báo cáo thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm hoạt hóa vi sinh vật chuẩn bị nguyên liệu lên men và môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Phương pháp này có ưu điểm là có thể xác định được ngay lượng tế bào trong mẫu, nhưng lại có nhược điểm là không xác định được tế bào còn sống hay đã chết, dễ lầm tế bào VSV với các hạt

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HỒ CHÍ MINH

Lê Văn Triển – 2005225564 – Nhóm 6

TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 3 năm 2024

BÀI 1: HOẠT HÓA VI SINH VẬT, CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU LÊN MEN VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Câu hỏi: Nêu nguyên tắc, các bước hoạt hóa tế bào nấm men?

Nguyên tắc: Giống nấm thuần khiết trên môi trường thạch nghiêng Hansen, cấy chuyển sau 12 -

24 giờ sau khi đã hoạt hóa sơ bộ trên môi trường Hansen lỏng Môi trường lỏng để hoạt hóa nấm men người ta dùng dịch Hansen có có hàm lượng chất khô 12% Nấm men sau hoạt hóa để đồng

bộ về pha sinh trưởng lũy thừa

− Hấp tiệt trùng ống Hansen lỏng, bình Hansen hoạt hóa ở 1210C, 15 phút

− Hoạt hóa tế bào nấm men - Saccharomyces cerevisiae (Ống thạch nghiêng) và nhân giống

cấp 1 (5ml môi trường Hansen vô trùng ống giống thạch nghiêng để thu tế bào nấm 50 mL, môi trường Hansen để tiến hành hoạt hóa cấp 1 [2 - 3 ngày ở nhiệt độ phòng, tiến hành lắc (không lắc)]

Câu hỏi: Nêu nguyên tắc, các bước tiến hành kiểm tra chất lượng giống nấm men?

Nguyên tắc: Khả năng lên men của các chủng nấm men dược

- Bước 4: Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men của nấm men là đo chiều cao cột khí CO2 sinh

ra trong ống thuỷ tinh úp ngược tại các thời điểm 12h, 24h Dòng nấm men có hoạt tính cao là dòng nấm men có chiều cao cột khí CO2 sinh ra là cao nhất

Câu hỏi: Nuôi cấy cấp 1 là gì? Các bước tiến hành và mục đích?

Mục đích: Chuyển vi sinh vật sang môi trường mới thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật,

đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất Tiến hành nhân giống một cách nhanh chóng Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật

+ Giống nấm men dược hoạt hóa được nhân giống cấp 1, 2 trên môi trường Hansen lỏng ở nhiệt

độ và thời gian xác định, bổ sung oxy bằng phương pháp nuôi cấy lắc hoặc sục khí Chất lượng giống đánh gia qua số lượng tế bào nuôi cấy

tế bào nấm men trước và sau nuôi cấy

*Notes: chuẩn bị 2 bình lên men để tránh nhiễm

BÀI 2: NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN VÀ ĐO SINH TRƯỞNG

NẤM MEN

Câu hỏi: Nuôi cấy cấp 2 là gì? Các bước tiến hành?

Nguyên tắc: Giống nấm men dược hoạt hóa được nhân giống cấp 1, 2 trên môi trường Hansen

lỏng ở nhiệt độ và thời gian xác định, bổ sung oxy bằng phương pháp nuôi cấy lắc hoặc sục khí Chất lượng giống đánh gia qua số lượng tế bào nuôi cấy

tế bào nấm men trước và sau nuôi cấy

− Nhân giống cấp 2 (25mL dịch nuôi cấy cấp 1 là 250mL môi trường Hansen vô trùng để tiến hành hoạt hóa cấp 2 (2-3 ngày ở nhiệt độ phòng, tiến hành lắc (không lắc)

*Notes: chuẩn bị 2 bình lên men để tránh nhiễm

Hình 1: đang bao gói đĩa petri

và ống nghiệm

Hình 2, 3: Đĩa petri và ống nghiệm đã được bao gói

Câu hỏi: Nguyên tắc và định lượng trực tiếp tế bào nấm men bằng kính hiển vi và buồng đếm hồng cầu?

