Thí nghiệm vi sinh môi trường đh công nghiệp thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG - Báo cáo: THÍ NGHIỆM VI SINH MƠI TRƯỜNG SVTH: Ngơ Thái Bảo : 3009110516 Trần Thị Hồng Cẩm:3009110470 Trần Thiên Ân:3009110373 Nguyễn Dũ:3009110440 TP.HCM,tháng năm 2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Dụng cụ, thiết bị sử dụng môn học: 1 1.1 1.2 Dụng cụ Thiết bị PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH 10 2.2.1 Kỹ thuật tiêu tạm thời 10 2.2.2 Kỹ thuật pha môi trường 11 2.2.3 Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : 12 2.2.4 Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật 13 2.2.5 Kỹ thuật phân lập vi sinh vật 15 2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu 18 2.2.7 Phương pháp hộp đổ 19 2.2.8 Phương pháp hộp trải 20 2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn 22 2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) 23 2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi 26 PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MƠI TRƯỜNG 28 3.1 Vi sinh vật phân giải cellulose 28 3.1.1 Nguyên tắc 28 3.1.2 Kết 28 3.1.3 Nhận xét: 31 3.2 Vi sinh vật phân giải phosphor 31 3.2.1 Nguyên tắc 31 3.2.2 Kết 31 3.2.3 Nhận xét: 32 3.3 Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá vi khuẩn phản nitrat hoá 32 3.3.1 Nguyên tắc 32 3.3.2 Kết 33 3.3.3 Nhận xét: 35 3.4 E.coli,Coliform 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.4.1 Nguyên tắc 36 3.4.2 Kết 36 3.5 Vi sinh vật xử lý nước thải: 38 3.5.1 Nguyên tắc 38 3.5.2 Kết 40 3.5.3 Nhận xét 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 4.3 Bài học kinh nghiệm 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Dụng cụ, thiết bị sử dụng môn học: 1.1 Dụng cụ Dụng cụ Hình ảnh Cơng dụng Đĩa petri Chứa môi trường nuôi cấy VSV Ống nghiệm Dùng để chứa đựng dung dịch với thể tích nhỏ, nuôi cấy vi sinh vật môi trường lỏng hay mơi trường thạch Bình tam giác Phiến kính kính Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Chứa mơi trường ni cấy hay dung mơi hóa chất pha chế mơi trường Phiến kính:chứa giọt VSV trạng thái sống nhuộm màu quan sát kính hiển vi Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Lá kính : dung để đậy lên giọt VSV phiến kính để quan sát trạng thái sống tế bào VSV Dùng để chứa cồn, hóa chất… Cốc thủy tinh Trải giọt sinh khối VSV lên bề mặt thạch Que trang Que cấy vịng Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Ria bề mặt thạch hay phân lập VSV bề mặt thạch hoăc cấy chuyền môi trường lỏng Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Đèn cồn Micropipette Kính lúp Tạo khơng gian vô trùng, khử trùng loại que cấy Định lượng thể tích xác VSV, mơi trường ni cấy hay dung dịch hóa chất Quan sát vật có kích thước nhỏ Phễu thủy tinh Chuyển dung mơi từ dụng cụ chứa sang dụng cụ chứa dùng miệng dụng cụ chứa nhỏ Ống đong Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Sử dụng để định mức lượng hóa chất cần dùng với độ xác cao Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Nghiền nhỏ mẫu đất Cối Bình tam giác có nút mài Dùng để chứa cồn loại hóa chất dễ bay khơng khí Chậu thủy tinh Chứa rác giấy báo,gang tay, trang … sử dụng Giá để ống nghiệm Kẹp