báo cáo thí nghiệm hóa sinh 2

- Tiếp tục giữ ở 50℃ ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzymevàochođến lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền đỏ của nhiệt kế dung d

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH GVHD: Trần Thị Tuyết Nhung

Nhóm: C5 N2 – Sinh viên thực hiện:

1 Nguyễn Lê Ngọc Bích - 62101088 2 Văn Phạm Như Ngọc – 618H0045 3 Huỳnh Thị Kim Ngân – 622H0011

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

2

I Phản ứng biure1 Cách tiến hành

Ống nghiệm Biure Protein trứng NaOH 10% CuSO4 2%

2 Kết quả:

Hình 1: 2 ống nghiệm của phản ứng Biure

Điểm Bài số 1

Ngày thí nghiệm 31/08/2023

3

3 Bàn luận:

- Ống 1: Biure sau khi cho dung dịchNaOH10% và CuSO4 2% vào thì chuyển sang màu tím xanh nhạt Do biure có số lượng liên kết peptide trong mạch ít - Ống 2: Protein trứng sau khi cho dung dịch NaOH 10% và CuSO4 2% thì chuyển

sang màu tím đậm hơn Do protein trứng có số lượng liên kết peptide nhiều

II Các phản ứng kết tủa của protein:1 Kết tủa protein bằng muối trung tính:

a Cách thực hiện:

3ml dung dịch protein trứng + 3ml (NH4)2SO4 bão hòa Cho vào ống nghiệm 1, lắc đều

Lọc Tủa 1

Thu dịch lọc trong

+ từ từ (NH4)2SO4 tinh thể cho đến khi không tan nữa Cho vào ống nghiệm 2, lắc đều

Tủa 2

- Ở ống nghiệm 2, ta thu được tủa 2 là albumin: Khi lọc, ta được dịch lọc từ ống nghiệm 1 thu albumin bán bão hòa Khi thêm (NH4)2SO4'tinh thể cho đến khi nó không tan được nữa thì lúcnày (NH4)2SO4'ở trạng tháibão hòa nên sẽ làm albumin kết tủa

5 Cho vào mỗi

ống 1 ml protein trứng

Lắc nhẹỐng 1: 5 giọt TCA 10%

Lắc nhẹỐng 2: 5 giọt acidsunfolsalisilic 10%

2 Kết tủa protein bằng acid hữu cơ: a Cách thực hiện:

b Kết quả:

Hình 3:Ống nghiệm 1 2 và kết tủa protein bằng acid hữu cơ

6

c Bàn luận:

- Ống nghiệm 1: tạo kết tủa trắng đục

- Ống nghiệm 2: tạo kết tủa trắng đục nhưng nhanh hơn và nhiều hơn- Sự khác nhau giữa 2 loại tác nhân

+ Acid Sunfosalisilic có tính acid mạnh hơn TCA và acid sunfosalisilic có thể kết tủa protein, polypeptide và acid amin

+ TCA chỉ có khả năng kết tủa protein nên acid Sunfosalisilic có thời gian kết tủa nhanh và độ đục nhiều hơn

3 Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng: a Cách thực hiện:

Ống nghiệm Dung dịch nhỏ vào Lần 1 Lần 2 Nhận xét

Thuận nghịch

giọt đầu, khi nhỏ lượng dư thì tan.Không thuận nghịch

Nhỏ 1 giọt theo

thành ống chờ cho Cho lượng thừa

Xuất hiện kết tủa ở giọt đầu, khi nhỏ đến khi kết tủa để xem tủa tan đến lượng dư

Thuận nghịch

khi nhỏ lượng dư thì tan.