Nguyên tắc: Vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như: nấm men, tảo… có thể được định lượng

bằng cách đếm trực tiếp bằng buống đếm trên kính hiển vi Phương pháp này có ưu điểm là có thể xác định được ngay lượng tế bào trong mẫu, nhưng lại có nhược điểm là không xác định được tế bào còn sống hay đã chết, dễ lầm tế bào VSV với các hạt vật thể khác có trong môi trường và dịch huyền phù VSV phải có mật độ tế bào phải lớn

Bước 4 Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, điều chỉnh kính quan sát ở vật kính x40 cho đến khi nhìn thấy rõ các tế bào men trong buồng đếm

Bước 5 Đếm tổng số tế bào nấm men, tổng số tế bào nấm men chết, tỷ lệ tế bào men chồi

− Đếm tổng số tế bào có trong 5 ô lớn bao gồm: 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa buồng đếm hoặc đếm theo đường chéo Mỗi ô lớn gồm 16 ô nhỏ, tổng cộng 80 ô nhỏ

− Đối với tế bào nằm hoàn toàn bên trong ô, đếm theo đường zikzak để tránh sai sót

− Đối với tế bào nằm trên các cạnh của ô:Nếu đếm tất cả tế bào tiếp xúc với cạnh ngoài cùng bên trái và cạnh ngoài cùng bên dưới thì không đếm các tế bào tiếp xúc với cạnh trong cùng của bên phải và cạnh trong cùng bên trên

− Đếm tổng số tế bào nấm men chồi trong 5 ô, cách đếm tương tự

− Đếm tổng số tế bào chết trong 5 ô (chỉ đếm những tế bào bắt màu xanh), cách đếm tương

tự

Bước 6 Tính kết quả của tổng số tế bào nấm men:

C (tb/ml) = (T/n)*250000*D Trong đó: C: mật độ tế bào nấm men là tổng số tế bào có trong 1ml dịch men (tế bào/ml); T: tổng

số tế bào nấm men đếm được trong n lớn( 5 ô lớn); n: số ô vuông lớn (5 ô lớn)

250000= 103/(16 * 0.0025* 0.1) Trong đó: 103 : hệ số chuyển từ mm3 sang ml; 0.0025: diện tích 1 ô nhỏ (mm2); 0.1: chiều cao buồng đếm (mm); 16: số ô nhỏ trong 1 ô lớn

Câu hỏi: Nguyên tắc xác định sinh khối tế bào nấm men bằng phương pháp đo độ đục?

Nguyên tắc:

− Mật độ VSV có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua độ cản quang (độ đục) của dịch huyền phù tế bào Tế bào VSV cản các chùm sáng (λ, 550 – 610 nm) chiếu qua và màn chắn

ánh sáng phía sau sẽ nhận được ánh sáng ít hơn so với các chùm sáng chiếu đến Tỷ lệ ánh sáng tiếp nhận (màn tế bào quang điện) trên ánh sáng chiếu qua mẫu cho ta được giá trị mật độ quang (OD_Optical density) tuyến tính với mật độ tế bào VSV có trong mẫu

− Phương pháp này được thực hiện dễ dàng và nhanh chóng cho dịch lêm men bia hoặc trong dịch nuôi cấy tế bào nấm men Nấm men có thể được đo trực tiếp ở bước sóng 600 nm trong bình nuôi cấy tế bào Phương pháp này có thể được thực hiện tại bất kỳ địa điểm nào và không yêu cầu phải lắp đặt phòng thí nghiệm Các máy quang phổ khác nhau sẽ cho giá trị OD600 khác nhau (sai số) đối với cùng một mẫu nấm men Lý do cho điều này là các tế bào nấm men là các hạt tán xạ

và hấp thụ ánh sáng Một mẫu tế bào nấm men không tuân theo định luật Lambert-Beer, vì đây là huyền phù không phải dung dịch

− Các thiết bị đo mật độ quang: máy đo độ đục (để bàn và cầm tay), máy đo quang phổ khả kiến (Vis)

− Dựng đường tương quan tuyến tính theo hướng dẫn sau: Lấy dịch huyền phù tế bào pha loãng ở các cấp độ khác nhau để có được các giá trị theo bảng sau:

− Mật độ tế bào của đường tuyến tính có thể được đếm trực tiếp bằng buồng đếm hay kính

hiển vi huỳnh quang Đường tuyến tính được thể hiện bằng hàm số y = ax + b (x là mật độ tế bào

vi sinh vật của mẫu cần xác định, y là kết quả mật độ quang đo 600nm của mẫu)

− Ví dụ: Nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae trên 2 môi trường YPD và PBS Lập

đường chuẩn y = ax +b Sau khi pha loãng canh trường nuôi cấy nấm men và đếm mật độ nấm men trên buồng đếm, ta có bảng số liệu đo OD600nm tương ứng như sau:

Giá trị mật độ quang và mật độ tế bào nấm men

−

Mật độ nấm men

x(triệu tế bào/mL) 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 OD600 Môi trường

YPD-Y 0,00 0,16 0,28 0,47 0,63 0,75 0,87 0,98 1,09 1,23 1,38

Sử dụng excel xác định đồ thị chuẩn sinh khối y = 0.0676x + 0.0362, y: OD, x:Mật độ nấm men, R² = 0.9957

Xác định số lượng nấm men bằng phương pháp đo độ đục

Bước 1 Cân chuyển 1 gram nấm men khô vào trong 99 mL dung dịch sinh lý (0,9% NaCl) hoạt

hoá ở nhiệt độ phòng (30oC) trong 30 phút (trong nhà máy, dùng dịch lên men bia, dịch nuôi cấy sinh khối nấm men khi cần xác định mật độ nuôi cấy đương thời)

Bước 2 Pha loãng liên tiếp dịch nấm men để dựng đường chuẩn

Bước 3 Đếm mật độ tế bào nấm men bằng buồng đếm Neubauer cải tiến

Bước 4 Dựng đường tuyến tính (đường chuẩn) giữa giá trị OD của các độ pha loãng dịch nấm

men và số lượng tế bào:

Bước 5 Thực hiện đo OD 600nm của dịch mẫu nấm men cần xác định số lượng (ví dụ: dịch lên men bia, dịch nuôi cấy nấm men bánh mì) Dựa vào phương trình hồi quy đã vẽ để suy ra số

lượng tế bào có trong mẫu Mỗi độ pha loãng kế tiếp của dịch tế bào nấm men, thực hiện 3 phép

đo Sau khi có kết quả mật độ tế bào, chúng ta cũng có thể quy về logarit theo cơ số 10

Hình 2: nấm men sau khi cấy ria Hình 1: tế bào nấm men được quan sát dưới kính hiển vi

BÀI 3: TIẾN HÀNH QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Câu hỏi: Các bước xử lý nguyên liệu (táo), mục đích và vai trò của từng bước?

− Táo đã được chuẩn bị sẽ đem đi rửa nhằm vệ sinh sạch sẽ khỏi bụi bẩn bám trên vỏ

− Táo sẽ được cắt ra để thuận tiện cho việc ép lấy dịch quả; táo sẽ được loại bỏ hạt do trong hạt của chúng có một số độc tố

− Sau đó đem táo đã được cắt đi ép để lấy dịch quả

− Khi đã có dịch quả, chúng ta sẽ trộn đường với một tỉ lệ nhất định để đạt được độ Brix là

− Sau đó bổ sung nấm men đã chuẩn bị vào hỗn hợp thì chúng ta đã hoàn thành và đợi để dung dịch lên men

Câu hỏi: Cách cấy giống nấm men vào nguyên liệu?

Bước 1: nước trái cây cô đặc đã được chuẩn bị ở phía trên Làm 2 bình 1 bình đo, 1 bình làm mẫu

đánh giá chất lượng

Bước 2: Đo OD tế bào nấm men (NGC2→ xác định tế bào nấm men qua đường chuẩn);

Bước 3: Lên men ở các điều kiện khác nhau như nồng độ tế bào nấm men (106 tb/ml) và độ Brix (24) Tỷ lệ cấy giống cấp 2: 5% thể tích so với dịch lên men Bình lên men gắn van khóa 1 chiều thông áp, ghi nhãn, thời gian lên

Tiến trình lên men của Cider táo

Mốc thời

0h

24h

48h

72h

96h

120h

Bảng tế bào nấm men Thời gian Tổng số tế bào nấm men Số tế bào nấm men chết Tỉ lệ nấm men chết

Mật độ

tế bào dịch giống (tb/ml)

Thể tích lên men (ml)

Thời gian

đo (h)

