BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT THỰC TẬP CƠ SỞ SẢN XUẤT – BT480C Phân Lập Vi Khuẩn Gây Bệnh Bạc Lá Lúa Xanthomonas
GIỚI THIỆU
Giới thiệu về cơ sở sản xuất
Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) được thành lập ngày 8 tháng 1 năm 1977 theo quyết định số 41 NN-TC/QĐ, với tên gọi ban đầu là Trung Tâm Kỹ thuật Nông nghiệp ĐBSCL, tại xã Tân Thạch, huyện Thới Lai, TP Cần Thơ với tổng diện tích
360 ha Đến năm 1985, Viện chính thức đổi tên thành Viện Lúa ĐBSCL theo Quyết định số 24/CT ngày 09 tháng 01 năm 1985 của Hội đồng Bộ trưởng (nay là Chính phủ) Từ ngày 01 tháng 01 năm 2010, Viện được chuyển về trực thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam theo quyết định số 3533/QĐ-BNN-TCCB của Bộ trưởng Bộ Nông Nghiệp và PTNT Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long là đơn vị sự nghiệp khoa học công lập Viện có chức năng nghiên cứu khoa học, chuyển giao công nghệ, dịch vụ và sản xuất kinh doanh về cây lúa và hệ thống nông nghiệp phục vụ cho sự phát triển kinh tế xã hội vùng đồng bằng sông Cửu Long Công tác nghiên cứu khoa học, phát triển công nghệ và dịch vụ khoa học của Viện Lúa đã đạt được những thành tựu to lớn và đóng góp một phần quan trọng trong phát triển sản xuất nông nghiệp, đặc biệt đối với sản xuất lúa vùng ĐBSCL Kết quả nổi bật từ khi thành lập tới nay, Viện Lúa ĐBSCL đã được Bộ NN & PTNT công nhân 191 giống lúa mới do Viện lai tạo và chọn lọc và cho phép phổ biến vào sản xuất Trung bình hàng năm, Viện Lúa cung cấp khoảng 4000 tấn giống lúa các cấp có chất lượng cao vào sản xuất Cùng với việc tạo chọn ra các giống lúa mới Viện Lúa cũng đã xây dựng được 29 qui trình và giải pháp kỹ thuật đưa vào áp dụng cho sản xuất nông nghiệp tại các tỉnh ĐBSCL Bên cạnh đó, các cán bộ khoa học của Viện cũng đóng góp tích cực và có hiệu quả trong công tác đào tạo nhân lực của vùng và công bố các công trình nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước
Hình 5.1: Trụ sở chính của Viện lúa ĐBSCL
13 Để phát huy hơn nữa thế mạnh, tiềm năng và để đáp ứng tình hình mới hướng tới tự chủ và tự chịu trách nhiệm trong mọi mặt họat động nghiên cứu, đào tạo, dịch vụ và kinh doanh của các đơn vị sự nghiệp công lập theo Nghị định số 16/2015/NĐ-CP ngày 14/2/2015, trong năm 2019 Viện Lúa ĐBSCL đã triển khai và thực thi kế hoạch tái cấu trúc cơ cấu tổ chức và sắp xếp lại bộ máy để nâng cao hơn nữa hiệu quả của Viện trong hoạt động nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ để có những đóng góp nhiều hơn nữa trong sản xuất nông nghiệp và phát triển kinh tế vùng ĐBSCL và cho cả nước
Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học và Nông nghiệp Công nghệ cao (Địa chỉ: số 9B Đường Cách mạng Tháng 8, Phường An Hòa, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ) là đơn vị trực thuộc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, được thành lập theo quyết định Số 202/QĐ-VL-TCHC, ngày 30 tháng 08 năm 2019 của Viện trưởng Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long Trung tâm được giao nhiệm vụ nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ cao trong nông nghiệp cho vùng đồng bằng sông Cửu Long Trung tâm phấn đấu phát triển trở thành một trong những đơn vị hàng đầu trong vùng về nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ vào sản xuất nông nghiệp, và là đầu mối liên kết hợp tác trong và ngoài nước trong lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng CNSH và CNC vào nông nghiệp
