báo cáo thí nghiệm vi sinh môi trường

Micropipette Định lượng một thể tích chính xác VSV, môi trường nuôi cấy chất.. Bước 2: Dùng pipette vôthạch đĩa trong không gian vô trùng Hút trong khônggian vô trùng gầnngọn lửa đèn cồn

D ng c , thi t b s ụ ụ ế ị ử d ng trong môn h ụ ọc

Vi sinh v t phân gi i cellulose ậ ả

- Cellulose (C6H O10 5)n là thành phần c u tấ ạo cơ bản c a thành t bào thủ ế ực vật Hằng năm có một khối lượng lớn cellulose được đưa vào đất, m c dù là ch t cao phân t , khá b n, ặ ấ ử ề chúng vẫn b phân giị ải dưới ảnh hưởng c a mủ ột số vi sinh vật trong điều kiện k khí lị ẫn hiếu khí, môi trường kiềm hay môi trường axit, độ ẩ m cao th p nhiấ ở ệt độ khác nhau.

- Hoạt động phân gi i cellulose có ả ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu của đấ và có ý nghĩa t l n trong quá trình x ớ ử lý môi trường

- Quá trình phân giải cellulose x y ra nh tác d ng cả ờ ụ ủa enzyme cellulose Dưới tác d ng ụ của enzyme này, cellulose b phân giị ải thành cellulobiose (C12H O22 11) lại tạo thành glucose (C6H O12 6) nhờ tác dụng c a enzyme celloblase ủ

- Các vi sinh v t tham gia quá trình phân gi i cellulose bao g m vi khu n, x khu n, nậ ả ồ ẩ ạ ẩ ấm nhưng trong đó niêm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng

N : S khu n l c trung bình trong 1 petri ố ẩ ạ (với N = 26 t bào) ế

V : thể tích m u cẫ ấy (trong trường h p này là 0,1) ợ n : s nghố ịch đảo của nồng độ pha loãng (nồng độ pha loãng ở đây là 10 -4 n000) K: hệ s khô kiố ệt của m u (trẫ ong trường h p này K=1) ợ

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 29 Khuẩn l c ạ Kích thước Màu sắc Mức độ phân gi i ả S khu n l c ố ẩ ạ

Vi khuẩn đỏ 10-20mm Đỏ 5/10 13

Vi khuẩn trắng 3-5mm Trắng 2/10 5

- Nhóm chiếm ưu thế là vi khuẩn màu đỏ

- L y vi khu n tr ng cấ ẩ ắ ấy ria ta được

- Hình ảnh vi n m phân giấ ải cellulose, mô tả chi tiết

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 30 Hình: Vi sinh vật phân giải cellulose ở môi trường Hutchinson

Nấm t p trung thành t ng nhóm nh , mậ ừ ỏ ỗi chấm là m t khu n l c ộ ẩ ạ

Màu sắc: xanh,đen tầm 0,5-2mm

Hình dạng: ch m tròn nh ấ ỏ

Có khoảng 26 t bào trên mế ột đĩa với độ pha loãng 10 -4

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 31 3.1.3 Nh n xét: ậ

- Tùy vào môi trường mà th i gian xu t hi n khu n l c nhanh hay lâu ờ ấ ệ ẩ ạ

- Khi đặt gi y l c vào h p petri ph i ép sát gi y lấ ọ ộ ả ấ ọc vào môi trường để ậ t n d ng hụ ết bề m t gi y và tránh vi khu n khác loài m c lan vào gi y ặ ấ ẩ ọ ấ

- Lúc cấy ria ph i thao tác ph i nhanh, chính xác, thả ả ực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh sự nhiễm trùng từ môi trường bên ngoài.

Vi sinh v t phân gi i phosphor ậ ả

- Các vi sinh vật đảm nh n chậ ức năng chuyển hoá phosphor vô cơ thành dạng hoà tan có thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khu n nitrat hoá hoẩ ặc các laoị vi khu n sinh axit lên men ẩ nhi u ề chất khác nhau

- Để xác định s ố lượng vi khuẩn này, người ta thường dung môi trường glucose và muối phospho khó tan, thường dung Ca (PO Do k3 4)2 ết quả làm tan phospho mà xung quanh khu n lẩ ạc sẽ hình thành nh ng vòng trong su ữ ốt.

- Nồng độ pha loãng 10 -2 : khuẩ ạn l c m c dày trên mọ ặt thạch, không đếm được.