sắt Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Để ống nghiệm tránh vỡ, lăn ngồi… Dùng để giữ vật mà u cầu khơng sử dụng tay để giữ, vd : giữ phiến kính hơ lửa cồn, tn phân giải xenlulozo… Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm 1.2 Giá để pipet Dùng để để pipet, đũa thủy tinh Bình tia Chứa nước cất Bóp cao su Sử dụng để hút hóa chất thơng qua pipet Thiết bị Thiết bị Nồi hấp khử trùng Cách vận hành Hình ảnh Mở nắp nồi hấp, lấy hai giỏ inox Cho nước cất vào nồi hấp đến ngập ốc cảm ứng khoảng 1-2 cm tiếp tục cho giỏ inox lớn vào nồi hấp Cho dụng cụ môi trường cần hấp khử trùng vào giỏ nhỏ đưa vào nồi hấp Đóng nắp khóa van Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Bật cơng tắt bên hơng, cài đặt thông số nhiệt độ,áp suất, thời gian, bấm nút “set” “start” Khi có tín hiệu mở nồi hấp ra, chờ phút cho bớt nóng lấy dụng cụ mơi trường (nếu muốn hạ áp suất nồi hấp mở nắp nồi hấp ) Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Tủ sấy - Mở cửa tủ sấy cho vật liệu sấy vào đóng lại ( đẩy tay cầm sang trái để mở, sang trái để đóng) - Cắm nguồn điện chờ 10s bật on/off để mở máy - Nhấn phím “▲▼” để chọn chương trình P3, chờ 5s để xác nhận chương trình chọn - Nhấn phím X/W để cài nhiệt độ sấy( dùng phím “▲▼” để cài nhiệt độ ) - Nhấn phím X/W để cài thời gian sấy ( dùng phím “▲▼” để cài thời gian), chạy liên tục để thời gian cài đặt - Chờ 5s máy tự động lưu thong số vừa cài bước - Khi đạt nhiệt độ sấy hình nhấp nháy liên tục hai thông số cài đặt, thời gian cài đựt kết thúc trình sấy, tắt tủ sấy lấy vật liệu sấy - Vệ sinh tủ sấy Cân điện tử Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm 3.1.3 Nhận xét: - Tùy vào môi trường mà thời gian xuất khuẩn lạc nhanh hay lâu - Khi đặt giấy lọc vào hộp petri phải ép sát giấy lọc vào môi trường để tận dụng hết bề mặt giấy tránh vi khuẩn khác loài mọc lan vào giấy - Lúc cấy ria phải thao tác phải nhanh, xác, thực điều kiện vô trùng để tránh nhiễm trùng từ mơi trường bên ngồi 3.2 Vi sinh vật phân giải phosphor 3.2.1 Nguyên tắc - Các vi sinh vật đảm nhận chức chuyển hố phosphor vơ thành dạng hồ tan vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá laoị vi khuẩn sinh axit lên men nhiều chất khác - Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dung mơi trường glucose muối phospho khó tan, thường dung Ca3(PO4)2 Do kết làm tan phospho mà xung quanh khuẩn lạc hình thành vịng suốt 3.2.2 Kết Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3 - Nồng độ pha loãng 10-2: khuẩn lạc mọc dày mặt thạch, không đếm - Nồng độ pha lỗng 10-3: gồm 76 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu trắng xung quanh có vịng phân giải suốt - Kết phân tích : Tính kết quả: Số tế bào/g = N x x n x K=76 x x 103 x = 76.105 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm N : Số khuẩn lạc trung bình petri (với N = 26 tế bào) V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp 0,1) n : số nghịch đảo nồng độ pha loãng K: hệ số khô kiệt mẫu (trong trường hợp K=1) - Hình ảnh vi khuẩn phân giải cellulose, mơ tả chi tiết 3.2.3 Nhận xét: - Khi đổ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh tay để tránh nhiễm vi sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đổ thạch phải