Cơ cấu tổ chức – Nhân sự
Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Công nghệ cao có 01 Giám đốc Trung tâm và 01 Phó Giám đốc Trung tâm Số lượng người làm việc của Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Công nghệ cao gồm các ông/bà có tên trong danh sách dưới đây
Hình 1.6: Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học và Nông nghiệp Công nghệ cao
Bảng 1.1: Danh sách nhân sự Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Công nghệ cao
TT Họ và tên Chức vụ Trình độ
1 Nguyễn Thế Cường Giám đốc Tiến sĩ
2 Đặng Minh Tâm Phó giám đốc Tiến sĩ
3 Đồng Thanh Liêm Nghiên cứu viên Thạc sĩ
4 Võ Thị Kiều Trang Nghiên cứu viên Thạc sĩ
5 Hồ Thị Huỳnh Như Nghiên cứu viên Cử nhân
6 Lê Hoàng Ninh Nghiên cứu viên Cử nhân
7 Nguyễn Thị Thoan Nghiên cứu viên Cử nhân
8 Lê Võ Thùy Ngân Nghiên cứu viên Thạc sĩ
9 Viên Phúc Đạt Nghiên cứu viên Cử nhân
10 Nguyễn Văn Tuấn Anh Nghiên cứu viên Cử nhân b Chức năng, nhiệm vụ:
Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Công nghệ cao, là đơn vị dịch vụ trực thuộc Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, có chức năng nghiên cứu phát triển và cung cấp dịch vụ về ứng dụng công nghệ sinh học và nông nghiệp công nghệ cao (cây con, chế phẩm vi sinh vật, các giá thể, quy trình kỹ thuật, trang thiết bị.…) trong sản xuất nông nghiệp
* Nhiệm vụ: Ứng dụng công nghệ sinh học trong vi nhân giống các loại cây trồng: cây cảnh, cây dược liệu, cây lâm nghiệp, cây ăn quả …
Nghiên cứu phát triển các sản phẩm (qui trình kỹ thuật, dinh dưỡng, giá thể, trang thiết bị…) phục vụ cho nông nghiệp đô thị và nông nghiệp theo hướng công nghệ cao
Nghiên cứu phát triển các sản phẩm từ vi sinh vật để sử dụng trong sản xuất và bảo vệ cây trồng
Nghiên cứu và phát triển thực phẩm chức năng ứng dụng CNSH và công nghệ cao
Tổ chức và xây dựng mô hình trình diễn công nghệ mới trong ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ cao trong sản xuất nông nghiệp
Sản xuất và thương mại hóa các sản phẩm ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ cao (cây con, chế phẩm vi sinh vật, các giá thể, quy trình…) trong sản xuất nông nghiệp
Cung cấp các dịch vụ tư vấn, đào tạo, chuyển giao công nghệ và hợp tác trong lĩnh vực công nghệ sinh học và ứng dụng công nghệ cao trong nông nghiệp c Quan điểm phát triển
Nghiên cứu khoa học, phát triển và ứng dụng công nghệ vừa là mục tiêu, vừa là động lực cho sự phát triển của Trung tâm UDCNSH và NNCNC Khoa học và công nghệ đóng vai trò chủ đạo để tạo bước phát triển đột phá cung cấp tri thức mới, nâng cao chất lượng sản phẩm, chất lượng đào tạo nguồn nhân lực, thu hút các nguồn lực, tạo nên giá trị và thương hiệu của Trung tâm nói riêng và của Viện Lúa ĐBSCL nói chung
Phát triển khoa học và công nghệ dựa trên thế mạnh nghiên cứu cơ bản, nghiên cứu ứng dụng, nguồn nhân lực chất lượng cao và cơ sở hạ tầng của Viện Lúa ĐBSCL Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng khoa học và công nghệ theo hướng tiếp cận sản phẩm đầu ra, khoa học gắn liền với dịch vụ, sản xuất và nhu cầu thực tiễn của xã hội, tạo sản phẩm mới có hàm lượng khoa học và công nghệ cao cho ngành nông nghiệp vùng ĐBSCL và cả nước
Xây dựng và phát triển hệ sinh thái nghiên cứu và thị trường khoa học và công nghệ gắn với thực thi pháp luật về sở hữu trí tuệ, chuyển giao tri thức, thúc đẩy thương mại hóa kết quả nghiên cứu, khuyến khích các hoạt động nghiên cứu, sáng tạo, và chuyển giao khoa học và công nghệ