- Nồng độ pha loãng 10 -3 : gồm 76 khu n l c, khu n l c có màu tr ng xung quanh có ẩ ạ ẩ ạ ắ nh ng vòng phân gi i trong suữ ả ốt

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 32

N : Số khu n l c trung bình trong 1 petri (v i N = 26 t bào) ẩ ạ ớ ế

V : thể tích m u cẫ ấy (trong trường h p này là 0,1) ợ n : s nghố ịch đảo của nồng độ pha loãng

K: hệ s khô kiố ệt của mẫu (trong trường h p này K=1) ợ

- Hình ảnh vi khu n phân gi i cellulose, mô t ẩ ả ảchi tiết

- Khi đổthạch vào h p petri ph i kh ộ ả ửtrùng vùng xung quanh và tay để tránh nhiễm vi sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đổ thạch phải thực hiện trong ph m vi kh ạ ử khu n cẩ ủa đèn cồn

- Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha loãng tránh gây l n l n ẫ ộ

- Do thí nghiệm của nhóm không đạ ết k t qu , nên có s d ng kả ử ụ ết quả ủ c a một số nhóm khác để hoàn thiện bài báo cáo.

Vi khu n Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khu n ph n nitrat hoá ẩ ẩ ả

NH4 +dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để bi n thành NOế - 2gọi là quá trình nitrit hoá NO- s 2ẽtác dụng v i dung dớ ịch Griss I và Griss II sẽ t o thành h p ch t màu h ng ạ ợ ấ ồ

NH4 +dưới tác dụng c a mủ ột số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc bi t ệ được oxy hoá để bi n thành NOế - 3 g i là quá trình nitrat hoá Quá trình này gọ ồm 2 giai đoạn: giai đoạn nitrit hoá t o s n ph m nitrit NOạ ả ẩ - 2và giai đoạn nitrat hoá với sản ph m là NOẩ - 3Xác định s hi n di n cự ệ ệ ủa NO- 3bằng cách cho dung d ch phị ản ứng diphenylamine, nitrat s ph n ẽ ả ứng với diphenylamine tạo ra Sulfonylindiphenyamine và dung dich có màu xanh

- Quá trình phản nitrat hoá

Là quá trình khử NO- qua nhi3 ều giai đoạn và cuối cùng tạo ra nitơ phân tử dưới tác dụng của vi sinh vật Quá trình xảy ra trong môi trường kị khí Định tính sự có mặt của nitrat, nitrit như trong phần nitrat hoá, sự tạo ra của nitơ phân tử thể hiện sự hình thành các bọt khí trong môi trường nuôi cấy.

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 33 3.3.2 K t qu ế ả

3.3.2.1 Vi khuẩn amon trong môi trường lỏng:

- Quan sát và ghi nhận các đặc điểm sau:

 S biự ến đổi màu s c cắ ủa giấy th pH: giá tr pH ử ị

 S biự ến đổi màu c a gi y lủ ấ ọc thấm acetate chì

 So sánh mẫu đối chứng Độ pha loãng Đục môi trường Tạo bông Tạo cặn pH Màu giấy lọc tẩm acetate

Hình : ống nghi m amon hóa ệ

Vi khuẩn Amon hoá Sự đổi màu của gi y pH ấ

- Sau vài ngày,trong quá trình nuôi c y không ng ng sinh ra b t khí và trên b mấ ừ ọ ề ặt môi trường có một lớp bọt khí Chứng tỏ có quá trình chuyển hóa NO- và sinh ra 3 khí N 2

- Phả ứng địn nh tính nitrit:

Dùng ống hút l y 0,1 ml dung dấ ịch môi trường cho vào ng nghiố ệm vô trùng.

Nhỏ 1 gi t dung d ch Griess I, Griess II : màu h ng ọ ị ồ

- Chọn ng nghiố ệm dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hi n vi ể

- Mô tả,so sánh các hình thái t bào vi khuế ẩn quan sát được về: hình d ng,kh ạ ả năng di động, khả năng tạ ập đoàn khuẩo t n keo

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 35 Hình: Sự đổi màu của vi khu n Nitrat ẩ

3.3.2.3 Vi khuẩn phản Nitrat hoá:

- quá trình ph n nitrat hóa : NOỞ ả -được khử đế3 n N2O và N2 S gi i phóng Nự ả 2 là sản phẩm ưu thế ủa quá trình phả c n nitrat Vì N 2hòa tan ít trong nước,do đó chúng có

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 36 khuynh hướng thoát ra ngoài như các bong bóng nổi lên trên.Nhờ có lớp dầu paraffin trên b mề ặt môi trường nên không khí bên ngoài không vào được và nito bên rong môi trường cũng không thoát ra ngoài được Trong quá trình thí nghiệm c n thao tác c n th n tránh ầ ẩ ậ để không khí bên ngoài vào

