tieu-chuan-viet-nam-tcvn-11203-2016-bo-khoa-hoc-va-cong-nghe

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11203:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OXYTETRACYLIN/OXYTETRACYCLIN HYDROCHLORIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG Animal feeding stuffs - Determination of oxytetracyline/oxytetracycline hydrochloride content by liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 11203:2016 xây dựng dựa theo AOAC 2008.09 Oxytetracycline/Oxytetracycline Hydrochloride in Animal Feed, Fish Feed and Animal Remedies Liquid Chromatography; TCVN 11203:2016 Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố THỨC ĂN CHĂN NI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OXYTETRACYLIN/OXYTETRACYCLIN HYDROCHLORIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG Animal feeding stuffs - Determination of oxytetracyline/oxytetracycline hydrochloride content by liquid chromatographic method CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn không đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn cần thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng oxytetracyclin/oxytetracyclin hydrochloride có thức ăn chăn ni premix khống với hàm lượng lớn mg/kg thức ăn cho thủy sản với hàm lượng lớn 10 mg/kg Các kết phép thử liên phòng thử nghiệm nêu Phụ lục B Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi (nếu có) TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử Nguyên tắc Chiết oxytetracyclin hydrochloride (OTC.HCl) khỏi mẫu nghiền dung dịch metanol môi trường axit, sử dụng máy khuấy học Sau ly tâm lực ly tâm 1230g (khoảng 000 r/min với bán kính quay 275 mm) phần dịch chiết pha loãng nước (4.4) và/hoặc dung dịch metanol môi trường axit cho nồng độ OTC.HCl xấp xỉ với nồng độ dung dịch chuẩn làm việc dung dịch thu chứa 50 % nước (Các dung dịch mẫu thử pha loãng cuối mẻ cần chứa tỷ lệ phần trăm nước phù hợp với dung dịch hiệu chuẩn Hình dạng pic cải thiện tăng hàm lượng nước) Dịch chiết lọc phân tích sắc kí lỏng (LC) pha đảo có detector huỳnh quang Việc phát dựa vào đặc tính tạo chelat oxytetracyclin (OTC) với ion kim loại hóa trị hai tạo thành hợp chất chelat phát huỳnh quang Gradient pha động gồm có dung dịch đệm chứa natri axetat, axit dinatri etylendiamin tetraaxetat (EDTA) ngậm hai phân tử nước canxi clorua dùng metanol làm pha hữu Natri axetat EDTA dùng làm dung dịch đệm, EDTA canxi clorua kết hợp với OTC.HCl tạo thành phức chất có khả phát huỳnh quang Thuốc thử 4.1 Canxi clorua ngậm hai phân tử nước 4.2 Metanol, loại dùng cho LC loại tương đương 4.3 Dung dịch axit clohydric (HCl), 12 M 4.4 Nước, loại khoáng dùng cho LC loại tương đương 4.5 Natri hydroxit (NaOH), dạng viên 4.6 Dinatri EDTA 4.7 Natri axetat ngậm ba phần tử nước (CH3COONa.3H2O) 4.8 Dung dịch natri hydroxit, 40 % (khối lượng/thể tích) Hịa tan 40 g natri hydroxit (4.5) vào 100 ml nước (4.4) 4.9 Dung dịch gradient pha động: natri axetat 0,1 M, canxi clorua 0,055 M dinatri EDTA 0,020 M Hòa tan 7,44 g dinatri EDTA ngậm hai phân tử nước (4.6) khoảng 600 ml nước (4.4) ml dung dịch natri hydroxit 40 % (4.8) Sau đó, hòa tan 8,08 g canxi clorua ngậm hai phân tử nước (4.1) 13,6 g natri axetat ngậm ba phân