7

b Kết quả: Lần 1:

Lần 2:

Hình 4.1: Lần lượt các ống nghiệm 1,2,3,4 sau khi cho giọt dung dịch muối 1

Hình 4.2: Các ống nghiệm ở lần sau 1 khi cho lượng dư dung dịch muối

8

c Bàn luận:

- Khi cho dư lượng muối sẽ làm dư các ion kim loại nặng và kết tủa tan ra do phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân tử protein làm chúng cùngtích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) Ioncóhóa trị càng cao thì kết tủa càng dễ tan trở lại

4 Kết tủa protein bằng nhiệt: a Cách thực hiện:b Kết quả:

Hình 5: Lần lượt các ống nghiệm 1, 2, 3, 4, kết 5 tủa sau khi đun

9

c Bàn luận:

Ống nghiệm

Protein trứng

NaCL

bão hòa Gia nhiệt

- Ống nghiệm 1: Xuất hiện kết tủa trắng, đun sôi có sủi bọt khí Do protein bị nhiệt làm các mạch bị giãn nở, liên kết bị phá vỡ nên tạo thành kết tủa

- Ống nghiệm 2: Sủi bọt khí và có kết tủa trắng nhanh hơn ống 1 Có 1 giọt CH3COOH 1% tạo môi trường acid yếu Trung hòa ít, lượng H+ ít nên tạo kết tủa

- Ống nghiệm 3: Khi đun có sủi bọt khí nhưng không xuất hiện kết tủa Khi nhỏ 7 giọt CH3COOH 10% tạo nên môi trường acid mạnh Lượng H+nhiều làm cho các phần tử protein tích điện dương nên không có kết tủa

- Ống nghiệm 4: Khi đun sủi bọt khí và sau đó hơi ngả vàng nhạt NaOH 10% tạo nên môi trường kiềm và làm protein tích điện âm

- Ốngnghiệm 5: Xuấthiện kết tủa nhanh nhất CH COOH3 10% và NaCl bão hòa tạo môi trường trung hòa về điện giúp protein lên dễ dàng tủa

5 Xác định điểm đẳng nhiệt của protein: a Cách thực hiện:

- Lấy 4 ống nghiệm bằng nhau (sạch, đã sấy khô), cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch Na2HPO4'và acid citric theo bảng sau, nhớ lắc đều rồi cho albumin vào, thêm cồn, lắc nhẹ

- Để yên phút 5 sẽ xuất hiện kết tủa các mức độ ở khác nhau Ghi nhận kết quả Hãy xác định pH đẳng điện của albumin

10 Ống

nghiệm

Na HPO24

0.2 M (ml)

Acid citric 0.1 M (ml)

pH tương ứng

Lượng dd albumin 1%

11

c Bàn luận:

- Cả 4 ống đều đục nhưng ống 3 có độ đục nhanh và nhiều nhất nên ta có thể suy ra điểm đẳng điệncủa albumin là4.7 vì tại điểm đẳng điện dung dịch protein dễ dàng bị kết tủa khi thêm vào một lượng nhỏ các chất gây kết tủa

6 Đông tụ sữa bằng protein:a Cách thực hiện:

- Pha dung dịchsữagầy 10% trong CaCl2'0,01M

- Cân 10gthơmbỏ vào cối chày giã thật nhuyễn, dùng giấy lọc để chắt lấy nước.- Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nghiệm, để vào bể điều nhiệt đến khi đạt 50oC - Cho một lượng dịch enzyme (khoảng 0,1 - 0,5ml), lắc đều

- Tiếp tục giữ ở 50℃ ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzymevàochođến lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền đỏ của nhiệt kế (dung dịch enzyme cần được chuẩn bị sao cho thời gian đông tụ sữa khoảng 1 5 phút).-

Kết quả tính:

𝐸" =" 𝑉𝑠" "×"𝐾"=" 5"''

×"1"="10 42 (ĐV/mL)𝑇×𝑉𝐸"1.6'×'0.3'

13 Trong đó:

E: hoạt lực đông tụ sữa, (ĐV/mL) 𝑉𝑠': thể tích dung dịch sữa, (mL) T: thời gian đông tụ sữa, (phút) 𝑉𝐸: thể tích dịch enzyme sử dụng, (mL) K: độ pha loãng dịch enzyme !

!!!