- quá trình nitrat hóa: s i màu t ng sang h ng ch ng t Ở ự đổ ừtrắ ồ ứ ỏ cường độ hoạt động của vi khu n m nh ẩ ạ

E.coli,Coliform

- Ngoài phương pháp đếm khu n lẩ ạc, số lượng coliforms, coliforms ch u nhi t, coliforms ị ệ phân và E.coli trong mẫu được xác định bằng phương pháp MPN (most probable number)

- Phương pháp này dựa vào nguyên t c mắ ẫu được pha loãng thành một dãy nồng độthập phân; 3 ho c 5 mặ ẫu có độ pha loãng th p phân liên tiậ ếp được ủ trong ng nghi m có môi ố ệ trường thích h p có ng Durham bẫy khí M i nợ ố ỗ ồng độ pha loãng t ủ ừ 3 đến 5 ng l p l ố ặ ại.

- Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để đị nh tính s hi n di n trong t ng ng nghiự ệ ệ ừ ố ệm, đây là các ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗ ồng độ i n pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra s ố lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hi n ệ di n trong 1g (ho c 1ml) mệ ặ ẫu ban đầu

Nồng độ M u ẫ Nồng độ 10 -1 Nồng độ 10 -2 Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 37 Nồng độ

M u ẫ Nồng độ 10 -1 Nồng độ 10 -2 Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 38 Hình ảnh

Do m u b nhi m vi sinh v t nên không có k t qu và hình ẫ ị ễ ậ ế ả ảnh quan sát dưới kính hi n vi ể Coliform

Làm tiêu bản và hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi

Vi sinh v t trong x ậ ử lý nướ c th ải

3.5.1.1 Nguyên tắc xác định Clostridium

- Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào t , ph n l n ử ầ ớ di động, có thể thuỷ giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 39 Những loài thu gi i saccharide có th lên men các loỷ ả ể ại đường polysaccharide tạo thành acetic axid, butyric acid mùi r t khó ch u trong s n phấ ị ả ẩm Hầu h t các gi ng Clostridium ế ố thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuyy nhiên có m t sộ ố loài thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh

- Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định b ng cách s dằ ử ụng môi trường có ch a ferri ứ ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở37 o C trong 1-2 ngày N u nghi ng ế ờcó Clostridium ưa nhiệt có th ểủthêm ở 50 C o Trên môi trường này các khu n lẩ ạc

Clostridium có màu đen do phản ứng gi a ion sulphite (Sữ -) và ion (Fe2 + 2) có trong môi trường

3.5.1.2 Nguyên tắc xác định Streptococcus phân

- Streptococcus phân (Feacal Streptococcus) là các liên c u khu n, có ngu n gầ ẩ ồ ốc từ phân, có hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương, thường tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy Hầu h t các ;oài ế này s ng hi u khí tu ố ế ỳ ý nhưng phát triể ốt trong điền t u ki n k khí, tiệ ị ết bacteriocin trong quá trình tang trưởng và có thể ức chế s ựtang trưởng của các vi khuẩn khác

Streptococcus được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân của môi trường nước

- Có thể xác định Septoccus phân bằng phương pháp đếm khuẩ ạn l c hoặc phương pháp MPN

Mẫu được cấy trên b mề ặt môi trường chọ ọc, sau kn l hi m khu n lủ đế ẩ ạc đặc trưng và khẳng định các khu n lẩ ạc đã đếm b ng các th nghiằ ử ệm sinh hoá Trong trường h p nghi ợ ng ờcó sự ệ hi n di n c a Streptococcus ệ ủ phân nhưng có thể ị ổn thương, tiế b t n hành hồi phục các vi khuẩn này b ng cách c y mằ ấ ẫu vào trong môi trường không ch n lọ ọc, ủ ở

37 C trong 2 gi o ờ, sau đó phủ lên một lớp môi trường ch n lọ ọc, các đĩa môi tường sau khi cấy được ủ 44 C trong khoở o ảng 48 gi ờ

Dịch mẫu được cấy vào môi trường canh Azide Glucose Stretococcus phân có kh ả năng sinh trưởng trong môi trường này, lên men glucose sinh acid làm biến đổi màu của chất chỉ ị th pH trong môi trường Tất cả các ng cho kố ết quả dương tính sẽ được cấy tiếp sang môi trường khẳng khác Môi trường khẳng định được sử dụng Bile Esculine Agar

