Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường: Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng, dịch tễ và sự biến đổi, đột biến gen ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

MẪU 13/KHCN Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-ĐHQGHN ngày tháng năm 2022 của Giám đốc Đại học Quốc gia Hà Nội ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ KH&CN CẤP ĐẠI HỌC Q

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

MẪU 13/KHCN

(Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-ĐHQGHN ngày tháng năm 2022

của Giám đốc Đại học Quốc gia Hà Nội)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng, dịch tễ và sự biến đổi, đột biến gen ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

Mã số nhiệm vụ:

Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Chu Đình Tới

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng, dịch tễ và sự biến đổi, đột biến gen ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

2 Mã số:

3 Danh sách thành viên tham gia thực hiện nhiệm vụ

TT Họ và tên Đơn vị công tác Chức danh trong nhiệm vụ

1 TS Chu Đình Tới Trường Quốc tế, ĐHQGHN Chủ nhiệm

2 TS Bs Đặng Tiến

Trường

Phó chủ nhiệm Bộ môn Giải phẫu,

3 TS Bs Phạm Văn

Bình

GĐ Trung tâm PTNS Robot, Trưởng khoa Ngoại Bụng 1, Phó Giám đốc Bệnh viện K

Ngọc Sương Mai Trường Quốc tế, ĐHQGHN Thành viên chính

7 ThS Bùi Nhật Lệ Trường Quốc tế, ĐHQGHN Thành viên chính

Thành viên

10 Bs Hà Hải Nam Phó trưởng khoa Ngoại Bụng 1,

Bệnh viện K Trung ương Thành viên

11 Bs Trần Đình Tân Phó trưởng khoa Ngoại Bụng 1,

Bệnh viện K Trung ương Thành viên

14 CN Bùi Thu Anh Kỹ thuật viên, Công ty TNHH

15 CN Nguyễn Thị

Nga

Kỹ thuật viên, Công ty TNHH

4 Đơn vị chủ trì: Trường Quốc tế, ĐHQGHN (Trước là Khoa Quốc tế, ĐHQGHN)

5 Thời gian thực hiện:

5.1 Theo hợp đồng: 12 tháng, từ 26 tháng 03 năm 2021 đến 26 tháng 03 năm 2022 5.2 Gia hạn (nếu có):

+ Lần 1: 12 tháng, từ 26 tháng 03 năm 2022 đến 26 tháng 03 năm 2023

+ Lần 2: 12 tháng, từ 26 tháng 03 năm 2023 đến 26 tháng 03 năm 2024

5.3 Thực hiện thực tế: 33 tháng, từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 01 năm 2024

6 Tổng kinh phí được phê duyệt của nhiệm vụ: 750 triệu đồng

7 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Không có

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện Nêu rõ

lý do thay đổi)

8 Đề tài nhận được chấp thuận của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học theo Quyết định số 02-2022/NCHG-HĐĐĐ ngày 09 tháng 03 năm 2022 của Viện nghiên cứu

hệ gen thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

9 Đơn vị chủ trì đề tài trân trọng cảm ơn Bệnh viện Ung bướu Trung ương, Hà Nội, Học viện Quân y, Công ty TNHH Khoa học và Dịch vụ Kỹ thuật Genome, Viện nghiên cứu

hệ gen thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phối hợp và hỗ trợ trong quá trình thực hiện đề tài

PHẦN II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Mục lục

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT 1

DANH MỤC HÌNH VẼ 2

DANH MỤC BẢNG BIỂU 2

MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về ung thư buồng trứng 5

1.1.1 Khái niệm 5

1.1.2 Tác động của Ung thư buồng trứng tới sức khỏe 5

1.2 Phương pháp NGS trong nghiên cứu Ung thư buồng trứng 6

1.2.1 Khái niệm NGS 6

1.2.2 Phương pháp NGS trong nghiên cứu sự biến đổi gen ung thư 6

1.2.3 Quy trình thực hiện 6

1.3 Tình hình nghiên cứu sự biến đổi gen ở bệnh nhân ung thư buồng trứng 7

1.3.1 Các nghiên cứu nước ngoài 7

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước 9

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Phương pháp phân tích tổng quan hệ thống (systematic review) 11

2.2 Phương pháp phân tích đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng và dịch tễ của bệnh nhân ung thư buồng trứng 12

2.3 Phương pháp phát hiện đột biến trên gen BRCA1, BRCA2 ở bệnh nhân ung thư buồng trứng 13

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Kết quả nghiên cứu sự đột biến gen BRCA1/2 trên mô ung thư buồng trứng 17

3.1.1 Kết quả phân tích đột biến của gen BRCA1/2 trên mô ung thư buồng trứng

bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới 17

3.1.2 Đặc điểm biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh ở gen BRCA1 và BRCA2 20

3.2 Mối liên quan giữa sự đột biến gen BRCA1/2 và một số đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng, dịch tễ ở bệnh nhân ung thư buồng trứng 22

3.2.1 Đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng và dịch tễ ở bệnh nhân ung thư buồng trứng 22

3.2.2 Mối liên hệ giữa các biến thể trên gen BRCA1/2 và các đặc điểm lâm sàng hoặc cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư buồng trứng 33

3.2.3 Kết quả phân tích tổng quan hệ thống 39

KẾT LUẬN 48

KIẾN NGHỊ 49

Tài liệu tham khảo 50

PHỤ LỤC 64

1

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nội dung đầy đủ Nội dung tiếng Việt

BRCA1/BRCA2 BReast CAncer gene 1/2

máu

embeded

Cố định bằng Formalin

và vùi trong parafin

Gynecology and Obstetrics

Liên đoàn Quốc tế về Phụ khoa và Sản khoa

chuỗi

2

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1 Sơ đồ PRISMA phân tích tổng quan hệ thống 11 Hình 2 Kết quả điện di khi chuẩn bị thư viện DNA cho quá trình giải trình tự 15

Hình 4 Biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh ở gen BRCA1 và BRCA2 20

Hình 3 Trình tự chi tiết của các biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh trên gen

BRCA1 và BRCA2 20

Hình 5 Đặc điểm cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu 27 Hình 6 Đường cong Kaplan Meier phân tích tỉ lệ sống sót của bệnh nhân ung thư buồng trứng 32

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Đặc điểm các biến thể của gen BRCA1 và BRCA2 tìm thấy trên các bệnh nhân

ung thư buồng trứng 17

Bảng 2 Đặc điểm của biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh trên gen BRCA1 và

BRCA2 21

Bảng 3 Một số đặc điểm dịch tễ học của đối tượng nghiên cứu 23 Bảng 4 Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu 24 Bảng 5 So sánh đặc điểm lâm sàng và phi lâm sàng giữa bệnh nhân ung thư buồng trứng

và không ung thư buồng trứng 28 Bảng 6 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nguy cơ biến thể cao và nhóm nguy cơ biến thể thấp 33 Bảng 7 So sánh đặc điểm lâm sàng giữa nhóm mang biến thể P/LP và nhóm không mang biến thể P/LP 35

Bảng 8 Công cụ phát hiện đột biến gen BRCA1/2 trong ung thư buồng trứng 40 Bảng 9 Các yếu tố liên quan đến đột biến gen BRCA1/2 trong ung thư buồng trứng 42 Bảng 10 Ảnh hưởng của đột biến gen BRCA1/2 đến sức khỏe và điều trị ung thư buồng

trứng 45

IV – ung thư đã lan đến các cơ quan xa hơn trong cơ thể [3] Do tính chất phức tạp của bệnh, việc phát hiện và điều trị ung thư buồng trứng là một thách thức lớn đối với sức khỏe toàn cầu Một trong những khó khăn trong điều trị là bệnh nhân khi được chẩn đoán lần đầu thường đã ở giai đoạn muộn do những triệu chứng bệnh ban đầu khá mơ hồ Phụ nữ mắc bệnh ung thư buồng trứng thường được phát hiện sau mãn kinh; do đó, sự phát triển của khối u buồng trứng thường không gây ra các triệu chứng rõ rệt cho đến khi chúng đạt kích thước lớn và lan rộng [4, 5] Điều đó đã cản trở đáng kể sự phát triển của các biện pháp sàng lọc và phát hiện sớm ung thư buồng trứng Vì vậy, đa số bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn muộn và hiệu quả điều trị thấp Theo nghiên cứu của Chandra và cộng sự, có tới 90% trường hợp được chẩn đoán ở giai đoạn muộn khi khối u đã lan đến vùng xương chậu hoặc vùng bụng [4, 5] Tỷ lệ sống sót sau 5 năm của bệnh nhân ung thư buồng trứng được phát hiện ở giai đoạn đầu là 70%; tuy nhiên, điều đáng lo ngại là tỷ lệ này chỉ đạt 35% ở giai đoạn muộn [4] Điều đó nảy sinh nhu cầu cấp thiết phát triển các biện pháp chẩn đoán sớm và tiên lượng điều trị ung thư buồng trứng một cách toàn diện hơn

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ung thư buồng trứng, bao gồm các biến thể di truyền

và một trong những nguyên nhân di truyền được biết đến nhiều nhất là các biến thể dòng

mầm trong gen nhạy cảm (BRCA1/2) Một nghiên cứu của Kast và cộng sự chỉ ra rằng các biến thể BRCA1/2 của dòng mầm góp phần gây ra khoảng 25% bệnh ung thư buồng trứng

và ung thư vú di truyền trên toàn thế giới [6] Hơn nữa, do gen BRCA1 và BRCA2 đóng vai

trò sản xuất protein nhằm mục đích sửa chữa DNA bị hư hỏng, nên các biến thể gây bệnh

trong gen BRCA1/2 được coi là một trong những yếu tố dự báo mạnh mẽ về đáp ứng của

bệnh nhân với nhóm thuốc ức chế poly ADP-ribose polymerase (PARPi)

4

Ngày nay, tiềm năng của các liệu pháp điều trị cá thể ngày càng được chú ý, mở ra một kỷ nguyên mới của y học chính xác Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu không thể tiếp cận liệu pháp này nếu thông tin di truyền về ung thư buồng trứng chưa được làm sáng tỏ Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) là một phương pháp mới với sự tiến bộ vượt trội trong việc xác định cấu trúc phân tử của các khối u, bao gồm cả khối u buồng trứng [6] Công nghệ này có nhiều ưu điểm so với giải trình tự gen truyền thống, chẳng hạn như thời gian đọc nhanh hơn, dữ liệu đầu ra mở rộng và tiết kiệm chi phí [7] Hiện nay, các nghiên cứu trên

thế giới sử dụng kỹ thuật NGS trong việc xác định đột biến gen BRCA1/2 đã khá phổ biến

Ví dụ như nghiên cứu được tiến hành ở Ý bởi Paola Concolino và cộng sự năm 2019 [8], trong nghiên cứu này các tác giả tiến hành giải trình tự gen thế hệ mới ở 132 bệnh nhân ung

thư buồng trứng hoặc ung thư vú Kết quả cho thấy có 37 biến thể ở BRCA1 và BRCA2 được tìm thấy, trong đó 24 biến thể có hại ở BRCA1 và 13 biến thể có hại ở BRCA2 Ngoài

ra, nghiên cứu này đã tìm ra 7 biến thể mới chưa từng được báo cáo trước đây (5 biến thể

trên BRCA2 và 2 biến thể trên BRCA1) Một nghiên cứu khác của tác giả Daniel Trujillano

và cộng sự năm 2015 cũng đã xác định được 49 trong số 95 bệnh nhân ung thư vú và/hoặc

ung thư cổ tử cung có xuất hiện đột biến BRCA1/2, và tất cả các biến thể đều được xác nhận

lại bằng giải trình tự Sanger [9]

Đặc điểm di truyền của ung thư buồng trứng có thể khác nhau đáng kể giữa các nhóm dân tộc và chủng tộc [10] Vì vậy, cần có cái nhìn toàn diện về đặc điểm di truyền của bệnh ung thư buồng trứng ở người Việt Nam Hơn nữa, việc xác định các nhóm nguy cơ cao dựa trên lịch sử di truyền cũng cần được chú trọng để việc sàng lọc thuận tiện hơn Chính vì những lý do trên, nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện nhằm tổng hợp đặc điểm biến

thể gen BRCA1 và BRCA2 trên bệnh nhân ung thư buồng trứng tại Việt Nam bằng công

nghệ NGS với 02 mục tiêu như sau:

Mục tiêu 1: Khảo sát sự đột biến gen BRCA1/2 bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ

mới trên nhóm bệnh nhân nghiên cứu

Mục tiêu 2: Bước đầu đánh giá sự biến đổi của đột biến gen BRCA1/2 theo một số

đặc điểm lâm sàng hoặc cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu

Các kết quả của nghiên cứu có thể là tư liệu tốt để xây dựng bản đồ di truyền và đột biến chuẩn cho người Việt Nam, từ đó phát triển chiến lược sàng lọc và điều trị đặc hiệu hơn, phù hợp với kỷ nguyên y học chính xác hiện nay

5

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về ung thư buồng trứng

1.1.1 Khái niệm

Ung thư buồng trứng là khối u ác tính có xuất phát từ một hoặc cả hai buồng trứng Các tế bào ung thư là các tế bào bất thường, phát triển không kiểm soát và không tuân theo nhu cầu của cơ thể Các tế bào ung thư này có thể xâm lấn và phá hủy các mô, cơ quan xung quanh Không chỉ vậy chúng có thể di căn tới các cơ quan ở xa trong cơ thể và gây ung thư thứ phát tại cơ quan đó [11, 12]

Hầu hết các trường hợp ung thư buồng trứng đều thuộc loại ung thư biểu mô – bệnh phát triển từ bề mặt buồng trứng Các loại ung thư buồng trứng khác bắt đầu từ tế bào trứng

- u tế bào mầm hoặc bắt đầu từ tế bào nâng đỡ - u mô đệm [11, 13]

1.1.2 Tác động của Ung thư buồng trứng tới sức khỏe

Ung thư buồng trứng đứng vị trí thứ bảy trong số các khối u ác tính và đứng thứ tám trong số các nguyên nhân gây tử vong do ung thư ở phụ nữ trên thế giới [14] Khoảng 240.000 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư buồng trứng mỗi năm [13] Theo tổ chức giám sát ung thư toàn cầu (GLOBOCAN) năm 2018, thế giới có 295 414 trường hợp ung thư buồng trứng đã được phát hiện, chiếm 3,4% trong tổng số các trường hợp ung thư ở phụ

nữ [15] Đồng thời, cũng năm 2018, 184 799 trường hợp tử vong xảy ra do ung thư buồng trứng, chiếm 4,4% toàn bộ tỷ lệ tử vong liên quan đến ung thư ở phụ nữ [15] Ung thư buồng trứng chỉ chiếm 3% trong các bệnh ung thư phổ biến, nhưng đứng hàng thứ 5 về tỷ

lệ tử vong do ung thư ở nữ giới

Ở Việt Nam, theo GLOBOCAN, năm 2018 cả nước ta có khoảng 165 000 số ca mắc mới ung thư Riêng ung thư buồng trứng, theo ước tính nước ta hiện có khoảng 3736 ca, và mỗi năm có khoảng 1500 ca mắc mới và 856 ca tử vong [16] Phần lớn bệnh nhân bị ung thư buồng trứng ác tính là ung thư biểu mô, được phát hiện ở giai đoạn muộn, và tỷ lệ sống

5 năm chỉ còn 29% [17]

Tỷ lệ tử vong do ung thư buồng trứng gần gấp ba lần so với ung thư vú, khiến cho ung thư buồng trứng trở thành bệnh ác tính phụ khoa gây tử vong cao nhất ở các nước phát triển [13] Tần suất của bệnh ung thư này thay đổi tùy theo quốc gia và dân tộc Theo các nhóm dân tộc, tỷ lệ hiện mắc cao nhất là ở phụ nữ da trắng (12 trên 100.000), tiếp theo là người Tây Ban Nha (10,3 trên 100.000), người Mỹ gốc Phi (0,4 trên 100.000) và phụ nữ

1.2 Phương pháp NGS trong nghiên cứu Ung thư buồng trứng

1.2.1 Khái niệm NGS

Next genome sequencing (NGS) hay giải trình tự gen thế hệ mới là công nghệ giải trình tự được phát triển trên nguyên tắc tổng hợp và có thể thực hiện một loạt phản ứng cùng lúc, tạo ra lượng lớn trình tự [19] Công nghệ NGS đã được ứng dụng rất nhiều trong nghiên cứu và tầm soát di truyền ung thư

1.2.2 Phương pháp NGS trong nghiên cứu sự biến đổi gen ung thư

BReast CAncer - BRCA1/2 là hai gen ức chế khối u quan trọng, giữ vai trò cốt yếu

trong sửa chữa hiện tượng đứt gãy mạch DNA, một trong những nguyên nhân gây ung thư

do gen, vì vậy thường các trường hợp mang đột biến trên gen BRCA sẽ thường gây ung thư Bên cạnh đó, trong ung thư biểu mô buồng trứng, cá thể mang đột biến BRCA1/2 sẽ nhạy

cảm với hóa trị liệu platin và thuốc ức chế poly ADP-ribose

Đột biến trên gen BRCA1/2 khá đa dạng, bao gồm đột biến điểm, đột biến thêm/mất

đoạn từ ngắn đến dài Hơn nữa, các đột biến phân bố rộng trên hai gen, nên giải trình tự Sanger không giải quyết được vấn đề này một cách tối ưu cả vể độ bao phủ, giá thành Vì vậy, việc phân tích toàn bộ vùng mã hóa và khu vực nối giữa exon và intron nhờ kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới là cần thiết và hiệu quả [20]

1.2.3 Quy trình thực hiện

- Tạo, làm giàu và pool thư viện

Mẫu DNA sau khi phân mảnh và sửa đuôi sẽ được gắn adapter và barcode; Các đoạn DNA được gắn adapter được khuếch đại bằng phản ứng PCR Sản phẩm của bước phân mảnh, sửa đuôi, gắn adapter và khuếch đại bằng phản ứng PCR đều được tinh sạch trước khi thực hiện công đoạn tiếp theo Sản phẩm sau tinh sạch được định lượng theo phương pháp gắn huỳnh quang Các DNA này được trộn với thể tích khác nhau để tương đương nồng độ và tiến hành bước tạo Template

7

- Tạo Template

Mẫu DNA thư viện tự do sau khi được pha loãng đạt nồng độ 55pM sẽ được làm giàu một lần nữa trong hệ thống tự động Phản ứng emulsion PCR (ePCR) trong đó có hạt Ion Sphere Particle (ISP) Trong điều kiện tối ưu, trong 1 giọt dầu môi trường ePCR chỉ chứa 1 hạt ISP và 1 đoạn DNA tự do thư viện và các thành phần phản ứng PCR Hạt ISP sau khi được làm giàu sẽ được tinh sạch bằng hạt từ đặc hiệu với Biotin có gắn trên đầu gắn barcode Bước kế tiếp là nạp dung dịch chứa các hạt ISP đã được làm giàu vào trong Chip

- Giải trình tự

Trước khi giải trình tự, toàn bộ hệ thống tiến hành chu trình rửa tự động; đưa chip

đã được chuẩn bị trên hệ thống; Máy tự động chạy theo kế hoạch đã thiết lập từ trước Quá trình thu nhận tín hiệu và phân tích dữ liệu được diễn ra đồng thời trên máy và hệ thống máy chủ Thời gian giải trình tự kéo dài 2,5 giờ

- Phân tích dữ liệu giải trình tự

+ Giai đoạn phân tích dữ liệu thô:

Dữ liệu thô ban đầu gồm các đoạn đọc có kích thước khác nhau Dữ liệu của mỗi mẫu được nhận biết thông qua trình tự barcode Tiếp theo, các đoạn đọc được cắt (trimming) dần từ đầu 3’ (nhằm loại bỏ trình tự barcode), sau đó lọc (filtering) giữ lại đoạn đọc có kích thước < 167 bp Toàn bộ trình tự đoạn đọc còn lại được gióng hàng và so sánh với trình tự chuẩn bộ gen người (hg19) Tiếp theo, những đoạn đọc được giữ lại là những đoạn đọc chỉ xuất hiện tại 1 vị trí duy nhất trên bộ gen được gọi là các unique reads (URs) Các đoạn đọc không tương đồng hoặc tương đồng nhiều hơn 1 vị trí trên bộ gen sẽ được lọc bỏ

+ Giai đoạn phân tích và xác định đột biến

Dữ liệu DNA sau khi được phân tích sẽ được nạp tự động vào hệ thống máy chủ Trên hệ thống này, các đột biến sẽ được phát hiện một cách tự động [21]

1.3 Tình hình nghiên cứu sự biến đổi gen ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

1.3.1 Các nghiên cứu nước ngoài

Những con số trong các báo cáo thống kê cho thấy tỷ lệ bệnh nhân tử vong do ung thư, đặc biệt là ung thư buồng trứng là rất cao Do đó, việc tiến hành các chương trình sàng lọc và phát hiện ung thư sớm là rất cần thiết ở nước ta, trong đó có các loại ung thư thường gặp ở nữ giới như ung thứ vú, ung thư buồng trứng và ung thư cổ tử cung

8

Việc sử dụng các chỉ dấu khối u (như sự đột biến/thay đổi biểu hiện gen, protein, thay đổi hormone, v.v.) trong mô (sinh thiết), máu, hoặc nước tiểu thể để phát hiện/chẩn đoán ung thư hoặc để theo dõi hiệu quả điều trị ung thư đang được quan tâm nhiều trên thế giới Cơ sở khoa học là các chỉ dấu này chỉ có trong tế bào ung thư, hoặc được tạo ra bởi các tế bào ung thư hoặc bởi các tế bào bình thường khi đáp ứng với sự có mặt của tế bào ung thư trong cơ thể [22, 23]

Một số chỉ dấu sinh học đặc trưng cho một loại ung thư hoặc một vài loại ung thư nhất định Nhưng một số loại chỉ dấu sinh học khác lại xuất hiện ở nhiều loại ung thư, mặc

dù có thể chúng đặc trưng hơn ở một loại ung thư nào đó, ví dụ sự thay đổi (đột biến) các

gen ung thư vú (đặc biệt hai gen BRCA1 hoặc BRCA2) đã được chứng minh làm tăng nguy

cơ ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tụy [24, 25]

Sự đột biến của các gen này đặc biệt liên quan đến sự hình thành và phát triển của ung thư

vú và ung thư buồng trứng Các hướng dẫn lâm sàng hiện nay trên thế giới đề nghị xét

nghiệm di truyền đột biến gen BRCA cho phụ nữ có nguy cơ ung thư vú và buồng trứng

cao, nhất là khi bệnh nhân đáp ứng một số tiêu chí lâm sàng nhất định hoặc nếu có tiền sử

gia đình về ung thư vú hoặc buồng trứng Tuy nhiên, hơn 50% người mang BRCA không đáp ứng các tiêu chí này nên không được kiểm tra, và hơn 97% người mang BRCA trong

dân số vẫn chưa được xác định Do vậy, việc xét nghiệm ung thư vú và buồng trứng dựa

vào đột biến BRCA trên người dân chưa được khuyến cáo rộng rãi

Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới sử dụng kỹ thuật NGS trong việc xác định đột

biến gen BRCA1/2 đã khá phổ biến Nghiên cứu được tiến hành ở Ý bởi Paola Concolino

và cộng sự năm 2019 [8], đã tiến hành giải trình tự gen thế hệ mới ở 132 bệnh nhân ung thư

buồng trứng hoặc ung thư vú Các tác giả tìm thấy 37 biến thể trên gen BRCA1 và BRCA2, trong đó 24 đột biến có hại ở BRCA1 và 13 đột biến có hại ở BRCA2 Ngoài ra, nghiên cứu này đã tìm ra 7 đột biến novel chưa từng được báo cáo trước đây (5 trong BRCA2 và 2 trong BRCA1) Một nghiên cứu khác của tác giả Daniel Trujillano và cộng sự năm 2015

cũng đã xác định được 49 trong số 95 bệnh nhân ung thư vú và/hoặc ung thư cổ tử cung có

xuất hiện đột biến BRCA1/2, và tất cả các đột biến đều được xác nhận lại bằng giải trình tự

Sanger [9]

9

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Hiện nay công nghệ NGS đang được ứng dụng nhiều ở lĩnh vực chẩn đoán, kiểm soát và điều trị bệnh Công nghệ giúp khắc phục một số nhược điểm của giải trình tự gen truyền thống như thời gian đọc nhanh hơn, dữ liệu đầu ra lớn, tiết kiệm chi phí Tuy nhiên, NGS vẫn chưa được phát triển rộng rãi tại Việt Nam, đặc biệt là trong các nghiên cứu về

đột biến gen BRCA1/2 ở bệnh nhân ung thư buồng trứng Số lượng các nghiên cứu đột biến

BRCA1/2 trên gen người Việt Nam sử dụng công nghệ NGS vẫn còn hạn chế Những nghiên

cứu này là nghiên cứu bước đầu về thay đổi di truyền ở bệnh nhân ung thư buồng trứng, tuy nhiên đó chỉ là những nghiên cứu nhỏ lẻ, trên một vài gen, và chủ yếu là các nghiên cứu ở phía Nam Chưa thấy nghiên cứu về sự biểu hiện các gen quan trọng ở ung thư buồng trứng được công bố trên các cơ sở dữ liệu quốc tế ISI/Scopus Đặc biệt trong các nghiên cứu đó,

chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về sự tương quan giữa đột biến gen BRCA1/2 và đặc điểm

lâm sàng hoặc cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư buồng trứng tại Việt Nam

Tác giả Ngô Đại Phú và cộng sự năm 2020 đã bước đầu khảo sát tỷ lệ đột biến

BRCA1/2 bằng cách sử dụng máy Ion Torrent PGM Các tác giả thu thập 11 mẫu khối u vùi

nến cố định bằng formalin (FFPE) từ một nhóm gồm 11 bệnh nhân ung thư biểu môi buồng trứng từ Bệnh viện Từ Dũ TP Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy 1/11 bệnh nhân ung thư có

đột biến gây bệnh trên gen BRCA1 Nghiên cứu này đã cho thấy thành công bước đầu trong việc xác định và điều tra sự phổ biến của đột biến BRCA1/2 trong một nhóm nhỏ ung thư

biểu mô buồng trứng với các mẫu FFPE [26]

Ở một nghiên cứu khác tiến hành trên 101 bệnh nhân ung thư buồng trứng tại bệnh viện Từ Dũ, tác giả Vũ Hoàng Long và cộng sự đã phát hiện được 8 bệnh nhân mang đột

biến trên gen BRCA1, nhưng không phát hiện bệnh nhân nào mang đột biến trên gen BRCA2

[27] Mặc dù, hơn 1/5 trường hợp ung thư có tính nhạy cảm do di truyền và trong đó khoảng

65–85% các trường hợp liên quan đến đột biến trên gen BRCA, nhưng có một số gen ức chế

và gen sinh ung thư khác có liên quan đến ung thư buồng trứng di truyền, bao gồm các gen:

mismatch repair (MMR) ở hội chứng Lynch, tumor suppressor gen - TP53 trong hội chứng

Li-Fraumeni, và một số gen khác liên quan đến hệ thống sửa chữa sự tổn thương chuỗi xoắn

kép của DNA như CHEK2, RAD51, BRIP1 và PALB2 [28]

Việc nghiên cứu các yếu tố di truyền của ung thư buồng trứng và các hội chứng liên quan đến ung thư buồng trứng có ý nghĩa cho việc phát triển các chiến lược chẩn đoán phân

10

tử và các phương pháp điều trị nhắm đích ung thư buồng trứng trong tương lai Đồng thời, đối với bệnh nhân ung thư buồng trứng, việc xác định các đột biến/biến đổi di truyền có thể cung cấp các đích tiềm năng cho việc điều trị sử dụng bằng các tác nhân sinh học và đưa ra các quyết định điều trị Ngoài ra, một số gen như neurofibromin 1, synaptonemal complex protein 2 và tumor protein 53 được dự đoán có liên quan đến mạng lưới tương tác gen của

BRCA1 và BRCA2 trong ung thư buồng trứng, và kể cả ung thư vú [29]

Ngoài ra, một nghiên cứu ca bệnh đã được thực hiện trên một phụ nữ Việt Nam 47 tuổi bị ung thư bằng cách áp dụng kỹ thuật NGS [30] Nghiên cứu này cho thấy một đột

biến gen BRCA1 mới là NM_007294.3 (BRCA1): c.4998insA (p Tyr1666Terfs) đã được

xác định ở cả bệnh nhân này và ở một số thành viên trong gia đình Điều này chứng minh rằng các gen đột biến được truyền qua nhiều thế hệ Sự thay đổi này có thể khởi phát nguy

cơ ung thư theo cấp số nhân và trở thành một dấu hiệu có giá trị để tiên lượng và điều trị lâm sàng chính xác

11

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp phân tích tổng quan hệ thống (systematic review)

- Tìm kiếm và lựa chọn tài liệu:

Chúng tôi đã tuân theo nguyên tắc lựa chọn tài liệu PRISMA (Mục báo cáo ưu tiên

để đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp) cho quy trình lựa chọn tài liệu statement.org/) Cơ sở dữ liệu tìm kiếm bao gồm PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/) và Science Direct (https://www.sciencedirect.com/) Tiêu chuẩn PICOT (Dân số, Can thiệp, So sánh, Kết quả và Thời gian) được sử dụng để xác định câu hỏi nghiên cứu chính và chiến lược tìm kiếm Tiêu chí đưa vào bao gồm các

(http://prisma-bài báo đã được công bố về đột biến và biểu hiện của gen BRCA1/2 trong ung thư buồng

trứng Không có giới hạn về thiết kế nghiên cứu Các bài viết được viết bằng tiếng Anh và được xuất bản trong mười năm (từ 2011 đến 2021)

Từ khóa tìm kiếm: Đột biến BRCA1/2; biểu hiện gen BRCA1/2; Gen BRCA1/2 trong

ung thư buồng trứng Kết quả tìm kiếm được trình bày bằng sơ đồ PRISMA (Hình 1)

Hình 1 Sơ đồ PRISMA phân tích tổng quan hệ thống

12

- Quản lý dữ liệu:

Phần mềm Zotero được sử dụng để trích xuất và quản lý các bài viết từ cơ sở dữ liệu Sau khi tìm kiếm, tất cả kết quả đã được nhập vào Microsoft Excel và bị xóa khỏi bản sao Hai nhà nghiên cứu (DTC, SMVN) đã sàng lọc tài liệu một cách độc lập bằng cách đọc tiêu

đề và tóm tắt của các bài báo để quyết định nên đọc toàn văn hay loại bài báo ra khỏi nghiên cứu Bất kỳ mâu thuẫn nào trong quyết định của hai điều tra viên phải được thảo luận để tìm được đồng thuận hoặc được tư vấn bởi điều tra viên thứ ba (HVT, DTV hoặc HNM)

2.2 Phương pháp phân tích đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng và dịch tễ của bệnh nhân ung thư buồng trứng

- Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu hồi cứu nhằm mô tả đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng,

một số đặc điểm dịch tễ học ở bệnh nhân ung thư buồng trứng ở Việt Nam và một số yếu tố liên quan

- Đối tượng nghiên cứu: Toàn bộ hồ sơ bệnh án của bệnh nhân được chẩn đoán ban đầu là

ung thư buồng trứng nhập viện tại Bệnh viện K Trung ương, Hà Nội từ năm 2018 đến năm

2021

- Phương pháp chọn mẫu: Sử dụng phương pháp lấy mẫu thuận tiện

+ Tiêu chuẩn lựa chọn: Hồ sơ bệnh án của bệnh nhân được chẩn đoán ban đầu ung thư buồng trứng nhập viện Bệnh viện Ung thư Trung ương, Hà Nội từ năm 2018 đến năm

2021 Hồ sơ bệnh án có đầy đủ các thông tin sau: Chẩn đoán xác định, Tiền sử bản thân và gia đình, kết quả xét nghiệm công thức máu, sinh hóa máu, điện giải đồ

+ Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân mắc kèm bệnh ung thư khác không phải ung thư buồng trứng

+ Chẩn đoán ban đầu được coi là chẩn đoán theo kết luận của bác sĩ sau lần khám lâm sàng đầu tiên Vì vậy, kết quả chẩn đoán ban đầu có thể khác với kết quả chẩn đoán xác định Chẩn đoán xác định là chẩn đoán được bác sĩ xác nhận sau khi thực hiện các xét nghiệm cận lâm sàng hoặc sinh thiết, và được sử dụng trong các phân tích về sau Trong nghiên cứu này, bệnh nhân được chia thành nhóm ung thư buồng trứng và nhóm không phải ung thư buồng trứng (bao gồm khối u lành tính và một số bệnh khác)

13

Nhóm nghiên cứu tiến hành liên lạc với các bệnh nhân thông qua số điện thoại được lưu trong hồ sơ bệnh án nhằm theo dõi tình trạng sức khỏe của bệnh nhân sau khi nhập viện/phẫu thuật Bệnh nhân hoặc người thân của họ được yêu cầu cung cấp một số thông tin, bao gồm tình trạng sức khỏe hiện tại, tái phát hoặc tái nhập viện và thời gian tử vong (nếu bệnh nhân

đã chết)

- Thu thập dữ liệu:

Nhóm nghiên cứu tiến hành tra cứu hồ sơ bệnh án giấy của bệnh nhân được lưu trữ tại Bệnh viện K Trung ương, sau đó nhập liệu bằng phần mềm Epidata Entry 3.1 (EpiData, Odense, Đan Mạch) Các nghiên cứu viên thu thập thông tin về các đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng và dịch tễ học của bệnh nhân Cụ thể, dữ liệu được thu thập bao gồm các thông tin nhân khẩu học, các mô tả về cơ quan bị tổn thương và các cơ quan khác, tiền sử bệnh của bệnh nhân và tiền sử gia đình, quá trình điều trị, thời gian và kết quả các xét nghiệm cận lâm sàng như: Xét nghiệm công thức máu toàn phần, các yếu tố đông máu, sinh hóa máu, điện giải đồ, và xét nghiệm nồng độ các chất chỉ điểm ung thư như CA125, HE4 trong huyết tương Chẩn đoán giai đoạn bệnh được thực hiện bởi bác sĩ điều trị, và được xác định dựa trên tiêu chí của Liên đoàn Sản phụ khoa Quốc tế (FIGO) Nghiên cứu chỉ thu thập thông tin về lần nhập viện gần thời điểm tiến hành nghiên cứu nhất đối với những bệnh nhân nhập viện nhiều lần

- Phân tích thống kê: Phần mềm SPSS v 22 được sử dụng để phân tích thống kế Các đặc

điểm lâm sàng, phi lâm sàng, một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh nhân được biểu diễn bằng tỷ lệ phần trăm (%) hoặc giá trị trung bình (mean ± SD) Kiểm định Mann Whitney U

và hồi quy logistic đa biến được sử dụng để tìm ra các yếu tố liên quan, khác biệt được coi

là có ý nghĩa thống kê với p<0,05 Nghiên cứu cũng sử dụng đường cong Kaplan-Meier để phân tích sống sót (survival analysis) của bệnh nhân ung thư buồng trứng

2.3 Phương pháp phát hiện đột biến trên gen BRCA1, BRCA2 ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

- Tuyển chọn đối tượng nghiên cứu:

Trong số 233 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư buồng trứng và điều trị tại Bệnh viện K Trung ương (Hà Nội, Việt Nam) giai đoạn 2018-2021 (trên tổng số 305 bệnh nhân được chọn trong nghiên cứu), tổng cộng có 60 bệnh nhân mà mẫu mô sau phẫu thuật vẫn

14

được lưu giữ tại bệnh viện Chúng tôi chia 60 bệnh nhân thành nhóm nguy cơ cao mang biến thể di truyền và nhóm nguy cơ thấp mang biến thể di truyền theo các tiêu chí sau: i) Nhóm nguy cơ cao gồm 40 bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư buồng trứng qua kết quả xét nghiệm mô bệnh học và có một hoặc cả hai tiêu chí của hội chứng ung thư vú – ung thư buồng trứng di truyền: 1) dưới 40 tuổi; 2) Bệnh nhân có tiền sử ung thư vú/buồng trứng; 3) Trong gia đình có ít nhất một thành viên mắc bệnh ung thư vú/buồng trứng; 4) Giai đoạn muộn khi chẩn đoán ii) Nhóm nguy cơ thấp bao gồm những nhóm còn lại Có

22 bệnh nhân trên 40 bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ cao và 11 bệnh nhân trên 20 bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ thấp có mẫu bệnh phẩm đủ tiêu chuẩn để tách chiết và giải trình

tự DNA Thông tin y tế của bệnh nhân được thu thập từ bệnh án của bệnh nhân trong quá trình điều trị

- Thu thập mẫu bệnh phẩm:

Trong nghiên cứu này, 33 mẫu mô khối u lâm sàng được lấy từ 33 bệnh nhân ung thư buồng trứng sau phẫu thuật và được bảo quản trong parafin sau khi cố định bằng formalin (FFPE) tại Bệnh viện K Trung ương (Hà Nội, Việt Nam) Tất cả các mẫu mô FFPE trong nghiên cứu đều được thu thập dưới sự kiểm duyệt của các chuyên gia giải phẫu bệnh Các mẫu mô được cố định trong Formalin đệm trung tính (NBF) 10% trong vòng 30 đến

60 phút sau khi phẫu thuật Sau đó các mẫu được cố định trong 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phòng, trước khi được nhúng vào parafin Kích thước mẫu mô tiêu chuẩn là 1x1x0,5cm, nhưng có thể thay đổi tùy theo tính chất của bệnh hoặc loại mô Các mẫu FFPE được bảo quản ở nhiệt độ phòng Các khối FFPE được cắt thành lát (dày 5μm) và nhuộm bằng Hematoxylin & Eosin (H&E) bằng hệ thống Dako Coverstainer (Agilent, CA 95051, US)

để đánh giá mô bệnh học Chẩn đoán được thực hiện bởi hơn hai chuyên gia bệnh học dựa trên hướng dẫn của Ủy ban Ung thư Hoa Kỳ (AJCC, 2009)

- Tách chiết DNA và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS):

DNA tổng số được chiết xuất từ mô ung thư buồng trứng bằng bộ kit tách chiết QIAamp DNA FFPE (Qiagen, Valencia, CA, USA) Các mẫu cần đảm bảo chứa ít nhất 30% tế bào khối u Chất lượng và số lượng DNA tổng số được đo bằng máy quang phổ UV-Visible BioDrop (Biochrom, Vương quốc Anh) Chất lượng DNA sợi đôi được đánh giá bằng Qubit 4 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA) Các mẫu đáp ứng yêu cầu được sử dụng trong nghiên cứu này

15

Quá trình chuẩn bị thư viện cho giải trình tự BRCA1 và BRCA2 được thực hiện bằng

bộ kit BRCAaccuTestTM PLUS (NGenBio Co., Ltd, Hàn Quốc), thông qua 2 phản ứng PCR với lượng 50ng DNA chất lượng cao cho một phản ứng, theo quy trình của nhà sản xuất Thư viện DNA được kiểm soát bằng hệ thống điện di tự động Agilent 4200

TapeStation D1000 ScreenTape (Hình 2)

Quá trình giải trình tự được thực hiện trên hệ thống tự động MiSeqDx (Illumina, Inc USA) sử dụng MiSeq Reagent Micro v2 (300 chu kỳ) (Illumina, San Diego, CA, USA) với

3 lần chạy giải trình tự, mỗi lần chạy bao gồm 1 DNA đối chứng và 11 mẫu bệnh phẩm

- Phương pháp phân tích dữ liệu đột biến:

Quy trình phân tích tin sinh học từ dữ liệu giải trình tự thô dưới định dạng FASTQ được thực hiện với lần lượt các bước như sau: kiểm soát chất lượng dữ liệu giải trình tự, làm sạch và cắt adapter, gióng hàng trình tự, gọi biến thể và chú thích Đầu tiên, chất lượng của dữ liệu thô được kiểm tra bởi FASTQC Công cụ Sickle v1.33 được sử dụng để loại bỏ các adapter từ quá trình chuẩn bị thư viện và các điểm giải trình tự có điểm Q-score thấp (ngưỡng giới hạn của điểm Q là ≥ 30), sau đó phần mềm BWA-MEM v0.7.10 được sử dụng

để gióng hàng và căn chỉnh các trình tự theo trình tự bộ gen tham chiếu của người Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ gen hg19 làm bộ gen tham chiếu Các đoạn đọc chưa được ánh xạ được trích xuất (với MAPQ<60) Biến thể đa hình đơn nucleotid và indel ngắn (chèn/xóa) đều được xác định bởi FreeBayes v9.9.2 và GATK v.2.3 Nghiên cứu sử dụng phần mềm snpEff v4.2 để chú thích biến thể, các quá trình phân tích được thực hiện trên

Hình 2 Kết quả điện di khi chuẩn bị thư viện DNA cho quá trình giải trình tự

16

phần mềm NgenAnalySysTM (NGenBio Co., Ltd, Hàn Quốc) Phần mềm MEGA v.11.0.13 cũng được sử dụng để trực quan hóa và gióng hàng trình tự Các biến thể được phân loại dựa trên tiêu chí năm bậc của ACMG (Hoa Kỳ) Trong nghiên cứu này, chúng tôi chủ yếu tập trung vào các biến thể gây bệnh (pathogenic) và có khả năng gây bệnh (likely pathogenic) Biến thể CNV không được nhà sản xuất khuyến nghị phát hiện trong trường hợp này

17

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu sự đột biến gen BRCA1/2 trên mô ung thư buồng trứng

3.1.1 Kết quả phân tích đột biến của gen BRCA1/2 trên mô ung thư buồng trứng bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới

Kết quả gọi biến thể cho thấy tổng cộng 323 biến thể được ghi nhận ở 33 bệnh nhân Sau khi loại bỏ các biến thể chồng chéo và một số biến thể là biến thể phổ biến của người

châu Á, bao gồm 4563A>G, c.6513G>C và c.7397T>C tại BRCA2, 33 biến thể khác biệt

đã được tìm thấy trong BRCA1/2 (Bảng 1) Trong số 33 biến thể trên, có 14 biến thể được

phát hiện ở gen BRCA1 (chiếm 38,8%), trong khi con số này ở BRCA2 là 61,1% Chỉ có 4

biến thể mất đoạn (del) chiếm tỷ lệ 12,12%, còn lại là biến thể đơn nucleotide (SNP) Khoảng 45,45% biến thể là vô nghĩa, tiếp theo là các biến thể đồng nghĩa với 39,39% Chỉ

có 4 biến thể gây dịch khung và 1 biến thể là biến thể dừng Hầu hết các biến thể BRCA1 được phát hiện trên exon 10 trong tổng số 23 exon của BRCA1, trong khi mỗi exon 3, 12 và

15 của BRCA1 có 1 biến thể Các biến thể của BRCA2 được tìm thấy ở exon 10, 11, 14 và

18 trên 27 exon của BRCA2 Tuy nhiên, gần 60% trong số chúng nằm trên exon 11 Ngoại trừ c.5785A>G trong BRCA2 và c.1801_1808delCACAATTC trong BRCA1, tất cả các biến

thể đều là dị hợp tử (Bảng 1) Theo phân loại của ACMG, tỷ lệ các biến thể gây bệnh và có

khả năng gây bệnh là 15,15%, trong khi tỉ lệ biến thể lành tính là 48,48%, tiếp theo là các biến thể không chắc chắn (chiếm 36,36%)

Bảng 1 Đặc điểm các biến thể của gen BRCA1 và BRCA2 tìm thấy trên các bệnh nhân

ung thư buồng trứng

Aa thay đổi

Aa thay đổi

Aa thay đổi

Về nhóm có nguy cơ cao và nguy cơ thấp, mặc dù chúng tôi đã tìm thấy các biến thể

lành tính BRCA1 và BRCA2 ở tất cả 33 bệnh nhân (các biến thể 4563A>G, c.6513G>C và c.7397T>C trong BRCA2 không được tính đến), các biến thể không chắc chắn được phát

hiện ở 9 bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ cao (40,91%) và 6 bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ

thấp (54,55%) (Bảng 3) Các biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh (P/LP) được tìm

thấy ở hơn 20% nhóm có nguy cơ cao trong khi con số này ở nhóm có nguy cơ thấp là 9,09% Tuy nhiên, phân tích thống kê không tìm thấy sự khác biệt đáng kể về mức độ phổ biến của các biến thể giữa nhóm có nguy cơ cao và nhóm có nguy cơ thấp

20

3.1.2 Đặc điểm biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh ở gen BRCA1 và BRCA2

Trong tổng cộng 33 biến thể phát hiện ở gen BRCA1 và BRCA2 trong 33 bệnh nhân

của nghiên cứu này chỉ có 5 biến thể gây bệnh/có khả năng gây bệnh (biến thể P/LP) được phát hiện trên 6/33 bệnh nhân Bao gồm: c.1801_1808delCACAATTC, c.1016delA,

c.1673_1674delAA, c.928C>T tại BRCA1 và c.2865delC tại BRCA2 (Hình 3 và Hình 4)

Trong đó, có 4 biến thể là biến thể dịch khung, và một biến thể là biến thể dừng Tất

cả các biến thể gây bệnh được phát hiện đều có mặt trong các vùng mã hóa, đặc biệt là ở

exon 10 của BRCA1 và exon 11 của BRCA2 c.1801_1808delCACAATTC được phát hiện

ở 2 bệnh nhân với tần suất 6,06%, trong khi các biến thể khác được phát hiện ở một bệnh nhân với tần suất 3,03% Các biến thể c.1016delA, c.1673_1674delAA và c.928C>T đã được báo cáo một số nghiên cứu trước đây trên thế giới, trong khi biến thể

c.1801_1808delCACAATTC trên gen BRCA1 và c.2865delC trên gen BRCA2 lần đầu được

Hình 3 Biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh ở gen BRCA1 và BRCA2

Hình 4 Trình tự chi tiết của các

biến thể gây bệnh và có khả năng

gây bệnh trên gen BRCA1 và

BRCA2

21

báo cáo (Bảng 2) c.1801_1808delCACAATTC là biến thể đồng hợp tử duy nhất trong số

33 biến thể được phát hiện

Bảng 2 Đặc điểm của biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh trên gen BRCA1 và BRCA2

Chú thích: LP (likely pathogenic): có khả năng gây bệnh; P (Pathogenic): gây bệnh; del (deletion):

đột biến mất đoạn; snv (single nucleotde variant): biến thể đơn nucleotid; FS (frameshift): dịch

khung; SG (stop gained): dừng

Trong tổng số 33 bệnh nhân ung thư buồng trứng được lựa chọn trong nghiên cứu

của chúng tôi, tần số biến thể BRCA1/2 là 18,18%, nằm trong phạm vi tần số biến thể ở

bệnh nhân buồng trứng thuộc các dân tộc khác nhau đã được công bố trong các nghiên cứu

trước đó (5-30%) [31] Mặc dù nhiều biến thể được tìm thấy ở những bệnh nhân có nguy

cơ biến thể cao so với nhóm nguy cơ thấp (5/22 so với 1/11), sự khác biệt này không có ý

nghĩa thống kê (p=0,076)

Bằng cách sử dụng NGS, nghiên cứu phát hiện được 05 biến thể có hại trên

BRCA1/2, bao gồm 2 biến thể lần đầu được công bố Tất cả 04 biến thể tại BRCA1 đều nằm

trong vùng mã hóa của exon 10 Đột biến ở phần trung tâm của exon này được biết đến

rộng rãi vì có liên quan đến việc tăng nguy cơ ung thư buồng trứng [32] Biến thể còn lại

nằm ở vùng mã hóa tại exon 11 của gen BRCA2, liên quan đến nguy cơ ung thư buồng trứng

cao hơn so với các vùng khác của gen [32] Hai biến thể c.1673_1674delAA và

c.1801_1808delCACAATTC nằm ở vùng cụm ung thư buồng trứng (OCCR) của gen

BRCA1, điều này có thể hiểu được vì tỷ lệ mắc ung thư buồng trứng cao đáng kể ở những

bệnh nhân có biến thể BRCA trong OCCR [33] Điều đó cũng có nghĩa là những biến thể

ID Loại nu

thay đổi

Loại aa thay đổi Tỉ lệ

Phân loại Gen Exon

Lo

ại

Hậu quả

Điểm bắt đầu

Mản

h

Độ sâu

Nguồ

n gốc

Ghi chú

74delAA p.Lys558fs 3.03% P BRCA1 10/23 del FS 41245873 49.21 1331 Dị hợp

rs8035

7600 OC48 c.928C>T p.Gln310* 3.03% P BRCA1 10/23 snv SG 41246620 56.15 1560 Dị hợp rs3975

09338

22

này có nguy cơ mắc ung thư buồng trứng cao hơn so với biến thể ở các vùng khác trên gen [34] Trong số 5 biến thể P/LP mà nghiên cứu của chúng tôi phát hiện được, c.1016delA cũng từng được báo cáo trong một nghiên cứu khác trên bệnh nhân Việt Nam mắc bệnh ung thư buồng trứng [34] Ngoài ra, biến thể c.1016delA và c.1673_1674delAA đã được tìm thấy ở các quần thể khác như Canada, Hoa Kỳ, Na Uy và Cộng hòa Séc theo cơ sở dữ liệu của NCBI (dbSNP) Cơ sở dữ liệu của NCBI cũng cho thấy, ngoài Việt Nam, biến thể c.928>T được tìm thấy và mô tả ở một nhóm dân tộc Á châu khác là Đài Loan

Biến thể c.1801_1808delCACAATTC và c.2865delC là hai biến thể mới chưa được

mô tả trong các hệ thống cơ sở dữ liệu Biến thể đầu tiên nằm ở exon 10 của OCCR gây ra

sự dịch khung trình tự liên quan đến acid amin histamine (acid amin thứ tự số 601) Trong

khi đó, c.2865delC là biến thể P/LP BRCA2 duy nhất được xác định trong nghiên cứu của

chúng tôi Đây cũng là một biến thể dịch khung, dẫn đến loại bỏ nucleotide cytosine, từ đó dẫn đến sự thay đổi asparagine ở vị trí 955 trong chuỗi polypeptide Cơ chế bệnh sinh của biến thể này vẫn chưa được biết vì nó không nằm trong bất kỳ vị trí gắn protein nào

Chúng tôi quan sát thấy rằng tất cả các biến thể gây bệnh và có khả năng gây bệnh đều được tìm thấy ở những bệnh nhân được chẩn đoán mắc ung thư buồng trứng dạng biểu

mô Phát hiện này được cho là hợp lý vì các biến thể dòng mầm trong gen BRCA1/2 chiếm

tới 18% các trường hợp ung thư biểu mô và những biến thể soma chỉ được quan sát thấy ở 7% các trường hợp [33] Điều này đã mang lại hi vọng mới cho các bệnh nhân ung thư biểu

mô vì các biến thể BRCA1/2 có liên quan đến độ nhạy cao hơn với phác đồ hóa trị bằng

platinum và các tác nhân hóa trị liệu khác và do đó tiên lượng tốt hơn Bệnh nhân có biến

thể BRCA1/2 đặc biệt nhạy cảm với các chất ức chế poly-(ADP)-ribose polymerase [35]

3.2 Mối liên quan giữa sự đột biến gen BRCA1/2 và một số đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng, dịch tễ ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

3.2.1 Đặc điểm lâm sàng, phi lâm sàng và dịch tễ ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

3.2.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

Trong số 305 bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu có 233 bệnh nhân bị ung thư buồng trứng, chiếm tỉ lệ 76,39%, 58 bệnh nhân (19,02%) có khối u buồng trứng lành tính và

14 bệnh nhân (4,59%) được chẩn đoán mắc các bệnh khác như u xơ tử cung (Bảng 3) Độ

tuổi trung bình của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu là 49,43 ± 0,895 tuổi, cân nặng trung bình và BMI lần lượt là 51,19 ± 7,838 kg và 21,17 ± 3,032 Phần lớn bệnh nhân là người

3.2.1.2 Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân ung thư buồng trứng ở Việt Nam

Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận có 38 bệnh nhân có bệnh lý đi kèm chiếm 12,46% tổng số bệnh nhân Trong đó, có 12 bệnh nhân có khối u ở cơ quan khác ngoài cơ quan sinh

sản, số còn lại mắc bệnh tiểu đường hoặc tăng huyết áp (Bảng 4) Về tiền sử bệnh, phần lớn

bệnh nhân chưa từng bị ung thư trước đó (89,18%) Về tình trạng xuất viện, 37,70% trường hợp khỏi bệnh, 51,80% cải thiện, 3,28% không thay đổi và 7,21% bệnh nặng hơn hoặc tử vong Về giai đoạn bệnh tại thời điểm chẩn đoán, có 59 bệnh nhân ở giai đoạn I, 29 bệnh nhân ở giai đoạn II, trong khi con số này ở giai đoạn III và IV lần lượt là 78 và 13, ngoài ra

có 54 bệnh nhân ung thư buồng trứng thiếu thông tin về giai đoạn bệnh Trong số những bệnh nhân có thông tin về kích thước khối u trong hồ sơ bệnh án, gần một nửa trong số họ

có kích thước khối u lớn hơn 10 cm Một số triệu chứng lâm sàng là chướng bụng hoặc đau

và chảy máu âm đạo bất thường

Giai đoạn theo FIGO

Bên cạnh tình trạng không có triệu chứng, một số triệu chứng được phát hiện qua khám lâm sàng là chướng bụng hoặc đau và chảy máu âm đạo bất thường Do các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu, ung thư buồng trứng bị nhầm lẫn với một số bệnh về bụng, tiết niệu hoặc phụ khoa, dẫn đến chẩn đoán muộn [4] Trong nghiên cứu này, trong số 179 bệnh nhân ung thư buồng trứng được phân loại giai đoạn theo hướng dẫn của FIGO, có 78

25

bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn III, chiếm hơn 43,57%, trong đó có 13 bệnh nhân (chiếm khoảng 7%) được chẩn đoán ở giai đoạn III giai đoạn IV Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Maringe và cộng sự, trong đó giai đoạn chẩn đoán phổ biến nhất là giai đoạn III Hơn nữa, hơn một nửa số phụ nữ ở Canada, Đan Mạch, Na Uy và Vương quốc Anh được chẩn đoán mắc bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III và IV) [36]

Theo kết quả của nghiên cứu CONCORD-2, mặc dù ung thư buồng trứng có thể xảy

ra tại bất kỳ giai đoạn nào trong suốt cuộc đời [3], nhưng độ tuổi chẩn đoán trung bình chủ yếu dao động từ 54 đến 66 tuổi, ngoại trừ các trường hợp ung thư tế bào mầm Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung bình của bệnh nhân giai đoạn I là 43,68 ± 2,07, trong khi độ tuổi trung bình của bệnh nhân giai đoạn III và IV lần lượt là 55,86 ± 1,48 và 57,77 ± 4,23 Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi, tuổi tác là một trong những yếu tố liên quan đến giai đoạn ung thư buồng trứng Đặc biệt, bệnh nhân càng lớn tuổi thì nguy cơ được chẩn đoán ung thư ở giai đoạn muộn càng cao, khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p < 0.001 Tương tự, nghiên cứu của Maringe và cộng sự cũng báo cáo rằng tuổi trung bình của bệnh nhân ở giai đoạn tiến triển của ung thư buồng trứng cũng cao hơn đáng kể so với tuổi trung bình của bệnh nhân ở giai đoạn I [36] Tuy nhiên, tuổi trung bình của bệnh nhân ở giai đoạn III dao động từ 62 đến 66 trong khi con số này ở giai đoạn IV là từ 67 đến 69 trong nghiên cứu của Maringe và cộng sự, cao hơn đáng kể so với con số này trong nghiên cứu của chúng tôi Điều này cho thấy độ tuổi mắc bệnh ung thư buồng trứng ở phụ nữ Việt Nam có sự trẻ hóa so với các dân tộc khác Tương tự, Katherine và cộng sự báo cáo rằng bệnh nhân châu

Á có nguy cơ mắc ung thư buồng trứng biểu mô ở độ tuổi trẻ hơn so với bệnh nhân da trắng Các nghiên cứu cũng cho rằng tỷ lệ sống sót sau 5 năm mắc bệnh ở Việt Nam là 62%, cao hơn các nước châu Á khác bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và thậm chí cao hơn

cả người da trắng [37]

3.2.1.3 Đặc điểm cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư buồng trứng ở Việt Nam

Phần lớn các kết quả trong xét nghiệm công thức máu của bệnh nhân đều bình thường, ngoại trừ xét nghiệm huyết sắc tố (tỉ lệ bình thường là 49,30% so với tỉ lệ bất thường là

50,7%) Tất cả bệnh nhân đều có kết quả thể tích trung bình tiểu cầu bình thường (Hình 5)

Chỉ một tỷ lệ nhỏ đối tượng nghiên cứu có kết quả bất thường về tỷ lệ % bạch cầu ái kiềm

là 4,91% và bạch cầu ái toan là 5,61% Về xét nghiệm đông máu, chỉ có xét nghiệm đo thời gian prothrombin (PT) (tỉ lệ bất thường là 95,39% so với tỉ lệ bình thường là 4,61%), và xét

26

nghiệm đo thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (aPTT) (tỉ lệ kết quả bất thường là 89,95% so với tỉ lệ bình thường là 10,05%) Phần lớn bệnh nhân có kết quả xét nghiệm sinh hóa máu và điện giải đồ bình thường Trong đó, xét nghiệm nồng độ glucose có tỷ lệ kết quả bất thường cao nhất (25,82%), tiếp theo là xét nghiệm nồng độ kali (22,49%) Kết quả của hai xét nghiệm định lượng chỉ dấu ung thư buồng trứng (HE4 và CA125) cho thấy trong khi hầu hết bệnh nhân có nồng độ CA125 huyết thanh bất thường (62,72%) thì có 22,56% bệnh nhân có nồng độ HE4 bất thường

27

Hình 5 Đặc điểm cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu

Độ tuổi trung bình của bệnh nhân được chẩn đoán ung thư buồng trứng lớn hơn so với những người không bị ung thư buồng trứng (với độ tuổi là 50,13 ± 1,191 so với 48,07 ±

2,034) (Bảng 5) Các bệnh nhân thuộc nhóm ung thư buồng trứng cũng có thời gian nằm

RBC HGB HCT MCV MCHC MCH RDW RDW-SD WBC

PT (s)

PT (%) INR Fibrinogen quantification

APTT (s) APTT ratio

Creatinine Glucose (fasting)

SGOT SGPT Total billirubin

Total protein

Urea Sodium Potassium

Chloride Total calcium

Albumin CA125 HE4

% Normal

% Abnormal

28

viện dài hơn (92,26 ± 8,07 ngày so với 24,93 ± 3,69) Ngoài ra, xét nghiệm hai chỉ dấu ung thư CA125 và HE4 cho kết quả nồng độ của các chỉ dấu này ở nhóm ung thư buồng trứng cao hơn đáng kể so với nhóm bệnh nhân không ung thư buồng trứng, và sự khác biệt này có

ý nghĩa thống kê (lần lượt là 481,41 ± 85,62 U/mL so với 91,61 ± 43,15 U/mL, và 236,77 ± 37,00 U/mL so với 78,02 ± 11,46 U/mL) Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở các yếu tố khác bao gồm thời gian prothrombin, protrombin (%), INR, định lượng fibrinogen, APTT, nồng độ ion Cl- Trong khi đó, tỷ lệ % prothrombin ở nhóm ung thư buồng trứng thấp hơn nhóm ung thư không phải buồng trứng (96,73 ± 1,35 so với 102,77 ± 1,84) Như vậy, khi so sánh với nhóm không phải ung thư buồng trứng, 13 yếu tố ở nhóm ung thư buồng trứng đều khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05), bao gồm tuổi, thời gian nằm viện, kết quả xuất viện, thời gian prothrombin, tỉ lệ % prothrombin (%), INR, fibrinogen, APTT, kết quả xét nghiệm CA125 và HE4, trong khi không tìm thấy sự khác biệt thống kê ở kết quả xét nghiệm công thức máu toàn phần, kết quả hóa sinh máu và điện giải đồ, ngoại trừ PLT, SGOT và nồng độ ion Cl- Tuy nhiên, không có yếu tố nào được tìm thấy có liên quan đáng

kể (tất cả các p > 0,05) với tình trạng ung thư buồng trứng trong kết quả phân tích hồi quy

đa biến

Bảng 5 So sánh đặc điểm lâm sàng và phi lâm sàng giữa bệnh nhân ung thư buồng

trứng và không ung thư buồng trứng

người thân bị ung thư

29

Không thay đổi

Nặng hơn, chết

Chỉ dấu khối u

31

kinh ≤ 70, mãn kinh

≤140 pmol/L

78.02 11.46 236.77 37.00 <0.001*

3.2.1.4 Một số đặc điểm dịch tễ học ở bệnh nhân ung thư buồng trứng ở Việt Nam

Khi phân tích mối liên quan giữa giai đoạn bệnh và một số yếu tố phi lâm sàng, bao gồm độ tuổi chẩn đoán, thời gian nằm viện, một số kết quả xét nghiệm công thức máu như

số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, tỷ lệ bạch cầu trung tính, tỷ lệ bạch cầu lympho,

tỷ lệ bạch cầu đơn nhân, số lượng tế bào lympho, thể tích trung bình tiểu cầu và một số thông

số đông máu như tỷ lệ protrombin, INR, định lượng fibrinogen, một số thông số sinh hóa như glucose, nồng độ albumin và nồng độ huyết thanh của 2 chỉ dấu ung thư là CA125 và HE4 khác nhau đáng kể giữa các bệnh nhân ở 4 giai đoạn ung thư (p <0,001) Cụ thể, bệnh nhân ở giai đoạn muộn thường là các bệnh nhân có độ tuổi chẩn đoán cao hơn (57,77 tuổi ở giai đoạn IV so với 43,68 tuổi ở giai đoạn I) và phải nằm viện lâu hơn (231,85 ngày ở giai đoạn IV so với 50,9 ngày ở giai đoạn I) Nồng độ albumin huyết thanh của bệnh nhân cao nhất ở nhóm ung thư buồng trứng giai đoạn I (42,04 ± 5,15) và kết quả nồng độ glucose huyết thanh cao nhất thuộc nhóm giai đoạn III (6,95 ± 4,36) Tuy nhiên, nồng độ CA125 và HE4 đều cao nhất ở bệnh nhân giai đoạn III (1209,06±922.40 đối với CA125 và 499.07 ± 498.66 đối với HE4) Trong khi đó, tình trạng dinh dưỡng dựa trên nồng độ albumin huyết thanh là biến định tính duy nhất cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa 4 nhóm giai đoạn FIGO (p = 0,001), trong đó bệnh nhân ở giai đoạn II được cho là có điều kiện dinh dưỡng tốt nhất (với tỉ lệ bệnh nhân ở mức bình thường là 31,3%)

Thời gian theo dõi đối với các bệnh nhân là 43 ± 12,69 tháng Trong số 95 bệnh nhân ung thư buồng trứng mà chúng tôi quan sát và có đủ thông tin về tình trạng sức khỏe, chúng

tôi ghi nhận 31 trường hợp tử vong trong thời gian theo dõi (Hình 6) Phân tích

Kaplan-Meier cho thấy tại thời điểm 5 năm sau khi chẩn đoán ung thư buồng trứng, tỷ lệ sống sót chung của bệnh nhân là khoảng 70% Bệnh nhân có độ tuổi chẩn đoán trên 50 tuổi có tỷ lệ sống sót chung kém hơn bệnh nhân dưới 50 tuổi (p=0,001) Các bệnh nhân được phát hiện

ở giai đoạn muộn hơn cũng liên quan đến tỷ lệ sống sót chung thấp hơn (p<0,001) Không

có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ sống sót chung theo nồng độ chỉ dấu khối u CA125 trong huyết tương

32

Hình 6 Đường cong Kaplan Meier phân tích tỉ lệ sống sót của bệnh nhân ung thư

buồng trứng

A Không hiệu chỉnh

B Hiệu chỉnh theo độ tuổi

C Hiệu chỉnh theo giai đoạn bệnh

D Hiệu chỉnh theo CA125

Sử dụng phân tích Kaplan Meier, chúng tôi cho rằng tỷ lệ sống sót chung của bệnh nhân ung thư buồng trứng sau 5 năm là khoảng 70% và tỉ lệ này thấp hơn khoảng 30% ở bệnh nhân giai đoạn III Bên cạnh lý do bệnh nhân ung thư buồng trứng ở Việt Nam thường được chẩn đoán ở độ tuổi trẻ hơn, tỉ lệ sống sót cao hơn trong nghiên cứu của chúng tôi có thể được giải thích bằng sự khác nhau về mặt di truyền giữa người Việt Nam và các dân tộc khác trên thế giới, chẳng hạn như đột biến trên gen BRCA1/2 Một số nghiên cứu gần đây

về tác động của đột biến BRCA đối với ung thư buồng trứng đã chỉ ra tỷ lệ lưu hành và loại đột biến trên gen BRCA1 và BRCA2 khác nhau ở các dân tộc khác nhau, chẳng hạn như

khác nhau giữa người Hán (Trung Quốc) và người Kinh (Việt Nam) [27, 38] Ví dụ, so với

nhóm không có đột biến, việc mang đột biến dòng mầm ở BRCA1 hoặc BRCA2 có thể cải

thiện tỷ lệ đáp ứng của bệnh nhân với các phác đồ điều trị, do đó cải thiện kết quả và tăng

33

tỷ lệ sống sót như một nghiên cứu được thực hiện trên người Úc [39] Vì vậy, cần nghiên

cứu sâu hơn về đột biến gen, đặc biệt là BRCA để giải thích đầy đủ về sự đa dạng về nguy

cơ và đáp ứng với điều trị của bệnh nhân, nhất là với cộng đồng người Việt Nam

3.2.2 Mối liên hệ giữa các biến thể trên gen BRCA1/2 và các đặc điểm lâm sàng hoặc cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư buồng trứng

3.2.2.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu phân tích biến thể trên gen BRCA1 và BRCA2 được thực hiện trên 33

bệnh nhân, và được chia thành nhóm có nguy cơ đột biến cao (n=22) và nhóm có nguy cơ

đột biến thấp (n=11) (Bảng 6) Tuổi chẩn đoán trung bình của 33 bệnh nhân tham gia nghiên

cứu này là 49,06 ± 14,79 tuổi, giá trị trung bình của BMI là 21,15 ± 2,45 Chỉ có 2 bệnh nhân được ghi nhận gia đình có người mắc bệnh ung thư, cả 2 đều được phân vào nhóm nguy cơ cao (chiếm 6,06%) Kết quả giải phẫu bệnh cho thấy hầu hết bệnh nhân nghiên cứu đều mắc ung thư biểu mô, chiếm 76,00% tổng số bệnh nhân Tỷ lệ bệnh nhân ung thư buồng trứng không biểu mô ở nhóm nguy cơ thấp cao hơn đáng kể so với nhóm nguy cơ cao Thống kê cũng chỉ ra rằng bệnh nhân ở nhóm nguy cơ thấp được chẩn đoán ở giai đoạn sớm hơn những bệnh nhân ở nhóm nguy cơ cao (p=0,003)

Bảng 6 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nguy cơ biến thể cao và nhóm nguy cơ

Ung thư không

3.2.2.2 Mối liên hệ giữa đặc điểm lâm sàng và biến thể trên gen BRCA1/BRCA2

Độ tuổi chẩn đoán trung bình của bệnh nhân không mang biến thể P/LP trên gen

BRCA1/2 thấp hơn đáng kể so với những bệnh nhân có biến thể P/LP, cụ thể tuổi trung bình