tử nước (4.7) Chỉnh pH đến 6,5 dung dịch axit clohydric (4.11) thêm nước (4.4) đến lít Lọc qua lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.5) chân không Dung dịch chuẩn bị ngày sử dụng bảo quản lạnh để ngăn vi khuẩn phát triển Pha động loại khí cách thổi khí heli dùng khử khí chân khơng (xem 5.8) 4.10 Dung dịch chiết, metanol môi trường axit (tỷ lệ 1:50) Cho 20 ml dung dịch axit clohydric (4.3) vào lít metanol (4.2) 4.11 Dung dịch axit clohydric (HCl), M Thêm từ từ 83 ml dung dịch axit clohydric (4.3) vào 800 ml nước (4.4) đựng bình định mức lít, vừa thêm vừa khuấy, để nguội đến nhiệt độ phòng thêm nước đến vạch 4.12 Dung dịch axit clohydric(HCl), 0,01 M Pha loãng dung dịch axit clohydric M (4.11) nước (4.4) với tỷ lệ 1/100 4.13 Chất chuẩn OTC 4.14 Dung dịch chuẩn gốc, 1000 µg/ml Cân 25 mg chất chuẩn OTC (4.14), xác đến ba chữ số thập phân cho vào bình định mức 25 ml, thêm ml metanol (4.2), hòa tan thêm dung dịch axit clohydric 0,01 M (4.12) đến vạch Bảo quản tủ lạnh Dung dịch bền ba tuần Nồng độ OTC có dung dịch gốc, Cs, tính microgam mililit (µg/ml) theo cơng thức sau: Cs = w s × P × 1,08 Vs Trong đó: ws khối lượng chất chuẩn, tính miligam (mg); P độ tinh khiết chất chuẩn, ghi nhãn (ví dụ: 919 µg OTC/mg); 1,08 số microgam OTC.HCl tương ứng với µg OTC; Vs dung tích bình định mức, tính mililit (ở Vs = 25 ml) 4.15 Dung dịch chuẩn trung gian A, 100 µg/ml Dùng pipet lấy 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.14) cho vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch metanol môi trường axit (4.10) đến vạch Bảo quản tủ lạnh đông tủ lạnh Dung dịch bền ba tuần 4.16 Dung dịch chuẩn trung gian B, 10 µg/ml Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch chuẩn trung gian A (4.15) cho vào bình định mức 50 ml thêm dung dịch metanol môi trường axit (4.10) đến vạch Bảo quản tủ lạnh đông tủ lạnh Dung dịch bền ba tuần 4.17 Các dung dịch chuẩn LC, 0,2 µg/ml, 0,6 µg/ml, 1,2 µg/ml, 2,4 µg/ml, 4,0 µg/ml 5,0 µg/ml Chuẩn bị dung dịch chuẩn LC Bảng 1, tùy thuộc vào nồng độ mẫu cần phân tích Đối với mẫu bổ sung thuốc, bỏ qua dung dịch chuẩn LC mẫu dạng vết bỏ qua dung dịch chuẩn LC Pha loãng dung dịch chuẩn trung gian A (4.15) B (4.16) nước loại khoáng (4.4) và/hoặc dung dịch metanol môi trường axit (4.10), cho dung dịch chứa 50 % nước VÍ DỤ: Để chuẩn bị dung dịch chuẩn OTC µg/ml, cho ml dung dịch chuẩn trung gian A (100 µg/ml) (4.15) vào bình định mức 100 ml, thêm từ từ 45 ml dung dịch metanol môi trường axit (4.10), thêm nước loại ion (4.4), trộn kỹ thêm nước đến vạch Bảo quản dung dịch tủ đá tủ lạnh Dung dịch bền ba tuần 4.18 Dung dịch chuẩn làm việc, chuẩn bị theo Bảng Bảng - Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc Dung dịch chuẩn trung gian Dung tích bình Dung dịch chuẩn LC Dung dịch sử dụng Thể tích, ml định mức, ml Nồng độ, µg/ml Dung dịch sử dụng 4.16 1,0 50 0,20 Dung dịch chuẩn LC 4.16 3,0 50 0,60 Dung dịch chuẩn LC 4.16 3,0 25 1,2 Dung dịch chuẩn LC 4.16 6,0 25 2,4 Dung dịch chuẩn LC 4.16 10,0 25 4,0 Dung dịch chuẩn LC 4.15 5,0 100 5,0 Dung dịch chuẩn LC Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thủy tinh phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 5.1 Bình