TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11599:2016 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG RACTOPAMIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG Meat and meat products - Determination of ractopamine residues - High performance liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection Lời nói đầu TCVN 11599:2016 xây dựng sở tham khảo AOAC 2011.22 Ractopamine in swine, bovine, and turkey tissues HPLC with fluorescence detection; TCVN 11599:2016 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG RACTOPAMIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG Meat and meat products - Determination of ractopamine residues - High performance liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection CẢNH BÁO: Bảo quản dung môi buồng bảo quản chất lỏng dễ cháy Các dung mơi gây nguy hiểm hít, nuốt tiếp xúc qua da Sử dụng thiết bị bảo vệ cá nhân thích hợp kính an tồn găng tay cao su, thao tác sử dụng dung môi phải thực tủ hút Thải bỏ vật liệu theo quy định Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang để xác định dư lượng ractopamin thịt, bao gồm gan, thận mỡ động vật Nguyên tắc Ractopamin mẫu thịt, bao gồm gan thận, chiết metanol Làm bay phần dịch chiết, bổ sung dung dịch đệm cacbonat, chiết ractopamin vào metyl-t-butyl ete (MTBE) Sau đó, mẫu tinh cột chiết pha rắn (SPE) nhôm oxit A axit hóa Đối với mẫu mỡ, chiết metyl-t-butyl ete bazơ hóa, sau tinh cột SPE Dịch chiết tinh phân tích HPLC có detector huỳnh quang sử dụng đường chuẩn dải phân tích thấp Dư lượng ractopamin xác định dạng ractopamin hydroclorua chuyển đổi ractopamin tự theo hệ số thích hợp Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác CHÚ THÍCH: Có thể chuẩn bị dung mơi với thể tích khác khác với quy định với điều kiện chúng có nồng độ Trong q trình chuẩn bị, dung dịch gốc chỉnh độ tinh chất chuẩn đối chứng 3.1 Nước, nước cất nước khử ion, loại dùng cho HPLC 3.2 Metanol, loại dùng cho HPLC 3.3 Axetonitril, loại dùng cho HPLC 3.4 Metyl-t-butyl ete, loại dùng cho HPLC 3.5 Toluen, thuốc thử loại phân tích 3.6 Hexan, thuốc thử loại phân tích 3.7 Polymetylsiloxan clo hóa, ví dụ Gelest Aquaphobe™(P.N PP1-AQCM) 1) 3.8 Axit axetic băng, thuốc thử loại phân tích 3.9 Axit trifluoroaxetic, thuốc thử loại phân tích 3.10 Trictylamin, thuốc thử loại phân tích 1) Sản phẩm Gelest, Inc., Morrisville, PA, USA Thông tin đưa nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 3.11 Muối natri axit 1-pentanesulfonic, loại dùng cho HPLC 3.12 Natri bicacbonat (NaHCO3) 3.13 Dung dịch đệm cacbonat, pH 10,5 Cho 8,40 g ± 0,10 g natri bicacbonat (3.12) vào 950 ml nước trộn Thêm dung dịch