Hợp tác với các đơn vị nghiên cứu, trường đại học, doanh nghiệp trong nước và hợp tác quốc tế trong phát triển khoa học và công nghệ vừa là mục tiêu, vừa là phương thức đẩy nhanh tốc độ hội nhập và tạo bứt phá cho phát triển và ứng dụng khoa học công nghệ của Trung tâm d Các lĩnh vực hoạt động
Tham gia các hoạt động trong chọn tạo và vi nhân giống các loại cây trồng, cây cảnh, cây dược liệu, cây lâm nghiệp, cây ăn quả,…theo hướng công nghệ cao và ứng dụng trong nông nghiệp định hướng sinh thái bền vững
Nghiên cứu phát triển các sản phẩm (quy trình kỹ thuật, dinh dưỡng,giá thể, trang thiết bị, …) phục vụ cho nông nghiệp đô thị và nông nghiệp theo hướng công nghệ cao
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1.1 Triệu chứng và sự phát triển của bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá (hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá lúa) là một bệnh phổ biến trên lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae (Xoo) gây ra Bệnh gây héo cây con, vàng và khô lá (Hình 2.1) Bệnh phát triển mạnh ở những khu vực có cỏ dại và rơm rạ không được xử lý đúng cách Bệnh xảy ra ở cả môi trường nhiệt đới và ôn đới, đặc biệt ở các vùng đất thấp được tưới tiêu và tưới phun mưa Nhiệt độ lây lan bệnh mạnh ở 25-34℃ và độ ẩm tương đối trên 70% Bệnh thường xảy ra khi có gió mạnh và mưa lớn liên tục, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây bệnh dễ dàng lây lan qua các giọt nước rỉ ra trên các vết bệnh của những cây bị nhiễm bệnh Khi vi khuẩn xâm nhập vào vết thương trên lá trong
24 giờ, lá lúa bắt đầu xuất hiện màu trắng vàng ở hai bên mép lá và bắt đầu kéo dài đến hết phiến lá trong 2-3 tuần Bệnh bạc lá có thể diễn ra nghiêm trọng ở các giống lúa mẫn cảm khi được bón phân đạm cao (Syed, 2019); (IRRI, 2020) Môi trường trên đồng ruộng quyết định rất lớn đến tình trạng bệnh của lúa Dựa vào đặc tính và triệu chứng của bệnh có thể chia làm hai thời kỳ: Kỳ bạc lá và kỳ Kresek
Hình 2.4: Dấu hiệu bệnh bạc lá
Kỳ bạc lá (leaf blight phase): Giai đoạn này của bệnh xuất hiện rất sớm với các triệu chứng ban đầu trên phiến lá sau khi đẻ nhánh và thường bắt đầu ở cuống lá xâm nhập dần lên chóp lá của cây (Goto, 1992; Cha, 1982) Phần trên của lá hoặc toàn bộ diện tích phiến lá chuyển sang màu vàng nhạt sau đó trở nên héo dần tùy mức độ của bệnh (Mizukami và Wakimoto, 1969) Ở mức độ nghiêm trọng hơn, lá lúa có màu bạc trắng ngay từ thời gian đầu ủ bệnh sau đó chuyển sang màu vàng nhạt và chết (Ou, 1985)
Kỳ Kresek (Kresek phase): Từ Kresek có nguồn gốc từ thuật ngữ bản địa trong tiếng Java có nghĩa là “Âm thanh của lá khô” (Wakimoto, 1969) Kỳ Kresek của bệnh bạc lá có đặc trưng chủ yếu là sự truyền nhiễm trực tiếp của vi khuẩn vào hệ thống tế bào thực vật và thường có triệu chứng vào một đến hai tuần trong giai đoạn chuyển cây từ vườn ươm ra đồng ruộng Trong điều kiện khắc nghiệt, lá lúa chuyển sang màu xanh xám đến hơi trắng và đột nhiên khô héo Kỳ Kresek đôi khi xảy ra ở cây lúa trưởng thành Bệnh lan mạnh từ các bộ phận sinh trưởng mạnh như lá đến thân cây của cây trưởng thành(Goto, 1992; Watanabe, 1975)
