TIÊU CHUẨN VIỆT NAM - VI SINH VẬT HỌC – HƯỚNG DẪN CHUNG VỀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM – KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4882 : 2001 VI SINH VẬT HỌC – HƯỚNG DẪN CHUNG VỀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM – KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT Microbiology - General guidance for the enumeration of coliform - Most probable number technique Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn chung để định lượng coliform có thực phẩm thức ăn chăn ni cách tính số có xác suất lớn (MPN) sau nuôi 30 0C, 350C 370C môi trường lỏng, nhiệt độ cần thỏa thuận bên có liên quan Chú thích - Nhiệt độ ủ ấm 300C sử dụng với mục đích định lượng coliform công nghệ sản xuất; nhiệt độ 350C 370C sử dụng nhiều lĩnh vực sức khỏe cộng đồng Điểm hạn chế áp dụng tiêu chuẩn chỗ kết có độ dao động lớn Do phương pháp nên sử dụng giải thích kết theo thơng tin nêu điều 10.4 Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 4829 : 2001 (ISO 6579 : 1993), Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung phương pháp phát Salmonella TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887 : 1983), Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung cách pha chế dung dịch pha loãng để kiểm nghiệm vi sinh vật TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1997), Vi sinh vật học thực phẩm thức ăn gia súc - Nguyên tắc chung kiểm tra vi sinh vật Định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng định nghĩa sau: Coliform (Coliforms): Vi khuẩn nhiệt độ qui định (tức 30 0C, 350C 370C theo thỏa thuận) lên men lactoza sinh khí điều kiện thử theo qui định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Cấy vào ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ kép [xem 5.3a)] lượng mẫu thử xác định sản phẩm ban đầu chất lỏng với lượng huyền phù ban đầu xác định sản phẩm dạng khác 4.2 Cấy vào ba ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ đơn [xem 5.3b)] với lượng mẫu thử xác định sản phẩm ban đầu chất lỏng, với lượng huyền phù ban đầu xác định sản phẩm dạng khác Sau đó, điều kiện, cấy ống chứa mơi trường [5.3 b)] với dịch pha lỗng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu 4.3 Ủ ấm 300C, 350C 370C (theo thỏa thuận) ống chứa môi trường nồng độ kép [5.3 a)] 24 h ống chứa môi trường nồng độ đơn [5.3 b)] 24 h 48 h sau kiểm tra ống 4.4 Cấy vào loạt ống chứa môi trường thử khẳng định (5.4) chất cấy từ ống chứa môi trường 5.3 a) chất cấy loạt ống thứ chứa môi trường 5.3 b) có màu đục có sinh khí 4.5 Ủ ấm 300C, 350C 370C (theo thỏa thuận) 24 h 48 h, sau kiểm tra loạt ống (4.4) 4.6 Tính số có xác suất lớn coliform có mililit gam mẫu (tức số MPN) từ số ống có sinh khí loạt ống thử (4.5) Dùng bảng để xác định số có xác suất lớn 5 Mơi trường ni cấy dịch pha lỗng 5.1 Khái qt Thực hành phịng thí nghiệm, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) 5.2 Dịch pha loãng Xem TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887) tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm nghiệm 5.3 Canh thang tryptoza lauryl sulfat (môi trường tăng sinh chọn lọc) Thành phần a) b) Môi trường nồng độ kép Môi trường nồng độ đơn Tryptoza 40 g 20 g Lactoza 10 g 5g Dikali hidro phosphat (K2HPO4) 5,5 g 2,75 g Dikali dihidro phosphate (KH2PO4) 5,5 g 2,75 g Natri clorua 10 g 5g Natri lauryl sunfat 0,2 g 0,1 g 000 ml 000 ml Nước Chuẩn bị Hịa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau trùng 6,8 250C, cần Phân phối lượng môi trường 10 ml vào ống có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4) chứa ống Durham (6.5) môi trường nồng độ đơn, vào ống nghiệm có kích thước 20 mm x 200 mm (6.4) [ khơng chứa ống Durham (6.5)] môi trường nồng độ kép Thanh trùng nồi hấp áp lực nhiệt độ 121 0C 15 phút Các ống Durham khơng chứa bọt khí sau trùng 5.4 Canh thang mật lactoza lục sáng (lactose bile brilliant green broth) (môi trường thử khẳng định) Thành phần Pepton 10 g Lactoza 10 g Mật bị khơ Lục sáng Nước 1) 20 g 0,0133 g 000 ml Chuẩn bị Hịa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách đun nóng, cần Chỉnh PH cho sau trùng 7,2 250C, cần Phân phối lượng môi trường 10 ml vào ống có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4) có ống Durham (6.5) 1) Phù hợp với yêu cầu nêu TCVN 4829 : 2001 (ISO 6579 : 1993), phụ lục C Thanh trùng nồi hấp áp lực nhiệt độ 121 0C 15 phút Chú thích - Do mơi trường hồn chỉnh khơ, khơng phải lúc cho kết mong muốn, cần phải kiểm tra trước sử dụng Thiết bị dụng cụ thủy tinh Chú thích - Có thể dùng thiết bị, dụng cụ sử dụng lần thay cho việc sử dụng lại dụng cụ thủy tinh chúng phù hợp với yêu cầu qui định Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thí nghiệm phân tích vi sinh vật đặc biệt là: 6.1 Thiết bị để trùng khô (tủ sấy) để trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) 6.2 Tủ ấm, có khả hoạt động 300C ± 10C, 350C ± 10C 370C ± 10C 6.3 Vòng que cấy, platin/iridi niken/crom có đường kính khoảng mm vịng que cấy sử dụng lần 6.4 Các ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm 20 mm x 200 mm, chai có dung tích thích hợp 6.5 Ống Durham, phù hợp để dùng với ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (6.4) 6.6 Pipet xả hết, có dung tích danh định ml 10 ml 6.7 pH met, xác đến ± 0,1 đơn vị pH 250C Lấy mẫu Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp sản phẩm liên quan Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể bên có liên quan nên thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp sản phẩm có liên quan Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể bên liên quan nên thỏa thuận với vấn đề Cách tiến hành (xem sơ đồ phụ lục A) Khi số mẫu lấy từ lơ hàng để xét nghiệm, tiến hành thử nghiệm mẫu 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dịch pha loãng Xem TCVN 4881 : 1989 (ISO 6887) tiêu chuẩn cụ thể thích hợp sản phẩm Chuẩn bị số độ pha loãng đủ để đảm bảo ống tương ứng với độ pha loãng cuối cho kết âm tính 9.2 Cấy 2) ủ ấm 9.2.1 Lấy ba ống môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép [5.3.a)] Dùng pipet vô trùng (6.6) chuyển 10 ml mẫu thử chất lỏng 10 ml huyền phù ban đầu, sản phẩm dạng khác vào ống 9.2.2 Sau đó, lấy ba ống mơi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn [5.3.1b)] Dùng pipet vô trùng (6.6) chuyển ml mẫu thử chất lỏng ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác vào ống 9.2.3 Đối với dịch pha loãng (từ 10-1 10-2 tương ứng với mẫu thử) tiến hành theo 9.2.2 Dùng pipet vô trùng cho dịch pha lỗng Trộn cẩn thận mẫu cấy mơi trường 2) Giả sử dãy pha loãng sử dụng tổ hợp ba ống nghiệm Đối với số sản phẩm cần đến kết có độ xác cao cần phải cấy dãy pha loãng dãy gồm ống (xem bảng B.2) 9.2.4 Để ống môi trường nồng độ kép (9.2.1) tủ ấm (6.2) nhiệt độ 30 0C, 350C 370C (theo thỏa thuận) 24 h ± h 9.2.5 Để ống môi trường nồng độ đơn (9.2.2 9.2.3) tủ ấm (6.2) 30 0C, 350C 370C (theo thỏa thuận) 24 h ± h, khơng thấy sinh khí khơng bị đục để thêm tủ ấm đến 48 h ± h quan sát tiếp tượng (sinh khí đục) 9.3 Phép thử khẳng định 9.3.1 Dùng vịng que cấy (6.3) cấy chất ni cấy vào ống môi trường thử khẳng định (5.4) vào ống ủ ấm 9.2.4 Đặt vào tủ ấm nhiệt độ 30 0C, 350C 370C (theo thỏa thuận) 24 h ± h khơng sinh khí giai đoạn nuôi ấm đến 48 h ± h 9.3.2 Tiến hành theo trình tự ống ủ ấm từ 9.2.5 có biểu sinh khí bị đục, quan sát lần thứ (tức sau 24 h ± h sau 48 h ± h) 9.4 Diễn giải kết Với độ pha lỗng, tính tổng số ống sinh khí quan sát 9.3 (tức ống dương tính) sau 24 h ± h 48 h ± h (nếu có) 10 Biểu thị kết 10.1 Lựa chọn độ pha loãng 3) Mỗi mẫu xét nghiệm chọn ba độ pha loãng liên tiếp ứng với ba trường hợp sau cho thích hợp: 10.1.1 Trường hợp - Có độ pha lỗng cho ba ống dương tính Chọn độ pha loãng cao (tức dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho ba ống dương tính, với hai độ pha lỗng cao (tức độ pha lỗng có nồng độ mẫu 1/10 1/100 độ pha loãng thứ chọn) (xem bảng 1, thí dụ 1) Xem 10.1.3 Nếu dịch pha lỗng ngồi dịch pha loãng cao cho ba ống dương tính chọn tiếp ba độ pha lỗng cao dãy (tức độ pha lỗng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) (xem bảng 1, thí dụ 2) 10.1.2 Trường hợp - Khơng có độ pha lỗng cho ba ống dương tính Trường hợp khơng thể áp dụng Chọn ba độ pha lỗng cao dãy pha loãng (tức độ pha lỗng có nồng độ mẫu nhỏ nhất), số thu kết dương tính (xem bảng 1, thí dụ 3) Xem 10.1.3 10.1.3 Các trường hợp đặc biệt Trong tất trường hợp có nhiều ba độ pha lỗng chọn 10.1.1 10.1.2 không cho ống dương tính, chọn từ độ pha lỗng độ pha lỗng thấp khơng cho ống dương tính (tức độ pha lỗng có nồng độ mẫu cao nhất) hai độ pha loãng thấp dãy pha lỗng (tức có nồng độ mẫu gấp 10 lần 100 lần độ pha loãng thứ chọn), (xem bảng 1, thí dụ & 5), trừ ống dương tính tìm thấy mức pha loãng chuẩn bị từ mẫu thử trường hợp cuối cần chọn ba độ pha lỗng để tính MPN chí loạt ống bao gồm hai độ pha lỗng khơng cho ống dương tính Xem thí dụ bảng 10.2 Xác định số MPN 10.2.1 Dựa số mẫu xét nghiệm lô, dùng bảng B.1 B.2 kiểm tra xem tần suất ống dương tính tương ứng với độ pha lỗng chọn phù hợp với 10.1 chấp nhận mặt thống kê 3) Trong trường hợp này, huyền phù ban đầu, cần, mẫu thử coi dịch pha lỗng hay khơng Khả chấp nhận phụ thuộc vào số mẫu xét nghiệm việc định chấp nhận có khơng chấp nhận kết cấp hạng Thí dụ: Nếu chấp nhận kết cấp hạng 1, tần suất 221 chấp nhận 10 mẫu (từ lô hàng liên quan) xét nghiệm Tuy nhiên, kết cấp hạng nhỏ chấp nhận, tần suất 221 chấp nhận có 2, mẫu xét nghiệm Tuy nhiên, dãy số 221 kết xét nghiệm đơn lẻ không chấp nhận 10.2.2 Đối với dãy số tìm thấy chấp nhận theo 10.2.1, thu số MPN từ bảng B.1 B.2 Bảng - Thí dụ lựa chọn kết dương tính việc tính tốn MPN Mẫu MPN 2) Số ống dương tính nhận từ ống ủ ấm số mẫu nuôi cấy ống1) ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml 1g 10 -1 g 10-2 g 10-3g 10-4 g 3 2 3 3 2 1 3 2 Sản phẩm chất 10 ml lỏng Các sản phẩm dạng khác Sản phẩm lỏng ml-1 Các sản phẩm dạng khác g-1 1,5 x 101 1,5 x 102 2,4 x 101 2,4 x 102 7,4 7,4 x 101 0 2,4 2,4 x 101 2,1 x 10-1 2,1 1) ———, tổ hợp chọn 2) Được tính tốn từ cách sử dụng số MPN cho ống (bảng B.1) 10.3 Tính số có xác suất lớn (MPN) Số coliform mililit gam sản phẩm tính cách nhân số MPN (xem 10.2) với số đảo số pha loãng thấp chọn (tức dịch pha lỗng có nồng độ mẫu cao nhất) Khi độ pha loãng thấp chọn tương ứng với ống chuẩn bị với môi trường nồng độ kép (tức cấy với 10 ml), trước hết chia số số MPN cho 10 Biểu thị kết theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10 x, x số mũ 10 10.4 Độ chụm Có thể cho kết với dao động lớn với kỹ thuật MPN Do kết nhận theo phương pháp cần phải sử dụng thận trọng Giới hạn tin cậy cho bảng B.1 bảng B.2 Thí dụ: Đối với mẫu đặc 95% trường hợp giới hạn tin cậy dao động từ 13 đến 200 coliform g MPN 7,4 x 101 coliform g, từ đến 99 coliform g MPN 2,4 x 101 coliform g 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm cần qui định rõ phương pháp sử dụng, mục đích phép thử (phục vụ cơng nghệ hay bảo vệ sức khỏe), nhiệt độ ủ ấm kết thử thu Báo cáo thử nghiệm phải đề cập đến tất chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, điều kiện coi tùy ý cố ảnh hưởng đến kết thử Báo cáo thử nghiệm bao gồm tất thông tin cần thiết để nhận biết mẫu cách đầy đủ Phụ lục A (Qui định) Sơ đồ quy trình (xem điều 9) Phụ lục B