Đang tải... (xem toàn văn)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH Họ và tên SV Nguyễn Thị Thảo Lớp KTTP – 02– K64 MSSV 20190569 Mã lớp 705035 Giảng viên hướng d[.]
TRƯỜNGĐẠI HỌCBÁCHKHOA HÀNỘI VIỆNCƠNGNGHỆSINHHỌC&CƠNGNGHỆTHỰCPHẨM BÁOCÁO THÍNGHIỆMHĨASINH HọvàtênSV: NguyễnThịThảo Lớp: KTTP –02–K64 MSSV: 20190569 Mãlớp: 705035 Giảngviênhướngdẫn: TS.ĐỗBiênCương THS.LêThịHuyền BÁO CÁOTHÍNGHIỆM BÀI1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITO TỔNG SỐBẰNGPHƯƠNGPHÁPKJELDAHL I NguyêntắcphươngphápKjeldahl Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích vớiH2SO4 đậm đặc, hợpchấthữucơbịơ xihóa.CácbonvàhidrotạothànhCO2vàH2OcịnNitogiảip hóng dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tantrongdungdịchH2SO4 Mẫu+H2SO4 CO2 + H2O +NH3 +SO2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 ĐuổiNH3rakhỏidungdịchbằngNaOH,đồngthờicấtvàthuNH3bằngH3BO3dư: (NH4)2SO4 +2NaOH= 2NH3+2H2O +Na2SO42NH3+4H3BO3= ) B4O7+ 5H2O (NH4 Địnhphânlượng(NH4)2B4O7bằngH2SO4chuẩn,quađódễdàngtínhđượclượng Nitocótrongmẫuvật: (NH4)2B4O7+H2SO4=H3BO3+(NH4)2SO4 Xanh Tímhồng Tím II Cácbướcthínghiệm: Bước1: Cất đạm: Mẫuthínghiệm: - ChuẩnbịbìnhhấpthụNH3: Chovàobìnhtamgiác(cỡ100ml,miệngrộng):20ml H3BO33%(dùngốngđong) 23giọtchỉthịTashiroLắpbì nhvàobộcấtđạm -Chovào bầu cất: 5mlNaOH40%(dùngốngđong) 2mlH2O(đểtrángphễu)(dùngmicropipet) 5mldịchvơcơhóamẫu(dùngmicropipethútdịch -Đóngkhóabầucất -Tiếnhànhcất(khoảng5-7phút).Saukhithấy dungdịchtrongìnhhấpthụNH3chuyểntừmàutímhồngthànhmàuxanhđợikh oảng5phút.Hạbình,dùnggiấyquỳtímhứngmộtgiọtnướcngưngchảyratừống sinhhàn.Thấygiấyđổimàu,đặtbìnhhứngvàovịtrícũ.Khikhơngthấyđổimàu,lấy bìnhhấpthụrakhỏibộcất,tianướccấttrángđiốngsinhhàn Mẫukiểmchứng: - ChuẩnbịbìnhhấpthụNH3: Cho vào bình tam giác (cỡ 100 ml):20 ml H3BO33% (dùng ống đong)2-3giọtchỉthịTashiro Lắpbìnhvàobộcấtđạm(điốngsinhhànngậptrongdungdịch) - Chovàobầucất: 5mlNaOH40%(dùngốngđong) 7mlH2O(5mlthaychodịchvơcơhóa)Đ óngkhóabầucất Bước 2:Địnhphân: Địnhphânlượng(NH4)2B4O7tạoratrongbìnhhấpthụNH3bằngH2SO40,1N GhilượngH2SO40,1Ndùngđịnhphânchomẫuthínghiệmvàmẫukiểmchứng III Xửlí kếtquả: Khốilượngmẫuban đầum=5g; Thểtíchdịchvơcơhóamẫu:V=5ml; Thể tích H2SO4dùng cho mẫu thí nghiệm: V=4,75 ml;ThểtíchH2SO4dùngchomẫukiểmchứng:V=0,25ml; ThểtíchH2SO4dùngđểđịnhphânmẫu:4,75-0,25=4,5ml; 1ml tiêutốnchođịnhphântươngứngcho1,4mgNitotrongmẫu 4,5mlH2SO4địnhphânthìmẫucó4,5*1,4=6,3mg Vậy 5ml dungdịchvơcơhóamẫucóchứa6,3mgNito100m ldungdichvơcơhóamẫuchứa: 6,3×100= 126mg=0,126gNitơ VậytrongmẫuNitơchiếm: 0,126×100 = 2,52% IV Nhậnxétkếtquả: - Kếtquảcósựsailệchvì: Khiđunvơcơhóamẫudungdịchsơivàbámtrênthànhbìnhvìvậykhơngđư ợcvơcơhóamẫuhồntồn -Trongqtrìnhcấtđạmkhíbịbayrangồi dolắpđặtthiếtbịbịlệch -LượngH2SO4đ e m đihấpthụdưkhơngđủlớnnên khơnghấpthụtriệtđểlượngNH3ba y Cácphươngphápgiảmthiểusaisố: Rửasạchbộcấtđạmtrướckhisửdụngdocóthểmẫuthínghiệmcịnsótlạitrongbộcất Khichohóachấtvàobìnhcấtcầnmởkhóavantừtừtránhmởđộtngộtkhiếnápsuất thayđổigâythấtthốtđạm -Khiđunlắc nhẹđểchocác vếtđentrơixuốngdungdịch -Lắpthiếtbịchắc chắn,khơngbịnghiêngđểkhíkhơngthốtrangồi KhilắpbìnhhấpthụđiốngsinhhànphảingậptrongbìnhhấpthụNếuk hơngNH3sẽbịthấtthốtrangồimơi trường BÁO CÁOTHÍNGHIỆM BÀI2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN HÒA TAN BẰNG PHƯƠNGPHÁPLOWRY I Nguyêntắc: - Phươngphápdựatrêncơsởphảnứngtạomàugiữaproteinvàthuốcthửfolin Cườngđộmàucủahỗnhợpphảnứngtỷlệthuậnvớinồngđộproteintrongmộtphạm vinhấtđịnh.Biếtđượcmậtđộquangcủadungdịchprotein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa theo đường chuẩn protein tinhkhiếtvớithuốcthửnày,cóthểdễdàngtínhđượchàmlượngproteincủamẫunghiê ncứu - Đâylàphươngpháprấtnhạyvàchínhxác,đượcdùngphổbiếntr ongviệc xácđịnhprotein.Phươngphápdùngđối với proteinhịatan - Baogồm2giaiđoạn: + Phản ứng biure: Đây phản ứng đặc trưng liên kết peptide (CONH-).Trongmơitrườngkiềm,cáchợpchấtcóchứatừhailiênkếtpeptidetrởlêncót hểphảnứngvớiCuSO4tạothànhphứcchấtmàuxanhtím,tím,tímđỏhayđỏ.Cư ờngđộmàuthay đổi tùy thuộc vàođộdài mạchpeptide + Phản ứng với thuốc thử folin: Thuốc thử folin có chứa axitphosphomolipdic axit phos-phovolframic Các chất mặt làm tăngđộnhạycủaphảnứngbiure,mộtmặtkhácphảnứngvớigốcTyrvàTrptrongp hântử protein.Cácaxitaminnàythamgiatrongqtrìnhtạophứcchấtcómàuxanhd atrời,hấpthụcựcđạibướcsóngở750nm - ĐomậtđộquangOD.ĐịnhluậtLamba–Beer A=OD =logIoI=εLC C:nồngđộ chấthấp thụánhsáng(mg/ml, mmol/ml) L:chiềudàylớpdungdịch ε:hệsốhấpphụp h â n tử(đặctrưngchotừngloạichất) =>OD =εLC=kC(k:const) =>OD =f(C)=>quanhệtuyếntính>xácđịnhlượngproteinthơngquaC II Cácbướcthínghiệm: Chuẩnbị6ốngnghiệmsạch: Ốngfalcon Dung 0,2 0,4 0,6 0,8 dịchBSAgốc( ml) Nướccất (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 Lấyvàoốngnghiệm(khô,sạch): 0,2mldịchBSAđãphaởtrên(dùngmicropipet) 2ml dungdịchC(hỗnhợpdungdịchA:B=50:1mới pha) (dùngmicropipet) Trộn đều.Đểyên 10 phút Chotiếp0,2ml dungdịchFolin.Trộnđều(bằngtay bằngmáytrộn Voltex) Đểphảnứng20phút Đođộhấpthụcủadungdịchmàutạibước sóng750nmvới dungdịchđốisánh làmẫutrongốngnghiệm1 Mẫuthínghiệm:Mẫuthựcphẩmxúcxích Chuẩnbịdịchproteinphântích - Dùngốngđongchuẩnbị20mlNaOH0,1Nvàotrongcốcdungtích100ml - Cânchínhxác 0,3gmẫu;chuyểnmẫuvàocối,chomộtítdungdịchNaOH0,1Ntừcốc vàođểlàmẩm - Nghiềnnhuyễnmẫu;chuyểntồnbộmẫuvàobìnhtamgiácdungtích10 0ml - Trángsạchcối chàybằngdungdịchNaOH 0,1N cịnlại - Đặtbìnhmẫuvàonồiđuncáchthuỷđểchiếtproteintrong15phút - Lấymẫura,làmnguội,trunghồ(tớipH7)bằngHCl0,1N(dùngđũathủytinhchấ m dịchlênmiếnggiấy thửpHvàsovớidảimàuchuẩn) - Chuyểnmẫusangbìnhđịnhmức100ml,địnhmức bằngnướccấttới vạch.Trộnđều - Lọc trong,thudịchlọc proteinphântích Tiến hành phản ứng đo độ hấp thụMẫuthínghiệm: Lấyvàoốngnghiệm(khơ,sạch): 0,2mldịchlọc protein(dùngmicropipet) 2ml dungdịchC(hỗnhợpdungdịchA:B=50:1mới pha) (dùngmicropipet)Trộnđều.Đển10phút Chotiếp0,2ml dungdịchFolin.Trộnđều(bằngtay bằngmáy trộnVoltex) Đểphảnứng20phút Mẫu kiểm chứng(làm song song với mẫu thí nghiệm ):Lấyvàoốngnghiệm(khơ,sạch): 0,2mlH2O(dùngmicropipet) 2ml dungdịchC(dùngmicropipet)Trộ nđều.Đển10phút Chotiếp0,2ml dungdịchFolin.Trộnđều(bằngtay bằngmáy trộnVoltex) Đểphảnứng20phút Đođộhấpthụánhsáng Đọc kỹHướngdẫnsửdụngmáyđoquangtại PTN,SVđềnghịKỹthuậtviêncủaPTN hướngdẫnsửdụngmáy Đođộhấpthụcủadungdịchmàucủacácốngthínghiệmởbước sóng750nm,vớidung dịchđối sánhlàmẫukiểmchứng.Ghi kếtquả Sửdụngđườngchuẩnproteinđểtínhhàmlượngproteincủadungdịchnghiênc ứu III Kếtquảthínghiệm:khốilượngmẫuxúcxíchm=0,55g Ống MẪU thínghiệm Nồng 0,2 0,4 0,6 0,8 0,001 0,163 0,241 0,348 0,444 0,526 0,175 độproteinCi (mg/ml) OD750nm Xâydựngđườngchuẩn: Từđồthịđườngchuẩntacóy =0.5114x+0.0313vớiR^2=0.9878 TađođượckếtquảODcủa mẫuthí nghiệmlà y=0,175từđótínhđược:x=(0,1750,0313)/0,5114=0,281mg/ml Từthực nghiệm1mldịchlọc chứa0,281mgprotein ->100mldịchlọc chứa:100*0,281=28,1mg=0,0281g; Vậytỉlệphầntrămproteintrongmẫulà: 0,0281/0,55=5.11% IV Nhận xét kết quảvàchúý: Chuẩn bịdịchphân tích