Nồng

độ đường Brix

pH-

đo máy

đo

Mật độ tế bào nấm men “1”

(tb/ml)

Tổng

số tế bào nấm men

Với “1” tính theo công thức C (tb/ml) = (T/n)*250000*D Trong đó: C: mật độ tế bào nấm men là tổng số tế bào có trong 1ml dịch men (tế bào/ml); T: tổng

số tế bào nấm men đếm được trong n lớn( 5 ô lớn); n: số ô vuông lớn (5 ô lớn)

BÀI 4: XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO NẤM MEN VÀ CÁC CHỈ

TIÊU HÓA LÝ TRONG CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

Câu hỏi: Trình bày cơ sở lý thuyết, các bước tiến hành xác định tỷ lệ nấm men nảy chồi, sống chết, pH, độ cồn, hàm lượng đường?

tế bào nấm men mẹ trong một đơn vị thời gian Mật độ tế bào nấm men sống và chết là số lượng

tế bào nấm men sống và chết trong một đơn vị thể tích môi trường lên men Mật độ tế bào nấm men sống chết được đo bằng cách đếm số lượng tế bào nấm men sống và chết trong một đơn vị thể tích môi trường lên men Tế bào nấm men có thể chết do nhiều nguyên nhân như nhiệt độ quá cao, pH quá thấp, hoặc thiếu dinh dưỡng, sự tích tụ các chất độc hại trong môi trường lên men, vv

− Mật độ tế bào nấm men nảy chồi, sống và chết là những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá hiệu quả của quá trình lên men Việc xác định mật độ tế bào nấm men nảy chồi, sống và chết trong các điều kiện lên men khác nhau giúp chúng ta hiểu rõ hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trìnhlên men, từ đó có thể điều chỉnh các điều kiện lên men để đạt hiệu quả cao nhất Cụ thể, mật độ tế bào nấm men nảy chồi có thể được sử dụng để đánh giá khả năng sinh sản của nấm men trong môi trường lên men Mật độ tế bào nấm men sống và chết có thể được sử dụng để đánh giá độ bền của nấm men trong môi trường lên men Việc xác định mật độ tế bào nấm men nảy chồi, sống và chết trong các điều kiện lên men khác nhau có thể được thực hiện bằng các phương pháp sau:

− Phương pháp đếm tế bào: Phương pháp này sử dụng kính hiển vi để đếm số lượng tế bào nấm men trong một đơn vị thể tích môi trường lên men Phương pháp này có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi nhiều thời gian và công sức

− Phương pháp đếm tế bào bằng máy quang học: Phương pháp này sử dụng máy quang học

để đếm số lượng tế bào nấm men trong một đơn vị thể tích môi trường lên men Phương pháp này

có độ chính xác cao và tiết kiệm thời gian hơn phương pháp đếm tế bào bằng kính hiển vi

− Phương pháp đếm tế bào bằng máy quang học flow cytometry: Phương pháp này sử dụng máy quang học flow cytometry để phân loại và đếm số lượng tế bào nấm men trong một đơn vị thể tích môi trường lên men Phương pháp này có độ chính xác cao nhất và tiết kiệm thời gian nhất

− Các điều kiện lên men khác nhau có thể ảnh hưởng đến mật độ tế bào nấm men nảy chồi, sống và chết Các điều kiện lên men khác nhau có thể ảnh hưởng đến mật độ tế bào nấm men nảy chồi, sống và chết, bao gồm:

Nhiệt độ: Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quá trình lên

men Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men rượu là 25-30°C Nhiệt độ quá cao sẽ làm cho nấm men bị chết, nhiệt độ quá thấp sẽ làm cho quá trình lên men chậm lại

pH: pH là độ axit của môi trường lên men pH thích hợp cho quá trình lên men rượu là 4 -

5 pH quá cao sẽ làm cho nấm men bị chết, pH quá thấp sẽ làm cho quá trình lên men chậm lại

Nồng độ đường: Nồng độ đường ban đầu trong môi trường lên men là một yếu tố quan

trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men

Chưng cất cồn và đo hàm lượng cồn

Nguyên tắc: mẫu lên men được đem chưng cất để tách ethanol ra khỏi dung dịch, ethanol sau đó được xác định bằng cồn kế hoặc tỉ trọng kế

