phát loại vi sinh vật có mặt thu nhận canh trường cần thiết cho nghiên cứu Cấy chuyền trình chuyển canh trường vi sinh vật từ môi trường sang mơi trường khác với mục đích nhận giống giữ giống Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối Dụng cụ: Que cấy nhọn vòng, pipet, que trang, Một số phương pháp gieo cấy a Cấy chuyền từ ống nghiệm sang ống nghiệm khác Tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng) b Gieo cấy mặt thạch nghiêng - Theo hình chữ chi - Theo hình vịng xoắn - Theo đường song song - Theo đường thẳng - Theo chem c Dùng que cấy đâm sâu thạch đứng d Cấy thạch hộp - Hình chữ chi tồn mặt thạch - Theo bốn đường zich-zac bốn góc hộp - Theo đường song song - Chấm điểm e Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ Dung pipet lấy lượng canh trường thả mặt thạch dung que trang dàn giọt canh trường mặt thạch Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT Bài : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT A PHÂN LẬP VI SINH VẬT Vi sinh vật thường tồn thiên nhiên vật phẩm nghiên cứu dạng hỗn hợp gồm nhiều loại khác Muốn nghiên cứu sử dụng vào thực tế loài ta phải phân lập để thu canh trường chứa lồi Q trình tách vi sinh vật khỏi hỗn hợp gọi phân lập Tùy mức độ khiết mà người ta phân biệt canh trường tập trung hay canh trường khiết I Canh trường tập trung Định nghĩa Canh trường tập trung canh trường loài (hoặc vài loài) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hẳn số lượng Từ canh trường tập trung ta phân lập canh trường khiết sử dụng sản xuất thí nghiệm Phương pháp phân lập canh trường tập trung Sử dụng môi trường chọn lọc điều kiện chọn lọc, tức môi trường điều kiện thích hợp cho lồi vi sinh vật định, cịn lồi khác khơng thể khó phát triển Để có mơi trường chọn lọc, ta thay đổi thành phần, nguồn bon, nitơ, độ pH, nhiệt độ mơi trường, lưu lượng khí cấp Ví dụ: tách vi sinh vật ưa nóng lạnh cách nuôi nhiệt độ 50-600C 10-150, để tách vi sinh vật yếm khí khỏi vi sinh vật hiếu khí, ta ni điều kiện yếm khí Tuỳ đặc tính sinh lý lồi mà ta có mơi trường điều kiện chọn lọc khác II Canh trường khiết Định nghĩa Canh trường khiết canh trường mà tất vi sinh vật sinh từ tế bào ban đầu Việc phân lập canh trường khiết thường thực từ canh trường tập trung Các phương pháp phân lập canh trường khiết a Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng Phương pháp Pasteur đưa đầu tiên, tiến hành sau: Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - Lấy số ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn - Dùng que cấy pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ - Đánh tan lắc cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai - Lặp lại với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn Cuối ta thu ống nghiệm chứa tế bào Tế bào tổ tiên cho canh trường khiết Phương pháp đơn giản dễ làm khơng phải bảo đảm, thường dùng giai đoạn đầu phương pháp phân lập khác b Phương pháp gieo cấy môi trường đặc Nguyên tắc phương pháp tách khuẩn lạc mọc riêng lẻ môi trường đặc Cách tiến hành sau: - Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hồ tan pha lỗng dần đến mức độ định ống nghiệm chứa nước cất nước muối sinh lý (0.85%) vô trùng Tuỳ trường hợp mà pha lỗng nhiều hay khơng pha lỗng Nói chung nên pha lỗng để tế bào tách rời gieo cấy khuẩn lạc mọc tách biệt Hình 1: Sơ đồ quy trình pha lỗng Pasteur Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN Bài : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT Sơ đồ phân lập mơi trường đặc (có pha lỗng trước) Đem vật phẩm pha lỗng cấy mơi trường thạch hộp vô khuẩn theo cách sau: + Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần - cấy thưa đưa nhanh Hình 2: Các phương pháp cấy theo vết cấy cạn dần + Dùng pipet đưa lượng canh trường định vào hộp petri, sau dùng que trang dàn vật gieo cấy mặt thạch hộp + Trộn vật gieo cấy vào