Báo cáo thí nghiệm vi sinh môi trường

 Để quan sát hình thái, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hoá cũng như định lượng và phân lập vi sinh vật.. + Cấy vào hộp Petrie tuỳ theo mục đích nghiên cứu: Phân lập Kiểm định

BÁO CÁO THÍ NGHI M VI SINH MÔI TR ỆM VI SINH MÔI TRƯỜNG ƯỜNG NG

BÀI 1: KỸ THUẬT GIEO CẤY - PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

I Tóm tắt lý thuyết:

1 KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT

1.1 Định nghĩa:

Gieo cấy vi sinh vật là đưa các vật phẩm có chứa vi sinh vật vào môi trường thích hợp

(nguồn dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, độ ẩm, ) để phát hiện, định lượng, nghiên cứu đặc tính

sinh lý hoặc giữ giống vi sinh vật

 Để quan sát hình thái, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hoá cũng như định lượng

và phân lập vi sinh vật

1.2 Kỹ thuật gieo cấy

- Yêu cầu: phải tuyệt đối vô trùng (thao tác nhanh và dụng cụ vô trùng)

- Đối với vi sinh vật hiếu khí:

+ Từ ống nghiệm sang ống nghiệm: có thể cấy theo đường song song, thạch nghiêng, rích

rắc, chữ chi xoắn,

+ Cấy vào hộp Petrie tuỳ theo mục đích nghiên cứu:

Phân lập Kiểm định Nghiên cứu hoạt lực enzim

- Đối với vi sinh vật yếm khí: Cấy đâm sâu vào ống thạch đứng, cấy vào hộp Petri rồi

nuôi trong môi trường chân không

1.3 Nuôi vi sinh vật

- Nhiệt độ: tùy theo yêu cầu về nhiệt độ của vi sinh vật

- Độ ẩm: Độ ẩm tối thiểu với nấm mốc là 15% và với vi khuẩn là 30%

- Tính chất hô hấp:

+ Với sinh vật hiếu khí: có thể nuôi bề mặt trên môi trường đặc hoặc phải cấp khí khi

nuôi chúng trong môi trường lỏng

+ Với vi sinh vật hô hấp yếm khí có thể dùng nhiều phương pháp: cơ học, lý học,

hóa học Ở bài này ta sẽ dùng phương pháp cơ học (phương pháp đơn giản dễ

làm): cấy sâu vào môi trường đặc,lỏng ; Cấy vào hộp Petri, sau đó đổ môi trường

đặc ở nhiệt độ thích hợp đã vô trùng vào đĩa

1.4 Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường nuôi cấy.

-Trên môi trường đặc: Vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc.

Người ta phân biệt các dạng khuẩn lạc:

+ R (khuẩn lạc có bề mặt xù xì)

+ S (khuẩn lạc có bề mặt nhẵn bóng)

+ G (khuẩn lạc có bề mặt nhỏ li ti, mép khuẩn lạc nhẵn)

+ M (khuẩn lạc có bề mặt không định hình)

-Trên môi trường lỏng: Vi sinh vật phát triển có thể làm đục môi trường, kéo màng trên

bề mặt hoặc lắng ở đáy ống nghiệm Chúng có thể làm cho môi trường thay đổi về màu

sắc, mùi vị, độ đục

2.PHÂN LẬP VI SINH VẬT

2.1 Định nghĩa:

Phân lập vi sinh vật là tách chúng ra khỏi các vật phẩm để nghiên cứu hình thái tính chất

của chúng Tùy mức độ cần thiết mà người ta phân lập canh trường tập trung hoặc canh

trường thuần khiết

2.2 Phân lập canh trường tập trung:

-Là canh trường trong đó đó có một hay một vài loài vi sinh vật chiếm đa số Canh

trường này thường được dùng trong sản xuất, trong xử lý môi trường

-Để phân lập canh truowfng tập trung người ta sử dụng những môi trường nuôi cấy chọn

lọc,điều kiện nuôi cấy chọn lọc

2.3 Phân lập canh trường thuần khiết:

-Là canh trường trong đó vi sinh vật được sinh ra từ một tế bào ban dầu

-Có thể phân lập trực tiếp (thao tác với từng tế bào) hoặc phân lập gián tiếp (phân lập một

lượng nhất định của môi trường đã được pha loãng

3 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

3.1 Định nghĩa:

Xác định số vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên cứu để kiểm tra chất lượng sản phẩm,

vệ sinh sản xuất hoặc đánh giá mức độ ô nhiễm

3.2 Định lượng vi sinh vật:

+ Định lượng trực tiếp bằng buồng đếm: Đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật bằng

cách dàn mỏng chúng trênn lưới đếm tiêu chuẩn (Sẽ thực hành trong bài Quan sát

nấm men)

+ Định lượng gián tiếp: Cấy vi sinh vật vào môi trường thích hợp Nuôi cho chúng

phát triển thành khuẩn lạc Mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào ban đầu

II PHẦN THỰC HÀNH

1.Cấy vi sinh vật

a Mục đích:

Nắm được cách thực hiện gieo cấy vi sinh vật trên moi trưởng lỏng,đặc

b Cách tiến hành:

- Cấy thử:

+ Từ ống nghiệm thạch nghiêng sang ống nghiệm thạch nghiêng,hộp petri:

Bước 1: Thanh trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

Bước 2: Dùng que cấy đã thanh trùng trên đặt vào miệng ống nghiệm có vi sinh vật

cần cấy một lúc cho nguội rồi mới tiến vào lấy vi sinh vật lưu ý thao tác trên làm ở

gần ngọn lửa đèn cồn,cấy sang môi trường thạch nghiêng theo đường ríc rắc hoặc

song song.Cấy vào hộp petri cấy chấm điểm hoặc cấy ríc rắc, sau đó đậy nắp và úp

ngược lại trách trường hợp nước trên nắp rơi xuống.

+ Từ môi trường lỏng sang hộp petri:

Bước 1:Thanh trùng thanh gạt trên ngọn lửa đèn cồn

Bước 2:Dùng pipet hút khoảng 0,1ml vào giữa hộp petri rồi dùng thanh gạt đã thanh

trùng và đã làm nguội cấy gạt đều trên bề mặt thạch trong hộp petri Đậy nắp và úp

ngược lại

+ Tiến hành cấy:

Bước 1:Thanh trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn

Bước 2: Cấy từ ống nghiệm thạch nghiêng sang môi trường lỏng bằng que cấy rồi

khuấy đều

+ Cấy từ ống nghiệm H1 sang ống nghiệm DL,SC,NC,H1 (môi trường lỏng)

+ Cấy từ ống nghiệm H3 sang ống nghiệm H3 (môi trường lỏng)

2.Phân lập và định lượng vi sinh vật

a Phân lập vi sinh vật trong đất

- Nghiền nhỏ mẫu đất,cân được m=1g trên cân phân tích có sai số là 0.0001g

- Pha loãng 10-10 bằng cách cho 1g đất vừa cân xong vào bình tam giác đã có 99ml H20 vô

trùng,lắc đều

- Pha loãng tiếp bằng cách lấy 1ml hỗn hợp đã pha loãng cho vào ống nghiệm có 9ml

nước cất đã vô trùng.Lặp lại như vậy 8 lần

- Lấy 0,1ml cấy vào hộp petri (3 hộp) ,trang đều

- Nuôi vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc

b.Phân lập vi sinh vật trong nước.

- Pha loãng 10-4 bằng cách lấy 1ml nước cần phân tích cho vào bình tam giác có 9ml H20

đã vô trùng.Lặp lại như vậy 4 lần

- Hút 0,1ml dung dịch trên vào 3 hộp petri, trang đều

- Nuôi vi sinh vật ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc

c.Phân lập vi sinh vật trong không khí.

- Mở ở nắp hộp petri (3 hộp) trong phòng thí nghiệm trong 5 phút

- Đậy lại rồi đem nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc

3.Định lượng và nhận xét kết quả

a Mẫu đất

Mẫu 1: 82

Mẫu 2: 80

Mẫu 3: 90

TB : 84

X =84

0.1∗10

10

=8.4∗1012(tb

g )

b.Mẫu nước thải

Mẫu 1: 86

Mẫu 2: 69

Mẫu 3: 96

TB : 84

X =84

0.1∗10

4

=84∗105

(tb

ml)

c.Mẫu không khí

Mẫu 1: 14

Mẫu 2: 17

Mẫu 3: 17

TB :16

D=8,2 cm đường kính hộp petri

X =4∗16∗10

5

3.14∗8.22=30312(

tb

l )

*Nhận xét:

-Kết quả thí nghiệm đúng với lý thuyết về hệ sinh thái của vi sinh vật trong đất,

nước,không khí:

+ VSV trong đất có hàm lượng cao nhất vì có nhiều thức ăn vô cơ,hữu cơ.pH,độ

ẩm,nhiệt độ, tính chất cơ lý ,độ khoáng và lượng oxy khuếch tán rất phù hợp cho

VSV phát triển

+ VSV trong nước ít hơn trong đất ,số lượng và chủng loại ở mỗi loại nước rất khác

nhau(nước ngầm,nước mưa,nước mặt…)

+ VSV trong không khí là ít nhất vì không khí không phải là môi trường tốt cho

VSV phát triển.VSV bám vào các hạt bụi,các giọt nước nhỏ li ti và phát tán trong

không khí

-Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm có thể có sai số do trong quá trình thực hiện thao tác có

thể chưa chuẩn, cs sai số trong các kết quả đo và lấy mẫu ở các thao tác như: Thao tác hút

bằng pipet,thao tác cân,thao tác thanh trùng que cấy,thanh gạt,quá trình đếm khuẩn lạc

BÀI 2: QUAN SÁT NẤM MEN

A Tóm tắt lý thuyết

1 Khái niệm về nấm men

Nấm men (yeast, levure) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào và thường

sinh sản dinh dưỡng bằng nảy chồi

Nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp: lên men rượu, bia, sản xuất sinh

khối giàu protein

2 Hình dạng nấm men

- Hình dạng của nấm men phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi giống

Muốn quan sát hình dạng nấm men phải nuôi cấy chúng trong môi trường mạch nha dịch

thể (10 - 15o baling) trong 18 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC

- Hình dạng của nấm men rất đa dạng

Hình bầu dục: Saccharomyces

Hình tròn: Torula, Candida

Hình ống: Pichia

Hình tam giác: Triconopsis

Hình bình: Kloekera

-Một số nấm men có khuẩn ty:

Khuẩn ty thật: Trichosponron và Geotrichum

Khuẩn ty giả: Endomycopsis và Candida

3 Quan sát nấm men sống và chết

Để đánh giá chất lượng canh trường nấm men là tốt hay xấu, người ta xác định chỉ

tiêu: Số tế bào chết có trong canh trường

* Canh trường tốt: Số tế bào chết < 3 %

* Canh trường có số tế bào chết 15% không sử dụng được trong sản xuất

Nguyên tắc :

Dựa trên sự hấp phụ của thuốc nhuộm có chọn lọc của nguyên sinh chất trong các tế

bào sống Tế bào chết hấp phụ màu dễ dàng, không chọc lọc nên có màu của thuốc

nhuộm

Số tế bào chết được tính:

X(%) = b 100

a

+ Tổng số tế bào có trong 5 kính trường

+ Tổng số tế bào chết có trong 5 kính trường

4 Quan sát nấm men nảy chồi

- Một trong những đặc tính sinh lý đặc trưng của nấm men là sinh sản dinh dưỡng bằng

nảy chồi Số lượng tế bào nảy chồi trong canh trường cho biết chất lượng của canh

trường

+ Khi quan sát trong kính hiển vi nếu tế bào con nhỏ hơn 1/2 tế bào mẹ thì tính là 1

chồi Để đảm bảo độ chính xác cho 1 - 2 giọt H2SO4 5% vào canh trường để nấm

men không tiếp tục tạo chồi trong quá trình quan sát

+ Đếm trong 5 kính trường và tính số trung bình

5 Định lượng số tế bào trong canh trường

- Tùy theo yêu cầu của sản xuất và nghiên cứu mà số lượng tế bào nấm men/ml canh

trường nhiều hay ít Đếm số lượng tế bào để đánh giá số lượng vi sinh vật có trong mẫu,

trên cơ sở đó đánh giá chất lượng của canh trường

- Nguyên tắc (đếm trực tiếp): Dàn mỏng canh trường lên một diện tích có độ sâu nhất

định để đếm

- Buồng đếm: Là một phiến kính được phân chia thành nhiều ô có diện tích xác định

B PHẦN THỰC HÀNH

1.Mục đính thí nghiệm

-Quan sát hình dạng của một số chủng nấm men.Phát hiện nấm men sinh khuẩn ty giả

-Đếm số lượng tế bào chết.Đánh giá chất lượng canh trường nấm men là tốt hay xấu

-Nấm men sinh sản dinh dưỡng bằng nảy chồi.Đếm số lượng tế bào nảy chồi.Dựa vào tỷ

lệ ta biết được canh trường đó già hay trẻ

2.Cách tiến hành

a.Quan sát hình dạng nấm men:

Dùng kính hiển vi soi trực tiếp hình dạng 2 mẫu H1,H2,H3

b.Quan sát nấm men sống và chết.