2 Cách tiến hành

- Dùng 2 ống nghiệm cho các chất vào theo thứ tự sau:Ống

nghiệm Glucose 1% Fructose

1% Fehling A Fehling B Gia nhiệt

Tên bài: ĐỊNH TÍNH & KHẢO SÁT GLUCID Ngày nghiệm: 07/09/2023 thí

- Fructose cho ra phản ứng nhiều hơn Glucose vì Fructose có thêm 1 nhóm OH ở C-2 hay gọi là OH Glucoside và nhóm OH này giúp Fructose dễ bị khử hơn và mất oxy nhiều hơn nên gây sủi bọt khi phản ứng

II Xác định tính khử của đường đôi bằng phản ứng Fehling

1 Nguyên tắc

- Khi 2 phản ứng Monosacarit kết hợp với nhau tạo một Disaccarit, nếu nhóm OH Glucoside của đường đơn thứ nhất kếp hợp với nhómOH Alcol của đường đơn thứ hai thì đường đôi tạo thành còn mang tính khử (như Maltose), còn nếu nhóm OH Glucoside của đường đơn thứ nhất kết hợp với nhóm OH Glucoside của đường đơn thứ hai thì đường đôi tạo thành không còn mang tính khử (như Saccarose)

Lactose 2%

Saccarose 2%

Fehling A

Fehling B

Gia nhiệt

cách thủy

1 2 3

3 Kết quả

- Sau khi đun cách thủy thì ống nghiệm 1 chứa Lactose cho kếttủađỏ nâu, ống nghiệm 2 chứa Maltose có kết tủa đỏ nâu nhưng cho màu nhạt hơn kết tủa ở ống nghiệm 1 Riêng ống nghiệm thứ 3 chứa Saccarose thì không xuất hiện kết tủa sau khi đun cách thủy

Hình 2 Kết quả thí nghiệm sau khi chohóa chất vào và đun cách thủy

4 Bàn luận

- Maltose và Lactose đều thuộc nhóm Disaccaarit và cả 2 đều có nhóm OH glucoside tự do vì đều được tạo thành từ 1 nhóm OH glucoside liên kết với OH ở nhóm C-4 Glucose nên giữ được tính khử

- Còn Saccarose thuộc nhóm Disaccarit nhưng không có tính khử vì không có nhóm OH glucoside tự do Do Saccarose được cấu tạo từ α-D-Glucose và β-D-Fructose nên khi 2 monosaccarit này liên kết với nhau qua liên kết Glucoside được tạo thành giữa 2 nhóm OH glucoside của chúng, điều đó khiến cho cấu trúc Saccarose bền hơn và không có tính khử

III Chiết xuất glycogen

1 Nguyên tắc

- Glycogen cũng thuộc glucan, là polysaccarit dự trữ của người và động vật, có nhiều trong gan, óc, nhộng tầm… có một ít ở mô cơ Phân tử glycogen có cấu tạo phân nhánh tương tự như amilopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn Phần lớn các gốc glucose trong phân tử kết hợp với nhau qua liên kết a-1- - 4 glucozit, liên kết a-1-6- glucozit ở acid Khi thủy phân hoàn toàn glycogen nhận được a-D-glucose

2 Cách tiến hành

Hình 3 Sơ đồ khối cách tiến hành thí nghiệm chiết xuất glycogen

5g gan tươi (đã nghiền nát) + 20ml KOH 30% đã đun nóng

Cho vào cốc thủy tinhĐun và khuấy liên tục đến khi gan

tan hết

Để nguội, thêm 2ml Na2SO4 10% + 50 ml cồn 96o

Thu tủa dồn vào lọ sấy khô

3 Kết quả

- Sau thí nghiệm ta thu được kết tủa trắngđục là glycogen.