ống thạch vô trùng làm nguội đến 450C, sau đổ vào hộp petri Trong ba cách hai cách sau hay dùng thường cho khuẩn lạc riêng biệt Gieo cấy xong, ni điều kiện thích hợp cho lồi vi sinh vật định phân lập Sau - ngày, đem quan sát chọn khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy vi sinh vật khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch Mỗi khuẩn lạc cấy lên ống Sau ni nhiệt độ thích hợp ta canh trường khiết - Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết tương đối đảm bảo - Nhược điểm cách khắc phục: Khuẩn lạc khơng phải phát sinh từ tế bào ban đầu mà nhiều tế bào dính với từ lúc đầu Các khuẩn lạc lúc mọc riêng lẻ để để thời gian chúng lại dính liền khắc phục cách phân lập vài lần, đồng thời làm tiêu để kiểm tra đồng khuẩn lạc tách c Phương pháp tách tế bào Thường dùng để tách vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn nấm men, bào tử nấm mốc Có thể thực theo cách sau: + Tách giọt chứa tế bào có kiểm tra kính hiển vi: + Pha loãng canh trường vi sinh vật ống nghiệm chứa mơi trường lỏng vơ khuẩn Pha lỗng đến mức giọt nhỏ có hai tế bào vi sinh vật Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 10 Bài : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT + Tách tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulateur) Micromanipulateur dụng cụ tương đối phức tạp, làm việc kiểm tra trực tiếp qua kính hiển vi Nó bao gồm kim nhỏ, micropipet, giá đỡ phận học tinh vi di chuyển kim pipet để lấy riêng tế bào vi sinh vật giọt canh trường đem nuôi cấy riêng biệt ta canh trường khiết Ưu điểm: Phương pháp tương đối nhanh chóng, xác địi hỏi cẩn thận, khéo léo III Phân lập vi sinh vật yếm khí Nói chung phân lập theo phương pháp ni điều kiện yếm khí Dùng pipet Pasteur - Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ định - Lấy giọt canh trường pha loãng cuối cho vào ống thạch (đã đun chảy trước làm nguội đến 45 – 500C lắc - Hút mơi trường trộn vi sinh vật nói vào pipet Pasteur dùng đèn cồn hàn kín đầu nhỏ pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp - Sau - ngày khuẩn lạc vi sinh vật mọc ống thạch - Lấy pipet ra, đánh vỡ lấy cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào mơi trường ni cấy thích hợp Động tác phải tiến hành điều kiện hoàn tồn vơ trùng, ngồi ra, để nhận biết vùng có vi sinh vật yếm khí phát triển người ta thêm vào ống thạch 0,2% indigocacmin Những vùng có vi sinh vật phát triển indigocacmin bị khử chuyển thành màu vàng Dùng hộp petri lộn ngược - Pha loãng cho vào ống thạch - Lắc đổ hộp petri đậy ngược đáy nhỏ hộp lên lớp thạch, sau dùng paraphin bơi xung quanh mép hộp (Hộp petri vô trùng đặt lộn ngược trước) - Đặt vào tủ ấm, sau - ngày lấy tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào mơi trường thích hợp Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 34 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH Cố định vết bơi a Mục đích: Việc cố định vết bơi nhằm mục đích sau: - Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu an toàn tiếp xúc (nếu loại vi sinh vật gây bệnh) - Gắn chặt vi sinh vật phiến kính để lúc nhuộm, rửa chúng khơng bị trôi b Các phương pháp: + Phương pháp dùng nhiệt: Là phương pháp đơn giản phổ biến Kẹp phiến kính hai ngón tay trỏ, hơ mặt phiến kính qua lại đèn cồn, tránh khơng để tiêu nóng q + Phương pháp dùng hóa chất: Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào cố định cách hơ nóng khơng lợi mà phải cố định hóa chất cách phức tạp không gây biến dạng tế bào không làm đứt tiên mao Người ta thường dùng hóa chất loại rượu hay axeton thực cách sau: - Rượu etylic: Nhỏ rượu lên vết bôi nhúng vết bôi vào rượu Rượu tuyệt đối tác dụng tức thời, rượu 95O ngâm - 15 phút, rượu loãng thời gian lâu - Rượu metylic 2-5 phút - Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton phút - Dùng rượu etylic đốt cháy: nhỏ vài giọt rượu 