-Nguyên tắc: dựa trên sự hấp phụ thuốc nhuộm có chọn lọc của nguyên sinh chất trong

các tế bào sống Tế bào chết có màu của thuốc nhuộm

-Cách tiến hành:

+ Nhỏ 1 giọt xanh metilen sau đó dàn đều canh trường có nấm men lên trên

+ Đem quan sát bằng kính hiển vi

+ Đếm số tế bào chết và đếm số tế bào còn lại trong trong 5 canh trường và tính số

trung bình rồi tính %

c.Quan sát nấm men nảy chồi.

-Cách tiến hành:

Cho 1-2 giọt H2S04 5% sau đó dàn đều canh trường lên trên

+ Quan sát bằng kính hiển vi

+ Đếm trong 5 canh trường và tính số trung bình rồi tính %

d.Định lượng số tế bào trong canh trường.

-Nguyên tắc(đếm trực tiếp): Dàn mỏng canh trường lên một diện tích nhất định có độ sâu

nhất định để đếm

Buồng đếm là một phiến kính được phân chia thành nhiều ô có diện tích xác định

-Cách tiến hành:

+ Pha loãng canh trường nấm men 30 lần bằng cách hút 0.1ml từ ống ĐL vào 2.9ml

H2O đã vô trùng.Sau đó lấy 0.1ml canh trường đã pha loãng dàn đều lên buồng

đếm

+ Đặt lưới đếm đã dàn canh trường

+ Đếm 5 ô và tính số tế bào trung bình có trong 1 ô đếm

3.Kết quả và nhận xét.

-Quan sát hình dạng nấm men:

H1:Nấm men có dạng hình sợi nên dự đoán là khuẩn ty giả Endomycopsis

H2:Nấm men có hình bầu dục dự đoán H3:Nấm men có hình tròn dự đoán

là candida saccharomyces

trường Số tế bàochết Số tế bàosống Tổng số tế bào

% 23.47670251

-Số tế bào chết là 23.5% có thể thấy chất lượng canh trường xấu

Canh

trường Số tế bào nảychồi Số tế bào cònlại Tổng số tế bào

-Số lượng tế bào nảy chồi là 12.9% <15% đây là canh trường già

-Đếm mẫu định lượng 5 ô liên tiếp lần lượt là:74;84,;89;78;81

-Số tế bào trung bình là 81.2

X = 81.2

0.2∗1

16

∗1000∗30=194880000( tb

ml)

Nhận xét:

- Tùy theo yêu cầu sản xuất và nghiên cứu mà số lượng tế bào trên là nhiều hay ít.Theo

đánh giá cá nhân của em thì số lượng tế bào này ở mức trung bình ,chất lượng sinh học

của canh trường này là trung bình

- Tuy nhiên trong quá trình thí nghiệm làm có nhiều thao tác,điều kiện ảnh hưởng đến kết

quả như: Để VSV một thời gian ở ngoài môi trường dẫn đến chết VSV nên kết quả đếm

sai, do đếm bằng mắt nên có thể đếm sai

BÀI 3: QUAN SÁT NẤM MỐC VÀ TẢO 1.Mục đích thí nghiệm

- Quan sát tảo qua kính hiển vi từ đó nhận dạng các loài tảo khác nhau có ở trong tự

nhiên và tảo ở trong phòng thí nghiệm

- Quan sát một số chủng nấm mốc để phân biệt

+ Nấm mốc đơn bào,đa bào

+ Bào tử nội sinh và ngoại sinh

- Trên cơ sở các đặc điểm quan sát được gọi tên nấm mốc

2.Cách tiến hành

a.Tảo

Quan sát 3 mẫu tảo:1 mẫu lấy nước ở hồ Tiền tại Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội,2

mẫu lấy ở phòng thí nghiệm

b.Nấm mốc

Quan sát 5 mẫu nấm mốc bằng kính hiển vi

3.Kết quả

a.Tảo

Tảo chlorella

Tảo spirulina Tảo scenedesmus

b.Nấm mốc

Mẫu 1: A.niger bào tử màu đen Mẫu 2: P.notatum bào tử màu xanh lục

Mẫu 3: A.oryzae bào tử màu vàng hoa cau Mẫu 4: A.usami bào tử màu nâu đen

Mẫu 5: Nấm mốc Rhizopus