Xác định mật độ tế bào nấm men, tỉ lệ tế bào nấm men chết, tỉ lệ tế bào chồi:

Bước 1 Tiến hành pha loãng mẫu sao cho tế bào trong buồng đếm từ 30-80 tế bào trong một

ô lớn Pha loãng dịch lên men với nước cất vô trùng theo tỉ lệ thích hợp: ½, ¼,… 1/100,1/1000

Bước 2 Hút 0.5ml dịch lên men đã được pha loãng cho vào ống nghiệm có chứa 0.5ml

Methylen blue ở nồng độ 0.01% (pha loãng 2 lần), lắc đều

Bước 3 Đặt lamelle lên buồng đếm, dùng pipette pasteur cho mẫu dịch lên men đã nhuộm

màu vào cạnh của lamelle sao cho mẫu tự dẫn vào buồng đếm

Bước 4 Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, điều chỉnh kính quan sát ở vật kính x40 cho đến khi

nhìn thấy rõ các tế bào men trong buồng đếm

Bước 5 Đếm tổng số tế bào nấm men, tổng số tế bào nấm men chết, tỷ lệ tế bào men chồi

− Đếm tổng số tế bào có trong 5 ô lớn bao gồm: 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa buồng đếm hoặc đếm theo đường chéo Mỗi ô lớn gồm 16 ô nhỏ, tổng cộng 80 ô nhỏ

− Đối với tế bào nằm hoàn toàn bên trong ô, đếm theo đường zikzak để tránh sai sót

− Đối với tế bào nằm trên các cạnh của ô:Nếu đếm tất cả tế bào tiếp xúc với cạnh ngoài cùng bên trái và cạnh ngoài cùng bên dưới thì không đếm các tế bào tiếp xúc với cạnh trong cùng của bên phải và cạnh trong cùng bên trên

− Đếm tổng số tế bào nấm men chồi trong 5 ô, cách đếm tương tự

− Đếm tổng số tế bào chết trong 5 ô (chỉ đếm những tế bào bắt màu xanh), cách đếm tương tự

C: mật độ tế bào nấm men là tổng số tế bào có trong 1ml dịch men (tế bào/ml);

T: tổng số tế bào nấm men đếm được trong n lớn( 5 ô lớn);

Trong đó: D : số tế bào men chết trong 5 ô lớn; T: tổng số tế bào men trong 5 ô lớn

✓ Tỉ lệ tế bào men chồi

Tỷ lệ tế bào men chồi(%) =

- Kết quả tổng số tế bào nấm men lấy 1 số lẻ sau dấu phẩy, đơn vị tế bào/ml

- Kết quả tổng số tế bào chết và chồi lấy 1 số lẻ sau dấu phẩy, đơn vị %

Xác định pH

Bước 1 Chuẩn bị hai dung dịch đệm bao gồm: Dung dịch đệm có pH = 7 (môi trường trung tính)

và dung dịch đệm thứ 2 có pH gần với pH của mẫu dự kiến đo (có thể là acid hoặc bazơ)

Bước 2 Bật nguồn máy đo pH lên trước khoảng 30 phút, để đồng hồ ấm lên Sau đó làm sạch điện

cực bằng cách lấy điện cực ra khỏi dung dịch lưu trữ và rửa nó với nước cất, sau đó thấm khô bằng giấy sạch không bụi

Bước 3 Tiến hành đo pH

− Đặt điện cực vào mẫu cần đọc: Khi điện cực được đặt trong mẫu, bấm nút đo và để điện cực trong mẫu khoảng 1-2 phút

− Đặt mức độ pH của mẫu: Một khi đọc đã ổn định, nhấn nút đo Đây là mức pH của mẫu cần đọc

− Làm sạch điện cực sau khi sử dụng bằng cách rửa điện cực của bạn bằng nước cất và lau khô Cất máy đo ngăn nắp đúng nơi quy định

Xác định chất hòa tan bằng Brix

Bước 1: Mở tấm chắn sáng và lau lăng kính, chắc chắn rằng vị trí nhận mẫu dung dịch được sạch

sẽ, không bám bụi bẩn làm ảnh hưởng cũng như gián đoạn quá trình đo

Bước 2: Kiểm tra vạch 0 trên thiết bị bằng việc thực hiện kiểm tra với nước cất Quan sát kết quả