Hình 4 Glycogen thu được sau khi tách chiết

4 Bàn luận

- Các hóa chất cho vào khi thực hiện thí nghiệm:

+ Khi cho KOH 30% đã đun nóng vào làm phá hủy mô gan giúp glycogen sẽ được giải phóng

+ Thêm Na2SO4 giúptănghiệusuất của quá trình hình thành kết tủa glycogen + Thêm cồn 96 vào nhằm tạo điều kiện thuận lợi để hình thành kết tủa IV Thủy phân tinh bột

1 Nguyên tắc

- Khi đun nóng tinh bột trong môi trường acid thì acid phân giải tinh bột Sự phân giải lúc đầu qua các sản phẩm trung gian và sau cùng tạo maltose và glucose Các sản phẩm dextrin trung gian có phân tử lượnng khác nhau khitác dụng vớiiod cho ra các màu khác nhau:

Bước 1: Thủy phân tinh bột

Đun cách thủy khoảng 13 phút (đậy nắp miệng cốc bằng mặt kính đồng hồ)

Cho vào cốc thủy tinh 10ml tinh bột 1% + 5ml HCl 10%

Bước 2: Kiểm tra dịch thủy phân: sau khi kếtthúcphản ứng thủy phân, làm nguội rồi tiến hành như sau:

Tinh bột + Iod à màu xanh Amylodextrin + Iod à màu tím Eritodextrin + Iod à màu đỏ nâu Achrodextrin + Iod à màu vàng nâuMaltose và glucose + Iod à màu vàng của Iod

- Dựa vào sự thay đổi màu với hồ tinh bột mà xác định được phản ứng đang xảy ra ở giai đoạn nào hay nói cách khác kiểm tra mức độ bị thủy phân của tinh bột và đánh giá phần nào phân tử lượng của sản phẩm bị thủy phân

2 Cách tiến hành

Ống nghiệm Dịch thủy phân

Hình 6 Kết quả của thí nghiệm thủy phân tinh bột khi cho Fehling vào và đun nóng

4 Bàn luận

- Iod tạo màu với tinh bột và các sản phẩm dextrin trung gian vì phân tử iod được sắp xếp ở bên trong các vòng xoắn của tinh bột và các sản phẩm dextrin trung gian tạo ra phản ứng màu đặc trưng Ở ống nghiệm 1 tinh bột bị thủy phân thành maltose và glucose mà maltose và glucose không có cấu trúc xoắn ốc nên chỉ có màu vàng của dung dịch iod Tinh bột thủy phân hoàn toàn sẽ cho màu vàng của iod

- Ở ống nghiệm 2, khi đun dung dịch ban đầu sẽ không tạo kết tủa nhưng khi cho thêm 0.5 ml dung dịch Fehling B sẽ xuất hiện kết tảu màu đỏ gạch là Cu2O Vì dung dịch Cu(OH)2 tác dụng với Fehling B tạo ra ion Cu làm phản ứng diễn ra nhanh hơn và 2+

tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn thành maltose và glucose mà maltose và glucose có tính khử nên xuất hiện kết tủa đỏ gạch khi đun với dung dịch Fehling

1 Nguyên!tắc!

Qua 2 giai đoạn

a Giai đoạn vô cơ hóa:

- Nitơ tổng số là tất cả các dạng nitơ có trong mẫu Khi đốt nóng mẫu cần phân tích với H2SO4 đậm đặc có mặt của chất xúc tác, nitơ ở tất cả các dạng đạm có trong mẫu đều biến thành dạng vô cơ (NH4)2SO4

tan trong dung dịch

H2SO4dư + NaOH = Na2SO4 + H2O (4)

2 Cách!tiến!hành!

a Vô!cơ!hóa.!Tiến hành trong tủ Hotte

ĐIỂM!

- Cho!mẫu!vào!bình!Kjendahl:!hút!1ml!nước!mắm!hoặc!nước!tương!(chú!ý!sao!cho!nguyên!liệu!không!dính!vào!thành!cổ!bình).!Thêm!10ml!H2SO4!đđ!và!0,5g!xúc!tác.!

- Sau!khi!thêm!xúc!tác,!đun!nhẹ!hỗn!hợp,!tránh!sôi!trào!và!chỉ!đun!mạnh!khi!hỗn!hợp!đã!hoàn!toàn!chuyển!sang!dịch!lỏng.!Trong!quá!trình!đun!thỉnh!thoảng!lắc!nhẹ,!tráng!khéo!léo!sao!cho!không!còn!một!vết!đen!nào!của!mẫu!nguyên!liệu!chưa!bị!phân!hủy!còn!sót!lại!trên!thành!bình.!Đun!cho!tới!khi!dung!dịch!trong!bình!hoàn!toàn!trong!suốt.!

- Chuyển!toàn!bộ!dung!dịch!đã!vô!cơ!hóa!xong!bào!bình!định!mức!100ml,!thêm!nước!cất!cho!đến!vạch!định!mức.!Chú!ý!phải!làm!nguội!và!lắc!đều.!

b Cất!đạm.!!

- Cho!10ml!H2SO4##0,1N!vào!bình!Kjendahl,!10ml!dung!dịch!đã!vô!cơ!hóa!vào!Erlen.!Cho!cả!hai!vào!máy!cất!đạm.!

- Sau!khoảng!4!phút,!ta!lấy!erlen!chứa!dung!dịch!mẫu!ra!khỏi!máy!cất!đạm.!Nhỏ!vào!erlen!5!giọt!phenolphtalein.!

4 Tính!toán!

a Tính!hệ!số!hiệu!chuẩn!F!của!dung!dịch!NaOH.!

- F!là!tỉ!số!giữa!nồng!độ!thực!tế!và!nồng!độ!lý!thuyết!của!NaOH.!!

Ta!có:!Thể!tích!NaOH!sau!khi!chuẩn!độ! SOH24!là!11,15!ml!!!!!Đổi!đơn!vị:!11,15!ml!=!0,01115!(l)!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!C!H2SO4#.!V!H2SO4!!=!!!CNaOH###.!VNaOH##!!!!!!!!!!!!!!!!! !!!!!!è 0,1!!!!.!!!!!0,01!!!!=!!!!CNaOH#!.!!!0,01115!!!!!!!!!!!!!!!!! !!!!!è CNaOH#=!0,09!N!

𝐹 = [𝑁𝑎𝑂𝐻' 𝑡ℎự𝑐'𝑡ế ]( )[𝑁𝑎𝑂𝐻'(𝑙ý'𝑡ℎ𝑢𝑦ế𝑡)]=

0,090,1 = 0,9!

b Tính!kết!quả!

*Tính!hàm!lượng!Protein!thô!thông!qua!hàm!lượng!Nitơ!tổng.!

Protein (%) = Nitơ (%) x 6,25 ð Protein!(%)!=!5,18!x!6,25!=!32,36%!!

5 Giải!thích.!

- Việc!bổ!sung!từ!từ!10ml!dung!dịch!H2SO4!đậm!đặc!vào!bình!Kjendahl!để!vô!cơ!hóa!mẫu!để!tránh!hiện!tượng!háo!nước!nhanh!làm!bắn!nước!tung!tóe.!Ta!dùng!H2SO4!đậm!đặc!vì!đó!là!chất!oxi!hóa!mạnh!không!bay!hơi!ở!nhiệt!độ!phòng!mà!chỉ!bay!hơi!ở!nhiệt!độ!450oC!–!500oC!nên!hạn!chế!việc!nhiễm!độc!và!tránh!thất!thoát.!

- Khi!ta!nhìn!thấy!dung!dịch!trong!bình!trở!nên!trong!suốt!chứng!tỏ!sản!phẩm!đã!vô!cơ!hóa!hoàn!toàn!tạo!ra!(NH4)2SO4.!!

- Ta!định!phân!dung!dịch!bằng!NaOH!0,1N.!Trước!đó,!ta!bổ!sung!vài!giọt!phenolphtalein!để!biết!điểm!dừng!định!phân.!Khi!dung!dịch!vừa!xuất!hiện!ánh!hồng!bền!vững!thì!quá!trình!này!hoàn!tất.!

2

I Nguyên tắc

1 Định tính acid amin bằng Nihydrin

- Khi phản ứng với ninhydrin ở nhiệt độ cao các acid amin bị dezamin hóa, oxy hóa nhóm COOH tạo thành NH3 và aldehyde tương ứng ninhydrin bị khử tạo thành diceto oxyhydidren

- Sau đó diceto oxyhydidren , NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử ninhydrin thứ hai tạo phức hợp có màu.

ĐIỂM Bài số: 4

Tên bài: ĐINH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN Ngày thí nghiệm: 21/09/2023

3

2 Định lượng nitơ acid amin theo phương pháp Sorensen

- Dưới tác dụng của formaldehyde (formol) các nhóm amin bị methylene hóa tạo thành các dẫn xuất methylene của các acid amin (Còn gọi là phương pháp chuẩn độ formol)

R!−!CH!−!COOH!+!HCHO! →! R!−!CH!−!COOH!

- Các hợp chất tạo thành là những acid mạnh hơn các acid amin tự do, dễ dàng định phân bằng kiềm qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin của các acid amin có trong nguyên liệu

R!−!CH!−!COOH!+!NaOH!→ R!−!CH!−!COONa!+!! !O! H

II Cách tiến hành

1 Định tính acid amin bằng Nihydrin

- Lấy 2 ống nghiệm rồi tiến hành như sau

5 giọt Bromothymol

Blue 0.04%

Xanh lục nhạt

20 mLdung dịch

pH 9.2

5 giọt Bromothy

mol Blue 0.04%

3 giọt phenolphta

5

Hình 2.4 Thang màu có pH = 9.2

2.2 Chuẩn bị dung dịch formol trung tính

Hình 2.5 Cách tiến hành dung dịch formol trung tính

Cho vào erlen lượng formol cần dùng

3 giọt phenolphtalein

0.5%

Nhỏ từ từ dung dịch NaOH vào

Màu hồng nhạt xuất hiện, đây nắp

6

Hình 2.6 Dung dịch formol trung tính

2.3 Tiến hành định phân mẫu:

Xác định lượng nitơ amin trong nước mắm Nước mắm là một dung dịch thủy phân protein có thể định lượng bằng phương pháp chuẩn độ formol.

Hình 2.7 Cách tiến hành định phân mẫu 1 mL nước

mắm cho vào bình định

mức

Dùng nước cất định mức

7 Bình nón có cùng dung tích với 2 bình màu

chuẩn 20mL + 5 giọt Bromothymol Blue Thêm 3 giọt phenolphtalein 0.5%

Thêm 5 mL formol trung tính (bằng ống đong) Chuẩn độ bằng NaOH 0.05N cho đến khi có

màu giống với bình có pH 9.2

Bình nón có cùng dung tích với 2 bình màu chuẩn 20ml + 5 giọt Bromothymol Blue

Dung dịch màu xanh dương

Dung dịch màu vàng

Thêm từng giọt HCl Thêm từng giọt

H2SO4 0.05N Thêm từng giọt

NaOH 0.05N

Có màu hồng giống với bình

có pH=7

Hình 2.2 Cách tiến hành định phân mẫu có pH = 7

Hình 2.3 Cách tiến hành định phân mẫu có pH = 9.2

8

- Thực hiện chuẩn dộ 3 lần, lấy kết quả trung bình.

- Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu bằng nước cất

2.4 Tính toán

𝑋 = '(𝑎 − 𝑏) ∗ 𝑇 ∗ 0.0007 ∗ 𝑉%&∗ 1000

Trong đó

X: lượng gam Nitơ acid amin có trong 1L nước mắm a: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm b: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn VDM: thể tích bình định mức

V: số mL nước mắm cho vào bình định mức 0.0007: số gam Nitơ ứng với 1ml NaOH 0.05N

III Kết quả thí nghiệmIII.1 Kết quả thí nghiệm 1 Định tính acid amin bằng Nihydrin

– Ống nghiệm 1 đun nóng cho ra màu xanh

– Ống nghiệm thứ 2 không đun cho không có hiện tượng