thực phạm vi khử khuẩn đèn cồn - Ghi nhãn môi trường nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn - Do thí nghiệm nhóm khơng đạt kết quả, nên có sử dụng kết số nhóm khác để hoàn thiện báo cáo 3.3 Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá vi khuẩn phản nitrat hoá 3.3.1 Ngun tắc - Q trình nitrit hố NH4+ tác dụng số vi sinh vật tự dưỡng hoá đặc biệt oxy hoá để biến thành NO2- gọi q trình nitrit hố NO2- tác dụng với dung dịch Griss I Griss II tạo thành hợp chất màu hồng - Quá trình nitrat NH4+ tác dụng số vi sinh vật tự dưỡng hoá đặc biệt oxy hoá để biến thành NO3- gọi q trình nitrat hố Q trình gồm giai đoạn: giai đoạn nitrit hố tạo sản phẩm nitrit NO2- giai đoạn nitrat hoá với sản phẩm NO3- Xác định diện NO3- cách cho dung dịch phản ứng diphenylamine, nitrat phản ứng với diphenylamine tạo Sulfonylindiphenyamine dung dich có màu xanh - Q trình phản nitrat hố Là q trình khử NO3- qua nhiều giai đoạn cuối tạo nitơ phân tử tác dụng vi sinh vật Quá trình xảy mơi trường kị khí Định tính có mặt nitrat, nitrit phần nitrat hoá, tạo nitơ phân tử thể hình thành bọt khí mơi trường ni cấy Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 32 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm 3.3.2 Kết 3.3.2.1 Vi khuẩn amon môi trường lỏng: - Quan sát ghi nhận đặc điểm sau:  Sự đục môi trường  Sự tạo bông, cặn  Sự váng bề mặt - Phản ứng sinh hoá:  Sự biến đổi màu sắc giấy thử pH: giá trị pH  Sự biến đổi màu giấy lọc thấm acetate chì  So sánh mẫu đối chứng Độ pha lỗng Đục mơi trường Tạo Tạo cặn pH Mẫu đối chứng     Mẫu thí nghiệm     Trước Màu giấy lọc tẩm acetate Sau Hình : ống nghiệm amon hóa Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Vi khuẩn Amon hố - Sự đổi màu giấy pH Sau vài ngày,trong q trình ni cấy khơng ngừng sinh bọt khí bề mặt mơi trường có lớp bọt khí Chứng tỏ có q trình chuyển hóa NO3- sinh khí N2 3.3.2.2 Vi khuẩn nitrat hoá: - Phản ứng định tính nitrit: Dùng ống hút lấy 0,1 ml dung dịch môi trường cho vào ống nghiệm vô trùng Nhỏ giọt dung dịch Griess I, Griess II : màu hồng - Chọn ống nghiệm dương tính làm tiêu quan sát kính hiển vi Mơ tả,so sánh hình thái tế bào vi khuẩn quan sát về: hình dạng,khả di động, khả tạo tập đoàn khuẩn keo Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Hình: Sự đổi màu vi khuẩn Nitrat 3.3.2.3 Vi khuẩn phản Nitrat hoá: 3.3.3 Nhận xét: - Ở q trình phản nitrat hóa : NO3- khử đến N2O N2 Sự giải phóng N2 sản phẩm ưu trình phản nitrat Vì N2 hịa tan nước,do chúng có Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm khuynh hướng ngồi bong bóng lên trên.Nhờ có lớp dầu paraffin bề mặt mơi trường nên khơng khí bên ngồi khơng vào nito bên rong mơi trường khơng ngồi Trong q trình thí nghiệm cần thao tác cẩn thận tránh để khơng khí bên ngồi vào - Ở q trình nitrat hóa: đổi màu từ trắng sang hồng chứng tỏ cường độ hoạt động vi khuẩn mạnh 3.4 E.coli,Coliform 3.4.1 Nguyên tắc - Ngoài phương pháp đếm khuẩn lạc, số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms phân E.coli mẫu xác định phương pháp MPN (most probable number) - Phương pháp dựa vào nguyên tắc mẫu pha loãng thành dãy nồng độ thập phân; mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp ủ ống nghiệm có mơi trường thích hợp có ống Durham bẫy khí Mỗi nồng độ pha lỗng ủ từ đến ống lặp lại - Theo dõi sinh đổi màu để định tính diện ống nghiệm, ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính nồng độ pha loãng dựa vào bảng MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng diện 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu 3.4.2 Kết Nồng độ Nồng độ 10-1 Mẫu Nồng độ 10-2 Ống 3 Kết + + + + + + + + + Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường 3 Page 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Hình ảnh Nồng độ 10-1 Mẫu Nồng độ 10-2 Nồng độ Ống 3 Kết + + + + + + + + + Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường 3 Page 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Hình ảnh E.coli Do mẫu bị nhiễm vi sinh vật nên khơng có kết hình ảnh quan sát kính hiển vi Coliform Làm tiêu hình ảnh quan sát kính hiển vi Hình: nhuộm đơn Coliform 3.5 Vi sinh vật xử lý nước thải: 3.5.1 Nguyên tắc 3.5.1.1 Nguyên tắc xác định Clostridium - Giống Clostridium vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử, phần lớn di động, thuỷ giải saccharide protein hoạt động thu nhận lượng Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Những lồi thuỷ giải saccharide lên men loại đường polysaccharide tạo thành acetic axid, butyric acid mùi khó chịu sản phẩm Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuyy nhiên có số lồi thuộc nhóm ưa nhiệt số lồi khác thuộc nhóm ưa lạnh - Mật độ vi khuẩn Clostridium xác định cách sử dụng mơi trường có chứa ferri ammonium citrate disodium sulphite, ủ 37oC 1-2 ngày Nếu nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt ủ thêm 50oC Trên mơi trường khuẩn lạc Clostridium có màu đen phản ứng ion sulphite (S2-) ion (Fe2+) có mơi trường 3.5.1.2 Ngun tắc xác định Streptococcus phân - Streptococcus phân (Feacal Streptococcus) liên cầu khuẩn, có nguồn gốc từ phân, có hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương, thường tụ tập thành đôi hay chuỗi, không di động, không sinh bào tử, số dịng có tạo vỏ nhầy Hầu hết ;ồi sống hiếu khí tuỳ ý phát triển tốt điều kiện kị khí, tiết bacteriocin q trình tang trưởng ức chế tang trưởng vi khuẩn khác Streptococcus dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân mơi trường nước - Có thể xác định Septoccus phân phương pháp đếm khuẩn lạc phương pháp MPN - Phương pháp đếm khuẩn lạc Mẫu cấy bề mặt môi trường chọn lọc, sau ủ đếm khuẩn lạc đặc trưng khẳng định khuẩn lạc đếm thử nghiệm sinh hoá Trong trường hợp nghi ngờ có diện Streptococcus phân bị tổn thương, tiến hành hồi phục vi khuẩn cách cấy mẫu vào môi trường không chọn lọc, ủ 37oC giờ, sau phủ lên lớp mơi trường chọn lọc, đĩa môi tường sau cấy ủ 44oC khoảng 48 - Phương pháp MPN Dịch mẫu cấy vào môi trường canh Azide Glucose Stretococcus phân có khả sinh trưởng mơi trường này, lên men glucose sinh acid làm biến đổi màu chất thị pH môi trường Tất ống cho kết dương tính cấy tiếp sang môi trường khẳng khác Môi trường khẳng định sử dụng Bile Esculine Agar Streptococcus phân thuỷ phân esculine môi trường tạo sản phẩm cuối 6,7-hydroxycoumarin, chất kết hợp với Fe3+ tạo thành hợp chất có màu nâu đen Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm khuếch tán vào