90 - 95O lên vết bôi đốt cháy dập tắt Làm vài lần để khô Nhuộm màu Nguyên tắc: - Vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm trình hấp phụ nên cần sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng, bền vững Thuốc nhuộm thường dùng chất màu anilin, chủ yếu loại kiềm trung tinh - Vì thành phần hóa học tế bào loài vi sinh vật phận tế bào khác nên khả mức độ bắt màu không giống Tùy theo mục đích nghiên cứu mà chọn loại thuốc nhuộm cách nhuộm cho phù hợp Các phương pháp Có hai phương pháp nhuộm chính: nhuộm đơn giản nhuộm phức tạp Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 35 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH a Nhuộm đơn giản + Định nghĩa: Trên tiêu sử dụng loại thuốc nhuộm + Các bước tiến hành: Vết bôi cố định phải để khô đem nhuộm - Đặt tiêu lên cầu thủy tinh (gác nằm ngang miệng bocan) - Nhỏ thuốc nhuộm phủ vết bôi ý không cho thuốc nhuộm nhiều suốt thời gian nhuộm, vết bơi ln có lớp thuốc nhuộm phủ - Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu loại thuốc nhuộm đem dùng Trong điều kiện nhiệt độ phòng, thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl cần để yên - phút xanh metylen - phút Để tăng cường tác dụng thuốc nhuộm rút ngắn thời gian nhuộm hơ nhẹ phía phía kính đèn cồn - Khi nhuộm xong, đổ hết thuốc nhuộm đi, rưea nghiêng phiến kính cho dòng nước chảy nhẹ qua Nước kéo thuốc nhuộm Chú ý không xối nước trực tiếp lên vết bôi để tránh bị trôi vi sinh vật - Vẩy nước, dùng giấy thấm khô hơ nhẹ đèn cồn - Quan sát tiêu vật kính (x40) chuyển sang vật kính (x100) soi dầu b Nhuộm phức tạp + Khái niệm: Trên tiêu sử dụng đồng thời hai hay nhiều loại thuốc nhuộm + Ý nghĩa phương pháp nhuộm phức tạp: - Nhằm nghiên cứu hình thái, cấu trúc đặc biệt tế bào làm sở cho việc phân loại vi sinh vật - Nhằm phát có mặt vi sinh vật tổ chức, quan, thể động thực vật hay vật phẩm nghiên cứu - Là biện pháp bảo quản tiêu vi sinh vật lâu dài hơn, phục vụ cho công tác nghiên cứu + Nguyên tắc nhuộm phức tạp Các cấu trúc khác nhau, chí phàn khác cấu trúc thường có tính chất lý học, hóa học khả bắt màu khác Việc sử dụng đồng thời loại thuốc nhuộm tiêu cho phép ta nghiên cứu cấu tạo đặc tính tế bào khác loài vi sinh vật Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 36 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH + Các phương pháp nhuộm phức tạp thường là: nhuộm Gram, nhuộm bào tử, tiên mao, thể ẩn nhập, chất nhân, vỏ nhày v.v Phương pháp nhuộm Gram Phương pháp Christin Gram đưa vào năm 1884 Đây phương pháp nhuộm quan trọng dùng để định loại vi sinh vật dựa thành phần cấu tạo chúng * Nguyên tắc Người ta cho nguyên sinh chất tế bào số lồi vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc biệt mà thành phần có muối ribonucleat magie, nhuộm phức chất kết hợp với loại thuốc nhuộm triphenylmêtan (như gential violet, cristal violet, metyl violet ) iơt cho màu tím vững chịu tác dụng cồn Những vi sinh vật có tính chất gọi vi sinh vật Gram dương (+) nếưu không gọi vi sinh vật Gram âm (-) Dựa vào khả bắt màu gram người ta chia vi sinh vật thành hai nhóm: - Gram dương (+): gồm hầu hết loại cầu khuẩn, trực khuẩn hiếu khí có bào tử (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus mycoides), nấm men, xạ khuẩn - Gram âm (-): gồm nhóm vi khuẩn đường ruột Bacterium coli, Bacterium typhi, Bacterium aerogenes, Bacterium proteus, vi khuẩn axetic Hình 11: Cấu tạo lớp màng VSV Gram (-) Gram (+) * Các bước tiến hành Sau cố định vết bơi tiến hành nhuộm: - Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc phút - Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên để phút - Rửa nước - Tẩy cồn 30 giây, để nghiêng tiêu nhỏ từ từ giọt tan hết màu Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 37 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH - Rửa nước - Nhuộm bổ sung Fuchsin phút - Rửa