natri hydroxit M (3.14) pH 10,5 ± 0,1 3.14 Dung dịch natri hydroxit, M 3.15 Các dung dịch đệm dùng cho máy đo pH (4.6) 3.16 Dung môi chiết metyl-t-butyl ete, bazơ hóa (dung dịch trietylamin 0,2 % metyl-tbutyl ete) Cho ml trietylamin (3.10) vào 000 ml metyl-t-butyl ete (3.4), trộn kỹ Chuẩn bị dung dịch ngày 3.17 Dung môi rửa giải SPE Cho ml axit trifluoroaxetic (3.9) vào 000 ml metanol (3.2), trộn kỹ Chuẩn bị dung dịch ngày 3.18 Chất chuẩn đối chứng ractopamin hydroclorua (ractopamin HCI) Bảo quản chất chuẩn 25 oC 3.19 Ritodrin hydroclorua (C17H21NO3·HCI) 3.20 Pha động dùng cho HPLC Cho 0,87 g ± 0,05 g muối natri axit 1-pentanesulfonic (3.11), 20 ml axit axetic băng (3.8) 250 ml axetonitril (3.3) vào 750 ml nước (3.1) Trộn 3.21 Dung dịch pha loãng mẫu thử Cho 20 ml axit axetic băng (3.8) vào 980 ml nước (3.1) Trộn 3.22 Dung dịch chuẩn gốc ractopamin, 000 μg/ml Cho 100 mg ± 0,1 mg chất chuẩn đối chứng ractopamin hydroclorua (3.18) vào bình định mức 100 ml, hịa tan thêm metanol (3.2) đến vạch Dung dịch chuẩn bị bền tháng bảo quản nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC 3.23 Dung dịch chuẩn trung gian ractopamin I, 10 μg/ml Cho ml dung dịch chuẩn gốc ractopamin (3.22) vào bình định mức 100 ml, thêm metanol (3.2) đến vạch 3.24 Dung dịch chuẩn trung gian ractopamin II, 500 ng/ml Cho ml dung dịch chuẩn trung gian ractopamin I (3.23) vào bình định mức 20 ml, thêm dung dịch pha lỗng mẫu thử (3.21) đến vạch 3.25 Dung dịch chuẩn làm việc ractopamin, 2,5 ng/ml, 5,0 ng/ml, 10,0 ng/ml, 25,0 ng/ml, 50,0 ng/ml 100,0 ng/ml Cho dung dịch chuẩn trung gian II (3.24) vào bình định mức (4.2) sau: 0,5 ml vào bình định mức 100 ml, ml vào bình định mức 100 ml, ml vào bình định mức 50 ml, ml vào bình định mức 20 ml, ml vào bình định mức 20 ml ml vào bình định mức 20 ml, thêm dung dịch pha loãng mẫu thử (3.21) đến vạch Các dung dịch chuẩn bị bền 14 ngày bảo quản nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC 3.26 Dung dịch chuẩn gốc ritodrin, 100 μg/ml Thêm 10 mg ± mg ritodrin hydroclorua (3.19) vào bình định mức 100 ml Hòa tan thêm metanol (3.2) đến vạch 3.27 Dung dịch chuẩn trung gian ritodrin, μg/ml Cho ml dung dịch chuẩn gốc ritodrin (3.26) vào bình định mức 100 ml, thêm metanol (3.2) đến vạch 3.28 Dung dịch chuẩn phân giải Cho ml dung dịch chuẩn trung gian ractopamin II (3.24) ml dung dịch chuẩn trung gian ritodrin (3.27) vào bình định mức 20 ml, thêm metanol (3.2) đến vạch Trộn kỹ Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Pipet định mức, loại A, thủy tinh, có dung tích thích hợp 4.2 Bình định mức, loại A, dung tích 20 ml, 50 ml 100 ml 4.3 Ống đong hỗn hợp chia vạch, dung