Vi khuẩn nội sinh trong rễ cỏ dại “Leersia haxandra” mọc trong mùa trồng lúa hoặc trong các luống ươm Ngoài ra, rơm rạ tồn đọng sau vụ mùa chứa nhiều khả năng có sự hiện diện của vi khuẩn Xoo hoặc hạt bị nhiễm bệnh có khả năng đưa mầm bệnh vào vườn ươm cây (Mizukami, 1957, 1959, 1961) Sau khi đến giai đoạn lúa non, mầm bệnh bắt đầu tích tụ trên bề mặt rễ và xâm nhập lên thân bằng cách tiêu thụ các chất chuyển hóa để nhân lên Mầm bệnh có thể truyền đến phần gốc của bẹ lá thông qua vùng rễ bị thối rửa hoặc thông qua các lá phía dưới của cây lúa chạm nước có nguồn lây nhiễm (Mizukammi, 1961 và Dath, 1983) Nghiên cứu của Taibei (1967) cho thấy khí khổng là con đường xâm nhập chủ yếu của vi khuẩn Xoo Vi khuẩn nhân mật số trong khoảng gian bào của nhu mô và tấn công hệ thống mạch dẫn của cây Một nghiên cứu khác của Mohiuddin và cộng sự (1976) đã phát hiện ra sự xâm nhập của vi khuẩn thông qua vết bệnh gây ra từ tác nhân trung gian là bọ xít (Leptocorsia acuta)
2.1.3 Phân bố nguồn lây nhiễm dịch bệnh
Bệnh bạc lá được ghi nhận đầu tiên tại tỉnh Fukuoka, đảo Kyushu (Nhật Bản) trong giai đoạn 1884-1885 Sau đó bệnh lây lan mạnh vào những năm 1950 trên khắp Nhật Bản (Yamanuki et al., 1962; Tagami và Mizukami, 1962) Sau đó diễn ra liên tiếp các báo cáo có liên quan đến các dấu hiệu bệnh từ các nước láng giềng Nhật Bản như Malaysia, Indonesia (Reitsma và Schure, 1950), Hàn Quốc (Takeuchi, 1930), Đài Loan (Hashioka, 1951), và Campuchia (Nishiyana, 1977) Các báo cáo về bệnh không chỉ gia tăng tại các quốc gia châu Á mà còn bùng nổ sang các nước châu Phi như Mali, Mauritana, Gambia, Burikana, Papua New Guinea, Ghana, Nigeria (Awoderu et al., 1991; Herger et al., 1988) Trường hợp bệnh đầu tiên được công bố tại Mỹ vào năm
1977 (Lozano, 1977) và tại Bắc Úc cũng ghi nhận một số trường hợp nhiễm bệnh tương tự với các công bố quốc tế (Aldrick et al., 1973)
Bệnh bạc lá xảy ra trầm trọng nhất ở các nước Đông Nam Á, đặc biệt là từ việc thúc đẩy các giống lúa lùn năng suất cao (Seneviratne, 1962; Fekain, 1971) Ở Nhật Bản, thiệt hại về năng suất được ghi nhận dao động trong khoảng 25 – 35% và có thời kỳ tăng đến 60% (Ou, 1985) Tại Philippines và Indonesia, mức độ thiệt hại được đánh giá ở mức độ cao (Exconde, 1973) Tại Ấn Độ và Bangladesh, năng suất lúa bị thiệt hại
23 được công bố là 12-32% (Shajahan, 1992) Tương tự ở Đông Ấn Độ với mức độ tổn thất tương ứng với 7 – 62% và trên 80% với các giống lúa có mức độ tương đồng gen
2.2 Sơ lược về vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae
Chi Xanthomonas được phân loại theo Dowson (1939):
Chi Xanthomonas là một tập hợp lớn bao gồm cả chi Xylella Trong đó có sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh cây phổ biến là X fastidiosa với phổ ký chủ rộng Ngoài ra, tập hợp này còn bao gồm các chi Stenotrophomonas và Lysobacter với các lợi khuẩn được sử dụng để kiểm soát sinh học cho cây trồng hiệu quả (Hayward et al., 2010); (Gómez et al., 2015) Theo cơ sở dữ liệu LPSN (cập nhật đến 07/2024), hiện nay ghi nhận được 47 loài được công bố hợp lệ thuộc chi Xanthomonas Hầu hết các loài được xếp vào nhóm vi sinh vật gây bệnh cần được kiểm soát sinh học tốt để tránh các rủi ro về sự xâm nhiễm vào hạt giống, cây con gây ra những tổn thất kinh tế và môi trường
Sự đa dạng và tiến hóa của chi được đánh giá ở mức độ cao gây khó khăn cho việc phân loại (Catara et al., 2021)
2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae
Theo Ishiyama (1922), vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae có hình dạng que ngắn, Gram âm, và không có sự hình thành bào tử Kích thước vi khuẩn trong khoảng 0,5 – 0,8 × 1,0 – 2,0 μm và chiều dài chiên mao trong khoảng 6,2 – 8,1 μm Kích thước vỏch tế bào khi quan sỏt dưới kớnh hiển vi khoảng 0,56 – 0,71 ì 1,25 – 2,16 àm trong đĩa nuụi cấy và 0,44 – 0,51 ì 0,66 – 1,39 àm khi quan sỏt trong tế bào mụ thực vật Nghiên cứu này khá tương đồng với nghiên cứu của Swings và các cộng sự (1990) mụ tả vi khuẩn cú hỡnh dạng que thẳng, kớch thước khoảng 0.5 - 0.8 ì 1.5 - 2.10 àm, cú chiên mao để di chuyển Đôi khi vi khuẩn di chuyển theo cặp hoặc thành nhóm để tăng tính di động trong mao dẫn của thực vật Bên ngoài vi khuẩn là một lớp màng nhầy polysacchrides bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (Yoshimura et al., 1970) (Hình 2.2)
(Hình thái tế bào vi khuẩn Xoo dòng PXO99 dưới kính hiển vi TEM (A) và SEM (B))
X oryzae pv oryzae là vi khuẩn hiếu khí, không sử dụng nitrate và methylene blue, không hóa lỏng gelatin, tiêu hóa sữa bị đông tụ, làm đỏ sữa quỳ và không tạo khí từ đường (Ishiyama, 1922) Nghiên cứu của Mucoo và Isaka (1964) cho thấy sự đối lập về đặc tính sinh lý của các chủng Xoo so với kết quả của Ishiyama Các dòng vi khuẩn phân lập có độc tính mạnh có khả năng hóa đặc gelatin và có khả năng sản sinh hydro sulfide khi phân hủy sữa Kết quả trên tương đồng với các chủng được phân lập tại
Malaysia và Phillipines trong nghiên cứu của (Goto, 1964) Nghiên cứu của Hifni và cộng sự (1975) khảo sát các dòng phân lập tại Đài Loan và Nhật Bản cho thấy các dòng có hình thái khác nhau có khả năng hóa lỏng gelatin cũng khác nhau
Shewakhat và Srivasta (1968) ghi nhận sự khác biệt trong đặc điểm sinh lý của vi khuẩn có ảnh hưởng đến độc tính của một số dòng Do đó việc tìm hiểu cơ chế sinh lý của từng dòng có đóng góp quan trọng đến việc xác định độc tính cũng như cơ chế phòng ngừa phù hợp (Syed et al., 2019)
2.2.3 Phương pháp xác định vi khuẩn Xanthomonas pv oryzae
Phương pháp thử sinh hóa là phương pháp đơn giản, hiệu quả nhằm xác định sự hiện diện các dòng Xoo Di và cộng sự (1991) dựa trên hình thái khuẩn lạc, kích thước khuẩn dưới kính hiển và khảo sát sinh hóa bằng KOH để xác định Gram của vi khuẩn
Muneer và cộng sự (2007) thực hiện hàng loạt khảo sát sinh hóa bằng cách thực hiện phản ứng thủy phân dương tính với tinh bột kết hợp với phương pháp khảo sát oxidase và lecithinase âm tính, sản sinh acid từ nguồn carbon trong môi trường bán đặc Jabeen (2011) thực hiện phản ứng âm tính với khả năng phân giải lòng trắng trứng kết hợp với phương pháp xác định kiểu hình Seema và cộng sự (2018) đã khảo sát thêm
Hình 2.5: Hình thái vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae
25 các đặc tính sinh hóa như phản ứng dương tính với Methyl Red và khả năng sản sinh
(A: Phương pháp kiểm định hóa lỏng gelatin, B: Phương pháp kiểm tra sự sản sinh khí H2S, C: Phương pháp kiểm định phân giải tinh bột,
D: Phương pháp kiểm định Methyl Red)
*Phương pháp sinh học phân tử
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm sinh hóa, Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Công nghệ cao, Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long
Mẫu bệnh bạc lá được thu thập ở giống lúa OM5451 tại Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20℃
Các chủng vi khuẩn BA (Bacillus amyloliquefaciens), BS2 (Bacillus subtilis YJ21), LAB (Lactic Acid Bacteria) và BV2 (Bacillus velezensis) được cung cấp bởi công ty EcoBizNet Inc Korea được bảo quản ở nhiệt độ 4℃.