mơi trường Ngồi ra, việc khẳng định cịn thực thử nghiệm thử nghiệm catalase 3.5.2 Kết - Mỗi mẫu nước bề aerotank, SBR thực làm tiêu quan sát kính hiển vi Mẫu ban đầu 4h 2h 6h Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm 8h - Chụp hình vi sinh vật Mẫu 0h Mẫu 4h Mẫu 2h Mẫu 8h 3.5.3 Nhận xét Mẫu nước thải ban đầu nhiễm, mẫu nước có màu đen, có mùi kho chịu Sau cho sục mẫu nước , cặn lơ lửng lắng xuống đáy hình Tiếp tục làm ta hình 3,4,5 màu nước trong, khơng có mùi, cặn lơ lửng, bơng cặn lớn dần bị lắng xuống thành bùn Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Từ cho thấy, cho sục khí vào xuất vi sinh vật nước thải hoạt động, nhờ mà chất lượng nước thay đổi - Nước thải sục khí lâu có nhiều vi sinh vật kích thước lớn - Có vi sinh vật mẫu quan sát - Có vi sinh vật hình bầu dục di chuyển nên khơng chụp lại hình ảnh chúng - Máy ảnh chụp khơng rõ nét - Kính hiển vi cũ nên hình ảnh soi khơng đẹp - Không thể xác định số lượng vi sinh vật tên chúng PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau môn học sinh viên nắm bước tiến hành thí nghiệm Có kinh nghiệm việc thưc hành Nội dung liên kết với dễ hiểu Nội dung thí nghiệm phương pháp bước tiến hành trình bày kĩ Các thiết bị thí nghiệm có số khuyết điểm rõ ràng Nhiều không tiến hành thí nghiệm nghiên cứu kiến thức chun mơn hạng hẹp nhận định mang tính chất dự đốn, định tính mà khơng có kết xác Do kết nhóm đưa chưa chuẩn xác Rất mong góp ý sữa chữa thầy để kiến thức sinh thêm hoàn thiện Tuy kết chưa cao chúng tơi biết cách thao tác thí nghiệm kiểm nghiệm kiến thức 4.2 Kiến nghị Nếu trường có đầy đủ dụng cụ thí nghiệm, phịng học mơn sinh viên suy nghĩ làm việc độc lập nhằm phát triển lực cá nhân sinh viên Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm 4.3 Bài học kinh nghiệm Trong q trình rèn luyện khả làm thí nghiệm thực hành nhóm rút số kinh nghiệm sau: • Khi làm thí nghiệm phải nắm mục đích thí nghiệm • Nắm bước tiến hành thí nghiệm Thao tác thí nghiệm cẩn thận xác Tránh tình trạng làm làm lại nhiều lần làm tính thuyết phục • Dự đốn kết trước làm thí nghiệm để sau tiến hành thí ngiệm so sánh kết • Sinh viên tự biết bố trí thí nghiệm thấy kết làm • Sinh viên tự biết khám phá kiến thức, tự tìm kiến thức tâm cho để ghi nhớ để tránh việc ghi nhớ máy móc mà hiểu sâu vấn đề hơn, khả diễn đạt rõ ràng (Hình ảnh thành viên nhóm) Họ tên Hình ảnh Ngơ Thái Bảo Trần Thị Hồng Cẩm Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Trần Thiên Ân Nguyễn Dũ Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật mơi trường Page 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Chứa môi trường nuôi cấy VSV Ống nghiệm Dùng để chứa đựng dung dịch với thể tích nhỏ, ni cấy vi sinh vật môi trường lỏng hay môi trường thạch Bình tam giác Phiến kính kính Báo cáo thí nghiệm vi sinh. .. trình rèn luyện khả làm thí nghiệm thực hành nhóm rút số kinh nghiệm sau: • Khi làm thí nghiệm phải nắm mục đích thí nghiệm • Nắm bước tiến hành thí nghiệm Thao tác thí nghiệm cẩn thận xác Tránh... để vào giá đựng o Ghi tên sinh vi? ?n, môi trường, tên VSV lên đĩa petri bao gói lại bảo quản Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường o Để que cấy vào miệng ống nghiệm cho bớt nóng o Chú