nước - Làm khô tiêu soi vật kính dầu - Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) có màu tím, gram (-) màu hồng Phương pháp nhuộm Gram cho kết ổn định, cịn phụ thuộc trạng thái ni cấy, lứa tuổi sinh lý đặc tính số lồi (nên nhuộm lúc vi sinh vật cịn non) Ngồi lúc tẩy màu làm thiếu cẩn thận kết khơng xác Để đảm bảo kết nên dùng cồn có iơt thay cồn (100ml cồn + - 4ml nước iơt 10%) Trong cồn có iơt, vi khuẩn gram () bị màu sau phút vi khuẩn gram (+) giữ màu sau B QUAN SÁT VI KHUẨN I Đặc điểm hình thái, sinh lý ứng dụng vi khuẩn công nghiệp Đặc điểm hình thái Hình dạng: Căn vào hình dạng bên ngồi vi khuẩn, người ta chia chúng thành nhóm cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn + Cầu khuẩn (coccus) vi khuẩn mà tế bào có dạng hình cầu, phổ biến tự nhiên Tùy theo kiểu phân chia tế bào mà người ta chia cầu khuẩn thành số nhóm như: - Đơn cầu khuẩn (Monococcus) hay vi cầu khuẩn (Micrococcus) có kích thước nhỏ, có khả phân chia tế bào theo mặt phẳng sau phân chia xong hai tế bào tách rời Chúng chủ yếu loại sống hoại sinh, có nhiều đất nước, khơng khí - Song cầu (Diplococcus) phân chia tế bào theo mặt sau phân chia hai tế bào dính Chúng chủ yếu vi khuẩn gây bệnh - Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus) có khả phân chia tế bào theo hai mặt phẳng vng góc với nhau, từ tế bào thành bốn tế bào dính liền Loại có tự nhiên - Bát cầu khuẩn (Sarsina) cầu khuẩn có khả phân chia tế bào theo ba mặt phẳng vng góc, từ tế bào thành tám tế bào Loại thường sống hoại sinh đất, có nhiều ý nghĩa nơng nghiệp Ví dụ Sarsina urea có khả tổng hợp enzim ureaza Ngồi số loại bát cầu khuẩn sống ký sinh thực vật gây nên hư hỏng rau Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 38 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH - Liên cầu khuẩn(Streptococcus) tạo thành phân cắt tế bào theo hướng sau phân chia xong tế bào dính liền thành chuỗi Loại có nhiều tự nhiên, đặc biệt rau quả, thực phẩm Chúng có nhiều ý nghĩa công nghiệp, công nghiệp thực phẩm sản xuất axit lactic, chế biến sữa chua, fomat, chế biến rau Ngồi cịn có nhiều loại gây bệnh (liên cầu trùng) làm viêm đường hô hấp, viêm khớp - Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) loại cầu khuẩn mà phân chia tế bào không xảy theo hướng định, sau phân chia tế bào xếp hỗn độn (dạng chùm nho) Trong tự nhiên, chủ yếu loại vi trùng gây bệnh mụn nhọt, ví dụ Staphylococcus aureus + Trực khuẩn: vi khuẩn hình que, chiều dài lớn chiều rộng nhiều Đa số trực khuẩn có tiên mao di chuyển nhờ tiên mao Nhiều loại trực khuẩn có khả tạo bào tử Dựa vào khả tạo bào tử người ta chia trực khuẩn thành hai nhóm: - Trực khuẩn có bào tử (Bacillaceae) - Trực khuẩn khơng có bào tử (Bacterium) Tùy theo bố trí kích thước bào tử, trực khuẩn có bào tử lại chia thành hai nhóm: - Bacillus: bào tử nằm lọt tế bào, không làm biến dạng tế bào - Clostridium: bào tử lớn bề ngang tế bào, làm tế bào bị phình có dạng dùi trống Trực khuẩn sinh bào tử thường có nhiều ứng dụng cơng nghiệp, y học Ví dụ Bacillus subtilis sử dụng để tổng hợp -amilaza; Bacillus anthracis vi khuẩn gây bệnh mụi than động vật có sừng Clostridium tetani gây bệnh uốn ván Đa số trực khuẩn đứng riêng rẽ, có số loại liên kết với gọi diplococcus hay diplobacterium xếp thành chuỗi gọi Streptobacterium hay Streptobacillus + Xoắn khuẩn: vi khuẩn mà tế bào có hình dạng lị xo hay nửa vịng xoắn Chúng chia làm hai loại chính: - Phẩy khuẩn (Vibrio) loại tế bào có nửa vịng xoắn - Spirillium loại tế bào có vài vịng xoắn Xoắn khuẩn có khả di động tiên mao cách uốn vặn vòng xoắn Đa số chúng sống hoại sinh, số sống ký sinh gây bệnh Ví dụ: Vibrio chorela gây bệnh lao, Spirillium rubrum gây bệnh dịch hạch Kích thước:Kích thước vi khuẩn biến thiên theo cấu tạo Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 39 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH - Cầu khuẩn có kích thước xấp xỉ - - Trực khuẩn dài - 5; đường kính khoảng 0,5 - - Xoắn khuẩn: Vibrio thường dài -3, cịn Spirillium - 30 Hình dạng kích thước tế bào đặc điểm ổn định loài thường sử dụng tiêu để phân loại Tuy nhiên, thực tế có biến thiên định Tùy thuộc điều kiện môi trường thời gian nuôi cấy mà hình dạng chuyển từ hình cầu sang hình que qua dạng trung gian Cấu tạo: Vi khuẩn vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản, có nhiều tính chất dấu hiệu thể thực vật.Về cấu tạo tế bào vi khuẩn không khác so với tế bào sinh vật bậc cao a Màng vi khuẩn Bên có lớp màng dày gọi màng tế bào Bên có lớp màng mỏng gọi màng nguyên sinh chất Trong có chất nguyên sinh có nhiều bào quan khác Một số vi khuẩn bên ngồi có lớp giáp mạc (capsul) + Giáp mạc (capsul) phận phụ tế bào vi khuẩn, tách mà khơng gây ảnh hưởng đến hoạt động sống vi khuẩn Đó lớp chất nhày, lỏng lẻo bám xung quanh tế bào nên gọi màng nhày Màng nhầy hình thành nhày hóa màng tế bào, tạo nên lớp vỏ bao bọc bên tế bào Ở số loại vi khuẩn, vỏ bao bọc tế bào Bacillus anthraxit Ở số loài khác vỏ bao bọc hàng chục tế bào, gọi khuẩn bao đàm Azotobacter chrococcum *Thành phần chủ yếu giáp mạc polysacarit polypeptit tùy loại vi khuẩn Ví dụ giáp mạc Acetobacter xylynum chủ yếu polypeptit Điều kiện hình thành giáp mạc biến thiên theo tính chất loài vi khuẩn điều kiện mơi trường giàu đường, đạm *Chức năng: Tạo giáp mạc hình thức tự vệ vi khuẩn Vi khuẩn tạo giáp mạc để chống lại chất kháng sinh diệt khuẩn Tuy nhiên, 98% trọng lượng giáp mạc nước, giáp mạc cịn có chức chống lại khô cạn, kéo dài thời gian sống vi khuẩn Ngồi ra, giáp mạc cịn nơi dự trữ thức ăn thải chất không cần thiết trình trao đổi chất Một số vi khuẩn vi khuẩn lưu huỳnh dùng giáp mạc bám vào vật thể mơi trường để di động Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 40 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH + Màng (membrane) phận chính, nằm cùng, sát giáp mạc, mỏng, bề dày cỡ 10 - 20 nm, chiếm 20% trọng lượng khô tế bào, có tính đàn hồi, tính bán thấm độ bền học cao, nhờ chống va đập, giúp cho vi khuẩn trao đổi chất dễ dàng với mơi trường Màng tế bào khơng có màu, suốt, khả khúc xạ ánh sáng kém, khó bắt mầu thuốc nhuộm thông thường nghiên cứu phải sử dụng biện pháp đặc biệt gây tượng co nguyên sinh (plasmolyse) cách ngâm vào dung dịch muối ưu trương 0,2M KNO3 hay 0,2M NaCl tế bào chất bị co lại (vì nước ngồi), màng tách Cũng dùng siêu âm phá vỡ tế bào dùng kính hiển vi điện tử để bóc màng Thành phần hóa học màng chủ yếu polysacarit, lipit, lipoit, protein với loại đường glucoza, araphinoza, lactoza Khác với màng tế bào thực vật, màng tế bào vi khuẩn hợp chất xenluloza Chức màng bảo vệ tế bào chất thực trình trao đổi chất + Màng nguyên sinh chất (citoplasmid membrane) Đó phần chất nguyên sinh nằm sát màng tế bào, dày khoảng 50 - 100AO, chiếm gần 10 - 15% trọng lượng khô tế bào, cấu tạo từ phức chất lipoprotein Dưới tiêu siêu cắt, người ta thấy màng nguyên sinh chất gồm ba lớp: lớp protein, lớp photpholipit Sự xếp làm tăng khả bán thấm màng tế bào Chức màng nguyên sinh chất: - Là nơi thực trình tổng hợp số thành phần tế bào màng tế bào, giáp mạc, tiên mao, 90% enzim oxy hóa khử (dehdrogenaza xitocrom) nằm vùng - Nó chủ động tích lũy thức ăn cho tế bào enzim permeaza có vai trị quan trọng giống enzim vận chuyển định cư màng tế bào chất - Duy trì áp suất thẩm thấu tế bào b Nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn Nguyên sinh chất phận chính, chủ yếu tế bào, nằm phía màng nguyên sinh chất, nơi thực trình tổng hợp phân giải chất tế bào sở tế bào phát triển đổi Thành phần hóa học nguyên sinh chất gồm 90% nước lại protein tế bào trẻ, nguyên sinh chất đồng quang học tế bào già tính đồng việc hình thành số bào quan khơng bào số thể vùi dự trữ Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 