Streptococcus phân thuỷ phân esculine trong môi trường t o ra s n ph m cu i cùng là ạ ả ẩ ố6,7-hydroxycoumarin, ch t này k t h p vấ ế ợ ới Fe 3+ t o thành h p ch t có màu nâu ạ ợ ấ đen

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 40 khuếch tán vào môi trường Ngoài ra, vi c khệ ẳng định còn được thực hi n b ng th ệ ằ ử nghi m b ng th nghi m catalase ệ ằ ử ệ

- M i mỗ ẫu nước trong b ềaerotank, SBR th c hiự ện làm tiêu bản quan sát dưới kính hi n ể vi

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 41 8h

- M u ẫ nước thải ban đầu rất ô nhiễm, mẫu nước có màu đen, có mùi hôi kho chịu

- Sau khi cho s c khi thì mụ ẫu nước trong hơn , cặn lơ lửng ít và l ng xuắ ống đáy như hình 2

- Tiếp tục làm như vậy ta được hình 3,4,5 màu nước trong, không có mùi, ít cặn lơ l ng, các bông c n lử ặ ớn dần và b l ng xu ng thành bùn ị ắ ố

- T ừ đó cho thấy, khi cho s c khí vào thì xu t hi n các vi sinh vụ ấ ệ ật trong nước thải hoạt động, và nh ờ đó mà chất lượng nước đã thay đổi

- Nước thải càng s c khí lâu thì càng có nhi u vi sinh vụ ề ật và kích thước lớn

- Có ít vi sinh vật trong mẫu quan sát.

- Có những vi sinh vật hình bầu dục có thể di chuyển nên không chụp lại được hình ảnh của chúng

- Máy nh ch p không rõ nét ả ụ

- Kính hiển vi cũ nên hình ảnh soi được không đẹp

- Không th ể xác định được số lượng vi sinh vật và tên của chúng

PHẦN 4 K T LU N VÀ KI N NGHỊ Ế Ậ Ế

Sau môn h c sinh viên nọ ắm được các bước tiến hành của từng thí nghiệm.

Có kinh nghiệm trong việc thưc hành.

Nội dung bài liên kết v i nhau dớ ễ ể hi u

Nội dung thí nghiệm các phương pháp và các bước tiến hành được trình bày kĩ.

Các thi t b thí nghi m có mế ị ệ ột số khuyết điểm rõ ràng Nhi u bài không tiề ến hành được các thí nghiệm nghiên c u và kiứ ến th c chuyên môn còn h ng h p các nhứ ạ ẹ ận định trong bài ch mang tính ch t d ỉ ấ ự đoán, định tính mà không có kết quả chính xác Do đó kết quả nhóm đưa ra chưa chuẩn xác Rất mong được sự góp ý sữa ch a của thữ ầy để kiến thức của sinh chúng tôi thêm hoàn thiện

Tuy k t qu ế ả chưa cao nhưng chúng tôi biết cách thao tác thí nghi m và ki m nghiệ ể ệm ki n th c ế ứ

Nếu trường có đầy đủ các dụng cụ thí nghiệm, phòng học bộ môn thì sinh viên sẽ suy nghĩ và làm việc độc lập nhằm phát triển hơn về năng lực cá nhân của sinh viên

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 43 4.3 Bài h c kinh nghi m ọ ệ

Trong quá trình rèn luyện kh ả năng làm thí nghiệm thực hành nhóm đã rút ra một số kinh nghiệm sau:

• Khi làm thí nghiệm ph i nả ắm được mục đích thí nghiệm.

• Nắm chắc các bước tiến hành thí nghi m Thao tác thí nghi m c n th n chính xác ệ ệ ẩ ậ Tránh tình trạng làm đi làm lại nhiều l n làm m t tính thuyầ ấ ết phục

• Dự đoán kết quả trước khi làm thí nghiệm để sau đó tiến hành thí ngiệm rồi so sánh kết quả

• Sinh viên tự biết bố trí thí nghiệm và thấy được k t qu làm ra ế ả

• Sinh viên tự biết khám phá ki n th c, t tìm kiến th c trong tâm cho mình để ghi ế ứ ự ứ nh tránh vi c ghi nh máy móc mà hi u sâu v vớ để ệ ớ ể ề ấn đề hơn, khả năng diễn đạt rõ ràng

(Hình ảnh các thành viên trong nhóm)

Báo cáo thí nghi m vi sinh k thu ệ ỹ ật môi trườ ng Page 44 Trần Thiên Ân

Ki n ngh ế ị