Ảnh hưởng của znci2 lên sinh lí phát triển và mức Độ phiên mã các gen kháng oxi hóa của phôi Ấu trùng cá ngựa vằn danio rerio hamilton 1822

bảo, Ở thể giới đã có nhiều nhiên cứu về lĩnh vực này, tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có tác giả nào công bỗ nghiên cứu ảnh hưởng của ZnCl, lên phôi cũng như ấu trùng cá Ngựa vẫn ở cả mức

„ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

'TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

Artis

BAO CAO TONG KET _ 4

ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG

TÊN ĐÈ TÀI:

ANH HUONG CUA ZnCl; LEN SINH Li PHAT TRIEN VA MUC DO PHIEN MA CAC GEN

KHANG OXI HOA CUA PHOI, AU TRUNG

cA NGUA VAN - Danio rerio (Hamilton, 1822)

Ma sé: CS.2017.19.20

ThS NGUYEN THI HANG

Tp Hồ Chi Minh, thing 12/2018

TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

¬ BAO CAO TONG KET _ ;

DE TAI KHOA HQC VA CONG NGHE CAP TRUONG

TEN DE TAI:

ANH HUONG CUA ZnCl, LEN SINH Li PHAT TRIEN VA MUC DO PHIEN MA CAC GEN KHÁNG OXI HÓA CỦA PHÔI, ÁU TRÙNG

CÁ NGUA VAN - Danio rerio (Hamilton, 1822)

Ma sé: CS.2017.19.20

XAC NHAN CO QUAN CHU TRÌ CHU NHIEM DE TAL

‘Tp HO Chi Minh, 12/2018

ThS Lê Thị Tường Vi Cựu học viên cao học K24 Trường

HCM

ThS Doan Lé Minh Giáo viên môn Sinh Trường trung

Tân Uyên, Bình Dương

3 NOI DUNG NGHIÊN CUU

4 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

5 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

6, SAN PHAM CUA DE TAI

1.1 NHỮNG NGHIEN CUU VE ANH HUONG CUA KẼM LÊN CÁ NGỰA VĂN .4

1.2.7 Ảnh hưởng của kẽm lên động vật thủy sinh - cá

1.3.2 Đặc điểm sinh học của cá ngựa vẫn

1.3.3 Vòng đời và sự phát triển của cá ngựa vải

1.4 CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN STRESS OXI HÓA DÙNG TRONG ĐÈ TẢI 1.4.1 Stress oxi héa

1.4.2 Các gen liên quan đến stress oxi hóa sử dụng trong để tài

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Keesesrerrsrrerrrrsreserre 22 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIÊM THÍ NGHỊ

2.2 VẶT LIỆU VÀ HOA CHAT SU DUNG

2.4.3 Thu phôi vả gây nhiễm ZnCI; cho phôi

3.2.4 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của ZnCl; lên một số đặc điểm sinh lí

2.4.6.2 Tinh mức độ biểu hiện của các gen mục tiểu

tương 3, KẾT QUÁ VÀ BẢN LUẬN, sssxssseseeeerreserrresrrrrsrrrresrress 3Ø

3.1 ẢNH HƯỚNG CỦA ZaCl;› LÊN SINH LÍ, PHÁT TRIEN Ở PHOI VA AU

3.1.1 Ảnh hưởng đến giai đoạn phôi

3.1.1.1 Ảnh hưởng lên sức sống

3.1.1.2 Số cá thể dị tật

3.1.1.3, Ảnh hưởng lên nhịp tim

3.1.1.4 Ảnh hưởng của ZnCl› lên hoạt động nở của phôi

Ảnh hưởng đến giai đoạn ấu trùng

3.1.2.1 Ảnh hưởng lên sức sống

3.1.2.3 Ảnh hưởng đến nhịp tim

3.1.2.4 Ảnh hưởng đến chiều dài

3.2 ẢNH HƯỚNG CỦA ZnCl› LÊN MỨC ĐỘ BIÊU HIỆN MỘT SÓ GEN KHÁNG OXI HÓA Ở MỨC PHIÊN MÃ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các dụng cụ và thiết bị sử dụng để khảo sát các đặc điểm sinh lí

Bảng 2.2 Các dụng cụ và thiết bị sử dụng để việc định lượng tương đối mức độ bi

Bảng 2.4 Các thông số p

Bang 2.5 Chương trinh PCR

Bang 3.1 Tỉ lệ nở của phôi qua các móc tl

gian tại các nồng d6 ZnCl, khao si

Bảng 3.2 Chiều đài của ấu trùng qua ngày nuôi tại các nông độ ZnCl› (mm)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hinh 1.2 Giai đoạn phân cắt (X20)

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thẻ

Hình 2.2 Xác định chiéu dai du trùng dưới kính hiển vi (1X)

‘Tom tắt các bước tách RNA tổng số bằng Rneasy Mini Kit [65 Hình thái phôi cá Ngựa vẫn quan sát dưới kính hiễn vi soi nỗi (SX)

Hình 3.2 Biểu đỏ thẻ tỉ lệ sống trung bình của phôi tại các nồng độ khảo sát

Hình 3.3 Biểu đỗ thể hiện tỉ lệ sống của phôi theo từng giai đoạn tại các nồng độ

ZnCl, Khao sat

Hình 3.4 Một số hình ảnh về dị tật ở giai đoạn phôi _

Hình 3.5 Biểu đỏ thể hiện nhịp tỉ lai ủ 4I

.6 Đỗ thị thể hiện nhịp tìm tại các mốc thời gian của phôi trong từng nồng độ

ZnCl,

Hình 3.7 Tỉ lệ sống chung của ấu trùng qua 7 ngày tại các nồng độ khảo sát

Hình 3.8 Đỗ thị thể hiện tỉ lệ sống của ấu trùng tại các nồng độ ZnC]› khảo sát theo

thời gian gây nhiễm

Hình 3.9 Một số dị tật của ấu trùng cả ngựa vẫn thu được trong thí nghiệm

Tỉ lệ đị tật trung bình (%) của ấu trùng tại các nỗng độ khảo sát qua các

mốc thời gian gây nhiễm

Hình 3.11 Đỗ thị thể hiện nhịp tìm của ấu trùng từ ngày 1 đến ngày 7 tại các nồng độ

Hình 3.12 Đồ thị thể hiện nhịp tim của ấu trùng qua các ngảy trong từng nồng độ

ZnCl; khảo sắt

Hình 3.13 Biểu đồ thể

kháng oxi hóa ở phôi vả ấu trùng cá ngựa vẫn

ện thay đổi mức độ phiên mã của các gen liên quan

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction Superoxide dismutase

‘Tumor necrosis factor (yéu t6 hoai tir khdi u)

‘Times gravity (Lan trong lye)

TOM TAT KET QUÁ NGHIÊN CỨU

“Ảnh hưởng của ZnCl; lên sinh lí phát triển và mức độ phiên mã các gen

Kháng oxi hóa của phôi, ấu trùng cá ngựa vẫn - Danio rerio (Hamilton, 1822)"

Kim loại nặng (chỉ, asen, kềm ) tích tụ trong tế bào sẽ cảm ứng các quá trình

sản sinh các chất chứa oxi hoạt động (ROS) gây hại cho cấu trúc tế bảo Để bảo vệ

tế bảo, các gen kháng oxi hóa nhur Cat, SOD sé ving biéu hiện nhằm tạo c; protein

tương ứng chuyển hóa các ROS thành dạng không gây hại Nghiên cứu nảy được

được tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ ZnCl; lên sức sống của

phôi vả ấu trùng cũng như sự biểu hiện của một số gen kháng oxi hỏa (Caf, H1sp70,

gây nhiễm với ZnCl› ở 09 nông độ (0.5; l; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 50 mg/L) va 16

đoạn (phôi vị, phân đốt, hẳu họng và nở) về các đặc điểm sinh lí: sức sống của phôi,

nhịp tìm vả hoạt động nở Đánh giả sự phát triển của ấu trùng liên tục sau mỗi 24

giờ, kế từ mốc thời gian 72 hpf (ngảy thứ nhất - Ð,) đến ngày hết ngày thứ bảy (D;),

nhịp tim, đị tật vả chiều đải Kết quả cho thấy:

Tỉ lệ sống của phôi cao (> 68%) ở tất cả các nồng độ và chưa có mối liên hệ

giữa tỉ lệ phôi sống vả nông độ gây nhiễm: từ nông độ 0,5 -2,5 mg/L làm tăng nhịp

tim; từ nồng độ 5 ~ 50 mg/L làm giảm nhịp tim; dị tật xuất hiện ngẫu nhiên; nồng

độ ZnCl; cảng tăng cảng làm giảm tỉ lệ nở và làm chậm nở phôi

Tỉ lệ sống ở ấu trùng bị ảnh hưởng bởi ZnCl› đáng kể từ nông độ 20 mg/L

ZnCl; lam du tring chét hang loat va day được xem là ngưỡng gây chết LCs¿ đối

với ấu trùng ở ngảy thứ 6; từ nồng độ 2.5 mg/L trở lên số ấu trùng dị tật tăng theo

nông độ 0,5 — 5 mg/L, sau đó nhịp tìm giảm theo thời gian và theo sự tăng dẫn của

nồng độ ZnCl;: chiéu dai ấu trùng giảm theo sự tăng dẫn của nông độ ZnCl; từ nông

độ 20 ~ 50 mạ/L kế từ này thử 2 gây nhiễm

Kết quả thực hiện RT-qPCR các gen Cat, Hsp70, Mt2, Cu/Zn-SOD cho thay &

ự biểu hiện các gen kháng oxi hóa ở lô thí nghiệm có xu hướng tăng so với lô đối chứng, trong khi đó ở giai đoạn ấu trùng, mức độ biểu hiện các gen nảy có xu hướng giảm

SUMMARY

"The effects of zine chloride (ZnCl) exposure on developmental biology and

the expression of antioxidant genes transcription on embryo, larvae in

zebrafish (Danio rerio - Hamilton, 1822)"

Heavy metals (lead, arsenic, zinc ) accumulated in the cell will induce the

production of highly reactive oxygen chemical species (ROS) which can damage

cell structures To protect the cell, antioxidant genes such as Cat, CwZn-SOD which

are usually effective in blocking harmful effects of ROS will be highly expressed

This study aims to evaluate the effects of zinc chloride (ZnC12) concentrations on

vitality and the expression of antioxidant genes Cat, Hsp70, Mt2, Cu/Zn-SOD in

exposed to ZnCl, in the examined concentrations (0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40;

50 mg/L) in the E3 embryonic medium, The embryos were examinated at 4 different stages of development (gastrula, segmentation, pharyngula and hatching):

vitality, heartbeat, hatching The development of larvae had been evaluated every

24 hours in 7 days since the day of hatching (D1) The result showed that:

‘The survival rate of embryos quite high (> 68%) and there was no relationship

with the concentrations of ZnCl›, the heartbeat increased in 0.5 — 2.5 mg/L and not cause malformation; with the increasing of examined concentrations, the hatching rate decreased and hatching delayed

‘The survival rate of larvae was affected by ZnCl:, The ZnCl; concentration of

20 mg/L (considered as LC50) or higher caused the death of larvae on the day 6;

from 2.5 to 50 mg/L concentrations of ZnCl,, the malformation of larvae increased

when the concentration increased in second day upwards; the heartbeat increased in concentration of ZnCl, and the less time were; in 20 — 50 mg/L concentrations of

ZnCl, and in second day upwards exposured to concentrations of ZnCl, the length

of larvae decreased with the increasing of examined concentrations The RT-qPCR showed that in the embryo stage, the expression of antioxidant genes (Cat, Hsp70, Mt2, Cu/Zn-SOD) tend to increase while it tend to decrease in

the larvae stage

PHAN MO DAU

1 TINH CAP THIET CUA DE TAL

Trong những năm gắn đây, ö nhiễm môi trường sinh thái và sức khỏe con người do các kim loại nặng gây ra đang ngày cảng được quan tâm Các kim loại nặng từ ngành công nghiệp, kĩ thuật, nông nghiệp, dược phẩm và thậm chí cá nguồn

dần Các kim loại nặng cẳn thiết cho các quá trình sinh học diễn ra trong cơ thể sinh

độc hại Các sinh vật thủy sinh sống trong môi trường ô nhiễm kim loại nặng đều có

điều này góp phần dẫn tởi những ảnh hướng lớn đến sức khỏe con người Kẽm (Zn) là một nguyên tổ vĩ lượng cần thiết để duy trì sự sống của tế bảo Kẽm déng vai trỏ quan trọng trong các quả trình sinh học như: các hoạt động của

ra, kẽm cỏn có nhiều vai trò quan trọng trong quả trình chuyển hỏa RNA vả DNA,

quá mức cho phép sẽ gây độc cho cơ thẻ sinh vật Một số nghiên cứu cho thấy độc

chết, lâm giảm tí lệ nở của phôi, gây dị tật ở phôi [1] [4] [5], [6] Những thay đổi

số công bố; Zhu et al, 2009; Bai et al, 2010: Melek Kũcukoglu et al, 2013; Brun et

al, 2014 (1), (4), [5] (7]-

Trong tế bảo ở sinh vật, sự dao động kẽm được điều hòa chủ yếu bằng cách kẽm gắn kết với metallothioneins (MT) Khi kẽm tích tụ nhiều trong tế bảo sẽ cảm

ứng các quá trình sản sinh các chất chứa oxi hoạt động (ROS- Reactive oxygen

gen kháng oxi hóa như Cư, SƠD sẽ tăng biểu hiện nhằm tạo các protein tương ửng chuyển hóa các ROS thành dạng không gây hại Sự cam img ROS kich thích các đáp ứng stress oxi hóa đã trở thành mô hình được chấp nhận phỏ biến đối với tế

bảo, Ở thế giới đã cỏ nhiều nhiên cứu về lĩnh vực này, tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa

cá Ngựa vẫn ở cá mức độ cơ thê và mức độ phân tứ một cách tông thể

Việc khảo sát độc tính của kim loại nặng trong giai đoạn đầu của cả rất quan

trọng để đánh giá khả năng tổn tại, sinh trướng và phát triển trong môi trường ô

nhiễm và là cơ sở để xác định các chỉ tiêu chất lượng nước Đặc biệt khi nghiên cứu

những hậu quả do ô nhiễm kim lại nặng gây ra đối với các động vật thủy sinh Trên cơ sở đó, để tài “Ảnh hưởng của ZmnCl; lên sinh lí phát triển và mức

độ phiên mã các gen kháng oxi hóa của phôi, ấu trùng cá ngựa vẫn - Danio

rerio (Hamilton, 1822)" được tiền hành

2 MỤC TIÊU ĐÈ TÀI

Dánh giá sự ảnh hưởng của ZnCl; lên sinh lí phát triển của phôi và ấu trùng

cả ngựa vẫn; đồng thời đánh giá sự biểu hiện của một số gen kháng oxi hóa ở mức phiên mã lên sự phát triển của hai giai đoạn nảy,

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Y Khao sit ánh hưởng của ZnCl; lên một số đặc điểm sinh lí, phát triển của phôi

và ấu trùng cá ngựa vẫn;

Y Khao sat anh hưởng của ZnCl; lên sự biểu hiện của một số gen kháng oxi hóa

ở giai đoạn phôi vả ấu trùng cá ngựa vẫn ở mức phiên mã

4, ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

* Phôi cá ngựa vẫn ở các giai đoạn khác nhau sau khi thy tinh: giai đoạn phôi nang, phôi vị, giai đoạn phân đốt, giai đoạn hình thành hẳu họng và giai đoạn

nở (thoát nang);

* Âu trùng cá ngựa vẫn sau khi nở cho đến khi đạt 7 ngày tuôi

5 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

* _ Các giai đoạn phát triển của cá ngựa vẫn: từ giai đoạn phôi đến giai đoạn cá

ấu trùng 7 ngảy tuổi;

*_ Gây nhiễm ZnCl; cho phôi cá ở 9 nồng độ (0,5: l; mg/L) va lô đối chứng (0 mg/L):

trong các nghiệm thức để phân tích mức độ biểu hiện gen

độ ảnh hưởng nhiều nhất (còn lượng mẫu đủ đề

6 SAN PHAM CUA DE TAL

Kết quả đào tạo

01 cứ nhân

Đảo My Ly, dé tai "Khảo sát ánh hưởng của kẽm clorua lên sự biểu hiện gen

2016

Ø1 Thạc sĩ

Lê Thị Tưởng Vi, đề tải “Kháo sát ánh hưởng của kẽm clorua lên một số đặc

điểm sinh li va sy biểu hiện gen kháng oxi hóa ở phôi và ấu trùng cá ngựa vẫn -

Hỗ Chí Minh

Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố

Có I bải báo khoa học đăng trong kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2018: "Ảnh hưởng của ZnCl; lên sức sống và sự biểu hiện một số gen kháng

oxi hóa ở phôi vị

CHƯƠNG I TÔNG QUAN

1.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VÈ ẢNH HƯỚNG CỦA KẼM LÊN CÁ NGỰA

VĂN

1.1.1 Trên thế giới

Ca ngựa vần là đối tượng đà được các nhả khoa học trên thể giới dùng làm mô

hình nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phát triển, di truyền học, tế bảo gốc, y học

xem lả một mô hình động vật xương sống nổi bật dùng cho những nghiên cứu về ảnh hưởng của kim loại nặng (As, Cu, Fe, Zn, Cd, Pb ) đối với cơ thể sinh vật Tuy nhiên, các nghiên cửu về ảnh hưởng của ZnCl; nói riêng và của kẽm nói chung

kết quả cụ thể như sau:

Rougier et al (1996) đã đánh giả ảnh hưởng của Kẽm (các nồng độ 0.05; 0,15

va 0,25 mẹ/L) lên cá ngựa vằn, Kết quả cho thấy, tại nồng độ 0,25 mẹg/L, một lượng nhỏ Kẽm đã tích tụ trong thận của cả [10]

Xiaoshan Zhu et al (2008) đã xác định được giá trị LC« (Lethal Concentration 50: nồng độ gây chết 50% động vật thi nghiệm) đối với ấu trùng cá ngựa vẫn khi bị

1,550 mg/L sau 96 gid thy tinh; ECs (Effective Concentration 50: ndng dovliéu lượng chất độc gây ra các ảnh hưởng sinh học khác nhau cho 50% đối tượng thí

mg/L Dac biệt, công trình nghiên cứu đã chứng minh được dịch huyển phủ chứa

trùng, làm giảm tỉ lệ sống vả nở của phôi, gây tổn thương mô [1] Wei et al (2010) cho thấy tác động của ZnO (cdc nong dé tir | - 25 mg/L) lam giảm chiều dài cơ thể của phôi cá ngựa vẫn và xuất hiện đị tật ở phần sau đuôi [5] Xiong et al (2011) nghiên cửu về độ độc cấp tỉnh và tác động oxi hỏa của nano-ZnO, nano-TiO2 và ZnO lên cá ngựa vẫn Độ độc cấp tính của nano-ZnO,

ZnO và dung dịch chứa ion Zn”" tương ứng tại 96 hpf li 4.92; 3,31 va 8,06 mg/L

Khi tiếp xúc với 5 mg/L nano-ZnO va ZnO trong dich huyền phù, cho thấy kích

hoạt sự oxi hóa trong mang cá mà không gây tổn thương (mắt cân bằng) quá trình oxi hỏa Tại gan, những ảnh hưởng do oxi hỏa thể hiện mạnh hơn [12] Melek Kiigiikoglu et al (2013) đã kháo sát độc tính của kèm trên phôi cá ngựa vẫn, Kết quá nhận thấy ở nồng độ lớn hơn 0.5 mg/L Kẽm gây tt phôi, đồng thời khẳng định phôi cá ngựa vẫn là đối tượng tốt để đánh giá nguy cơ gây hại của hóa chất lên sinh vật thủy sinh [7]

Chen et al (2014) cho ring khi phôi cá ngựa vẫn tiếp xúc với dung dich nude nổi chứa Zn”" hòa tan tại các nỗng độ 0,5; 1; 5 và 10 mg/L sé lim cho tỉ lệ nở của

tử vong hoặc đị tật ở ấu trùng [13]

Brun ct al (2014) đã so sánh ảnh hưởng của các hạt ZnO (nZnO) và Zn”' (từ ZnCI;) trên phôi và ấu trùng cá ngựa vẫn Phối được tiếp xúc với nZnO (0.2; 1,0 và

độ 0.1; 0,2 và 2,2 mg/L đến 168 hpf Kết quả bước đầu cho thấy có mối liên hệ giữa

sự giải phóng kẽm tử nZnO và ZnŸ khi kết hợp vào mô; chứng mình vai trò chủ đạo

cứu của nhóm đã cho thấy sự thay đổi cảm ứng phiên mã của gen Metallothionein

(MT2) ở phôi và ấu trùng tại tắt cả nỗng độ khảo sát Sự phiên ma cua gen Car va

CwZn-SOD liên quan đến stress oxi hóa, gen IL-/f và TNZz liên quan đến phản ứng tiễn viêm cũng bị thay đổi [I]

Shabnam Ansari et al (2015) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá độc tính của kim loại nặng lên giai đoạn sớm của cá ngựa vẫn thông qua chỉ số LC4o tại những

thấy độc tính phụ thuộc vào nồng độ và thời gian phơi nhiễm Nhóm nghiên cứu cũng quan sát thấy sự nhạy cảm với kim loại của ấu trùng cao hơn so với phôi [14] Salvaggio et al (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ZnCl; lên sự phát triển xương của ấu trùng cả ngựa vẫn và đã cỏ những quan sát ban đầu cho thấy xuất hiện

đị tật xương ở nông độ nhiễm cao (> 25 mg/L) Đồng thời nghiên cứu này cũng cho

và vây, chứng minh được các khuyết tật xáy ra trong tăng trưởng của cá khi gây

vẫn khi tiếp xúc với nZnO va Zn’ tir ZnCl, tai các nỗng độ 0, 1, 5, 10, 20, 40 vả 70

mg/L dén 96 hpf li 21,37 + 1,81 va 4,66 + 0,11 mg/L, tong img, tỉ lệ sống của ấu

nhỏm tác giá cũng cho rằng các đứt gãy DNA trong tế bảo ấu trùng sau 96 hpf khi

các gen liên quan đến stress (p53, rađŠ/ và m2) ở ấu trùng còn phức tạp vả không

liên quan trực tiếp đến nông độ của nZnO và Zn, mặc dù sự cảm ứng có khác biệt

thống kê ở gen z2 nghiệm thức so với đổi chứng: khi gây nhiễm với nZnO (6

mt2 cao gip 20,5 + 1,9 lần so với đối chứng Nhóm tác giả nảy cho rằng tính độc cỏ

cứu khác của Choi et al (2016) cho thấy độc tính của các hạt nano ZnO khi cho phối

cá ngựa vẫn tiếp xúc với các hạt nano ZnO (ZnO NPs) tai các nông độ 0.01; 0,1, 1

và 10 mg/L trong 96 hpf cũng tương tự khi cho tiếp xúc với ZnSO¿: phù nề mảng

lần sau khi tiếp xúc với ZnO NPs (498 gen tăng điều hỏa và 191 gen giảm điều hòa); có 6 gen (aicda, eybSdl, edar, intl2, ogfrl2 and rmftf13B) liên quan đến dị tật

và hệ miễn dịch đáp ứng đặc hiệu với ZnO NPs Nhỏm nảy cho rằng, ZnO NPs có

the anh hướng đến các gen liên quan đến các dị tật và hệ miễn dịch, từ đó lảm mủ

màng bao tìm vả phù khối noăn hoảng trong các giai đoạn phát triển của phôi“ẫu trùng [16]

Kteerba et al (2017) nghiên cứu độc tính của ZnO NPs lên phôi cá ngựa vẫn Khi cho phôi tiếp xúc với ZnO NPs tại nông độ 50 ppm (50 mg/L) không có phôi

phôi (mỗi nồng độ) tiếp xúc với Zn” tại nồng độ 5 và 0,5 ppm trong 72 hpf, kết quá

nhóm nghiên cứu này một lần nữa chứng minh độc tính của ZnO NPs lên sự phát

ảnh hướng của ZnO NPs lên sự phát triển cá ngựa vẫn Kết quả cho thấy ZnO NPs gây độc đến sự phát triển tế bảo thần kinh [18]

Sarasamma et al (2018) tiến hảnh cho cá ngựa vẫn trưởng thành tiếp xúc cấp

tính (24, 48, 72 và 96 giờ) và mãn tính (21 ngày) với ZnCl; ở các nỗng độ thấp (0.1;

nhở ngắn hạn, cỏ tính cảm ứng đảng kể đối với các chỉ số stress oxi hóa (ROS)

xem là mô hình có tiềm năng cho việc nghiên cứu các bệnh về Alzheimer (Alzheimer’s Disease) [19]

1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, số lượng các công trình nghiên cứu về cá ngựa vẫn còn rất ít,

điều này thể hiện qua số lượng các bải báo đăng trên các tạp chí khoa học lớn, có uy

tín Tuy nhiên, những công trình được nghiên cứu vả công bổ đã tao nén tảng cơ

“Trong số đó, có thể kể đến một vài công trình như:

Năm 2009, Lê Thanh Long va es céng bé da chuyén gene phat sing gpf tir sửa cho củ ngựa vẫn thành công bằng kĩ thuật bắn gene với khoảng cách 6, 9, 12 em [20]

Năm 2011, Nguyễn Thị Hạnh Tiên nhận thấy cá ngựa vẫn khi nuôi ở 32°C bị

dj tật ở các đốt sống phần trước đầu xương cột sống, trong khi cá nuôi ở các nhiệt

trình nối các đốt sống vả tao dj tat trên cá ngựa vẫn [21]

Nam 2012-2018, Nguyễn Thị Thương Huyền củng cs đã tiến hành nghiên cứu nhằm đảnh giá tác động của cadmium, chỉ, kèm, asen lên quá trình phát triển phôi

độ cơ thẻ, cơ quan vả tế bảo; chưa có nghiên cứu nào thực hiện đến mức độ phân tử [22] [23] 24] (25] [26] [28], [29], [30]

Tom lại, việc nghiên cứu về ảnh hướng của kẽm (ZnO, nano-ZnO, ZnCl; lên sự phát triển của cả ngựa vẫn đã được nhiều nhả khoa học trên thế giới thực

hiện Trong khi đó ở Việt Nam, các công trinh nghiên cứu về kẽm chủ yếu tập trung

ở phương diện hóa lí, chưa có nghiên cứu nảo để cập đến ảnh hưởng cúa ZnCl; lên

sự sinh trưởng và hoạt động sinh lí của động vật, đặc biệt là động vật thủy sinh

Vi vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với quy mô phòng thí nghiệm nhằm khảo sắt độc tính của ZnCl; lên sự phát triển của cá ngựa vẫn ở hai giai đoạn (phôi va du

tải sẽ mở ra một hưởng nghiên cứu ở mức độ phân tử, từ đỏ làm cơ sở, tư liệu cho

các nghiên cửu lên các động vật thủy sinh khi sống trong môi trường bị ö nhiễm các

kim loại nặng Đặc biệt khi nghiên cứu đến mức phân tử sẽ làm cơ sở cho việc tìm

ra đổi với các động vật thủy sinh Đồng thời kết quá của để tài cũng có thể ứng

Nhiệt đới, Viện thủy sản II

1.2, TONG QUAN VE KIM LOALKEM

1.2.1 Đặc tính lí hóa của kẽm:

Trong bảng hệ thống tuần hoàn, kẽm kí hiệu là Zn, khối lượng nguyên tử 65,39 đvC (đơn vị Carbon), số hiệu nguyên tử 30, nhiệt độ nóng chảy 419,53°C

Kẽm tự nhiên có 5 đồng vị ôn định, 25 đồng vị không ồn định và các đồng phân

Kẽm là kim loại sáng, cỏ màu trắng xanh Kẽm là kim loại dẫn điện, giỏn ở nhiệt độ

hợp kim với các kim loại khác nhau [31]

Về tính chất hóa học, kèm là kim loại hoạt động, có tính khử mạnh (hơn sả), tác dụng trực tiếp với oxi, lưu huỷnh khi đun nỏng va tic dụng được với các dung dịch acid, kiểm hoặc muối [31]

1.2.2 Kém trong tự nhiên

“Trong tự nhiên, kẽm là nguyên tổ tương đối phố biển, chiếm khoáng 0,0075% trữ lượng trong vỏ Trái Đất, Năm 2017, tông lượng kẽm trên thể giới ước tỉnh

Smitsonit (ZnCO;), Zincit (ZnO), Calamin (kém sillicate), Franklinite (oxide sit,

Kẽm cỏn có một lượng đáng kể trong cơ thể thực vật và động vật, Các mỏ kẽm có

khắp thể giới nhưng những nước có mỏ kẽm lớn là Canada, Australia, Nhật, Đức, Hoa kỳ, Trung Quốc [31] (32), [33]

1.2.3 Kẽm trong công nghiệp

Kẽm được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghiệp Một lượng lớn kẽm được sử dụng để sản xuất khuôn đúc, được sử dụng rộng rãi bởi các ngảnh công,

như một sắc tổ trắng trong sơn, làm chất xúc tác trong sản xuất cao su để giải phóng

phẩm, dược phẩm, mực in, đệt may, thiết bị điện và các sản phẩm khác [32] Kẽm

cũng được sử dụng để mạ kim loại, giúp chủng không bị ăn mỏn Kẽm sunfua (ZnS)

tivi và các chat phat sing [32], [34]

1.2.4 Vai trò của kẽm

Kẽm là một nguyên tố vi lượng thiết yếu cho con người, các động vật, thực vật

va vi sinh vat [35-37] Kẽm là nguyên tố phỏ biến thứ hai ở người sau sắt và nó là

của hơn 300 enzyme và 1000 yếu tố phiên mã [36] Hàm lượng kẽm trong tế bảo có

protein cũng như tông hợp hoặc phân hủy nucleic acid [38] Kẽm có vai trò trong sự

cần thêm 50% thức ăn đẻ đạt được thẻ trọng như một cơ thê được cung cấp đây đủ kẽm [34)

G người, vai trò sinh học của kèm rất phổ biến Kẽm có vai trỏ trong quả trình

chuyên hóa RNA và DNA, truyền tín hiệu và biểu hiện gen, điều chỉnh apoptosis

có khả năng liên kết với kẽm, ngoài ra cỏn có hảng trăm loại kẽm vận chuyển và

glutamatergic cua titi synap vả cỏ thể điều chỉnh tỉnh kich thích tế bảo thần kinh Nó

bằng nội môi kềm cũng đóng một vai trò quan trọng trong vi chính chức năng của hệ thần kinh trung ương Rối loạn quá trình cân bằng nội môi kẽm trong

hệ thần kinh trung ương dẫn đến nông độ kẽm ở synap quá mức được cho là gây ra

độc tính thần kinh thông qua căng thắng oxy hỏa tỉ thẻ (vỉ dụ, bằng cách phá vỡ một

ketoglutarate dehydrogenase) [36], [37], [40], [41]

Kèm cỏ vai trỏ là một chất chống oxi hỏa bằng nhiều cơ chế khác nhau: cạnh tranh với Fe” và Cu” để liên kết với protein và các màng trong tế bảo; kết hợp với nhỏm sulfhydryl (-SH) để bảo vệ khỏi sự oxi hóa; tăng cường kích hoạt các loại enzyme, protein vi các phân tử kháng oxi hóa như glutathione (GSH) catalase vi

trình oxi hóa (inducible nitrie oxide synthase (iNOS), NADPH oxidase) và ngăn can

sự tông hợp các sản phẩm oxi hỏa lipid: gây ra sự biểu hiện của kim loại gắn kết với protein metallothionein (MT) Theo nghiên cứu của Prasad (2014), bổ sung kẽm

tuôi Kẽm có khả năng chống oxi hóa do nó có thé làm giảm hoạt động của nuelear factor kappa B (NF-KB) và các gen nhw: tumor necrosis factor-a (TNF-a), interleukin-1 (IL-1), vascular cell adhesion molecule (VCAM) [42]

'Tóm lại, kẽm có nhiều vai trò trong hoạt động sống của các động vật cũng như

con người Thiểu kẽm sẽ dẫn đến nhiễu vấn để nghiêm trọng: ảnh hưởng đến hệ

thần kinh, hệ tuần hoàn, giác quan hệ sinh sản thậm chí có thể là nguyên nhân

cũng gây ánh hưởng nghiêm trọng đến sức sống của sinh vật nói chung và con người nỗi riêng

1.2.5 Nhiễm độc kẽm

Mặc dù kẽm lả một vi chất cẩn thiết cho cơ thể Tuy nhiên, hảm lượng kẽm vượt quả mức cẳn thiết sẽ gây hại cho sức khỏe Ngộ độc kẽm cắp tính là một trong những trường hợp thừa kẽm do tiếp xúc với kim loại nảy ở liều lượng lớn trong thời gian ngắn, Ngộ độc cắp tính thường do tiếp xúc qua các con đường sau: hô hắp, tiêu hóa, tiếp xúc qua da và mắt [42], [43]

Con người hít phải khỏi công nghiệp chứa ZnO sẽ xuất hiện các triệu chứng

như: sốt, đau nhức cơ bắp, ớn lạnh, viêm dạ đảy - ruột, đau ngực và ho (có sự gia tăng bạch cẩu)

hiểm khi dẫn đến bệnh phổi mãn tính Nếu tiếp xúc với ZnCl; từ khỏi hoặc bom

khỏi trong quân sự sẽ dẫn đến các triệu chứng: kích ứng mi mạc, ho, khản tiếng, khó thở, thở khò khè, buôn nôn, bơ phở, giảm khả năng vị giác

và thậm chí có thể dẫn đến tử vong Tiếp xúc với bột kẽm qua da có thẻ dẫn đến

viêm đa, loét, phòng rộp và để lại sẹo Các loại muối kẽm được xem là những chất

iều này có thể dẫn đến sự suy giảm chức năng phối tạm thời vả

và họng, viêm kết

gây kích ứng cho mắt, gây nên các triệu chứng như: loét giác mạc, phủ nŠ, bóng, tỉnh thể [44]

'Theo cục quán li thực phẩm và được phẩm Hoa Kỷ (FDA), mức bô sung kẽm

vào chế độ ăn uỗng đối với nam giới là 11 mg/ngày vả phụ nữ là 8 mg/ngày Đôi

với trẻ sơ sinh, lượng kẽm cẩn từ 2 - 3 mgingày vả trẻ em lä khoảng 5 - 9 mg/ngiy,

cỏ thể gây độc, lượng kèm uống vào phải lớn hơn 15 mg/L mới gây ra ngộ độc cấp

gan, hôn mê, bắt tinh vả trường hợp nghiêm trọng có thể dẫn đến tứ vong Ngoài ra,

chuyển hỏa lipid, làm mắt cân bằng cholesterol, suy tụy, suy giảm hệ miễn dịch [42], [44]

1.2.6 Cơ chế gây độc của kẽm

Cơ chế gây độc của kẽm hiện nay chưa rõ Người ta cho rằng, sau khi khi cơ thể hít phải độ nóng của khỏi kim loại khoảng 3-10 gid, sẽ gây ra một phản ứng

histamine hoặc giống histamine, Lúc này, phức hợp kháng thẻ-khảng nguyên đị ứng

thể kháng — kháng thể đị ửng được hình thành và chỉ phổi tiếp tục voi ZnO, lúc

phức hợp khang thé - di img chiém wu thé tao ra phan ứng dị ứng vả triệu chứng sốt

khói kim loại Nếu tiếp xúc với kèm bằng con đường tiêu hỏa sẽ gây thiểu máu do

kẽm cạnh tranh với sắt và đông, giảm nồng độ cholesterol HDL và gây tốn thương tụy ở người [44]

1.2.7 Ảnh hưởng của kẽm lên động vật thiiy xinh - cá

Cá là động vật thủy sinh va là một thành phân không thể thiểu trong các chiến lược kiểm tra độc tổ Vì cơ thể chúng có các đặc điểm trao đổi chất và khả năng

động vật không xương sông Mặc khác, khi nguồn nước bị ở nhiễm bởi bất kì

nhiễm Vì vậy, từ lâu nay cá được xem như "lính canh” chất lượng nước để phục vụ

nhu cau sinh hoạt của con người Do đó, để giám sát tỉnh trạng ô nhiễm nước va kiểm tra độc tính thủy sản, cá được cho là một mô hình khảo sát lí tưởng [22], [45]

Ở cá, cơ quan có khả năng hấp thụ Zn hòa tan trong nước là mang (đường hô

hap), ruột (qua thức ăn) Sự hắp thụ kẽm qua mang cả phụ thuộc vào thành phần các

chất hóa học cỏ trong nước, Hảm lượng lớn canxi trong nước sẽ lảm giảm sự hấp

nếu hàm lượng cadmium hiện diện với số lượng lớn Có bằng chứng cho rằng, sự

giảm pH trong nước sẽ lâm giảm sự tích tụ của Zn trong mang trong khi sự tích tụ

Zn ở cơ thẻ động vật lại tăng

Sự hấp thụ Zn vào ruột cá có sự giới hạn vẻ tài liệu Sự hấp thụ Zn trong cả

Bơn (Pseudopleuronectes americanus) và cá Chim (Pleuroneetes platessa) dường

sẽ bị bão hòa khi hảm lượng Zn cao, điều này được quyết định bởi sự gắn Zn ở

Fletcher, 1983)

Sự hấp thụ Zn qua mang và ruột phụ thuộc nhiễu vào điều kiện môi trường, Ở biển, khi có sự hiện điện của Zn, ruột sẽ đóng vai trò quan trọng hơn mang trong

việc hấp thụ Zn như một yếu tố dinh dưỡng (Pentreath, 1973, 1976; Renfro et

từ nước, do cá ở biển uống một lượng nước đáng kế Trong hằu hết các trường hợp

ngọt, thâm chỉ cá sống nơi nước ngọt không uống bắt ki lượng Zn nảo trong nước Spry et al (1988) đã nhận thấy trong nước cửng, nơi có hảm lượng Zn cao (90 g/L)

được cung cấp nguyên tố này Thậm chí, khi lượng Zn trong chế độ ăn được cung cấp đây đủ, Zn trong nước vẫn đóng góp 57% vảo lượng Zn tích tụ trong cơ thể 1.2.8 Tình hình ô nhiễm kẽm

1.2.8.1 Trên thể giới

Tình hình ô nhiễm kẽm trên thể giới hiện nay rắt đảng báo động, đặc biệt là

các nước có trữ lượng khai thác kẽm cao Tại Trung Quốc (2017), lượng kẽm trong

số 10 kim loại nặng trong bề mặt lớp đất trầm tích của sông Tương Giang, tính Hồ

Co> Cd) Điều này dẫn đến ô nhiễm nguồn nước, đặc biệt là môi trường sinh thái của khu vực sông Xiangjiang bị nhiễm kẽm nghiêm trọng [46] Theo kết quả tổng

cây trằng vả cây lương thực đã vượt mức cho phép [47] Tại Châu Âu (2016) có tới

tron khi đây được xem là nơi có độ an toàn về đất canh tác nông nghiệp [48] 1.2.8.2 Ở Việt Nam Chất thái công nghiệp, nông ghiệp và sinh hoạt là một vẫn để nan giải đối với

những quốc gia còn đang phát triển trong đó có Việt Nam Qua thời gian, nguy cơ ô

kẽm Theo QCVN 08-MT:2015/BTNMT, hảm lượng kẽm cho phép trong nước sinh

thực tế cho thấy lượng kẽm đã vượt mức cho phép cao, cụ thể;

Đặng Hoài Nhơn vả cs (2010) đã phân tích chất lượng trằm tích tại tằng mật vùng biển ven bờ Hải Phòng nhận thấy: hàm lượng kẽm trong trằm tích đao động

trong khoảng 47.47 - 225.29 mg/Kg, trung bình toàn vủng là 14043 mg/Kg Him

lượng kẽm cao tập trung tại vùng cửa sông Bach Ding, phan Dong Nam dao Cát

Bà, vùng cửa sông Văn Uc Nhỏm này kết luận hầu hết các trạm lấy mẫu đều có

sông Yangtze (Trung Quốc) đối với tắt cả các kim loại khảo sát (V, Cr, Co,Ni, Cụ,

Zn, As, Mo, Cd, Sb, Pb và Thì So với hảm lượng trung bình kim loại nặng hỏa tan

của các dòng sông trên thể giới thiết lập bởi Viers vả cs (2008), hảm lượng nguyên

tổ kẽm trung bình trong nước sông Hồng tại Trạm Thủy văn Sơn Tây tới 3,23 ug/L

trong nước sông Hồng dạng lơ lững trung bình là 196 mg/Kg, tương đương với

trung bình chung của các con sông khác trên thể giới (208 mg/Kg) Khi sir dung chi

số chí số độc sinh thái học TEC và PEC (Probable Effect Concentration) để đánh

gid ảnh hưởng của hàm lượng kim loại nặng dạng lơ lửng lên hệ sinh thái, nhận thấy, hàm lượng trung bình của kim loại kẽm cao hơn chỉ số PEC và vượt quá chỉ

số TEC nhiều lần [52] Như vậy nguy cơ ảnh hưởng trực tiếp cúa kim loại kẽm lên

õ nhiễm các kim loại nặng khác nói chung còn có nguy cơ lan rộng khi sông Hồng

gây ô nhiễm kim loại nặng cho môi trường (đất, nước) vả cỏ thể tích tụ trong cây

trồng cũng như trong sinh vật ở vùng đồng bằng [54]

Theo Hoàng Thị Thanh Thủy và cs (2007) khi nghién cứu địa hóa môi trường một số kim loại nặng trong trằm tích sông rạch ở thảnh phố Hồ Chí Minh nhận thấy,

Nhiêu Lộc - Thị Nghẻ, Tân Hóa - Lò Gồm, Tàu Hũ - Bến Nghẻ lần lượt là 761, 627

tiêu chuñn Mỹ US EPA là 110 mg/kg Kết quả của nhóm nảy cho thấy, 82% tổng số

mẫu trằm tích thu nhận tại các kênh rạch ở thảnh phó Hồ Chí Minh chứa hàm lượng

Zn vượt quá giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn độc tính của Cục bảo vệ môi trường

hưởng đến hệ sinh thải PEL của Canada (Canadian Sediment Quality Guidelines, Environmental Canada) [55]

1⁄3 TÔNG QUAN VẺ CÁ NGỰA VĂN

Giong: Danio Oken, 1817

Loài: Danio rerio (Hamilton, 1822)

Tén ding danh: Barilius rerio, Cyprinus chapalio, Cyprinus rerio, Danio frankei, Danio lineatus, Nuria rerio, Perilampus striatus, Zebra danio [56] 1.3.2 Dic diém sinh hoc cia cé ngya vin

Cá ngựa vằn là loài cá nhiệt đới, thuộc họ cá chép Cyprinidae sống ở tằng đáy;

cá trưởng thành có chiều dài trung bình từ 3 — 5 em, trọng lượng 0,5-1,0 gram; tốc

độ sinh trưởng nhanh nhất trong ba thắng đầu; thảnh thục sinh dục ở tháng thứ ba và thir tu; sau đỏ, sự sinh trưởng chậm dần và boản toàn dừng lại sau một năm rười Chúng có sức sống cao, sinh trưởng vả phát triển tốt nhất ở 28,5°C (chỉ có biểu hiện

hgu & Vigt Nam Danio rerio sinh trưởng khá nhanh trong điều kiện nuôi giữ [57] [58] [59]

Cú ngựa vẫn trở thảnh mô hình chính trong các nghiên cứu về độc chất học, sinh học thần kinh, sinh học phát triển vả sinh học phân tử Mỗi con cái đẻ 50 - 200

trứng/ngày, cá thụ tỉnh ngoài giúp để dàng quan sát và thao tác trên phôi ngay sau

khi được thụ tỉnh, phôi phát triển nhanh chỏng đạt độ trong suốt hoàn hảo cho phép những ưu điểm trên nên cá ngựa vằn được coi là sự lựa chọn hàng đầu cho các

chiến lược kiểm tra độc tố trên phôi Quá trình phát triển phôi được cảm ứng bởi ánh sáng và chu kỳ sáng tối tự nhiên của cá là 14 giờ :10 giờ [57], [58], [59] 1.3.3 Vòng đời và sự phát triển của cá nga vin

Sự phát triển của cá ngựa vẫn được mô tả qua sơ đỗ hình 1.1, bao gồm 4 giai

đoạn chính: phôi, ấu trùng, cá bột vả cá trướng thành Cụ thể:

phân đốt phôi vị

Hình 1.1 Vòng đời cá ngựa vằn

« Giải đoạn phối

Giai đoạn hợp tử (zygote period) kéo dải từ 0 - 0.75 hpf, bắt đầu từ khi trứng được thụ tính cho đến khi xảy ra quá trình phân chia tế bao dau tiên Lúc vừa xảy ra

"phông" lên; có sự di chuyển của bảo tương về cực động vật [58], [60] Giai đoạn phân cắt (cleavage period) kéo dài từ 0,7 - 2,2 hpf, bắt đầu khoảng

45 phút sau thy tỉnh, khoảng cách giữa các lần phân chia khoảng 15 phút Trong lần

phân chia đầu tiên, rãnh phân cắt hình thành, đánh dấu kết thúc giai đoạn hợp tử Các tế bào gia tăng theo cấp số nhân (2, 4, 6, 8 đến giai đoạn 64 tế bảo), kích

thước tế bảo cực động vật giám đi, phôi nhô lên rõ rệt, xuất hiện các tế bao bj bao

phủ hoàn toản ở bốn phia và các tế vào bao bên ngoải (Hình 1.2) [58], [60]

Hình 1.2 Giai đoạn phân cắt (20X) (A- 216 bio; B-4 tễ bảo; C- 8 tế bảo; D - 16 tế bào; E - 32 tế bào và F 64 tễ bào) Giai đoạn phôi nang (blastula period) kéo dai tir 2,25 - 5,25 hpf Dau giai đoạn phôi nang, các tế bào tiếp tục phân chia theo các nhịp như giai đoạn trước đó Sau

đó sự phân chia không còn đồng bộ, tập trung ở cực và lan dần sang vùng biên Quan sát dưới kính hiển vi, ta có thể dễ dàng nhận thấy vùng phôi bì, nơi các tế bảo sắp xếp tạo thành gò cao Dần dẫn, phôi bi sang bằng và trải ra, bao trùm noãn, gọi

là sự mọc phủ Phôi bước vảo giai đoạn hình thành các cơ quan [58], [60] Giải đoạn phôi vị (gastrula period) kéo đài tử 5.25 - 10 hpf, sự mọc phủ tiếp tục cho đến khi nhận thấy được vùng đầu và chỗi đuôi [58] [60] Giai đoạn phân đốt (segmentation period) kéo dai từ 10 - 24 hpf Trong giai đoạn nảy, hốc mắt vả đốt sống dần hình thảnh Các đốt sống cỏ hình chữ V được sắp xếp liên tục [38] [60]

Giai đoạn hầu họng (pharyngula period) kéo dai từ 24 - 48 hpf, hệ tuần hoàn bắt đầu hoạt động Tìm bơm máu đến các vùng của cơ thể thông qua hệ thống mạch 'Vòm miệng và nắp mang hình thảnh, hé than kinh phát triển nhanh chỏng, đặc biệt

batching), tỉa vây hình thành, collagen tăng cường sản xuất bao phù các vây, Sắc tố

[58] [60]

Giai đoạn nở (hatching period) kéo dai tit 48 - 72 hpf, dần hoàn thiện các cầu trúc Miệng, mang, vây có thể bắt đầu hoạt động Hoạt động quẫy mình diễn ra Lực quay mình làm rách nang, Âu trùng hoản tắt thoát nang, chui ra ngẫu nhỉ

ngoài môi trường [58] [60]

6.Giai don du tring

Giai đoạn ấu trùng được tính từ sau khi cá nở Tuy nhiên, thời điểm nở không động nhất giữa các cá thể, phụ thuộc vào điều kiện nuôi Do đó, để tài chọn 72 hpf

trưởng thành, bao gồm cả cấu tạo vây và vảy Trong giai đoạn nảy, hệ sinh dục chưa

hoàn thiện vả chưa có sự phân biệt rõ rằng vẻ giới tỉnh Theo nghiên cứu của David

tuần sau thụ tỉnh tùy thuộc vào điều kiện nuôi và sức sống [58], [60]

4 Giai đoạn cả trưởng thành

Sau giai đoạn cá bột, cá ngựa vẫn bước vào giai đoạn trưởng thành với đặc

điêm chính là sự hoàn thiện của các đặc điểm sinh dục thứ cấp, cũng như khả năng tạo trứng (ở cá cải) và tỉnh trùng (ở cá đực) [S8], [60]

1.4 CAC GEN LIEN QUAN DEN STRESS OXI HOA DUNG TRONG ĐÈ TÀI 1.4.1 Stress oxi hoa

Stress oxi héa (Oxidative Stress) là hiện tượng trong cơ thể sinh vật có sự mắt

cân bằng giữa sự tạo ra các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxi hóa Hay

chống oxi hóa trong cơ thể [19], [61]

Gốc tự do hay các chất hoạt động chứa oxi vả nitơ (Reactive Oxygen Species - ROS vụ Reactive Nitrogen Spccies - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxi và nito phan tir, gồm hai nhóm lớn là các "gốc tự do" và các dẫn xuất không phải gốc tự do

Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiễu điện tử độc thân

Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxi don, hydroperoxide, nitroperoxide va

tiền chất của gốc tự do Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá

trình trao đổi chất và tủy thuộc vào nồng độ mả chúng có tác động tốt hay xấu Ở

các gen tham gia quá trình miễn địch, kháng viêm điều hòa biểu hiện các gen tham

biển tinh protein, oxi hóa lipid, Tir dé, gay ra nhiễu bệnh nguy hiểm: hình thành mờ

bào, thay đổi chức năng của nhiều thụ thể trên tế bào, do đó ảnh hưởng đến tính

oxi hóa DNA gây nên biến dị đi truyển, tăng nguy cơ phát triển ung thư, Sự tỉnh lũy

các sản phẩm của oxi hóa cấu tử tế bảo gây nên hiện tượng lão hóa sớm, suy giảm

hệ thần kinh Vi vậy, đề bảo vệ cơ thẻ khỏi tác động xấu của ROS và RNS, tế bảo

được trang bị các chất chống oxi hóa [19], [61]

1.4.2 Các gen liên quan đến stress oxi hóa sứ dụng trong đề tài Các gen liên quan đến stress oxi hóa sử dụng trong để tài là Cat, CwZn-SOD,

Mt2, Hsp70 va gen đối chứng (housekeeping gene) RpL 13a Cy thé:

Gen Ca: mã hỏa cho các đơn phân của catalase, một loại enzyme chit chét trong việc chống lại stress oxi hóa trong cơ thể Mỗi một trong bốn đơn phân liên

enzyme Catalase hoạt động trong hầu khắp các tế bảo của cơ thể, Tại đây chúng sẽ

làm giảm ảnh hưởng độc hại của peroxide [62]

'Gen Cư/Zn-SỚD tạo nên sản phẩm là superoxide đismutase, một loại enzyme được sản xuất ở hầu hết các tế bảo trong cơ thể Chúng hoạt động bằng cách pha

thành HạO và O; nhờ catalase và glutathione peroxidase [62] Gen Af/2 tạo nên sản phẩm là metallotbionein Đây là một protein giảu cysteine, liên kết với kim loại nặng Metallothionein kiểm soát nông độ kim loại nặng bằng cách giải phỏng hoặc kết dính với kim loại nặng đỏ khi cần thiết Nó có

quan trọng trong điều hỏa hàm lượng kẽm vả phân phối kẽm trong không gian nội

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THOT GIAN VA DIA DIEM THÍ NGHIỆM

~_ Để tài được tiễn hành từ tháng 10/2017- 10/2018

~_ Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Giải phẫu - Sinh lí Người và Động vật ~ Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP Hỗ Chí Minh

~ Các thí nghiệm liên quan đến sinh học phân tử được thực hiện tại Phỏng thí

Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh

2.2 VAT LIEU VA HOA CHAT SU DUNG

STT Tên Hãng sản xuất Nước sản xuất

2 Kinh hién vi soi nổi Nikon Nhit

3 Kính hiển vi đảo ngược Nikon Nhật

4 May do pH Thermo Electron Corp Hoa Ky

9 Tủ lạnh Daewoo Hàn Quốc

10 Dia petri thay tinh Steriplan Dan Mach

1 Kim tiém 26G, Day truyén VinahankookMedical Vigt Nam nước biển Supplies

2 Eppendorf 1,5 mL Kartell Spa Pháp l3 Micropipette Biobit PLC Phan Lan

14 Diu tip các loại Greiner bio-one Đức

5 Bể thủy tỉnh

16 Dụng cụ sục khí KingFisher Đài Loan

19 Bình định mức, ống đong Schott Đức

Nước nuôi cá là nước máy được để bay hơi, khử sạch clo trước khi sử dụng

được đem đi phân tích hàm lượng Kẽm làm lô đối chứng ban đầu Các dụng cụ thủy tỉnh được rửa sạch và hấp, sấy khử trùng trước khi sử dụng

Hệ thống kính hiển vi đảo ngược được gắn phần mềm chụp ảnh NIS Elements Fpackage version 3.20

Rong dùng cho nuôi cá được nuôi sục khí và loại bỏ rong chết hàng ngày

“Thức ăn nuôi cá bao gồm thức ăn thương phẩm dạng viên nhỏ, bột trứng gà

thức ăn cho cá, hàm lượng protein có trong Bobo chiếm 50%, lượng chất béo

chiếm 20 — 70% khối lượng khô ở Bobo trưởng thành và 4 — 6% ở Bobo non

Các dụng cụ và thiết bị sử dụng cho thí nghiệm định lượng tương đối mức độ

biểu hiện gen của phôi và ấu trùng cá ngựa vằn được thê hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các dụng cụ và thiết bị sử dụng để việc định lượng tương đối mức độ biểu

hiện gen

3 Miy realtime PCR ‘Thermo Scientific Phin Lan

4 May do OD NanoVue Biochrom Anh

6 Eppendorfcáekíchcø Kartell Spa Pháp

7 Phiên vont Greiner bio-one Đức

8 Micropipette Biohit PLC Phan Lan

Hóa chất

Môi trường E3 gồm: 5 mM NaCl; 0,17 mM KCI; 0.33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7.2 -7,3 [5] cdc hóa chất nảy được mua từ hãng Scharlab S.L Tây Ban Nha; ZnCl2 (sigma, code: 101332675); NaOH IN, HCI 1N (Merck) Chi ZnCl2 (sigma, code: 101332675): cân 0,1 g ZnCl2 cho vào 100 mL, nước cắt, khuấy

các nồng độ khảo sát bằng môi trường E3

bj stock

Các cập mỗi khuếch đại các gen déi chimg RpL13a va gen mục tiêu Cư⁄Zn- SOD, M2 được sử dụng dựa theo công trình nghiên cứu của Brun và es., 2014 [1];

Các cặp môi khuếch đại các gen Cøf, //4›70 được thiết kế mới dựa trên các trình tự

gen tương ứng được tham khảo từ ngân hàng gen GenBank (NM 130912 và

chỉ nhánh tỉnh Vĩnh Long (Branch of Phusa bichem Co LTD., Binh Minh Park,

23

Bộ kit RNeasy Mini Kít tách chiết RNA tổng số (Qiagen, Đức); bộ kit qPCR SyGreen 1-Step Lo-ROX thực hiện RT-qPCR, (PCRBiosystem, Anh) Bang 2.3 Trình tự mỗi ding trong RT-qPCR [1], [2]

Gen myc 3s Bs (S'- 3 Kích thước

R: ATTCAGGACGCAAGCTCCAA

F: GGCCAACCGATAGTGTTAGA

R: CCAGCGTTGCCAGTTTTTAG

F: CTGCGAATGTGCCAAGACTGGAAC

sinh hoạt cho đến nước giao thông thủy) là 0,5 - 2 mg/L [49] Giá trị này tương

đương với nồng độ ZnCl, tir 1,05 - 4,18 mg/L

Theo Bùi Thị Nga vả cs 2009, hảm lượng kẽm đo được ở kênh Phụng Hiện (tỉnh Cả Mau) vào mùa mưa lên đến 8,59 mg/L (tương đương 17,97 mẹ/L ZnCl;),

vượt nhiều lần so với QCVN [64]

Hàm lượng kẽm hỏa tan trong nước mặt ở một số khu vực khai thác va chế

biến khoáng sản kim loại tại miền Bắc (Cây Châm, Mẫu Duệ, Sin Quyền, Chợ Don)

đều vượt ngưỡng cho phép Trong đỏ, hàm lượng kẽm hòa tan tại Mẫu Duệ lên đến 27,27 mg/L (57 mự/L ZnCl;) [55] Mặt khác, do khả năng tự bảo vệ của phối thưởng rất tốt, Melek et al khi khảo sát ảnh hưởng của ZnCl; lên sự phát triển của

Ansari ct al khi đánh giá ảnh hưởng của kim loại nặng lên phôi va du trùng đã thực

có thể khảo sát chính xác chỉ số LC«ạ sau các khoản thời gian gây nhiễm nhất định

[14]

'Từ những lí do trên, để tài chọn một dải nồng độ 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 20;

50 mg/L ZnCl; và lô đối chứng - 0 mg/L đề khảo sắt liên tục từ giai đoạn phôi đến

ấu trùng Toàn bộ thí nghiệm của để tải được bố trí theo sơ đổ hình 2.1

Lỉ do chọn các gen Cat, MĐ, Cu/Zn-SOD và Hsp70: Trong diều kiện thí nghiệm, chúng tôi chọn cdc nhém gen Cat, Mi2 và Cư/Zn- SOD lả những gen liên quan đến stress oxi hỏa khá phổ biến vả được Brun et al,

2014: Boran et al, 2016 có thực hiện nghiên cứu trên phôi cá ngựa

tham khảo, Gen #fsp70 là gen vừa có khả năng kháng oxi hỏa, vừa có liên quan đến

sốc nhiệt, để tải muồn tiền hành bước đầu thăm giò mức độ biểu hiện của gen này với mong muôn mở ra một hướng cho các nghiên cứu về sau

Lido chon ZnCl; thay vi ZnO:

Theo nghiên cứu của Brun et al, 2014 và Boran et al, 2016 khi nghiên cứu ảnh bưởng của Zn " từ ZnO hay từ ZnCl; lên sự phát triển phôi cá ngựa vẫn đều cho kết

chọn ZnCl›

“Gây nhiễm ZnCh: cho phối 9

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp ôn định điều kiện sống của cá

Cá ngựa vẫn trưởng thành được mua về

súng và 10 giờ tối) ở nhiệt độ 28°C tại phỏng thí nghiệm ít nhất tuần trước khi tiến hành phối cá thu phôi phục vụ cho thí nghiệm [58]

inh theo chu kì quang (14 giờ

2.4.2 Phương pháp phối cá

Sử dụng bể kinh có đường kính 30 em đẻ phối cá, cho nước ngập khoảng 2/3

bể, trải bí thủy tinh dưới đáy bê làm giá đỡ cho trứng bám và tránh việc cả ăn phôi sau khi đẻ Sử dụng một miếng nhựa trong suốt làm vách ngăn ở giữa bẻ, phối cá theo tỷ lệ 1 đực : 2 cai, phi tim vải mùng lên bể phối Giữ cả phối theo chu kỉ

chuẩn 14 giờ sáng : 10 giờ tối Trước khi thu phôi, mở đẻn vào buổi sáng vả tháo vách ngăn ra dé cá ghép đôi với nhau [SR]

2.4.3 Thu phôi và gây nhiễm ZuCl; cho phôi

Môi trường được sử dụng để nuôi phôi và ấu trùng là E3 với pH trung tính, bổ

‘Theo Bai et al (2009), đây là môi trường chuẩn cho việc nuôi giữ và sản xuất giống tử trứng cả sung xanh methylene 1% và duy trì nhiệt độ trung bình là 28,5°C

Ngựa vẫn, có thể kiểm soát được các nồng độ ion trong nước Việc bổ sung 1%

ai a pane ta 4 át tiên bình thường của cá [5] Sau khi tháo vách ngắn 30 - 45 phút, cá bố mẹ được vớt ra và thả trở lại bé nuôi chưng, bỉ được lấy ra nhanh chỏng và nhẹ nhảng, trắnh xáo động mạnh gây tỉnh 1000 ml, chuyển số phôi nảy qua đĩa petri thủy tỉnh, dùng ống pipette nhựa

vào từng cốc thủy tính (loại dung tích 1000 ml) chira 300 ml mdi trưởng nuôi phôi (E3 + 1% xanh methylen) đã bỏ sung ZnCl; với các nồng độ khảo sát vả lô đối

hiên vi soi nôi để đảm báo thu những phôi tốt (phát triển bình thưởng và đang ở đầu giai đoạn phân cắt) [25], [45] Mỗi cốc 30 phôi, lặp lại 4 lẫn 3.2.4 Phương pháp dánh giá ảnh hưởng của ZnCl; lên một số đặc diễm sinh lí của phôi ở các nồng độ khảo sát

Sức sống của phôi

Giai đoạn phôi bắt đầu từ khi hợp tử phân cất vả kết thúc tại mốc thời gian 72

hpf - là thời gian phôi hoản tắt quá trình nở về mặt lí thuyết Quan sát dưới kính

hign vi sé dé ding phat hig

quanh) hoặc dị tật (cấu trúc bên trong biến dạng) Những phôi sống cỏ cấu trúc phôi

các phôi chết (mờ đục, đem thẩm, xuất hiện nắm xung

bì tương ứng với các giai đoạn phát triển, trong suốt, mảng phôi nguyên vẹn, ở giai doan hau họng vả giai đoạn nở (thoát nang) thấy rõ nhịp tim, nhịp quẫy mỉnh vả