41 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH + Riboxom trung tâm tổng hợp protein cho tế bào Riboxom có hai nửa cấu tạo Khi tổng hợp protein, riboxom tập hợp thành vùng gọi polyxom Thành phần hóa học riboxom protein axit nucleic + Mezoxom tiểu thể hình cầu, nằm gần vách ngăn ngang tế bào, vai trị giúp tế bào q trình phân chia + Khơng bào (vacuola) có cấu trúc hình cầu hình bầu dục, xuất tế bào già Trong không bào chứa nhiều nước số chất vơ hịa tan Vai trị điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào + Sắc thể cấu trúc hình hạt có chứa khuẩn lục tố Vai trị sắc thể chuyển quang thành hóa giống lục lạp thực vật + Các loại thể vùi dự trữ: nơi chứa chất dự trữ cho tế bào, hình thành tế bào tổng hợp thừa số chất môi trường giàu thức ăn Nó đưa sử dụng mơi trường cạn thức ăn Thể vùi có dạng: - Hạt volutin (hay gọi metacromatin - dị nhiễm sắc) bắt màu không đồng với màu tế bào chất Vì thành phần chủ yếu ARN photpho nên nhuộm xanh metylen cho màu tím Hạt hình thành tế bào rơi vào mơi trường giàu nitơ, photpho Chúng có nhiều vi khuẩn Spirillium volutans + Hạt glycogen granuloza dạng dự trữ gluxit, thường hình thành mơi trường có nhiều đường.Khi nhuộm iơt glycogen cho màu nâu sẫm cịn granuloza cho màu xanh thẫm Những hạt nguồn cung cấp cacbon lượng cho thể + Hạt lipit nơi dự trữ chất béo Chúng tồn tế bào chất dạng giọt mỡ trung tính + Thể vùi vơ bao gồm: - Hạt lưu huỳnh S sản phẩm trình oxy hóa sunfua hidro: H2S + O2 = S + H2O + E sử dụng dạng dự trữ lưu huỳnh - Ngồi cịn có tinh thể muối canxicacbonat canxioxalat + Nhân tế bào: Tế bào vi khuẩn có nhân tồn dạng nguyên thủy Đó sợi ADN mạch vòng nằm phân tán tế bào chất, chưa hình thành loại hạt cụ thể Đa số vi khuẩn có nhân theo kiểu này, số vi khuẩn, người ta thấy phân tử Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 42 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ADN nằm tập trung vùng định tế bào chất, tạo nên vùng nhân - bắt đầu có dấu hiệu nhân phân hóa rõ rệt Loại niêm vi khuẩn (vi khuẩn nhầy) có Vai trị nhân truyền tín hiệu di truyền kiểm sốt q trình tổng hợp protein Đặc điểm sinh lý Dinh dưỡng: Đa số sống hoại sinh ký sinh, số có khả tự dưỡng ni tơ vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh rễ đậu Hô hấp: Các vi khuẩn hô hấp hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện phụ thuộc vào đặc tính lồi Sinh sản: a Hình thức sinh sản vi khuẩn phổ biến sinh sản vơ tính cách phân cắt ngang tế bào với tạo thành vách ngăn b Các giai đoạn: Giai đoạn 1: - giai đoạn chuẩn bị Tế bào phát triển nhanh chất, kích thước lớn lên rõ rệt, hoàn chỉnh phận bên trong, tập trung chất dự trữ cần thiết cho việc hình thành máy hạt nhân cấu trúc cho tế bào đời Giai đoạn 2: - giai đoạn hình thành màng ngăn Ở tế bào, sát màng tế bào mọc lên hai mấu, đánh dấu vị trí mà tế bào phân đơi, từ hai mấu phát triển, tiến dần vào nguyên sinh chất tạo màng ngăn Hai màng ngăn tiến dần vào nhau, lúc sở vật chất tách đơi Q trình kết thúc hai màng ngăn tiến sát vào tạo hai tế bào đứng độc lập (hai màng dính vào nhau) Giai đoạn 3: Từ tế bào mẹ hình thành hai tế bào độc lập Sự phân chia xảy tế bào - Phân chia đẳng hình cho hai tế bào giống hệt - Phân chia dị hình (sự phân chia lệch phía) cho hai tế bào khơng Các nhóm vi khuẩn khác khả phân tách tế bào xảy theo nhiều hướng khác - Cầu khuẩn phân tách theo 1, mặt phẳng trực giao cho 2, tế bào - Trực khuẩn, xoắn có hình thức cắt ngang tế bào Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 43 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH Hình thức sinh sản hữu tính ngun thủy tế bào xảy hoi Hai tế bào kết hợp với tạo thành kết hợp tử tạo hai tế bào theo cách phân đơi Hình thức xảy với hai phận tế bào làm cho tế bào có sức sống mạnh hơn, không phổ biến c Tốc độ sinh sản trung bình tế bào sau 20 30 phút tế bào phân cắt lần Với vi khuẩn chịu nhiệt, thời gian ngắn 10 phút lần vi khuẩn chịu lạnh (như vi khuẩn lao) 10 18 d Ý nghĩa trình sinh sản: - Duy trì nịi giống giúp vi khuẩn khỏi diệt vong - Giải thích q trình vi sinh xảy nhanh chóng Khả tạo bào tử: Một số loài vi khuẩn điều kiện sống bất lợi có khả tạo bào tử Khi bào tử già khó bắt màu thuốc nhuộm + Bào tử dạng hình cầu hình bầu dục hình thành bên tế bào điều kiện đặc biệt, có hình thái, cấu trúc khác hẳn tế bào bình thường Trong ngành vi khuẩn khoảng 1/3 số vi khuẩn tự nhiên có khả tạo bào tử gặp điều kiện khó khăn ; đa số nằm nhóm trực khuẩn thuộc họ Bacillaceae, hai giống Bacillus Clostridium Trong cầu khuẩn Sarsina urea có bào tử Trong xoắn khuẩn Spirillium volutans desunfovibrio (loại phẩy khuẩn phản sunfat hóa) có bào tử + Q trình hình thành bào tử tập trung, cô đặc tế bào chất chất nhân vùng định tế bào gọi vùng bào tử Lượng nước tự giảm dần, hàm lượng nước liên kết tăng lên Bên ngồi vùng bào tử hình thành lớp vỏ dày lipit khó thấm nước chất hịa tan từ ngồi vào, làm cho q trình sinh hóa giảm xuống mức tối thiểu tế bào biến thành bào tử Như vậy, bào tử tế bào đặc biệt mà cường độ trao đổi chất cực tiểu (minimum) Quá trình xảy điều kiện mơi trường khó khăn: thường nhiệt độ cao Thời gian từ đến kéo dài vài chục + Cấu trúc bào tử: - Ở bên ngoại mạc cấu tạo từ lipit khơng thấm nước chất hịa tan - Vỏ - nội mạc chủ yếu protein, có vai trò bào tử trở thành tế bào + Thành phần hóa học: Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 44 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH - Hàm lượng nước: Trong bào tử khơng có nước tự mà có nước liên kết nên có khả chịu nhiệt cao tế bào bình thường nước liên kết khơng làm biến tính protein tác dụng nhiệt độ cao - Muối canxidipicolinat có tác dụng giữ cho bào tử có tính ổn định nhiệt cao + Đặc tính bào tử: - Bào tử vi khuẩn chịu nhiệt cao Khả lồi khác Ví dụ: bào tử Bacillus cereus chịu 100OC từ đến phút, bào tử Bacillus subtillis chịu 100OC trpng 180 phút, bào tử Bacillus megaterium 100OC chịu 360 phút Bào tử tất vi khuẩn thuộc họ Clostridium chịu 180OC 110 phút Do phải vơ trùng sức nóng khơ nhiệt độ 160 - 150OC - 1, - Bào tử bền chất phóng xạ độc tố có ngoại mạc bảo vệ - Khả chịu khô cạn bào tử cao + Ý nghĩa việc hình thành bào tử: - Đây hình thức tự vệ giúp vi khuẩn chống chọi lại điều kiện khắc nghiệt - Việc hình thành bào tử coi trình tiếp xúc, kết hợp phận khác tế bào tạo nên tế bào có sức sống mãnh liệt tế bào cũ Khả chuyển động: Đa số vi khuẩn có khả di động di động cách chủ động quan di động riêng biệt gọi tiên mao Một số khác di động cách uốn vặn vịng vịng xoắn co bóp, phồng dẹt tế bào Một số di động cách bị động nhờ tác động hỗn loạn tự nhiên Người ta chia nhóm di động chủ động tiên mao nhóm: + Nhóm đơn mao khuẩn (monotricha) vi khuẩn có tiên mao đầu tế bào Ví dụ Anphitricha có hai tiên mao hai đầu tế bào +Nhóm chùm mao khuẩn (lophotricha) có chùm tiên mao đầu tế bào Ví dụ Spirillium volutans có hai chùm tiên mao hai đầu + Nhóm chu mao khuẩn (peritricha) gồm vi khuẩn có tiên mao bố trí xung quanh tồn tế bào Ví dụ vi khuẩn đường ruột Bacterium coli hay Clostridium Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 45 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH Cấu tạo tiên mao: Về chất, tiên mao sợi nguyên sinh chất kéo dài ra, kích thước mỏng 0,01 0,05 ; dài 10 , có trường hợp dài gấp 20 lần kích thước tế bào Sự bố trí tiên mao tế bào vi khuẩn ảnh hưởng lớn đến đến tốc độ hướng di động vi khuẩn - Loại tiên mao di động nhanh, hướng thẳng với vận tốc 20/s, chí có lồi tới 200/s - Loại chùm mao khuẩn di động chậm loại chu mao khuẩn cịn chậm khơng có hướng rõ rệt Chức tiên mao: Đây quan giúp cho vi khuẩn tìm kiếm mơi trường thích hợp - nhu cầu sinh lý phổ biến Một số vi khuẩn có tiên mao môi trường cũ già tiên mao