nón, dung tích 250 ml 5.2 Pipet, ống đong chia độ, bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml 5.3 Chai ống ly tâm polyproetylen, dung tích 50 ml 250 ml 5.4 Bộ lọc dung dịch thử nylon, đường kính 25 mm, cỡ lỗ 0,45 µm 5.5 Bộ lọc thủy tinh, để lọc dung mơi lọc nylon đường kính 47 mm, cỡ lỗ 0,45 µm loại tương đương 5.6 Máy lắc 5.7 Cân phân tích, đọc đến 0,0001 g 5.8 Hệ thống sắc kí lỏng, gồm có phận sau: - Bơm có độ xung thấp bơm trang bị giảm xung, trì tốc độ dòng từ 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min; - Bộ lấy mẫu tự động, có vịng bơm để bơm thể tích 20 µl; - Cột phân tích C18, kích thước 4,6 mm x 150 mm, cỡ hạt µm loại tương đương có cột bảo vệ C18 - Detector huỳnh quang, làm việc bước sóng kích thích 390 nm bước sóng phát xạ 512 nm; - Hệ thống tích phân hệ thống phân tích liệu LC; - Bộ khử khí (tùy chọn) 5.9 Máy ly tâm, vận hành lực ly tâm 1230g Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498) Mẫu thức ăn khô nghiền lọt hết qua sàng cỡ lỗ mm, không làm nóng mẫu Cách tiến hành 8.1 Chiết mẫu Cân lượng mẫu thử thích hợp, lấy đến hai chữ số thập phân, cho vào ống ly tâm 250 ml (5.3) Cân 20 g phần mẫu thử mẫu bị nhiễm OTC mức nhỏ 10 mg/kg, cân 10 g mẫu thử mẫu chứa hàm lượng OTC từ 10 mg/kg đến 000 mg/kg cân g mẫu thử mẫu chứa hàm lượng OTC 000 mg/kg Đối với mẫu có thuốc, chuẩn bị mẫu kiểm sốt (50 mg/kg) cách bổ sung ml dung dịch chuẩn trung gian A [100 µg/ml (4.15)] vào 10 g mẫu trắng, cần phân tích mẫu kiểm sốt với dãy mẫu bổ sung thuốc Đối với mẫu bị nhiễm, chuẩn bị mẫu kiểm soát cách bổ sung ml dung dịch chuẩn trung gian B [10 µg/ml] (4.16) vào 20 g mẫu trắng Mẫu trắng cần phân tích bắt đầu phương pháp để kiểm tra chất gây nhiễu Bổ sung 100 ml dung môi chiết (3.10), lắc máy lắc (5.6) 45 đến 60 Ly tâm lực ly tâm 1230g phần phía suốt Pha loãng phần dịch chiết nước (4.4) và/hoặc dung môi chiết cho nồng độ OTC dung dịch thử xấp xỉ dung dịch chuẩn LC dung dịch pha loãng cuối dịch chiết chứa 50 % nước CHÚ THÍCH: Các dung dịch thử pha loãng cuối mẻ cần chứa tỷ lệ nước phải phù hợp với dung dịch hiệu chuẩn Khi tỷ lệ nước tăng hình dạng pic cải thiện Cần chuẩn bị dãy pha loãng cách pha loãng lượng nhỏ (< ml) Các bảng so sánh phần trăm sai số tương đối sơ đồ pha lỗng khác có sẵn Ví dụ: lấy ml dịch chiết mẫu chứa 100 mg/kg cho vào bình định mức 100 ml (5.2) thêm nước (4.4) đến vạch Để dung dịch nguội đến nhiệt độ phịng, sau thêm nước đến vạch, cần Đối với mẫu có hàm lượng OTC nhỏ 110 mg/kg pha lỗng ml dịch chiết nước (4.4) đến 10 ml So sánh với dung dịch chuẩn làm việc LC thích hợp có nồng độ gần giống nồng độ dịch pha loãng Đối với mẫu có hàm lượng OTC lớn 110 mg/kg xác định độ pha lỗng, DF, theo cơng thức sau: DF − C1 w × C2 V Trong đó: C1 hàm lượng chất phân tích có mẫu, tính miligam kilogam (mg/kg); C2 nồng độ chất chuẩn, tính microgam mililit (µg/ml); w khối lượng phần mẫu thử, tính gam (g); V thể tích dịch chiết, tính mililit (ml) Sử dụng giá trị µg/ml làm nồng độ chuẩn, nồng độ dung dịch thử cuối không lớn µg/ml khơng nằm ngồi dải đường chuẩn (đối với mẫu chứa hàm lượng vượt lượng dự kiến), nhiên, phép phân tích cần sử dụng dung dịch chuẩn LC phù hợp (4,0 µg/ml 5,0 µg/ml) VÍ DỤ: Nếu C1 = 440 mg/kg, C2 = µg/ml, w = 10 g V= 100 ml độ pha lỗng là: DF = 440 10 × = 11 100 Chọn thể tích cuối thích hợp, ví dụ: 50 ml (dung tích bình định mức) thể tích dịch chiết, V1, tính theo mililit (ml) bằng: V1 = 50 = 4,5 (có thể làm tròn đến 5) 11 Cho 5,0 ml dịch chiết vào bình định mức 50 ml (5.2), thêm 20 ml dung môi chiết (4.10) thêm nước (4.4) đến vạch Hệ số pha loãng (DF) = 50/5 Lọc dung dịch thử qua lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.4) Tốt chuẩn bị dịch chiết phân tích ngày, khơng, dịch chiết dung dịch chuẩn làm việc cần bảo quản tủ tạnh để phân tích vào ngày hơm sau 8.2 Phép xác định LC 8.2.1 Điều kiện LC sau: - Tốc độ dịng: 1,5ml/min; - Thể tích bơm: 20 µl; - Thơng số detector: bước sóng kích thích 390 nm bước sóng phát xạ 512 nm; - Điều kiện gradient pha động: xem Bảng Bảng - Điều kiện gradient pha động Thời gian, Metanol (4.2), phần thể tích Dung dịch gradient pha động (4.9), phần thể tích 15 85 15 85 35 65 16 35 65 16,1 15 85 25 15 85 8.2.2 Yêu cầu phù hợp hệ thống sau: - Thời gian lưu: từ đến min; - Độ tuyến tính đường chuẩn cần có hệ số tương quan ≥ 0,999 với giới hạn tin cậy 95 % giao điểm trục y bao gồm điểm zero sai số chuẩn nhỏ 0,1; - Hệ số kéo đuôi, Tf (hệ số kéo đuôi USP hệ số đối xứng EP) phải nhỏ 1,5 Tính Tf theo cơng thức sau: Tf = t − t1 (t − t ) × Trong đó: t thời gian lưu, thời gian tối đa đường Gauss; t1 thời gian tương ứng với điểm % phía trước pic cực đại (điểm % vị trí mà đáp ứng bên pic đạt đến chiều cao % so với chiều cao pic cực đại); t2 thời gian tương ứng với điểm % phía sau pic cực đại CHÚ THÍCH: Hệ thống liệu sắc kí đồ tính với thơng số pic khác Ổn định cột pha động [hỗn hợp metanol (4.2) dung dịch gradient pha động (4.9) với tỉ lệ thể tích 15 : 85] 60 tốc độ 1,5 ml/min trước bơm dung dịch chuẩn dung dịch thử Kiểm tra xác nhận thơng số thích hợp hệ thống Điều chỉnh điều kiện gradient pha động để đạt thông số phù hợp hệ thống, cần Nếu gặp phải vấn đề áp suất kết tủa giảm lượng EDTA dung dịch pha động, cần xem xét khả tín hiệu làm cho pic OTC rộng Tốc độ dịng phải giảm để giảm thiểu áp suất cao Bơm 20 µl dung dịch thử Pha lỗng cần, để có diện tích pic OTC tương tự diện tích pic chất chuẩn Bơm 20 µl dung dịch chuẩn LC sau lần bơm dung dịch mẫu thử Để sử dụng hiệu chuẩn điểm, dựa vào diện tích pic trung bình chất chuẩn mẫu để tính nồng độ mẫu thử Đối với mẫu dạng vết, sử dụng dung dịch chuẩn LC 1, dung dịch chuẩn LC dung dịch chuẩn LC (4.17) Cách khác, sử dụng đường chuẩn điểm để định lượng dung dịch mẫu thử khơng có độ lệch trình vận hành Bơm dung dịch chuẩn LC (4.17) thích hợp bắt đầu cuối dãy mẫu, tính trung bình diện tích pic dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn Từng dung dịch chuẩn (4,0 µg/ml 5,0 µg/ml) cần bơm định kỳ để kiểm tra độ trơi Các ví dụ sắc kí đồ dung dịch chuẩn hiệu chuẩn OTC 2,4 µg/ml nêu Hình A.1; sắc kí đồ mẫu thức ăn cho gà giị chứa hàm lượng OTC 49 mg/kg nêu Hình A.2; sắc kí đồ mẫu thức ăn cho trâu bị chứa 430 mg/kg nêu Hình A.3 sắc kí đồ chất thay sữa chứa 310 mg/kg nêu Hình A.4 Khi kết thúc dãy mẫu thử, rửa hệ thống LC hỗn hợp metanol nước (tỉ lệ thể tích 15 : 85) h metanol 70 % 30 min, sau tắt hệ thống Đối với bơm có khóa thổi ngược, rửa pittong nước sau dãy mẫu CHÚ THÍCH: Pic epi-OTC tách tốt trước pic OTC, pic khoảng thời gian lưu 4,8 có mặt epi-OTC 8.3 Dựng đường chuẩn Kiểm tra độ tuyến tính hệ thống, sử dụng dung dịch chuẩn LC (4.17) Dựng đường chuẩn diện tích pic theo nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml) Độ tuyến tính đường chuẩn cần có hệ số tương quan ≥ 0,999 với giới hạn tin cậy 95 % giao điểm trục y bao gồm điểm sai số chuẩn nhỏ 0,1: hệ số kéo đuôi Tf (hệ số kéo đuôi USP hệ số đối xứng EP) phải nhỏ 1,5 Tính biểu thị kết 9.1 Tính kết Hàm lượng OTC.HCl mẫu thử dạng rắn, X1, tính miligam kilogam (mg/kg) theo công thức sau: X1 = A Cs × ×VE × DF As w Hàm lượng OTC mẫu thử dạng lỏng, X2, tính microgam mililit (àg/ml) theo cụng thc sau: X2 = Cs A ì ×Ve × DF As V × 1,08 Trong đó: A diện tích pic chất phân tích; As diện tích pic chất chuẩn; Cs nồng độ chất chuẩn, tính microgam mililit (µg/ml); w khối lượng mẫu thử dạng rắn, tính gam (g); V thể tích dung dịch mẫu thử dạng lỏng, tính mililit (ml); 1,08 hệ số chuyển đổi OTC.HCl sang OTC; VE thể tích dung mơi chiết dùng cho mẫu thêm chuẩn, tính mililit (trong trường hợp VE = 100 ml); DF hệ số pha lỗng VÍ DỤ: Mẫu dạng rắn có hàm lượng OTC 220 mg/kg cần pha loãng bốn lần để phù hợp với dung dịch chuẩn làm việc Diện tích pic mẫu = 19 626; diện tích pic dung dịch chuẩn = 21 598; nồng độ dung dịch chuẩn = 5,00 µg/ml; tổng thể tích = 100 ml; DF = 25/6, khối lượng phần mẫu thử = 10,01 g hàm lượng OTC.HCl tính sau: X = 19626 5,00 25 × × 100 × = 1,89 21598 10,01 Các phép tính thực sử dụng giá trị trung bình lần bơm dung dịch chuẩn riêng rẽ sử dụng đường hồi quy tuyến tính 9.2 Biểu thị kết Báo cáo kết đến ba chữ số sau dấu phẩy hàm lượng OTC.HCl lớn 10 mg/kg đến hai chữ số có nghĩa hàm lượng OTC.HCl nhỏ 10 mg/kg 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng đến kết quả; e) kết thử nghiệm thu Phụ lục A (Tham khảo) Các ví dụ sắc kí đồ đặc trưng Hình A.1 - Ví dụ sắc kí đồ dung dịch chuẩn hiệu chuẩn OTC 2,4 µg/ml Hình A.2 - Ví dụ sắc kí đồ mẫu thức ăn cho gà giị chứa hàm lượng OTC 49 mg/kg Hình A.3 - Ví dụ sắc kí đồ mẫu thức ăn cho trâu bị chứa hàm lượng OTC 430 mg/kg Hình A.4 - Ví dụ sắc kí đồ chất thay sữa chứa hàm lượng OTC 310 mg/kg Phụ lục B (Tham khảo) Kết phép thử liên phòng thử nghiệm Bảng B.1 - Kết thử nghiệm liên phịng xác định oxytetracyclin thức ăn chăn ni thức ăn thủy sản Thức ăn Thức ăn Thức ăn Thức ăn cho Thức ăn Thức ăn cho bê cho cá da thay Thức ăn gà thịt cho cá cho lợn AAFCOtrơn sữa cho lợn AAFCOhồi AAFCO 200425 AAFCO AAFCO30 200331 Hàm lượng trung bình, mg/kg 11 600 293 1070 215 4,82 14,2 46,2 Số lượng phòng thử nghiệm 10 11 10 10 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ 1 Độ lệch chuẩn lặp lại, Sr, mg/kg 181 9,04 42,5 7,98 0,44 1,31 2,3 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, % 1,56 3,08 3,96 3,71 9,2 9,21 4,98 Độ lệch chuẩn tái lập, SR, mg/kg 570 13,6 42,5 8,31 0,59 1,84 3,3 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, % 4,92 4,65 3,96 3,87 12,3 12,9 7,16 Chỉ số HorRat 1,26 0,68 0,71 0,54 0,97 1,2 0,8 11 000 440 1250 220 - - 55 Hàm lượng công bố nhãn, mg/kg Độ thu hồi, % 105,5 66,6 85,6 97,7 - - 84,0