báo cáo thí nghiệm hóa sinh 2

- Tiếp tục giữ ở 50℃ ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzymevàochođến lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền đỏ của nhiệt kế dung d

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

GVHD: Trần Thị Tuyết Nhung

Nhóm: C5 N2 – Sinh viên thực hiện:

1 Nguyễn Lê Ngọc Bích - 62101088

2 Văn Phạm Như Ngọc – 618H0045

3 Huỳnh Thị Kim Ngân – 622H0011

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

2

I Phản ứng biure

1 Cách tiến hành

Ống nghiệm Biure Protein trứng NaOH 10% CuSO4 2%

2 Kết quả:

Hình 1: 2 ống nghiệm của phản ứng Biure

Điểm Bài số 1

Ngày thí nghiệm 31/08/2023

II Các phản ứng kết tủa của protein:

1 Kết tủa protein bằng muối trung tính:

a Cách thực hiện:

3ml dung dịch protein trứng

+ 3ml (NH4)2SO4 bão hòa Cho vào ống nghiệm 1, lắc đều

Lọc Tủa 1

Thu dịch lọc trong

+ từ từ (NH4)2SO4 tinh thể cho đến khi không tan nữa Cho vào ống nghiệm 2, lắc đều

Tủa 2

- Ở ống nghiệm 2, ta thu được tủa 2 là albumin: Khi lọc, ta được dịch lọc từ ống nghiệm 1 thu albumin bán bão hòa Khi thêm (NH4)2SO4'tinh thể cho đến khi nó không tan được nữa thì lúcnày (NH4)2SO4'ở trạng tháibão hòa nên sẽ làm albumin kết tủa

5

Cho vào mỗi ống 1 ml protein trứng

Lắc nhẹ

Ống 1: 5 giọt TCA 10%

Lắc nhẹ

Ống 2: 5 giọt acidsunfolsalisilic 10%

2 Kết tủa protein bằng acid hữu cơ:

a Cách thực hiện:

b Kết quả:

Hình 3: Ống nghiệm 1 2 và kết tủa protein bằng

acid hữu cơ

6

c Bàn luận:

- Ống nghiệm 1: tạo kết tủa trắng đục

- Ống nghiệm 2: tạo kết tủa trắng đục nhưng nhanh hơn và nhiều hơn

- Sự khác nhau giữa 2 loại tác nhân

+ Acid Sunfosalisilic có tính acid mạnh hơn TCA và acid sunfosalisilic có thể kết tủa protein, polypeptide và acid amin

+ TCA chỉ có khả năng kết tủa protein nên acid Sunfosalisilic có thời gian kết tủa nhanh và độ đục nhiều hơn

3 Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng:

a Cách thực hiện:

Ống nghiệm Dung dịch nhỏ vào Lần 1 Lần 2 Nhận xét

Thuận nghịch

giọt đầu, khi nhỏ lượng dư thì tan.Không thuận nghịch

Nhỏ 1 giọt theo thành ống chờ cho Cho lượng thừa

Xuất hiện kết tủa ở giọt đầu, khi nhỏ đến khi kết tủa để xem tủa tan đến lượng dư

Thuận nghịch

khi nhỏ lượng dư thì tan

7

b Kết quả:

Lần 1:

Lần 2:

Hình 4.1: Lần lượt các ống nghiệm 1,2,3,4 sau khi cho giọt dung dịch muối 1

Hình 4.2: Các ống nghiệm ở lần sau 1 khi cho lượng dư dung dịch muối

8

c Bàn luận:

- Khi cho dư lượng muối sẽ làm dư các ion kim loại nặng và kết tủa tan ra do phân tử keo hấp thụ các ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân tử protein làm chúng cùngtích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) Ioncóhóa trị càng cao thì kết tủa càng dễ tan trở lại

4 Kết tủa protein bằng nhiệt:

a Cách thực hiện:

b Kết quả:

Hình 5: Lần lượt các ống nghiệm 1, 2, 3, 4, kết 5 tủa sau khi đun

NaCL bão hòa Gia nhiệt

- Ống nghiệm 1: Xuất hiện kết tủa trắng, đun sôi có sủi bọt khí Do protein bị nhiệt làm các mạch bị giãn nở, liên kết bị phá vỡ nên tạo thành kết tủa

- Ống nghiệm 2: Sủi bọt khí và có kết tủa trắng nhanh hơn ống 1 Có 1 giọt CH3COOH 1% tạo môi trường acid yếu Trung hòa ít, lượng H+ ít nên tạo kết tủa

- Ống nghiệm 3: Khi đun có sủi bọt khí nhưng không xuất hiện kết tủa Khi nhỏ 7 giọt CH3COOH 10% tạo nên môi trường acid mạnh Lượng H+nhiều làm cho các phần tử protein tích điện dương nên không có kết tủa

- Ống nghiệm 4: Khi đun sủi bọt khí và sau đó hơi ngả vàng nhạt NaOH 10% tạo nên môi trường kiềm và làm protein tích điện âm

- Ốngnghiệm 5: Xuấthiện kết tủa nhanh nhất CH COOH3 10% và NaCl bão hòa tạo môi trường trung hòa về điện giúp protein lên dễ dàng tủa

5 Xác định điểm đẳng nhiệt của protein:

a Cách thực hiện:

- Lấy 4 ống nghiệm bằng nhau (sạch, đã sấy khô), cho vào mỗi ống nghiệm dung dịch

Na2HPO4'và acid citric theo bảng sau, nhớ lắc đều rồi cho albumin vào, thêm cồn, lắc nhẹ

- Để yên phút 5 sẽ xuất hiện kết tủa các mức độ ở khác nhau Ghi nhận kết quả Hãy xác định pH đẳng điện của albumin

pH tương ứng

Lượng dd albumin 1%

(ml)

Rượu ethylic (ml) Kết quả

11

c Bàn luận:

- Cả 4 ống đều đục nhưng ống 3 có độ đục nhanh và nhiều nhất nên ta có thể suy ra điểm đẳng điệncủa albumin là4.7 vì tại điểm đẳng điện dung dịch protein dễ dàng

bị kết tủa khi thêm vào một lượng nhỏ các chất gây kết tủa

6 Đông tụ sữa bằng protein:

a Cách thực hiện:

- Pha dung dịchsữagầy 10% trong CaCl2'0,01M

- Cân 10gthơmbỏ vào cối chày giã thật nhuyễn, dùng giấy lọc để chắt lấy nước

- Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nghiệm, để vào bể điều nhiệt đến khi đạt 50oC

- Cho một lượng dịch enzyme (khoảng 0,1 - 0,5ml), lắc đều

- Tiếp tục giữ ở 50℃ ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzymevàochođến lúc vừa xuất hiện những hạt sữa mịn nhỏ, hiện rõ trên nền

đỏ của nhiệt kế (dung dịch enzyme cần được chuẩn bị sao cho thời gian đông tụ sữa khoảng 1 5 phút).-

×"1"="10 42 (ĐV/mL)𝑇×𝑉 𝐸" 1.6'×'0.3'

Tên bài: ĐỊNH TÍNH & KHẢO SÁT GLUCID

Ngày nghiệm: 07/09/2023 thí

II Xác định tính khử của đường đôi bằng phản ứng Fehling

1 Nguyên tắc

- Khi 2 phản ứng Monosacarit kết hợp với nhau tạo một Disaccarit, nếu nhóm OH Glucoside của đường đơn thứ nhất kếp hợp với nhómOH Alcol của đường đơn thứ hai thì đường đôi tạo thành còn mang tính khử (như Maltose), còn nếu nhóm OH Glucoside của đường đơn thứ nhất kết hợp với nhóm OH Glucoside của đường đơn thứ hai thì đường đôi tạo thành không còn mang tính khử (như Saccarose)

Saccarose 2%

cách thủy

1 2 3

3 Kết quả

- Sau khi đun cách thủy thì ống nghiệm 1 chứa Lactose cho kếttủađỏ nâu, ống nghiệm

2 chứa Maltose có kết tủa đỏ nâu nhưng cho màu nhạt hơn kết tủa ở ống nghiệm 1 Riêng ống nghiệm thứ 3 chứa Saccarose thì không xuất hiện kết tủa sau khi đun cách thủy

Hình 2 Kết quả thí nghiệm sau khi chohóa chất vào

và đun cách thủy

4 Bàn luận

- Maltose và Lactose đều thuộc nhóm Disaccaarit và cả 2 đều có nhóm OH glucoside

tự do vì đều được tạo thành từ 1 nhóm OH glucoside liên kết với OH ở nhóm C-4 Glucose nên giữ được tính khử

- Còn Saccarose thuộc nhóm Disaccarit nhưng không có tính khử vì không có nhóm

OH glucoside tự do Do Saccarose được cấu tạo từ α-D-Glucose và β-D-Fructose nên khi 2 monosaccarit này liên kết với nhau qua liên kết Glucoside được tạo thành giữa 2 nhóm OH glucoside của chúng, điều đó khiến cho cấu trúc Saccarose bền hơn và không

2 Cách tiến hành

Hình 3 Sơ đồ khối cách tiến hành thí nghiệm chiết xuất glycogen

5g gan tươi (đã nghiền nát) + 20ml KOH 30% đã đun nóng

Cho vào cốc thủy tinhĐun và khuấy liên tục đến khi gan

Thu tủa dồn vào lọ sấy khô

3 Kết quả

- Sau thí nghiệm ta thu được kết tủa trắngđục là glycogen

Hình 4 Glycogen thu được sau khi

tách chiết

4 Bàn luận

- Các hóa chất cho vào khi thực hiện thí nghiệm:

+ Khi cho KOH 30% đã đun nóng vào làm phá hủy mô gan giúp glycogen sẽ được giải phóng

+ Thêm Na2SO4 giúptănghiệusuất của quá trình hình thành kết tủa glycogen + Thêm cồn 96 vào nhằm tạo điều kiện thuận lợi để hình thành kết tủa

IV Thủy phân tinh bột

1 Nguyên tắc

- Khi đun nóng tinh bột trong môi trường acid thì acid phân giải tinh bột Sự phân giải lúc đầu qua các sản phẩm trung gian và sau cùng tạo maltose và glucose Các sản phẩm dextrin trung gian có phân tử lượnng khác nhau khitác dụng vớiiod cho ra các màu khác nhau:

Bước 1: Thủy phân tinh bột

Đun cách thủy khoảng 13 phút (đậy nắp miệng cốc

bằng mặt kính đồng hồ)

Cho vào cốc thủy tinh 10ml tinh bột 1% + 5ml HCl

10%

Bước 2: Kiểm tra dịch thủy phân: sau khi kếtthúcphản ứng thủy phân,

làm nguội rồi tiến hành như sau:

Tinh bột + Iod à màu xanh Amylodextrin + Iod à màu tím Eritodextrin + Iod à màu đỏ nâu Achrodextrin + Iod à màu vàng nâuMaltose và glucose + Iod à màu vàng của Iod

- Dựa vào sự thay đổi màu với hồ tinh bột mà xác định được phản ứng đang xảy ra ở giai đoạn nào hay nói cách khác kiểm tra mức độ bị thủy phân của tinh bột và đánh giá phần nào phân tử lượng của sản phẩm bị thủy phân

3 Kết quả

- Khi cho dung dịch I2/KIvào dịch thủyphântrongống nghiệm thì dịch có màu 1 vàng đỏ màu của Iot

Hình 6 Kết quả của thí nghiệm thủy phân tinh bột,

sau khi đung nóng 13 phút

- Khi cho Fehling A và Fehling B vào ống nghiệm và đun 2 cách thủy thì thấy xuất hiện đỏ gạch

Hình 6 Kết quả của thí nghiệm thủy phân tinh bột khi cho Fehling vào và đun nóng

4 Bàn luận

- Iod tạo màu với tinh bột và các sản phẩm dextrin trung gian vì phân tử iod được sắp xếp ở bên trong các vòng xoắn của tinh bột và các sản phẩm dextrin trung gian tạo ra phản ứng màu đặc trưng Ở ống nghiệm 1 tinh bột bị thủy phân thành maltose và glucose

mà maltose và glucose không có cấu trúc xoắn ốc nên chỉ có màu vàng của dung dịch iod Tinh bột thủy phân hoàn toàn sẽ cho màu vàng của iod

- Ở ống nghiệm 2, khi đun dung dịch ban đầu sẽ không tạo kết tủa nhưng khi cho thêm 0.5 ml dung dịch Fehling B sẽ xuất hiện kết tảu màu đỏ gạch là Cu2O Vì dung dịch Cu(OH)2 tác dụng với Fehling B tạo ra ion Cu làm phản ứng diễn ra nhanh hơn và 2+

tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn thành maltose và glucose mà maltose và glucose có tính khử nên xuất hiện kết tủa đỏ gạch khi đun với dung dịch Fehling

!

THỰC!HÀNH:!

1 Nguyên!tắc!

Qua 2 giai đoạn

a Giai đoạn vô cơ hóa:

- Nitơ tổng số là tất cả các dạng nitơ có trong mẫu Khi đốt nóng mẫu cần phân tích với H2SO4 đậm đặc

có mặt của chất xúc tác, nitơ ở tất cả các dạng đạm có trong mẫu đều biến thành dạng vô cơ (NH4)2SO4

tan trong dung dịch

!

!Ngày!thực!hiện:!14/09/2023!

!

ĐIỂM!

- Cho!mẫu!vào!bình!Kjendahl:!hút!1ml!nước!mắm!hoặc!nước!tương!(chú!ý!sao!cho!nguyên!liệu!không!dính!vào!thành!cổ!bình).!Thêm!10ml!H2SO4!đđ!và!0,5g!xúc!tác.!

!

- Sau!khi!thêm!xúc!tác,!đun!nhẹ!hỗn!hợp,!tránh!sôi!trào!và!chỉ!đun!mạnh!khi!hỗn!hợp!đã!hoàn!toàn!chuyển!sang!dịch!lỏng.!Trong!quá!trình!đun!thỉnh!thoảng!lắc!nhẹ,!tráng!khéo!léo!sao!cho!không!còn!một!vết!đen!nào!của!mẫu!nguyên!liệu!chưa!bị!phân!hủy!còn!sót!lại!trên!thành!bình.!Đun!cho!tới!khi!dung!dịch!trong!bình!hoàn!toàn!trong!suốt.!

!

- Chuyển!toàn!bộ!dung!dịch!đã!vô!cơ!hóa!xong!bào!bình!định!mức!100ml,!thêm!nước!cất!cho!đến!vạch!định!mức.!Chú!ý!phải!làm!nguội!và!lắc!đều.!

!

b Cất!đạm.!

!

- Cho!10ml!H2SO4##0,1N!vào!bình!Kjendahl,!10ml!dung!dịch!đã!vô!cơ!hóa!vào!Erlen.!Cho!cả!hai!vào!máy!cất!đạm.!

!

- Sau!khoảng!4!phút,!ta!lấy!erlen!chứa!dung!dịch!mẫu!ra!khỏi!máy!cất!đạm.!Nhỏ!vào!erlen!5!giọt!phenolphtalein.!

0,090,1 = 0,9!

- Khi!ta!nhìn!thấy!dung!dịch!trong!bình!trở!nên!trong!suốt!chứng!tỏ!sản!phẩm!đã!vô!cơ!hóa!hoàn!toàn!tạo!ra!(NH4)2SO4.!!

!

- Ta!định!phân!dung!dịch!bằng!NaOH!0,1N.!Trước!đó,!ta!bổ!sung!vài!giọt!phenolphtalein!để!biết!điểm!dừng!định!phân.!Khi!dung!dịch!vừa!xuất!hiện!ánh!hồng!bền!vững!thì!quá!trình!này!hoàn!tất.!

2

I Nguyên tắc

1 Định tính acid amin bằng Nihydrin

- Khi phản ứng với ninhydrin ở nhiệt độ cao các acid amin bị dezamin hóa, oxy hóa nhóm COOH tạo thành NH3 và aldehyde tương ứng ninhydrin bị khử tạo thành diceto oxyhydidren

- Sau đó diceto oxyhydidren , NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử ninhydrin thứ hai tạo phức hợp có màu

ĐIỂM Bài số: 4

Tên bài: ĐINH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN

Ngày thí nghiệm: 21/09/2023

3

2 Định lượng nitơ acid amin theo phương pháp Sorensen

- Dưới tác dụng của formaldehyde (formol) các nhóm amin bị methylene hóa tạo thành các dẫn xuất methylene của các acid amin (Còn gọi là phương pháp chuẩn độ formol)

R!−!CH!−!COOH!+!HCHO! →! R!−!CH!−!COOH!

- Các hợp chất tạo thành là những acid mạnh hơn các acid amin tự do, dễ dàng định phân bằng kiềm qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin của các acid amin có trong nguyên liệu

R!−!CH!−!COOH!+!NaOH!→ R!−!CH!−!COONa!+!! !O! H

II Cách tiến hành

1 Định tính acid amin bằng Nihydrin

- Lấy 2 ống nghiệm rồi tiến hành như sau

Bảng 2.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

2 Định lượng nitơ acid amin theo phương pháp Sorensen

2.1 Chuẩn bị thang màu có pH 7 và pH 9.2

- Lấy 2 bình nón có dung tích như nhau

• Cho vào bình thứ nhất:

5 giọt Bromothymol Blue 0.04%

Xanh lục nhạt

20 mL

dung dịch

pH 9.2

5 giọt Bromothy mol Blue 0.04%

3 giọt phenolphta

5

Hình 2.4 Thang màu có pH = 9.2

2.2 Chuẩn bị dung dịch formol trung tính

Hình 2.5 Cách tiến hành dung dịch formol trung tính

Nhỏ từ từ dung dịch NaOH vào

Màu hồng nhạt xuất hiện, đây nắp

6

Hình 2.6 Dung dịch formol trung tính

2.3 Tiến hành định phân mẫu:

Xác định lượng nitơ amin trong nước mắm Nước mắm là một dung dịch thủy phân protein

có thể định lượng bằng phương pháp chuẩn độ formol

Hình 2.7 Cách tiến hành định phân mẫu

7

Bình nón có cùng dung tích với 2 bình màu

chuẩn 20mL + 5 giọt Bromothymol Blue

Thêm 3 giọt phenolphtalein 0.5%

Thêm 5 mL formol trung tính (bằng ống đong)

Chuẩn độ bằng NaOH 0.05N cho đến khi có màu giống với bình có pH 9.2

Dung dịch màu vàng

Thêm từng giọt HCl

Thêm từng giọt H2SO4 0.05N

Thêm từng giọt NaOH 0.05N

Có màu hồng giống với bình

có pH=7

Hình 2.2 Cách tiến hành định phân mẫu có pH = 7

Hình 2.3 Cách tiến hành định phân mẫu có pH = 9.2

8

- Thực hiện chuẩn dộ 3 lần, lấy kết quả trung bình

- Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu bằng nước cất

X: lượng gam Nitơ acid amin có trong 1L nước mắm

a: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm

b: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn VDM: thể tích bình định mức

V: số mL nước mắm cho vào bình định mức

0.0007: số gam Nitơ ứng với 1ml NaOH 0.05N

III Kết quả thí nghiệm

III.1 Kết quả thí nghiệm

1 Định tính acid amin bằng Nihydrin

– Ống nghiệm 1 đun nóng cho ra màu xanh

– Ống nghiệm thứ 2 không đun cho không có hiện tượng

12

III Kết qu thí nghi ả ệm

Các giấy sắc ký đổi màu xanh tím là do có phả ứn ng giữa các acid amin và ninhydrin với nhau Qua

đó ta có th xác đ nh acid amin có trong m u hay không.ể ị ẫ

Vì là các loại acid amin khác nhau nên sau thời gian thí nghiệm thì các acid amin sẽ nằm lại những vùng khác nhau trên gi y sấ ắc ký

14

I Nguyên tắc

- Đường khử là đường chứa nhóm Aldehyde ( CHO) và nhóm Ketone (-CO) như đường glucose, fructose,… Ngoài ra, nhóm disaccharide là đường khử nếu có nhóm OH hemiacetal tự do -như maltose,…Trong khi đó, saccharose và trehalose không phải là đường khử

Phương pháp định lượng đường khử dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử 3,5-Dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong phạm vi nhất định Dựa theo đồ thị chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS, ta sẽ xác định được hàm lượng đường khuqr của mẫu nghiên cứu

I Cách tiến hành

1 Trích đường

- Cân 10g thơm Nghiền, cho vào becher và cho vào 20 mL cồn 96o Đun cách thủy cho sôi 3 lần Để nguội, lọc lấy bã Thêm 10 mL c n 80 vào cồ o ốc đựng bã Đun cách th y cho sôi 2 l n, lủ ầ ọc, rửa bã 2 lần b ng c n 80ằ ồ o Dồn nh ng ph n c n thu đưữ ầ ồ ợc cho bay hơi bằng cách chưng cách th y ủ

- Thêm 40 mL nước cất và 3 gi t đọ ỏ methyl, trung hòa bằng NaOH 0,1N đ n khi dung dịế ch xuất hiện màu vàng nh t Cho vào bình định mạ ức 100 mL thêm nư c cớ ất đến vạch (đây là dung dịch đường chưa biết nồng độ)

Tiến hành:

Ta có 2 ống nghiệm:

+ Ống 1: chứa 1mL nước cất + 1mL dung dịch DNS

+ Ống 2: chứa 1mL mẫu đã chuẩn bị + 1mL dung dịch DNS

- Đậy kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy 2 ống nghiệm trên trong 5 phút

- Làm nguội nhanh ống nghiệm trở về nhiệt độ phòng rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 10mL nước cất

- Lắc đều ống nghiệm đến khi hết phân lớp

- Đem hai ống nghiệm đo OD ở bước sóng 𝜆 = 540𝑛𝑚