rụng Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, nhờ làm phát triển máy tiếp xúc tế bào vi khuẩn với mơi trường bên ngồi tạo điều kiện cho trình trao đổi chất (bộ máy lớn việc hấp thụ chất dinh dưỡng thải chất dễ dàng) Vai trò ứng dụng vi khuẩn - Tham gia vào q trình chuyển hóa chất tự nhiên, vơ hóa chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái - Sản xuất axit hữu dung môi hữu - Sản xuất lượng sinh học (khí thắp, nhiên liệu sinh học - "xăng xanh") - Sản xuất chất có hoạt tính sinh học cao B QUAN SÁT NẤM MỐC I Đặc điểm hình thái, sinh lý ứng dụng nấm mốc cơng nghiệp Đặc điểm hình thái - Cấu tạo: Nấm mốc loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi Có hai loại sợi nấm: sợi có vách ngăn (đa bào) sợi không vách ngăn (đơn bào) - Hình dạng: Đa số nấm mốc có hình sợi phân nhánh Khi phát triển sợi chằng chịt với làm thành hệ sợi nấm - gọi khuẩn ty thể (micelium) Một số sợi sinh trưởng cách đâm sâu vào môi trường gọi khuẩn ty chất Phần khác phát triển bề mặt chất gọi khuẩn Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 46 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ty khí sinh Khuẩn ty chất có nhiệm vụ hút muối khống chất dinh dưỡng để ni tồn hệ sợi Khuẩn ty khí sinh có chức hơ hấp mang quan sinh sản bào tử - Kích thước: Sợi nấm có đường kính từ - 20 m, dài cỡ cm hay Đặc điểm sinh lý - Dinh dưỡng: Nấm mốc thuộc loại thực vật hạ đẳng khơng có diệp lục Chúng sống ký sinh hoại sinh - Hô hấp: Đa phần nấm mốc vi sinh vật hiếu khí - Sinh sản: Nấm mốc sinh sản nhiều phương thức: + sinh sản hữu tính tiếp hợp tử + Sinh sản sinh dưỡng đoạn sợi nấm + Sinh sản vơ tính hạch chủ yếu bào tử - Khả tạo bào tử: Bào tử quan sinh sản nấm mốc Có hai loại bào tử: + Bào tử nội sinh (bào tử nang - endospore) + Bào tử ngoại sinh (bào tử đính - exospore) Sợi nấm mang bào tử gọi cuống bào tử Bào tử nấm mốc có màu sắc đặc trưng cho lồi Bào tử nang Mucor, Rhizopus có màu đen.Bào tử Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, Aspergillus niger - màu đen, Aspergillus usami - màu nâu, Aspergillus awamori - màu nâu đen, Penicillium - màu xanh lam Sự hình thành bào tử nấm mốc khác có tính chất đặc trưng cho lồi - Khả chuyển động: Nấm mốc khơng có khả di động chúng phân bố rộng rãi tự nhiên bào tử phát tán khơng khí nhờ gió Ứng dụng cơng nghiệp - Nấm mốc đóng vai trị quan trọng q trình chuyển hóa vật chất tự nhiên, vơ hóa chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái - Sản xuất axit hữu - Sản xuất chất có hoạt tính sinh học cao enzim, protein, vitamin, axit amin, kháng sinh Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 47 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH II Quan sát phân biệt bốn lồi nấm mốc điển hình : Mucor, Rhizopus, Aspergilus Penicillium Nhóm Mucor Rhizopus Sợi nấm đơn bào, chúng có khả tạo thành bào tử nang (bào tử nội sinh) Sợi màu trắng, bào tử nang vàng Ở Mucor cuống bào tử nang phân nhánh mọc lên vị trí sợi nấm Ở Rhizopus cuống bào tử nang không phân nhánh, mọc lên chỗ sợi nấm ăn sâu vào môi trường, cuống bào tử mọc thành cụm ba bốn chân cụm có mọc nhiều sợi nhỏ ăn sâu vào môi trường trông giống rễ bụi lúa gọi rễ giả Nhóm Aspergilus Penicillium Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm mang bào tử phình to , tạo thành tế bào hình chai (hay thể bình) hình thành chuỗi đính bào tử (bào tử ngoại sinh) Ở Aspergillus cuống đính bào tử đơn bào tế bào hình chai đính bào tử tỏa đầu sợi nấm sinh sản tia nước đầu vịi tưới Ở Penicillium cuống đính bào tử đa bào, đầu cuống phân nhánh nhiều lần thành đốt song song hình thành đính bào tử Các tế bào hình chai đính bào tử hướng lên phía giống chổi Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN 48 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH Hình 12: Đặc điểm hình thái loại nấm Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN