Báo cáo thí nghiệm hóa sinh

Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định.. Thực hiện pha loãng mẫu 200 lần đề n

DAI HOC QUOC GIA THANH PHO HO CHi MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

KHOA KY THUAT HOA HOC

BAO CAO THI NGHIEM HOA SINH

Giảng viên hướng dẫn: Trần Trúc Thanh

Sinh viên: Vũ Hồ Yến Nhi-I914528

Lop: L01

Tp Hỗ Chí Minh, 2022

BAI 1: BINH LUQNG DUONG KHU BANG ACID DINITRO

SALICYLIC (DNS)

L Nguyên tắc thí nghiệm:

Phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS) 3,5 — dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ khử thành acid 3-amino-5-mtrosalicylic có màu đỏ cam

Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một

phạm vi nhất định Dựa theo đường chuẩn của ølucose với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm

lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

IL Phương pháp thí nghiệm:

- Chuẩn bị các hóa chất và mẫu cần định lương đường khử:

> Thuốc thử DNS:

® - Hoà tan 10g DNS vào 400ml nước cất

® - Hoà tan l6g NaOH vào 150 mÍ nước cất

® Thêm dung dịch NaOH vừa pha vào dung dịch DNS ở trên

® - Hoà tan bằng khuấy ở 0 không quá 500C

¢ Tiép tuc khuay va cho thém timg it mét 300g potassium sodium tartrate

cho đến khi tan hoàn toàn, chú ý bao kín cốc pha hóa chất

® Sau khi hòa tan hoàn toàn, định mức dung dịch đến I lít, trữ trong chai tôi

+ Dung dich glucose10 mg/ml

+ Mẫu cần định lượng đường khử: 7up

Mẫu cần định lượng có hàm lượng đường tổng là 43g trong 390 ml Thực hiện pha loãng mẫu 200 lần đề nồng độ đường khử rơi vào trong khoảng xác định của phương trình đường chuẩn glucose (0-10 mg/ml)

- Tiên hành dựng đồ thị đường chuẩn glucoso (0-10 mg/ml) và phân tích đường khử

Bang 1: Thứ tự thí nghiệm phân tích đường khu:

Ông nghiệm Đối ĐI D2 D3

„ No.1 No.2 No.3 No.4 No.5

Dun séi cach thiy 5 phút, làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng

Bang 2: Két qua do ODss0mctia déy chuan glucose

Ong nghiém Đôi No.1 No.2 No.3 No.4 No.5

chung Nong d6 glucose 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (mg/ml)

ODs40nm 0 0.301 0.953 1.422 1,080 2.772

Bang 3: Két qua do ODs40un cia mau

Hinh 3: D6 thi biéu dién sy tuong quan gitra néng d6 glucose va d6 hap thu ODsaoum

Mắi tương quan giữ nồng độ glucose và độ hấp thụ OD 540nm 1.2

1 †(x) = 0.35 x + 0.06 ng R?= 0.99 vớ

2 Bién luan:

Theo thông tin sản phẩm trong 390ml 7up có 43g đường tông tương đương 110mg/ml Tuy nhiên, theo thí nghiệm ta thu được 52.4 mg/ml Vì lượng đường tông trong sản phẩm không phải toàn bộ là đường khử nên theo phương pháp này ta không thể xác định chính xác lượng đưởng tông như trong thông tin sản phẩm

IV Các phương pháp khác:

1 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand:

Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiểm các đường khử (glucose, fructose, maltose, ) khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling với sự có mặt của Kalinatri tartrat Kết tủa đồng I oxit (Cu2O) có màu đỏ gạch, có khả năng khử với muối Fe3+ thành muối Fe2+ trong môi trường axit

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 > 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O

Fe2+ sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO4 là chất oxy hóa nên dùng KMnO4 đề

chuẩn độ Fe2+ trong môi trường axit

10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2S04 — K2S04 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8 H20 Dựa vào lượng KMnO4_ sử dụng ta có thê tính được lượng đường khử trong dung dich bằng cách tra tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường khử của Bertrand

Có nhiều phương pháp khác xác định hàm lượng đường như phương pháp Somogyi, phương pháp Codextan, phương pháp DNS Tuy nhiên, phương pháp Bertrand là phương pháp

thường được sử dụng nhất vì độ chính xác, tính kinh tế và phù hợp với tiêu chuân đo lường

của Việt Nam Ở phương pháp Bertrand, để khử các tạp chất có trong mẫu phân tích, người ta thường sử dụng dung dịch kẽm feroxyanua Ưu điểm của dung dịch này là kinh tế, không gây

độc, đảm bảo việc khử tạp tốt và ít ảnh hưởng đến quá trình định phân đường.

2 Xác định đường khử bằng phương pháp Graxianop:

Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm cùng với ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyên thành acid đường Dùng metylen xanh làm chất chỉ thị

sẽ mắt màu xanh khi phản ứng kết thúc Phản ứng như sau:

2K3Fe(CN), + 2KOH + CH,OH(CHOH),CHO —>

—> 2K,Fe(CN), + 2H,0 + COOH(CHOH),COOH

* Tài liệu tham khảo:

https://chatluongthucpham.com/duong-khu-la-gi/

BAI 2 BINH LUQNG PROTEIN THEO PHUONG PHAP BIURET

- Dung dich albumin:10 mg/ml

- Dung dich Biuret: 9g sodium potassium tartrate, 3g CuSO, H.O, hoa tan 100m] NaOH

0.2N định mức với nước cất thành L lít

3 Tiến hành

Dựng đồ thị đường chuẩn albumin và phân tích nồng độ protein

Bảng 3: Thứ tự thí nghiệm phân tích nồng độ protein

Ông nghiệm Đối Pl P2 P3

No.1 No.2 No.3 No.4 No.5

chất hoặc đã ống nghiệm sạch mới

2 Thực hiện phản ứng với các bước tuần tự như trong bảng 3

3 Vẽ đồ thị đường chuẩn nồng độ albumin- trị số OD 550nm

4 Tinh gia trị trung bình của OD 550nm của 3 mẫu P, nếu giá trị này nằm ngoài đường chuẩn thì phải pha loãng mẫu

Sử dụng giá trị trung bình của OD 550nm mẫu P và đồ thị đường chuẩn albumin, tinh được a mg/ml protein trong mẫu pha loãng

Nhân với hệ số pha loãng (n) để được nồng độ protein trong dung dịch mẫu gốc (Chú ý pha loãng sao cho OD 550nm của mẫu phân tích nằm trong giới hạn đường

chuẩn)

Biuret 5ml Biuret phòng Biuret 5ml

> <

20 phut

Ong nghiệm Đối No.1 No.2 No.3 No.4 No.5

chứng Nong d6 Albumin 0 2 4 6 8 10 (mg/ml)

đường chuẩn Protein từ đó định lượng hàm lượng Proteimn Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ

Protem

R R CH—£=NH—=€H—~£ =NH

Tetradentate OH Cut? + Mors/w+s ———_ + Complex

Folin Reagent

(phosphamolybdic/phosphotungstic acid] Amax = 750 nm

- D6 nhay va kha nang wng dụng

Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phắp xác định dung dịch mẫu chứa vài chục ng protem thường nhạy cảm trong khoảng 5-2000mg Protein Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các Protein không chứa acid amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì tạo kết tủa ảnh hưởng đến kết quả

¢ Dinh lwong protein theo phuong phap Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250):

- Neguyén tac

Dựa phản ứng màu của protein véi xanh Coomassie Brillant Blue G-250) va ca kha nang hấp thụ ánh sáng ở bước song 595 nm Trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác với cả nhóm ky nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protien làm dung dịch có màu xanh Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ

protein trong dung dịch Dựa vào đường chuân của Protein suy ra hàm lượng Protein trong

- D6 nhay va kha nang wng dụng

Phương pháp này dùng cho profein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và đơn giản hơn nhiều

vì nó cho phép xác định tới vài ug protein/ml, đồng thời làm gaimr ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử Tuy nhiên phương pháp này không dùng với những chất có chứa surfactants vì gây ra kết tủa của các chất phản ứng Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết qua Mau Coomassie lam ban cuvet thach anh nén chi ding covet thủy tỉnh dé

- Vô hoạt enzym và két tủa protein chưa bi thủy phân bằng dung dịch axit trichloacetic

- Dinh luong san pham tao thanh bang phan img mau v6i thuéc thtr Folin

- Dựa vào đồ thị đường chuẩn tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên dựa vào

đồ thị đường chuẩn tyrosine

Cho 5ml Casein 0.65% vào Thêm dung dịch enzyme vào

4 ống nghiệm, ủ 37°C, Sphut Cc 3 Ong (tr ong blank)

Thém sml dung dich TCA

3% vào mỗi ông

Thêm enzyme vào tất cả 4

ông sao cho thê tích enzyme

mỗi ông là Iml

Chuyên sang 4 ống nghiệm

mới môi ông 2ml dịch lọc

HI Kết quả thí nghiệm:

1 Dựng đường chuẩn tyrosine:

Blan No.1 No.2 No.3 No.4 No.5

Nong do L-Tyrosine

0 0.055 0.111 0.221 0.442 0.553

(umole/ml)

H;O (mÙ 2 1.95 1.9 1.8 1.6 1.5 Dung dịch chuẩn L-

tyrosine sốc 1,1 mM 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.5 (1,1 umole/ml), (ml)

Dung dich Na;CO;

Bảng 4: Dựng đường chuẩn L-tyrosine

Trục hoành: nồng độ tyrosine tính theo umole/ml

¢ Truc tung: d6 hap thy OD 660nm

2 Thiết lập phan ing protease:

Mỗi mẫu enzyme cần 4 ống nghiệm | éng lam mau blank, va 3 ống tiếp theo dùng đề đo hoạt tinh protease ở 3 nồng độ pha loãng khác nhau

Thi tw phan wng protease

Dung dich BH | Ong mau B2 | B3 Blank Ong

© Truc tung: độ hấp thụ OD 660nm

HI Kết quả:

e Tinh hoat tinh cua protease:

- _ Hoạt độ Protease được tính theo ơn vị trên mỗi ml:

Units/mL enzyme =

= =0,0836 Vol:

umole tuong duong fyrosine được giải phóng trong 2m] dịch lọc thu được từ phương trình

11 = Téng thé tich dich loc (mL)

10 = Thời gian phản ứng (phút)

0,5 = Thẻ tich enzyme (mL) ctia enzyme duge str dung

2 = Thể tích dich loc ding trong phan img tao mau (ml)

- Hoat tinh trong miu protease ran (Unit/mg)

Được pha loãng tính bằng Uni/mL enzyme chia cho lượng chất rắn được sử dụng trong phan img nay ban dau (mg/mL)

Units/mg chat ran = = = 0,00019857

- Hoat tinh riéng cia enzyme:

Units/mg protein= = =0,01286

IV Kết luận:

Trong thơm có chứa enzyme protease dùng đề thủy phân protein, chúng có khả năng phá vỡ phân tử protein thành các acid amin hoac peptide

Nông độ protease cảng cao, lượng protein bị thủy phân càng nhiều

Các chất xúc tác sinh học không chỉ xác tác cho các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ

thê sống, mà ở những điều kiện nhất định, sau khi tách khỏi hệ thống sống chúng vẫn

luôn giữ được hoạt tính xúc tác Chăng hạn như khi nghiền tế bào thơm nhưng chúng van còn giữ được enzyme protease

Proteases

1/ Các yếu tô ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme:

- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

- Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

- Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Ảnh hưởng của nồng độ muối

Ngoài các yếu tô trên hoạt độ enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tổ khác như: ánh

sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ

2/ Ứng dụng chung của Enzyme Protease:

Trong công nghiệp thực phẩm:

Chế biến thịt: protease thủy phân một phần protein trong thịt, làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và tăng hương vị cho thịt

Sản xuất dich dam: tir Streptomyces fradiae tach duoc ché phẩm Keratineza thủy phân

được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ

Công nghiệp sữa: protease được dùng để sản xuất pho mat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng

Sản xuất bánh: chỉ dùng prorease ở giai đoạn cực ngắn đề amino acid và peptide tự do phản ứng với một số thành phần của bột

Sản xuất bia: dùng protease đề thủy phân có giới hạn protein của bia

Trong công nghiệp da: protease được sử dụng để làm mềm da nhờ sự thuỷ phân sơ bộ lông, tách các mô liên kết phía ngoài ra, chỉ còn lớp collagen tạo lớp mỏng và mềm da Trong công nghiệp dệt: đây là protease được sử dụng đề xử lý bên ngoài các sợi tơ, làm nhiệm vụ kết dính các sợi tơ Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã

làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm do đó làm giảm

lượng hóa chất đề tây trắng

Trong chế biến thủy sản: tăng lượng nước mắm nhờ thủy phân protein thành các acid

amin lam tăng hiệu suât thu hồi đạm của nước mắm

3/ Phương pháp xác định họat tính enzyme:

Khi tiền hành thí nghiệm đo họat tính enzyme cần chú ý những điểm sau:

Cần tránh những yếu tố có thẻ bién tinh protein/ enzyme

Các thông số nhiệt độ, pH, nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng lên

hoạt tính enzyme Thử hoạt tính phải được tiên hành trong điều kiện thích hợp như điều

kiện sinh lý, điều kiện tồn trữ thực phâm hoặc điều kiện mà hoạt lực có thê đạt tối ưu Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất ồn định thì phải cho các chất này vào

enzyme trước khi cơ chất vào hỗn hợp phản ứng

Nông độ cơ chất trong phản ứng enzyme phải trong giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hòa enzyme nhưng không quá cao để kìm hãm enzyme Sau khi dừng phản ứng lượng

cơ chất được chuyển hóa 20-30%

Thời gian xác định hoạt tính thường 5-30 phút Tốt nhất là xác định tốc độ ban đầu của phản ứng (30-60 giây), vì giai đoạn này tốc độ phản ứng lớn nhất, sau đó bắt đầu giảm

Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứng song song với mẫu thí nghiệm Trong mẫu đối chứng enzyme phải bị bất hoạt trước khi tiếp xúc với co chat

Trang thai can bang

Giàu chất dinh dưỡng

Dứa là loại quả có hàm lượng calo thấp nhưng rất giàu các chất dinh dưỡng khác Một

sô chất dinh dưỡng có trong dứa bao gồm chất xơ, mangan, vitamin B9, magie, kali,

© Khong chi giau chat dinh duéng, dứa còn chứa nhiều chất chồng oxy hóa, được gọi là flavonoid và axit phenolic Các chất này mang lại nhiều tác dụng lâu dài đối với cơ thé người, bao gồm làm giảm nguy cơ mắc bệnh về hệ miễn dịch và chứng viêm mãn tính

- Hỗ trợ tiêu hóa

® Trong dứa có chứa một nhóm các enzyme tiêu hóa được gọi là bromelam Chúng có

chức năng phá vỡ các phân tử protein thành các khối xây dựng như axit amin và peptide Những phân tử protein bị phá vỡ sau đó có thể dễ dàng hấp thu vào ruột non

¢ Diéu nay đặc biệt hữu ích với những người bị suy tuyến tụy — tình trạng tuyến tụy

không thể tạo ra đủ các enzyme tiêu hóa mà cơ thể cần

- - Giảm nguy cơ ung thư

© Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, bên cạnh việc chống oxy hóa và giảm viêm, dứa còn

có tác dụng giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh ung thư Những enzyme tiêu hóa bromelain có trong dứa có thể ngăn ngừa sự phát triển các tế bào ung thư, bao gồm ung thư da, ống mật và dạ dày

- _ Tăng cường khả năng miễn dịch

® Không chỉ là một loại quả, dứa còn được biết đến như một phần của y học cỗ truyền trong nhiều thế kỷ Các loại vitamin, khoáng chất và enzyme có trong dứa giúp tăng khả năng miễn dịch và chống viêm

- _ Giảm các triệu chứng của bệnh viêm khớp

e _ Viêm khớp là căn bệnh phô biến, nhất là ở người cao tuổi Do có đặc tính chồng viêm,

dứa có khả năng giảm đau do chứng viêm ở các khớp Một số nghiên cứu đã cho thấy chất bromelain có trong dứa rất hiệu quả trong việc điều trị các bệnh thoái hóa khớp

- _ Tăng khả năng phục hồi sau phẫu thuật

© _ Chất bromelain có liên quan đến khả năng giảm sưng, bầm tím và đau nhức xảy ra sau khi phẫu thuật Ngoài ra, đặc tính chống viêm của bromelain cũng giúp giảm viêm mô

sau quá trình tập thể dục nặng

Tài liệu tham khảo:

Giáo trình Hóa sinh học cơ sở

1h nghiệm Hóa sinh Đại học Bách Khoa Hà Nội

Bai 4A DINH LUONG LIPID THO BANG PHUONG PHAP SOXHLET

L Nguyén tac thi nghiém:

Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết Lipid tự do tập trung chủ yếu ở các cơ quan

dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật) Đề xác định hàm lượng lipid, chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ

Có 2 phương pháp đề xác định

Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp

Phương pháp gián tiếp: chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu

Dùng dung môi kị nước trích li hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ Các dung môi chiết xuất lipid thông dụng là etylic (ether petrol, benzen, cloroform, tetraclorua cacbon .) Trong phòng thí nghiệm thuong sv dung ete etylic, vi ete co dé bay hơi cao, nhiệt

độ sôi thấp tốc độ của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu

Ngoài lipid ra còn có một số hợp chat khac nhu: vitamin hoa tan trong lipid phosphatit, steroid, cũng được chiết ra Tuy nhiên, hàm lượng các chất này rất ít, nên phương pháp này vấn chấp nhận trong các thí nghiệm thông thường Vì vậy, lipid chiết xuất trong hai phương pháp trên gọi là lipid thô

Quá trình chiết xuất lipid được thực hiện trên máy Soxhlet, gồm có: bình cầu (a), trụ

chiết (b), Ống sinh hàn (c)

Hóa chất: Ether etylic hoac ether petrol

IL Phuong phap thi nghiém:

M;= 4.1752g

Hàm lượng lipid có trong 100g mẫu nguyên liệu:

X=

Với: X: ham luong lipid (%)

a: khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (g)

b: khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi chiết (g)

c: khối lượng nguyên liệu đem xác định (g)

IV Kếtluận:

Qua kết quả trên cho ta thấy hàm lượng lipid trong đậu phộng

* Ưu điểm cia may Soxhlet:

Tiết kiệm dung môi, một ít dung môi chiết kiệt được mẫu

Không tốn thời gian châm dung môi mới và lọc dịch chiết như các kĩ thuật khác Chỉ cần cắm điện mở nước hoàn lưu là thiết bị sẽ tự động thực hiện quá trình chiết

* Nhược điểm của may Soxhlet:

Trong quá trình chiết các hợp chất chiết ra từ bột nguyên liệu được trữ lại trong bình cầu nên chúng luôn được đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi, vì thế hợp chất nào kém bền nhiệt sẽ

béo trong dịch sữa đạt độ chính xác cao thì cần loại bỏ lớp lipo-protein bảo vệ trước khi trích

ly chất béo bằng các dung môi hữu cơ

Mục đích: Trích ly chất béo trong các sản phâm thực phẩm dạng lỏng, đặc biệt là các loại

sữa động vật và thực vật

Nguyên tắc:

Trích ly chất béo bằng cách bồ sung lần lượt 4 dung môi khác nhau: amoniac, côn, diethyl ether va petroleum ether Con và ammoniac dùng đề kết tủa và loại protein ra khỏi các hạt cầu béo Diethy ether được dùng để trích ly chất béo và các thành phần tan trong chất béo Petroleum ether được bồ sung vào để trích ly béo và một lượng nhỏ các thành phần tan trong béo do petroleum ether la dung môi trích ly có tính chọn lọc cao hơn so với diethyl ether Hỗn hợp sau khi bố sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha: pha nhẹ nằm ở trên bao gồm dung môi và chất béo, pha nặng nằm ở dưới gồm nước và các chất hòa tan trong nước Ta thu pha nhẹ gồm dung môi và chất béo, làm bay hơi dung môi ta thu được tông chất béo trong mau sữa