Phương tiện nghiên cứu
Hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm: Peptone, NaCl, sucrose, glutamic acid, agar, dextrose, KOH 1N, H2O2, EtOH 96%
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Cân phân tích (Shimadzu, Nhật Bản), máy đo pH (Hanna, Romania), nồi khử trùng nhiệt ước (Nhật Bản), tủ cấy, kính hiển vi (EMZ-13TR, Nhật Bản) và một số dụng cụ khác.
Phương pháp nghiên cứu
Hình 3.1: Sơ đồ tóm tắt nội dung thực hiện thí nghiệm
Thu thập mẫu lá bệnh trên cánh đồng
Phân lập và xác định vi khuẩn Xoo dựa trên đặc điểm hình thái Đánh giá các chủng vi khuẩn đối kháng trên hai môi trường PSA và PDA
Thực hiện thí nghiệm
3.4.1 Phương pháp phân lập khuẩn Xoo từ lá lúa có dấu hiệu bệnh bạc lá
Mẫu lá được thu dựa vào mô tả đặc điểm bệnh theo báo cáo của IRRI năm 2020
Tiến hành thu thập khoảng 10 - 12 lá trên ba đối tượng có mức độ bệnh khác nhau bao gồm các lá có màu xanh xám, cuộn lại; các lá có màu vàng rơm và héo toàn bộ lá Các mẫu lá bệnh được rửa sạch và lưu trữ trong các túi bóng kín
*Phương pháp phân lập khuẩn từ lá bệnh:
Mẫu bệnh được tiến hành phân lập theo phương pháp của Wakimoto năm 1955
Cụ thể, mẫu lá bệnh được rửa sạch qua nước máy nhiều lần và lau bằng cồn 96℃ Sau đó ngâm trong Hydrogen peroxide (H2O2) 3% trong 3 phút rồi rửa lại ba lần bằng nước cất đã khử trùng Cắt lá thành những mảnh nhỏ khoảng 3 – 5 cm và nghiền nát trong cối chày sứ Bổ sung 2 mL nước cất khử trùng và hút phần dịch nghiền vào ống 1,5 mL Đợi 5 – 10 phút cho lắng bớt phần cặn Hút 100 μL dịch cho vào ống môi trường bán đặc PSA Ủ mẫu ở nhiệt độ 28℃ trong 1 – 2 ngày Sau thời gian trên, các ống môi trường bán đặc có sự xuất hiện của vòng pellicle (màng màu trắng đục cách bề mặt môi trường trong ống nghiệm khoảng 1 - 2 mm) chứng tỏ có sự xuất hiện của vi khuẩn nội sinh)
Tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trường PSA đặc Dùng kim cấy nhúng xuyên qua lớp vòng pellicle, tiến hành cấy ria vào môi trường đặc PSA, ủ mẫu ở
28 - 30 o C trong vòng 12 - 24 giờ sẽ xuất hiện các dạng khuẩn lạc khác nhau Chọn các khuẩn lạc khác nhau trên đĩa cấy vào các đĩa khác để phân lập Cấy phân lập nhiều lần trên môi trường tương ứng cho đến khi quan sát thấy các khuẩn lạc rời nhau và đồng nhất Dựa vào đặc trưng hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzaenhư dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên, kích thước khoảng 3 – 4 mm, màu trắng sữa hơi vàng hoặc vàng để chọn lọc quan sát dưới kính hiển vi Các mẫu ròng sẽ được cấy vào thạch nghiêng chứa môi trường tương ứng với môi trường phân lập và xem như một dòng (isolate)
3.4.2 Đánh giá sự phát triển của một số VSV có lợi trên môi trường PSA và môi trường PDA
Mục tiêu: Quan sát và ghi nhận đường kính của khuẩn để chọn ra môi trường nuôi cấy tối ưu nhất
Tiến hành: Thí nghiệm bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại
(Bảng 3.1) 100 μL dịch vi khuẩn pha loãng 10 -6 CFU/ mL được cấy trải sang 2 môi trường dinh dưỡng PSA và PDA Sử dụng nước cất khử trùng làm đối chứng (-) Đo đường kính khuẩn 1 NSKC, 7 NSKC và 10 NSKC để đánh giá khả năng phát triển của khuẩn
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm đánh giá sự phát triển của VSV đối kháng
Số liệu được ghi nhận ở phần mềm Microsoft Excel 2013 và phân tích thống kê One-way ANOVA bằng phần mềm Minitab 22 Số liệu được trình bày dưới dạng MEAN + SE Các giá trị trung bình được kiểm định bằng phép thử Tukey để kiểm tra sự khác biệt ở mức ý nghĩa thống kê 5%
Môi trường Thí nghiệm Lặp lại
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả thu thập từ 12 mẫu lá lúa cho thấy các đặc điểm hình thái bệnh bên ngoài tương tự với các mô tả của IRRI (2020) (Hình 4.1) Một số lá thu được có màu vàng bạc ở phần ngọn trên Một số lá xuất hiện lằn vàng lan dài đến tận cuống lá Số còn lại lá cong, héo, và có màu vàng xuất hiện bên trong cả gân lá Các mẫu lá bệnh được xử lý nhanh qua cồn để loại bỏ các chủng vi khuẩn ngoại sinh Sau đó tiến hành quy trình phân lập khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae Sau 24 giờ phân lập, các ống môi trường bán đặc xuất hiện vòng pellicle với kích thước khoảng 0.3 cm Kết quả thu được có 5 chủng vi khuẩn có hình thái, màu sắc và đặc điểm khuẩn lạc khác nhau Tiến hành tách ròng từng khuẩn lạc và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại là 100X Từ 5 chủng vi khuẩn phân lập, kết quả dưới kính hiển vi xác định được một chủng vi khuẩn có hình thái tương tự với miêu tả của (Chen et al., 2019) Vi khuẩn quan sát có hình que dài, cú đuụi, kớch thước khuẩn được ghi nhận khoảng 0.5 ì 1.2 àm Kết quả này phự hợp với mô tả của Ishiyama (1922) về hình thái quan sát của khuẩn Xoo dưới kính hiển vi Đường kính khuẩn lạc được ghi nhận khoảng 0.8 cm, trơn láng, bìa tròn, màu trắng sữa hơi vàng và nổi trên mặt môi trường PDA Kết quả này phù hợp với mô tả trong nghiên cứu của (Tita et al., 2023) Từ kết quả về đặc tính khuẩn lạc và hình thái khuẩn dưới kính hiển vi có thể xác định được một chủng trong số năm chủng phân lập là vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xanthomonas oryzae pv oryzae (ký hiệu là BL3)
(A): Cây lúa có các triệu chứng bệnh bạc lá (B): Các mẫu lá lúa với các mức độ và hình thái bệnh khác nhau
Hình 4.5: Mẫu lúa có triệu chứng bạc lá
Hình 4.6: Vòng pellet xuất hiện sau 24h phân lập
Hình 4.7: Hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn BL3 dưới kính hiển vi
(A): Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn BL3
(B): Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X
4.2 Kết quả đánh giá sự phát triển của một số VSV có lợi trên môi trường PSA và môi trường PDA