tích 100 ml có nắp đậy 4.4 Cân phân tích, cân xác đến ± 0,0001 g 4.5 Cân, cân xác đến ± 0,01 g 4.6 Máy đo pH 4.7 Thìa, thép khơng gỉ phủ Teflon 4.8 Chai thủy tinh, dung tích lit 4.9 Ống đong chia vạch, thủy tinh, có dung tích thích hợp 4.10 Máy khuấy từ que khuấy phủ Teflon 4.11 Máy xay thịt máy nghiền thực phẩm 4.12 Ống nghiệm, dài 100 mm, đường kính 16 mm, borosilicat có nắp đậy 4.13 Máy trộn vortex nhiều ống 4.14 Ống ly tâm, polypropylen, hình cơn, dung tích 50 ml, có nắp đậy 4.15 Máy xay nhuyễn, loại tương đương 4.16 Máy ly tâm 4.17 Pipet, thủy tinh, dùng lần 4.18 Máy làm khơ nitơ, ví dụ: TurboVap™ LV o C ± oC 2) nồi cách thủy, trì nhiệt độ 49 4.19 Bộ phân phối chân khơng, có khóa poly tetra fluorethylen (PTFE) giá để ống nghiệm dài 16 mm 4.20 Bể siêu âm 4.21 Bộ lọc, PTFE, đường kính 13 mm, cỡ lỗ 0,45 μm 4.22 Cột chiết pha rắn (SPE), ví dụ Sep-Pak® nhơm oxit A 3), 12 ml, g, cỡ hạt 50 μm đến 300 μm 4.23 Máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 4.24 Detector huỳnh quang, hoạt động bước sóng kích thích 226 nm, bước sóng phát xạ 306 nm 4.25 Cột HPLC, ví dụ cột Supelco LC-18-DB 4), dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, cỡ hạt μm Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Cách tiến hành 6.1 Silan hóa ống nghiệm a) Chuẩn bị dung dịch % (thể tích) polymetylsiloxan clo hóa (3.7) toluen (3.5) b) Đổ đầy lượng dung dịch thích hợp vào ống nghiệm đậy nắp Để cho phản ứng diễn h nhiệt độ phịng c) Loại bỏ dung dịch silan hóa Đổ đầy metanol (3.2) vào ống phản ứng h d) Loại bỏ metanol tráng ống nước 2) Sản phẩm Zymark, Hopkinton, MA, USA Thông tin đưa nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 3) Sản phẩm Waters, Milford, MA, USA Thông tin đưa nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 4) Sản phẩm Bellefont, PA, USA Thông tin đưa nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương e) Tráng ống metanol (3.2) Lật ngược ống để đến khô 6.2 Chuẩn bị mẫu thử Xay nghiền tối thiểu 500 g mẫu, sử dụng máy xay (4.11) để tạo mẫu đồng Có thể cân 5,0 g ± 0,5 g mẫu (mẫu nghiền), cho vào ống ly tâm (4.14) cấp đông để hạn chế mẫu cấp đông rã đông nhiều lần Bảo quản tất mẫu nhiệt độ đông lạnh (-10 oC thấp hơn) chưa xử lý chưa lấy mẫu Nên bảo quản mẫu bổ sung với mẫu phân tích để xác nhận tính ổn định bảo quản 6.3 Chiết làm mẫu thịt, gan thận 6.3.1 Cân hai phần mẫu kiểm sốt gan, thịt thận khơng chứa ractopamin (âm tính) nghiền nhỏ, phần 5,0 g ± 0,5 g, xác đến 0,00001 g, cho vào ống ly tâm (4.14) Cân 5,0 g ± 0,5 g phần mẫu thử, xác đến 0,00001 g, cho vào ống ly tâm (4.14) Thêm dung dịch chuẩn thích hợp vào mẫu kiểm sốt âm tính để chuẩn bị mẫu bổ sung (matrix-fortified) mức quy định Không thêm dung dịch chuẩn vào mẫu kiểm soát âm tính cịn lại Mẫu sử dụng làm mẫu kiểm sốt âm tính (mẫu trắng) Để n mẫu kiểm sốt nhiệt độ phịng khoảng 20 6.3.2 Thêm 18 ml đến 20 ml metanol (3.2) vào mẫu xay nhuyễn 20 s, dùng máy xay (4.15) 6.3.3 Ly tâm mẫu tốc độ khoảng 3000 r/min (gia tốc hướng tâm khoảng 2025 g) 15 6.3.4 Gạn dịch phía vào ống đong hỗn hợp chia vạch (4.3) vật chứa khác có nắp đậy hiệu chuẩn thích hợp 6.3.5 Thêm lần thứ hai thể tích metanol (3.2) từ 18 ml đến 20 ml vào phần mẫu lại Khuấy mạnh thìa (4.7), ly tâm (6.3.3) thêm phần dịch thứ hai vào phần dịch (6.3.4) 6.3.6 Thêm ml đến 10 ml metanol (3.2) vào phần mẫu cịn lại Khuấy mạnh thìa (4.7), ly tâm (6.3.3) thêm phần dịch thứ ba vào hai phần dịch trước 6.3.7 Thêm metanol (3.2) vào dịch chiết thu được, đến 50 ml 6.3.8 Đậy nắp ống đong chia vạch trộn kỹ Ghi lại thể tích 6.3.9 Đối với thịt gan gà, gan thận lợn, bò, chuyển 2,0 ml dịch chiết vào ống nghiệm dài 100 mm, đường kính 16 mm silan hóa (6.1) làm bay đến khơ, dùng dịng khơng khí nitơ, sử dụng nồi cách thủy máy làm khô nitơ (4.18) cài đặt 49 oC ± oC 6.3.10 Đối với thịt lợn thịt bò, chuyển 8,0 ml dịch chiết vào ống nghiệm dài 100 mm, đường kính 16 mm silan hóa (6.1) làm bay đến khơ, dùng dịng khơng khí nitơ, sử dụng nồi cách thủy máy làm khô nitơ (4.18) cài đặt 49 oC ± oC 6.3.11 Thêm ml dung dịch đệm natri bicacbonat (3.13) vào ống nghiệm trộn 6.3.12 Thêm ml dung môi chiết metyl-t-butyl ete (3.4) vào ống nghiệm chứa mẫu, vặn nắp lắc mạnh 30 s Đảm bảo mẫu hòa tan hết 6.3.13 Ly tâm ống 3000 r/min (2025 g) để tạo thành lớp hữu lớp nước 6.3.14 Ổn định cột SPE nhôm oxit A (4.22) cách đặt cột lên đỉnh phân phối chân không (4.19), làm ẩm ml metyl-t-butyl ete (3.4) để dung môi khô đến bề mặt nhôm oxit 6.3.15 Cho lớp metanol phía sau ly tâm (xem 6.3.13) vào cột nhôm oxit ổn định (6.3.14) để đến bề mặt nhôm oxit, loại bỏ nước thải 6.3.16 Lặp lại bước 6.3.12, 6.3.13 6.3.15 hai lần 6.3.17 Rửa cột SPE hai lần, lần ml metyl-t-butyl ete (3.4); loại bỏ nước thải 6.3.18 Rửa giải chất phân tích giữ lại với ml axit trifluoroaxetic 0,2 % metanol (3.17) vào ống nghiệm silan hóa dài 100 mm, đường kính 16 mm (6.1) 6.3.19 Làm bay đến khô, dùng dịng khơng khí nitơ, sử dụng nồi cách thủy máy làm khô nitơ (4.18) cài đặt 49 oC ± oC 6.3.20 Thêm 1,0 ml (hoặc thể tích thích hợp khác) dung dịch pha lỗng mẫu thử (3.21) vào ống nghiệm, siêu âm trộn vortex để hòa tan Lọc vào lọ nhỏ dùng cho sắc ký lỏng Sử dụng dịch lọc để phân tích theo 6.5 6.4 Chiết làm mẫu mỡ 6.4.1 Cân hai phần mẫu mỡ kiểm sốt khơng chứa ractopamin (âm tính), phần 5,0 g ± 0,5 g, xác đến 0,00001 g, cho vào ống ly tâm (4.14) Cân 5,0 g ± 0,5 g mẫu mỡ thử nghiệm, xác đến 0,00001 g, cho vào ống ly tâm (4.14) Thêm dung dịch chuẩn thích hợp vào mẫu kiểm sốt âm tính để chuẩn bị mẫu bổ sung mức sai số cho phép Không thêm dung dịch chuẩn vào mẫu kiểm soát âm tính cịn lại Mẫu sử dụng làm mẫu kiểm sốt âm tính (mẫu trắng) Để n mẫu kiểm sốt nhiệt độ phịng khoảng 20 6.4.2 Thêm 18 ml đến 20 ml dung môi chiết metyl-t-butyl ete bazơ hóa (3.16) vào mẫu xay nhuyễn 20 s, dùng máy xay (4.15) 6.4.3 Ly tâm mẫu tốc độ khoảng 3000 r/min (gia tốc hướng tâm khoảng 2025 g) 15 6.4.4 Gạn dịch phía vào ống đong hỗn hợp chia vạch (4.3) vật chứa khác có nắp đậy hiệu chuẩn thích hợp 6.4.5 Thêm 18 ml đến 20 ml dung môi chiết metyl-t-butyl ete bazơ hóa (3.16) lần thứ hai vào lượng mỡ cịn lại Khuấy mạnh thìa (4.7), ly tâm (6.4.3) chuyển phần dịch thứ hai vào phần dịch 6.4.6 Thêm dung môi chiết đến thể tích cuối 40 ml 6.4.7 Đậy nắp ống đong trộn kỹ Ghi lại thể tích 6.4.8 Ổn định cột SPE nhôm oxit A (4.22) cách đặt cột lên đỉnh phân phối chân không (4.19), làm ẩm ml metyl-t-butyl ete (3.4) để dung môi khô đến bề mặt nhôm oxit 6.4.9 Thêm ml dịch chiết metyl-t-butyl ete (3.4) vào cột SPE để đến khô bề mặt nhôm oxit; loại bỏ nước thải 6.4.10 Rửa cột SPE ml metyl-t-butyl ete (3.4); loại bỏ nước thải 6.4.11 Rửa giải chất phân tích giữ lại với 0,6 ml axit trifluoroaxetic 0,2 % metanol (3.17) vào ống nghiệm silan hóa dài 100 mm, đường kính 16 mm (6.1) 6.4.12 Làm bay đến khô, dùng dịng khơng khí nitơ, sử dụng nồi cách thủy máy làm khô nitơ (4.18) cài đặt 49 oC ± oC 6.4.13 Thêm 1,0 ml dung dịch pha loãng mẫu (3.21) ml hexan (3.6) vào ống nghiệm trộn kỹ 6.4.14 Ly tâm 3000 r/min (2025 x g) Loại bỏ lớp hexan 6.4.15 Lọc pha nước vào lọ dùng cho sắc ký lỏng Sử dụng dịch lọc để phân tích theo 6.5 6.5 Phân tích sắc ký lỏng/detector huỳnh quang (LC/FLD) 6.5.1 Điều kiện vận hành HPLC Các điều kiện vận hành sau cho thích hợp: - Cột: Cột HPLC (4.25) - Bước sóng: Bước sóng kích thích 226 nm, bước sóng phát xạ 306 nm - Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng - Pha động (3.20) - Tốc độ dịng: 1,0ml/min - Thể tích bơm: 100 μl - Thời gian chạy: 15 6.5.2 Sự phù hợp hệ thống 6.5.2.1 Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu dung dịch chuẩn ng/ml phải tối thiểu 10 6.5.2.2 Pic ractopamin phải phân giải tốt khỏi bề mặt dung môi rửa giải từ đến 6.5.2.3 Hệ số đuôi, T, pic chuẩn ractopamin 10 ng/ml tối đa 1,8, T xác định Cơng thức (1): T = W0,10 ×f (1) Trong W0,10 chiều rộng pic 10 % chiều cao pic; f chiều rộng tính từ cực đại pic đến mép 10 % chiều cao pic 6.5.2.4 Hệ số đuôi ractopamin ritodrin phải 1,5, xác định sau: - Bơm dung dịch chuẩn phân giải (3.28), dùng điều kiện mô tả phương pháp - Hệ số phân giải (Rs) pic bên cạnh, tính Cơng thức (2): RS = × ( t − t1 ) (w − w1 ) (2) Trong t1 t2 thời gian lưu hai chất thứ thứ hai; w1 w2 chiều rộng pic thứ thứ hai Trong đó, tỷ lệ tín hiệu/nhiễu khơng đáp ứng u cầu 6.5.2.1, detector khơng đủ để phân tích mức yêu cầu theo phương pháp Nếu không đáp ứng điều kiện quy định từ 6.5.2.2 đến 6.5.2.4, cần thay đổi pha động thay cột CHÚ THÍCH Việc giảm nồng độ axetonitril pha động làm tăng độ phân giải ractopamin khỏi ritodrin 6.5.3 Tiến hành phân tích 6.5.3.1 Đối với hệ thống HPLC sử dụng, kiểm tra xác nhận yêu cầu phù hợp hệ thống đáp ứng 6.5.3.2 Bơm riêng dung dịch chuẩn bơm riêng dung dịch chiết mẫu Nên bơm dãy chất chuẩn bắt đầu kết thúc bơm đợt phân tích 6.5.3.3 Đo diện tích pic ractopamin chất chuẩn dung dịch mẫu Dựng đường chuẩn tuyến tính, dùng tất độ đáp ứng chuẩn Từ đường chuẩn, tính nồng độ dung dịch chiết mẫu, biểu thị nanogam mililit (ng/ml) 6.5.3.4 Nếu diện tích pic ractopamin mẫu vượt điểm cao đường chuẩn dịch chiết cuối phải pha loãng bơm lại song song với dãy chuẩn 6.5.3.5 Nên dội mạnh cột hỗn hợp dung môi/nước [axetonitril metanol-nước, 80 + 20 (thể tích)] sau lần chạy để loại bỏ mẫu lại khỏi cột Tính kết 7.1 Nồng độ ractopamin hydroclorua mẫu thử, X1, biểu thị nanogam gam (ng/g), tính theo Cơng thức (3): E A − B X1 = ×D × F C (3) Trong A diện tích pic HPLC mẫu; B giao điểm đường chuẩn với trục tung; C độ dốc đường chuẩn (diện tích/ml/ng); D độ tinh khiết chất chuẩn đối chứng, tính gam (g); F khối lượng mẫu, tính gam (g); E tổng thể tích dịch chiết tương ứng với phần mẫu thử, tính mililit (ml), tính Cơng thức (4): E= M ×G N (4) Trong M thể tích dịch chiết thu ban đầu, tính mililit (ml); N thể tích dịch chiết sử dụng, tính mililit (ml); G thể tích dịch lọc cuối cùng, tính miliiit (ml) 7.2 Nồng độ ractopamin tự mẫu thử, X2, biểu thị nanogam gam (ng/g), tính theo Công thức (5): X2 = X1 x 0,89476 (5) Trong 0,89476 tỉ lệ khối lượng phân tử ractopamin tự ractopamin hydroclorua CHÚ THÍCH: Cơng thức dựa giả định đường chuẩn chưa hiệu độ tinh khiết chất chuẩn Nhiều hệ thống liệu sắc ký tự động hiệu đường chuẩn độ tinh khiết thực lắp đặt Nếu áp dụng việc hiệu dung dịch chuẩn gốc hiệu độ tinh khiết khơng cần hiệu độ tinh khiết chất chuẩn đối chứng (D) Nếu mẫu mẫu thu hồi bổ sung hệ thống liệu hiệu đường chuẩn độ tinh khiết, mẫu thu hồi phải hiệu độ tinh khiết chất chuẩn bổ sung Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; d) thao tác không quy định tiêu chuẩn này, điều coi tự chọn, chi tiết có ảnh hưởng tới kết quả; e) kết thử nghiệm thu