Kết quả đánh giá sự phát triển của các vi sinh vật có lợi trên 2 môi trường PSA và PDA được trình bày tại Hình 4.4 Kết quả cho thấy đường kính phát triển của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens phát triển tốt hơn ở môi trường PSA khi chỉ sau 1 ngày cấy đường kính ghi nhận được là 7,15 + 0,43 cmvà phát triển mạnh nhất sau 10 ngày sau khi cấy tại cả hai môi trường PSA và PDA lần lượt là 8,73 + 0,05 cm và 8,87 + 0,08 cm Vi khuẩn Bacillus velezensis thuộc cùng nhóm với vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens Kết quả ghi nhận lại cho thấy khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn Bacillus velezensis yếu hơn vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sau 24 giờ nuôi cấy khi đường kính ghi nhận được ở cả hai môi trường PSA và PDA lần lượt là 3,55 + 0,95 cm và 1,32 + 0,42 cm Vi khuẩn sinh trưởng mạnh sau 7 ngày nuôi cấy trở đi ở cả hai môi trường PSA là PDA lần lượt là 8,93 + 0,06cm và 8,53 + 0,13 cm
Vi khuẩn Bacillus subtilis YJ21 sinh trưởng tốt ở môi trường PSA sau 24 giờ nuôi cấy với đường kính ghi nhận là 4,92 + 0,91 cm Sự tăng sinh của B subtilis sau 7 ngày sau khi cấy có đường kính ghi nhận ở môi trường là PSA và PDA lần lượt là 8,61 + 0,34 cmvà 8,23 + 1,08 cm So với ba chủng còn lại, vi khuẩn lactic lacid lại phát triển khá chậm khi sau 24 giờ cấy đường kính ghi nhận được ở môi trường PSA và PDA là 1,40 + 0,70cm và 0,27 + 0,46 cm Vi khuẩn tăng sinh đạt cực đại sau 10 ngày sau khi cấy với đường kính ghi nhận ở môi trường PSA và PDA là 8,56 + 0,43 cm và 5,47 + 0,43 cm Nghiên cứu của Keddari và cộng sự (2021) đã chứng minh vi khuẩn
LAB có khả năng tiêu thụ fructose hơn đường dextrose Do vậy, vi khuẩn LAB có khả năng sinh trưởng mạnh hơn ở môi trường PSA do có sử dụng đường lactose so với môi trường sử dụng đường dextrose PDA Như vậy, vi khuẩn BV2, BS2 và LAB có khả năng sinh trưởng ở môi trường PSA tốt hơn so với môi trường PDA Trong khi đó, vi khuẩn
BA tăng sinh mạnh ở môi trường chứa dextrose chỉ sau 1 NSKC
Hình 4.8: Biểu đồ đường kính tăng trưởng của vi khuẩn có lợi trên 2 môi trường
BA BV2 BS2 LAB Đường kính (Cm)
Vi khuẩn Đường kính tăng trưởng của vi khuẩn có lợi trên môi trường PSA
BA BV2 BS2 LAB Đường kính (Cm)
Vi khuẩn Đường kính tăng trưởng của vi khuẩn có lợi trên môi trường PDA
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Dựa vào kết quả hình thái khuẩn lạc và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi đã xác định được 1 chủng vi khuẩn trong 5 chủng phân lập được lúa bệnh bạc lá có khả năng là Xanthomonas oryzae pv oryzae
Kết quả đánh giá sự tăng trưởng của các vi sinh vật có lợi cho thấy cả 4 chủng vi khuẩn đều có khả năng thích nghi và sinh trưởng tốt trên cả 2 môi trường PDA và PSA
Bacillus amyloliquefaciens tăng sinh tốt trên môi trường PDA trong khi đó chủng Bacillus velezensis, Bacillus subtilis và vi khuẩn lactic acid lại phát triển tốt hơn ở môi trường PSA
5.2 Kiến nghị Định danh vi khuẩn BL3 bằng chỉ thị phân tử nhằm tăng khả năng nhận diện chính xác vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae Đánh giá sự tăng trưởng của 4 chủng vi khuẩn có lợi trong các điều kiện khác như pH, nhiệt độ
Khảo sát khả năng đối kháng của 4 chủng vi khuẩn đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae
