Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu trích ly polyphenol tổng, chlorogenic acid, rosmarinic acid và khả năng chống oxy hóa từ lá cây kinh giới bằng phương pháp thủy phân bởi enzyme cellulase và pectinase

Tổng quan về nguyên liệu và các nghiên cứu trên thế giới về ảnh hưởng của phương pháp thủy phân bởi enzyme cellulase và pectinase nguyên liệu đến hiệu suất trích ly polyphenol tổng, chlo

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây kinh giới

2.1.1 Mô tả về cây kinh giới

Cây kinh giới có tên khoa học là Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland, thuộc chi

Elsholtzia, họ Hoa môi (Lamiaceae) Tên thường gọi của loại cây này là Kinh giới rìa, Kinh gới trồng, Khương giới, Giả tô,…[4] Chi Elsholtzia bao gồm khoảng 44 loài, thường phân bố chủ yếu ở Đông Á, Châu Phi, Bắc Mỹ và Châu Âu, đặc biệt là Nga, Mông Cổ, Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc và các nước thuộc khu vực Đông Nam Á [2] Hiện nay, có khoảng 7 loài thuộc chi Elsholtzia được phát hiện ở Việt Nam gồm, Elsholtzia ciliata, Elsholtzia winitiana, Elsholtzia blanda, Elsholtzia rugulosa, Elsholtzia communis, Elsholtzia penduliflora và Elsholtzia pilosa Thông thường Elsholtzia ciliata được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía bắc và một số ít phía nam như Lâm Đồng, thành phố Hồ Chí Minh [4]

Hình 2.1 Cây kinh giới Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland

Cây kinh giới là cây thân thảo, sống hằng năm, có mùi thơm Thân thuộc loại cỏ đứng, cao 0.6-0.8 m, toàn cây có lông màu trắng Thân non màu xanh, tiết diện vuông hơi khuyết ở bốn cạnh Thân già màu nâu tía có bốn góc lồi tròn dọc thân Lá đơn, mọc đối chéo nhau, phiến là màu xanh đậm hơn ở mặt trên, hình trứng nhọn phía đầu lá, kích thước 3-7 x 2.5-5 cm, mép lá có răng cưa, mặt dưới nhiều chấm nhỏ (lông tiết) Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, cuống lá hình trụ hơi phẳng ở mặt trên dài 2.5-4 cm Thường lá có màu xanh hoặc tía, sần sùi, mặt trên có nhiều lông bao phủ Cuống hoa màu xanh rất ngắn hoặc gần như không có Lá đài màu xanh, gần đều, dính nhau thành một ống hình chuông dài khoảng 1.5 mm Cánh hoa màu trắng hay tím nhạt đậm dần phía trên, mặt ngoài phủ đầy lông dài màu trắng [4]

Kinh giới có mặt nhiều ở các phương thuốc trong y học dân gian vì đặc tính kháng khuẩn, chống ung thư và chống viêm, ngoài ra chúng được dùng làm thực phẩm, một loại gia vị có mùi hương, đồ uống và là nguồn nguyên liệu sản xuất mật ong [3]

Kinh giới rất dễ trồng, ưa sáng và ưa ẩm, có yêu cầu thấp đối với môi trường tăng trưởng, chúng rất dễ phát triển nên có thể mọc ở đồi núi, đất bỏ hoang, địa hình nhiều nắng, bờ sông hay trong rừng, chu kỳ, thời kỳ ra hoa từ tháng 7 đến tháng 10, mùa quả từ tháng 10 đến tháng 12, thu hoạch vào mùa hè và mùa thu [4],[5]

2.1.2 Tác dụng dược lý của kinh giới

Trong Y học cổ truyền, theo Viện Y dược học dân tộc Việt Nam, cây kinh giới tính vị nóng và cay được sử dụng điều trị cho các trường hợp cảm mạo, phong nhiệt, phong hàn, cảm cúm, nhức đầu, viêm dạ dày, viêm ruột cấp tính, dùng ngoài để trị mụn nhọt, da có mủ [6],[7],[8]

Trong Y học hiện đại, tinh dầu của các loài thuộc chi Elsholtzia có hoạt tính sinh học khá tốt chống lại một số vi khuẩn thông thường chống gây bệnh cảm cúm như Staphylococcus aureus, Bacillus typhi, Aeruginosus bacillus, Diplococcus intracellularis Ngoài ra, còn có các hoạt tính chống virus, chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ thiếu máu cơ tim, cùng một số hoạt tính khác Các nhà nghiên cứu hiện nay càng ngày càng quan tâm nhiều hơn đến hoạt tính sinh học của chi này [6]

Hơn 50 hợp chất đã được phân lập từ chi Elsholtzia và hơn 100 thành phần đã được phân tích trong tinh dầu của chúng Thành phần hóa học của chúng có thể được chia thành flavonoid, coumarin, lignanoids, triterpenoid, steroid, acid béo và tinh dầu

Flavonoid là các hợp chất thuộc nhóm hợp chất phenolic đa vòng, có cấu trúc vòng benzene, mang một hoặc nhiều nhóm thế hydroxyl gắn trực tiếp vào vòng thơm Các flavonoid là những hợp chất có hoạt tính sinh học Có hơn 30 hợp chất flavonoids được phân lập từ các chi Kinh giới [9] Một số hợp chất được phân lập từ loài E ciliata gồm 5-hydroxyl-6,7-dimethyl flavone; 5-hydroxyl-7,8-dimethyl flavone; 5,7- dimethoxyl-4’-hydroxyl flavone; 5,7-dimethoxyl-4’-hydroxyl flavone, …[9]

Coumarin là một hợp chất hóa học hữu cơ có công thức C9H6O2, thuộc lớp hóa chất benzopyrone và được coi là một loại lactone Nó là một chất kết tinh màu trắng đục có mùi ngọt giống hương vani và vị đắng Coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thực vật với vai trò phòng vệ hóa học để phòng thủ chống lại kẻ thù Coumarin có nhiều hoạt động sinh học giúp phòng bệnh, kháng viêm, kháng vi sinh vật, chống đông máu và đặc tính chống oxy hóa, kích thích bài tiết insulin, [10] Một số coumarin đã được phân lập chẳng hạn, 5-(3’’-Methylbutyl)-8-methoxyl furanocoumarin; 5-(3’’, 3’’-dimethyl allyl)-8-methoxyl furanocoumarin; 5-(3’’- Hydroxyl-3’’-methylbutyl)-8- methoxyl furanocoumarin

Một số terpenoid và steroid được tìm thấy trong dịch chiết kinh giới như phytol, tiền chất của vitamin E và vitamin K1, hợp chất này giữ vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa hóa học của cơ thể cũng được tìm thấy trong dịch chiết kinh giới Nerolidol có khả năng chống nấm vi sợi Microsprorum gyseum trên chuột lang Thử nghiệm dùng eugenol và nerolidol của Lee và cộng sự cho thấy, với nồng độ 10% của hợp chất này dùng với nền kem bôi là vaseline, sau 3 tuần sử dụng thuốc tại vị trị bị bệnh, nấm Microsporum gyseum được loại bỏ một số steroid được tìm thấy ở E ciliata trong số đã phân lập được daucosterol [11]

Các acid béo được tìm thấy trong kinh giới gồm cả acid béo bão hòa, không bão hòa mạch ngắn, trung bình và dài Các dạng của acid béo mạch dài như acid oleic và hay omega-6 có trong dịch chiết kinh giới, đây là những hợp chất cần thiết để duy trì vận động cho cơ thể, vì cơ thể không tự tổng hợp được những acid này [12] Acid palmitic là acid béo đầu tiên được tạo ra trong quá trình tổng hợp acid béo, là dạng tích trữ chất béo cho cơ thể

Các loài thuộc chi Elsholtzia thường có lượng tinh dầu dồi dào, có tác dụng ức chế mạnh mẽ hệ thần kinh trung ương và có tác dụng giảm đau nhất định, đồng thời cũng cho thấy tác dụng kháng sinh và chống viêm [9] Có khoảng 100 thành phần hóa học của tinh dầu được phân tích bằng các công cụ phân tích hiện đại, chẳng hạn như phép đo sắc ký khí khối phổ (GCMS) [9] Thành phần hóa học chính của tinh dầu là không giống nhau giữa các loài Elsholtzia khác nhau Một số hợp chất chính trong tinh dầu loài E cilata là β-Dehydroelsholtzia ketone, elsholtzia ketone, 2- methyl-1,3,5-trimethyl-benzene, aromadendrene, d-carvone, limonene [13].

Tổng quan về chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào cơ thể sống [1] Chất chống oxy hóa có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc tự do mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản ứng dây chuyền được khơi mào bởi các gốc tự do, còn gọi là chất chống oxy hóa bậc một Chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự hình thành gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích thích tạo gốc tự do như Cu, Fe; bất hoạt oxy đơn) [2]

Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc, cấu trúc của chất chống oxy hóa Một trong những cách đó là dựa trên bản chất enzyme hoặc không enzyme của chất chống oxy hóa

2.2.2.1 Chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme Đây là hệ thống kháng oxy hóa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào và giữ một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự sống Tế bào sống luôn bị tổn hại bởi các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý như quá trình hô hấp và các quá trình bệnh lý Vì vậy, một hệ thống kháng oxy hóa nội sinh để bảo vệ tế bào là điều cần thiết Hệ thống đó bao gồm các enzyme kháng oxy hóa: Superoxide dismutase, Glutathion peroxidase (GSH-Px), Catalase, … [20]

2.2.2.2 Chất kháng oxy hóa phi enzyme

Chất kháng oxy hóa không có bản chất enzyme là những hợp chất do cơ thể sinh ra (có nguồn gốc nội sinh) như coenzyme Q10, vitamin A, glutathion, glycine, methionine, … hoặc các chất kháng oxy hóa ngoại sinh có nhiều trong thực vật được cung cấp vào cơ thể thông qua khẩu phần ăn gồm có các nhóm vitamin C, vitamin E, các carotenoid và các hợp chất phenolic [21],[22] Các chất này có nhiều trong rau quả Chúng được coi là các chất kháng oxy hóa tự nhiên.

Tổng quan về Polyphenol

Polyphenol là một nhóm các hợp chất hóa học có mặt chủ yếu ở thực vật, trái cây, rau quả Đặc trưng của nhóm hợp chất này là sự hiện diện của vòng thơm benzene cùng với một hoặc một vài nhóm hydroxyl (-OH) gắn trên nhân thơm [14]

Các hợp chất polyphenol có thể tồn tại trong tự nhiên dưới dạng aglycones tự do hoặc ở trạng thái ester hóa với glucose và các carbohydrate khác (dạng glycoside) Tuy nhiên trong tự nhiên polyphenol chủ yếu tồn tại ở dạng glycoside do ở dạng aglycones tự do không bền, dễ bị phân hủy [15] [16] Đặc tính của polyphenol: Không màu và có tính se khắt khứu giác Nó không cho mùi vị nhưng lại là chất chống oxy hóa cực mạnh Tác dụng sinh học của các polyphenol được giải thích là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do Các gốc tự do được sinh ra và tích luỹ trong cơ thể, là nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hoá cơ thể con người

Chất chiết xuất từ kinh giới là một nguồn polyphenol phong phú nhưng phần khối lượng của chúng phụ thuộc vào điều kiện trích ly, thời gian trích ly, độ phân cực dung môi và các điều kiện khác [17]

Các hợp chất polyphenolic rất đa dạng về cấu trúc hóa học và đây là cơ sở để phân loại Các biến thể phổ biến nhất trong bộ xương hóa học bao gồm mức độ oxy hóa, hydroxyl hóa, methyl hóa và glycosyl hóa [18] Có hơn 8000 loại polyphenol đã được xác định, Các nhóm chính của polyphenol bao gồm: Phenolic acid, Flavonoids và Non-Flavonoids [14]

Hình 2.2 Sơ đồ phân loại polyphenol dựa trên cấu tạo phân tử [18]

Phenolic acid là dẫn xuất của benzoic acid và cinnamic acid Chúng có nguồn gốc từ hydroxycinnamic acid (caffeic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, ) và hydroxybenzoic acid (syringic acid, vanillic acid, gentisic acid, ), trong phân tử của chúng có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl và nhóm cacboxylic acid được gắn trên một vòng benzene Phenolic acid được tìm thấy trong tất cả các nhóm thực phẩm và chúng có nhiều trong ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu, trái cây, rau, đồ uống và thảo mộc [23]

Hình 2.3 Cấu tạo phân tử của nhóm phenolic acid [24]

Flavonoids là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng thơm benzene nối với nhau qua một mạch 3 carbon (dị vòng pyran) Flavonoids là một nhóm lớn của polyphenol Có nhiều cách để phân loại nhóm flavonoids là dựa trên sắc tố hoặc dựa trên vị trí của gốc aryl so với khung chroman Các biến thể trong vòng dị vòng có thể tạo ra một số flavonoid và chúng có thể được phân loại thành flavonol, flavon, flavanol, flavanone, anthocyanidin và isoflavonoid

Non-flavonoids không có cấu tạo đặc trưng của phenolic acid hay flavonoids bao gồm Stilbenes, Lignans và nhóm khác

Stilbenes: có cấu trúc đặc trưng bởi sự hiện diện của nhân 1,2- diphenylethylene có thể được chia làm 2 loại là stilbene đơn phân và oligomeric [25] Chúng có các đặc tính sinh học quan trọng, như chất chống oxy hóa, chống viêm, chất chống ung thư và chất kháng khuẩn Chúng cũng có tác dụng bảo vệ gan, chống lại bệnh Alzheimer và ức chế sự gia tăng glucose và triglycerid trong huyết tương

Lignans: là những hợp chất có cấu trúc 2,3-dibenzylbutan liên kết với chất xơ được tìm thấy trong nhiều họ thực vật và thực phẩm thông thường, bao gồm ngũ cốc, quả hạch, hạt, rau và đồ uống như trà, cà phê hoặc rượu vang [26]

Một phân lớp non-flavonoid khác là diarylheptanoids bao gồm hai nhóm aryl được nối với nhau bằng chuỗi 7 carbon Chúng có thể được phân loại thành các diarylheptanoid tuyến tính và tuần hoàn; ví dụ, lần lượt là chất curcumin và myricanone [18]

Polyphenol là hợp chất tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong trái cây, rau, ngũ cốc và đồ uống Những phân tử này là chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật và thường tham gia vào việc bảo vệ chống lại bức xạ cực tím hoặc sự xâm nhập của mầm bệnh và cũng có thể góp phần tạo ra vị đắng, vị chát của thực phẩm Các nhà nghiên cứu đã khám phá ra rằng các phân tử này là chất chống oxy hóa rất tốt và có thể vô hiệu hóa phản ứng phá hủy của các loại oxy/nitơ phản ứng không mong muốn được tạo ra như sản phẩm phụ trong quá trình trao đổi chất trong cơ thể Các nghiên cứu dịch tễ học đã tiết lộ rằng polyphenol cung cấp sự bảo vệ đáng kể chống lại sự phát triển của một số bệnh mãn tính như bệnh tim mạch (CVD), ung thư, tiểu đường, nhiễm trùng, lão hóa, hen suyễn, … [19].

Tổng quan về Chlorogenic acid

Trọng lượng phân tử: 354.31 g/mol

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (1S,3R,4R,5R)-3-[3-(3,4- dihydroxyphenyl) prop-2-enoyl] oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid

3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl) quinic acid 3-Caffeoylquinic acid

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học Chlorogenic acid

Về mặt cấu trúc, Chlorogenic acid (CGA) là một nhóm hợp chất polyphenol hình thành thông qua liên kết este giữa quinic acid với trans-cinamic acid (chủ yếu là caffeic acid, ferulic acid và p-coumaric acid) [27] CGA là một trong những hợp chất phenolic acid có sẵn nhiều nhất trong thực phẩm, chẳng hạn như cà phê và trà Một số polyphenol được phân lập từ cà phê, đặc biệt là CGA được xem là chất chống oxy hóa nổi trội [28]

Chlorogenic acid (CGA) là chất rắn, dạng bột màu trắng hoặc hơi ngả vàng, tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid Đây là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là 4°C, độ hòa tan 40 mg/mL ở 25°C và nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 205 – 209°C [94]

CGA có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng thường được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, thực phẩm, chăm sóc sức khỏe,…

2.4.3.1 Khảng năng kháng oxy hóa

Khả năng kháng oxy hóa là một trong những hoạt động quan trọng của CGA CGA chứa năm nhóm hydroxyl hoạt động và một nhóm carboxyl Cấu trúc nhóm hydroxyl phenolic phản ứng dễ dàng với các gốc tự do vì có thể tạo thành các nguyên tử hydro có tác dụng chống oxy hóa để loại bỏ hoạt động của các gốc tự do hydroxyl và anion superoxide, do đó đóng vai trò kháng oxy hóa mạnh CGA có tác dụng thu hồi ba loại ROS (-O2,OH và H2O2) Hiệu quả thu hồi và nồng độ phụ thuộc vào liều lượng Khi nồng độ cao, tác dụng thu hẹp đối với ba loại oxy phản ứng này là rõ ràng và ổn định Khi nồng độ thấp, tác dụng thu hồi -O2 và OH suy giảm, thậm chí còn tạo ra tác dụng thúc đẩy quá trình oxy hóa [29] Chlorogenic acid có khả năng hạn chế sự oxy hóa trong thực phẩm đặc biệt là các thực phẩm giàu chất béo và các nhũ tương dầu/nước hay nước/dầu Quá trình oxy hóa chất béo trong thực phẩm thường làm giảm giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học và giá trị cảm quan của các sản phẩm thực phẩm [27]

Việc sử dụng chất bảo quản hóa học tổng hợp trong các sản phẩm thực phẩm là một mối quan ngại cho người tiêu dùng bởi các tác dụng phụ của chúng Do đó, việc xác định các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên có thể được chấp nhận bởi người tiêu dùng đã trở nên có giá trị và là mối quan tâm của rất nhiều nhà sản xuất thực phẩm Nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng CGA có thể được sử dụng như một chất bảo quản do có khả năng kháng vi sinh vật CGA thể hiện khả năng kháng lại nhiều loại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc trong đó có nhiều vi sinh vật gây bệnh như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Bacillus cereus, … [30]

2.4.3.3 Tác dụng chống bệnh tim mạch

CGA loại bỏ các gốc tự do và chống peroxy hóa lipid, làm tăng các nồng độ ion kali, giảm nồng độ triacylglycerol và cholesterol trong máu, bảo vệ các tế bào nội mô mạch máu và do đó có tác dụng bảo vệ hiệu quả đối với hệ thống tim mạch [29]

2.4.3.4 Khả năng chống đột biến và ung thư

CGA ức chế đột biến mạnh mẽ, ức chế đột biến do aflatoxin B và quá trình nitro hóa gây ra [31] Về tác dụng chống ung thư, CGA có tác dụng ức chế đáng kể đối với ung thư đại trực tràng, ung thư gian, ưng thư phổi,… nên chúng được xem là chất hóa học bảo vệ tránh ung thư hiệu quả [29] Đồng thời, CGA giúp ngăn chăn chu kỳ phát triển của tế bào bằng cách gây ra quá trình chết theo chương trình và cũng ức chế phát triển của tế bào ung thư [29].

Tổng quan về Rosmaniric acid

Rosmarinic acid (RA) là một este của caffeic acid và 3,4- dihydroxy phenyl lactic acid lần đầu tiên được phân lập từ lá của cây hương thảo

Trọng lượng phân tử: 360.3 g/mol

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2 R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(E)-3- (3,4-dihydroxyphenyl) prop-2-enoyl] acid oxypropanoic

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học Rosmarinic acid

Chất rắn kết tinh, sôi ở 694.71°C, 760 mmHg Điểm nóng chảy: 171-175°C Độ hòa tan: Hòa tan trong ethanol, DMSO hoặc dimethyl formamid

RA có tác dụng sinh học đáng chú ý, bao gồm kháng virus, kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, chống lão hóa, trị đái tháo đường, bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan, bảo vệ thận, chống trầm cảm, chống dị ứng và chống viêm [32]

RA thể hiện hoạt động thu dọn các gốc tự do trong các tế bào hình sao ở gan (HSC) do tác dụng chống oxy hóa của nó bằng cách tăng cường tổng hợp Glutathione (GSH) RA cũng ngăn ngừa stress oxy hóa trong tế bào thần kinh đệm C6 bằng cách tăng khả năng sống của tế bào và ức chế quá trình peroxid hóa lipid [32]

RA có tác dụng kháng khuẩn đối với các chủng Staphylococcus aureus và

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) Hơn nữa, RA cho thấy tác dụng hiệp đồng với kháng sinh amoxicillin, ofloxacin và vancomycin chống lại S aureus Mặt khác, RA làm giảm sự hình thành màng sinh học, cho thấy rằng nó có thể được sử dụng như một chất chống vi sinh vật hiệu quả để tiêu diệt hoạt động của tế bào sống tự do và làm giảm hoạt động hình thành màng sinh học trong quá trình phát triển ở giai đoạn đầu [32]

Tổng quan về Enzyme

Thành tế bào thực vật được cấu tạo chủ yếu từ cellulose và các tế bào thực vật được kết dính với nhau nhờ pectin Sử dụng các chế phẩm cellulase và pectinase để xử lý nhằm hỗ trợ sự phá hủy của thành tế bào và lớp kết dính giữa các tế bào trong cấu trúc mô thực vật nhờ đó thu được nhiều dịch bào và chất chiết hơn

Cơ chất của cellulase là cellulose Đây là cơ chất phổ biến trong tự nhiên Cellulose là polymer mạch thẳng của các phân tử đường glucose, chúng liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glucoside Mỗi phân tử cellulose có thể chứa 6000-12000 gốc glucose Trong tự nhiên, cellulose tồn tại ở dạng những bó sợi, khi đó sẽ xuất hiện các liên kết hydro giữa những phân tử cellulose với nhau Khi các phân tử cellulose được sắp xếp song song và số liên kết hydro giữa chúng tăng cao thì cấu trúc của bó sợi rất chặt chẽ, được gọi là cellulose cấu trúc tinh thể Khi các phân tử cellulose không được sắp xếp một cách trật tự và số liên kết hydro ít đi thì cấu trúc bó sợi ít chặt chẽ, được gọi là cellulose cấu trúc vô định hình và dễ bị thủy phân bởi cellulase hơn so với cellulose cấu trúc tinh thể [33]

2.6.1.2 Các giai đoạn tác dụng của hệ enzyme cellulase

Cellulase là hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân của cellulose thành cellubiose và cuối cùng thành glucose Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ cellulase gồm có các enzyme cơ bản sau đây:

- Cellulose bị thủy phân dưới tác dụng của hệ enzyme thủy phân β-1,4- glucanase Hệ enzyme này gồm có 2 loại là exo β-1,4-glucanase và endo β-1,4- glucanase

• Exo β-1,4-glucanase xúc tác thủy phân liên kết β-1,4-glucoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose, sản phẩm của quá trình thủy phân có thể là cellubiose hoặc glucose

• Endo β-1,4-glucanase xúc tác thủy phân liên kết β-1,4-glucoside ở bất kì vị trí nào giữa mạch phân tử cellulose

Dưới tác dụng của enzyme β-glucosidase (hoặc có tên khác là cellobiase), enzyme này có thể thủy phân những đoạn oligomer của cellulose và cellobiose Đối với cơ chất là các oligomer của cellulose, enzyme sẽ xúc tác thủy phân liên kết (β - 1,4 glycoside từ đầu không khử và giải phóng ra sản phẩm là glucose [33]

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong các loại rau quả cũng như trong các loại nguyên liệu, phế liệu của ngành trồng trọt và lâm nghiệp Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua thủy phân liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose nhờ đó dung môi khuếch tán vào bên trong nguyên liệu, cũng như tạo điều kiện để các chất cần trích ly sẽ thoát ra khỏi tế bào dễ dàng Có nhiều nghiên cứu về cellulase được ứng dụng vào thực tế Trong sản xuất nước hoa quả không cồn, cellulase được thêm vào giai đoạn dịch hóa nhờ đó mà nước quả có độ đồng hóa tốt hơn Ngoài ra độ nhớt của dịch quả giảm tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong [34]

Cơ chất của pectinase là các hợp chất pectin với những thành phần sau:

- Protopectin là phức của pectin với các hợp chất hóa học khác Protopectin có nhiều trong trái cây chưa chín

- Pectic acid thuộc polygalacturonic acid, đây là polymer của các phân tử acid polygalacturonic acid, liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside

- Pecticnic acid thuộc polygalacturonic acid, trong đó một số gốc –COOH trong phân tử đã bị ester hóa bởi methanol

- Pectate và pectinate là muối của pectic acid và pectinic acid Ngoại trừ protopectin, các hợp chất còn lại trong nhóm đều hòa tan được trong nước [33]

Hệ enzyme pectinase có thể bao gồm 2 nhóm chủ yếu [35]:

- Pectin methyl esterase (EC.3.1.1.11) là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết ester trong phân tử pectin hoặc pectinic acid (các polygalacturonic acid được ester hóa bởi methanol ở mức thấp), khi toàn bộ nhóm methoxyl đều bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là methanol và các polygalacturonic acid Số liên kết ester trong phân tử pectin và pectinic acid có thể bị thủy phân hoàn toàn hoặc bị thủy phân một phần

- Nhóm enzyme thủy phân liên kết α-1,4-glycoside trong các hợp chất pectin Nhóm này có thể bao gồm 2 nhóm lớn là Polymethylgalacturonase và Polygalacturonase [35]:

+ Polymethylgalacturonase tác dụng chủ yếu lên các ester methylic của các polygalacturonic acid Các enzyme này được chia làm hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glycoside bị cắt đứt:

• Endo Polymethylgalacturonase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4- glycoside tại vị trí giữa mạch của các phân tử pectin (các phân tử polygalacturonic acid được ester hóa ở mức độ cao)

Hình 2.6 Sơ đồ tác động của Endo Polymethylgalacturonase lên hợp chất pectin [35]

• Exo Polymethylgalacturonase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4- glycoside ở đầu mạch để tách từng gốc polygalacturonic acid ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu từ đầu không khử và sản phẩm được tạo ra là galacturonate

Hình 2.7 Sơ đồ tác động của Exo Polymethylgalacturonase lên hợp chất pectin

+ Polygalacturonase là các enzyme tác dụng chủ yếu lên các pectic acid (các polygalacturonic acid không bị ester hóa) và pectinic acid (các polygalacturonic acid bị ester hóa ở mức độ thấp) Các enzyme này cũng được chia làm hai nhóm tùy vào vị trí liên kết glycoside bị cắt đứt

• Endo Polygalacturonase xúc tác sự thủy phân các liên kết glycoside ở giữa mạch của các phân tử pectic acid hoặc pectinic acid, các enzyme này tác dụng ở vị trí đầu nhóm carboxyl tự do Sự thủy phân cơ chất duới tác dụng của Endo Polygalacturonase xảy ra mạnh hơn khi nguyên liệu đã được xử lý trước Pectin methyl esterase

Hình 2.8 Sơ đồ tác động của Endo Polygalacturonase lên acid pectinic [35]

+ Exo Polygalacturonase xúc tác sự thủy phân của các liên kết α-1,4-glycoside từ đầu không khử của phân tử pectic acid hoặc pectinic acid và sản phẩm được tạo ra là galacturonate

2.6.2.3 Ứng dụng Ở thành tế bào thực vật có chứa nhiều pectin và chúng được xem như thành phần gắn kết các tế bào với nhau Khi phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện để vật chất trong tế bào thoát ra Ngoài ra pectin còn gây ra độ nhớt cao làm hạn chế các chất trong tế bào thoát ra bên ngoài nên khi sử dụng pectinase thì pectin bị cắt thành những đoạn ngắn hơn và độ nhớt của hỗn hợp cũng giảm giúp các chất cần trích ly thoát ra ngoài Pectinase có nhiều ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp sản xuất rượu và nước quả hay được sử dụng trong các nghiên cứu nhằm tăng hiệu suất trích ly

2.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme

Khi tăng lượng cơ chất thì tốc độ phản ứng ban đầu tăng Nhưng Khi enzyme tác dụng hết với cơ chất, nghĩa là: xảy ra sự tạo thành phức enzyme – cơ chất ở mức lớn nhất có thể, thì tạo thành lượng sản phẩm lớn nhất; bổ sung tăng thêm nồng độ cơ chất cũng không tạo thành sản phẩm, nghĩa là vận tốc phản ứng không tăng [36]

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian rất ngắn, vận tốc phản ứng đã không đổi theo thời gian [36]

Hình 2.9 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng

Quá trình trích ly [33]

Trích ly là quá trình hòa tan chọn lọc một hay nhiều cấu tử có trong mẫu nguyên liệu bằng cách cho nguyên liệu tiếp xúc với dung môi Động lực của quá trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử ở trong nguyên liệu và ở trong dung môi Đây là một quá trình truyền khối Trong công nghiệp thực phẩm, các nguyên liệu cần trích ly thường tồn tại ở dạng pha rắn, dung môi thường ở dạng pha lỏng, quá trình được gọi là trích ly rắn - lỏng

Quá trình chiết xuất được sử dụng rộng rãi như một quá trình tách để thu được chiết xuất thô của các chất phytochemical từ nguyên liệu thực vật [73] Tuy nhiên, do mỗi nguyên liệu thực vật có những đặc tính riêng về chiết xuất phenolic, các loại thực vật khác nhau có thể yêu cầu các điều kiện chiết xuất khác nhau để đạt được hiệu suất thu hồi tối đa các hợp chất phenolic [73] Có một số yếu tố góp phần ảnh hưởng đến tốc độ chiết và chất lượng của các hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học được chiết xuất, bao gồm loại dung môi trích ly, nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian và pH của quá trình trích ly [73]

Dung môi: chọn dung môi là một vấn đề rất quan trọng để thực hiện quá trình trích ly thường dựa vào những tiêu chí sau để chọn dung môi

• Có khả năng hòa tan chọn lọc, tức cấu tử cần thu nhận trong mẫu nguyên liệu có độ hòa tan cao trong dung môi Ngược lại, các cấu tử khác có trong mẫu nguyên liệu cần trích ly thì không hòa tan được trong dung môi hoặc có độ hòa tan kém

• Trơ với các cấu tử có trong dịch trích

• Không gây hiện tượng ăn mòn thiết bị, khó cháy và không độc đối với người sử dụng

• Giá thành thấp, dễ tìm, các nhà sản xuất có thể thu hồi dung môi sau quá trình trích ly để tái sử dụng Những dung môi phổ biến hiện nay trong công nghiệp thực phẩm bao gồm nước, một số loại dung môi hữu cơ và CO2 siêu tới hạn

• Nước là dung môi phổ biến nhất trong công nghiệp thực phẩm Nước được sử dụng để trích ly saccharose trong công nghệ sản xuất đường từ củ cải đường, trích ly các chất chiết từ trà và cà phê trong công nghệ sản xuất trà và cà phê hòa tan,…

• Các dung môi hữu cơ (hexane, heptane hoặc cyclohexane) được sử dụng để trích ly chất béo từ thực vật trong công nghệ sản xuất dầu béo Tuy nhiên nhược điểm đáng lưu ý là cả ba dung môi trên là đều dễ gây cháy nên các nhà sản xuất cần cẩn thận khi sử dụng

• CO2 siêu tới hạn ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp thực phẩm, ưu điểm như không gây cháy, không độc và giá thành thấp, thường được dùng để trích ly caffeine từ trà và cà phê nhằm tạo ra các sản phẩm trà và cà phê có hàm lượng caffeine thấp Tuy nhiên độ hòa tan của cấu tử cần trích ly trong CO2 siêu tới hạn khá thấp Thường nhà sản xuất có thể bổ sung thêm một dung môi khác gọi là đồng dung môi để làm tăng độ hòa tan như ethanol, acetone, ethyl acetate,…

2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng khi trích ly bằng dung môi

Hàm mục tiêu của quá trình trích ly là hiệu suất thu hồi cấu tử cần chiết tách Tức là tỷ lệ giữa hàm lượng cấu tử trong dung dịch trích so với hàm lượng của nó trong nguyên liệu đem trích ly Giá trị hiệu suất thu hồi cấu tử càng cao thì việc thực hiện quá trình trích ly sẽ đạt hiệu quả kinh tế càng cao Cấu tử cần thu nhận không phải là một chất mà là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất hóa học khác nhau có trong nguyên liệu đem trích ly

Kích thước nguyên liệu càng nhỏ thì diện tích bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn Do đó, việc trích ly các cấu tử từ nguyên liệu vào dung môi sẽ trở nên dễ dàng hơn

2.7.2.2 Tỷ lệ khối lượng giữa nguyên liệu và dung môi

Với cùng một lượng nguyên liệu, nếu tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly sẽ tăng theo Đó là do sự chênh lệch nồng độ của cấu tử cần trích ly trong nguyên liệu và trong dung môi sẽ càng lớn Tuy nhiên, nếu lượng dung môi sử dụng quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích

Khi tăng nhiệt độ, các cấu tử sẽ chuyển động nhanh hơn, do đó sự hòa tan và khuếch tán của cấu tử từ nguyên liệu vào dung môi sẽ được tăng cường Ngoài ra, khi nhiệt độ tăng, độ nhớt của dung môi sẽ giảm, dung môi dễ dàng xuyên qua lớp nguyên liệu và làm cho diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ trích ly sẽ làm tăng chi phí năng lượng cho quá trình, đồng thời có thể xảy ra một số phản ứng hóa học không mong muốn trong dịch trích và sự tổn thất các cấu tử hương sẽ gia tăng

Khi tăng thời gian trích ly thì hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ gia tăng Nhưng đến một thời điểm hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ không tăng thêm đáng kể

2.7.2.5 Tốc độ dòng dung môi chảy qua lớp nguyên liệu trong thiết bị trích ly

Nếu dòng dung môi được bơm với tốc độ cao vào thiết bị chứa nguyên liệu cần trích ly thì sẽ làm giảm đi kích thước lớp biên bao bọc xung quanh nguyên liệu, đây là nơi tập trung các cấu tử hòa tan Do đó, tốc độ trích ly các cấu tử từ nguyên liệu sẽ gia tăng Tùy thuộc vào hình dạng thiết bị, kích thước của lớp nguyên liệu trong thiết bị mà tốc độ dòng dung môi bơm vào thiết bị sẽ được lựa chọn sao cho thời gian trích ly là ngắn nhất và hiệu suất hồi chất chiết là cao nhất

Trong phương pháp trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn, áp suất và nhiệt độ là hai yếu tố ảnh hưởng quyết định đến hiệu suất thu hồi chất chiết Thông thường, khi tăng áp suất và nhiệt độ thì quá trình trích ly diễn ra càng nhanh và hiệu suất trích ly sẽ tăng theo Tuy nhiên, việc tăng áp suất sẽ làm tăng chi phí vận hành và giá thành thiết bị cũng tăng cao.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam

Các nghiên về cây kinh giới khá phổ biến trên thế giới, các nghiên cứu tập trung về thành phần hóa học, khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chống viêm,… Đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về việc sử dụng sự hỗ trợ của enzyme để trích ly cây kinh giới Heemann, A C W., Heemann và cộng sự (2019), đã đánh giá các điều kiện trích ly tốt nhất như thời gian trích ly, nhiệt độ, nồng độ enzyme và độ pH để thu được polyphenol dùng trong công nghiệp từ yerba mate, sử dụng trích ly có hỗ trợ enzyme thay thế cho chiết xuất dung môi thông thường [37] Hỗn hợp enzyme thương mại được sử dụng là Viscozyme ® L, (Novozymes, Đan Mạch) điều kiện tốt nhất để chiết xuất polyphenol từ yerba mate là nhiệt độ 50°C, nồng độ enzyme 168 FGB/100 g, thời gian xử lý là 120 phút và giá trị pH là 4.5 [37]

Abdullah, S và cộng sự (2021), quá trình trích ly nước ép hạt điều có sự hỗ trợ của pectinase đã được mô hình hóa và tối ưu hóa bằng cách sử dụng mạng lưới nơron nhân tạo nhiều lớp (ANN) kết hợp với giải thuật di truyền (GA) [39] Ảnh hưởng của thời gian ủ, nhiệt độ ủ và nồng độ enzyme đến các phản ứng khác nhau như năng suất, độ đục, hàm lượng ascorbic acid, hàm lượng polyphenol, tổng chất rắn hòa tan và độ pH cũng được xác định Các thông số trích tối ưu thu được bằng cách sử dụng ANN-GA đã phát triển như sau: thời gian ủ là 64 phút, nhiệt độ ủ là 32°C và nồng độ enzyme là 0.078% [39]

Arias và cộng sự (2023), đã thực hiện tối ưu hóa phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của enzyme Pectinase để thu hồi hiệu quả các hợp chất hoạt tính sinh học từ dâu tằm [38] Điều kiện tối ưu bao gồm trích ly 0.15 g dâu tằm ở 40°C, sử dụng 15mL ethanol 70% làm dung môi ở pH 4, 38.46 U enzyme/g mẫu và lắc ở tốc độ 200 vòng/phút Nghiên cứu về thời gian trích ly tối ưu cho thấy rằng 5 phút trích là đủ để đạt được nồng độ tối đa của hợp chất có hoạt tính sinh học Dâu tằm đỏ (Morus rubra) có hàm lượng hợp chất phenolic cao nhất (121.10 ± 19.56 mg/100 g) Hơn nữa, các hợp chất được chiết xuất còn thể hiện đặc tính chống oxy hóa và kháng khuẩn đáng kể [38]

2.8.2 Tại Việt Nam Ở trong nước, tình hình nghiên cứu còn nhiều hạn chế, chưa có nghiên cứu nào liên quan đến việc sử dụng enzyme trong quá trình trích ly cây kinh giới Một vài nghiên cứu về enzyme chẳng hạn như, nhóm tác giả của Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu (2020), đã tận dụng nguồn phụ phẩm phế thải của công nghệ sản xuất nước ép từ trái Thanh long chiết tách dầu bằng phương pháp enzyme Enzyme Viscozyme L (hỗn hợp các enzyme Xylanase, Cellulase, Hemicellulase) cho hiệu suất chiết tách dầu hạt Thanh long cao Các thông số kỹ thuật cũng được nghiên cứu tối ưu hóa bao gồm: pH dịch trích 5.1 với tỷ lệ nước bổ sung là 3/1, hàm lượng enzyme sử dụng 0.54%, thời gian và nhiệt độ thủy phân là 5 giờ và 37 o C Hiệu suất chiết tách cao nhất đạt được là 88.67% [40]

Một nhóm tác giả khác của Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu (2020), sử dụng chế phẩm enzyme Viscozyme do Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu cung cấp để tách dầu mắc ca góp phần làm tăng hiệu suất thu hồi dầu và giữ được các tính chất đặc trưng của dầu mắc ca Các thông số công nghệ lựa chọn tối ưu là: Nồng độ enzyme sử dụng là 1.12%, nhiệt độ thủy phân 40.5 o C và thời gian thủy phân 5 giờ 20 phút, khi đó hiệu suất tách dầu mắc ca đạt 91.20% [41]

Trịnh Trúc Giang và cộng sự (2020), nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện thu nhận chlorogenic acid từ quả cà phê xanh bằng enzyme pectinase, với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:10 - 1:80 (g/ml), pectinase 10 - 60 U/g, khoảng pH 5.0 – 7.5, nhiệt độ 20 - 60 o C, tốc độ lắc 0 - 160 vòng/phút, thời gian 10 - 120 phút và đã tìm được phương án phù hợp cho hàm lượng CGA 58.18 mg/g Tối ưu điều kiện chiết xuất theo quy hoạch thực nghiệm bậc 2 Box-Benken đã nâng cao được nồng độ CGA đạt 62.31 mg/g (tỷ lệ 1:60 g/ml; 55 U/g; pH 5.5; 50 o C, 80 vòng/phút, 55 phút) [42]

Trong nghiên cứu của Trần Thị Thu Trà và cộng sự (2021), phụ phẩm vỏ và thịt quả cà phê robusta được trích ly bằng dung môi nước có sự hỗ trợ của hỗn hợp hai chế phẩm enzyme pectinase và cellulase được sử dụng đồng thời nhằm tăng hiệu suất trích ly các hợp chất polyphenol Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện trích ly tốt nhất khi hàm lượng pectinase và cellulase lần lượt là 600 U/g và 400 U/g nguyên liệu, pH dịch trích 4.0, nhiệt độ ủ 50 o C, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 trong thời gian 60 đến 75 phút [43]

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Cây kinh giới (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland) được mua tại Lâm Đồng từ tháng 01/2024 đến tháng 04/2024 Cây được thu mua ngay sau khi thu hoạch từ 5 giờ sáng (đã cắt bỏ rễ), tại trang trại rau sạch ở Lâm Đồng (không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và thuốc tăng trưởng), thân cây cao khoảng 50cm, được bọc trong giấy kraf và xếp vào thùng xốp EPS đầy khoảng 2/3 thể tích thùng, thùng được đậy nắp và có đục lỗ, được vận chuyển trên xe có nhiệt độ khoảng 20 o C về TP.HCM và các thùng xốp EPS được chuyển đến phòng thí nghiệm, bảo quản tủ mát 10-15 o C trong từng túi plastic EVA (co-polymer của polyethylene và vinylacetate) với khối lượng phù hợp cho thí nghiệm, được bảo quản ở điều kiện trên trong vòng 2-3 ngày

Hình 3.1 Nguyên liệu lá kinh giới

Chế phẩm enzyme cellulase và pectinase đều được cung cấp bởi công ty Brenntag Việt Nam

Bảng 3.1 Đặc tính các chế phẩm enzyme

- Thuốc thử Folin-Ciocalteu (Ấn Độ)

- Sodium carbonate (Na2CO3) (Việt Nam)

Tên chế phẩm Celluclast® 1.5L Pectinex® Ultra SP- L

Sản phẩm được sản xuất bằng phương pháp lên men vi sinh vật Protein enzyme được phân tách và tinh sạch sau quá trình lên men

Hoạt lực công bố 700 EGU/g 3800 PGNU/ml

Nhiệt độ tối ưu 45ºC ÷ 60ºC 45ºC ÷ 60ºC pH tối ưu 4 ÷ 6 4 ÷ 6

Trạng thái vật lý Dạng lỏng, màu nâu Dạng lỏng, màu nâu

Chất ổn định Sodium chloride Sorbitol

Chất bảo quản Potassium sorbate Potassium chloride

- Máy đo quang phổ UV-VIS

- Cân điện tử 4 số lẻ (Shimadzu AUY 22)

- Cân 2 số lẻ (Ohaus SKX222)

- Cân sấy ẩm hồng ngoại

- Dụng cụ: Cuvette, cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, ống nghiệm, giấy lọc, rổ quay li tâm,

Phương pháp nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu được trình bày dưới dạng sơ đồ sau đây:

Hình 3.2 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình công nghệ trích ly TPC, CGA, RA từ lá cây kinh giới có sự hỗ trợ của enzyme

Mục đích: đảm bảo lựa chọn nguồn nguyên liệu đồng nhất

Phương pháp thực hiện: lá kinh giới từ cây kinh giới đã được bảo quản ở phòng thí nghiệm ở nhiệt độ từ 10-15 o C, lá được lựa chọn thủ công với kích thước đồng đều nhau, loại bỏ những lá hư hỏng và cho vào các túi nilon với khối lượng khoảng 10g

Mục đích: loại bỏ tạp chất, bụi bẩn trên bề mặt nguyên liệu

Phương pháp thực hiện: rửa lá kinh giới dưới vòi nước sạch ở nhiệt độ phòng sao cho các tạp chất bám trên bề mặt lá đều bị loại bỏ hoàn toàn, thực hiện nhẹ nhàng tránh làm tổn thương đến lá và để ráo

Mục đích: diệt enzyme nội tại tế bào với phương pháp dung nhiệt giúp bất hoạt enzyme Polyphenol Oxidase, là nguyên nhân làm tổn thất hàm lượng polyphenols khi trích ly

Phương pháp thực hiện: chuẩn bị nước cất có thể tích gấp 10-12 lần nguyên liệu, đun nước và giữ lá kinh giới ở nhiệt độ chần trong một khoảng thời gian xác định, sau đó làm lạnh nhanh lá

Mục đích: làm giảm nhiệt độ của lá để tránh các biến đổi xảy ra sau quá trình chần

Phương pháp thực hiện: lá kinh giới sau khi chần được cho vào nước đá để làm lạnh nhanh trong nước 5-10 o C khoảng 2 phút

Mục đích: tạo thành tinh thể đá bên trong tế bào lá, giúp tăng phá vỡ cấu trúc màng tế bào, giúp quá trình khuếch tán các hoạt chất vào dung môi, tăng hiệu suất trích ly; ức chế hoạt động của vi sinh vật

Phương pháp thực hiện: lá kinh giới sau khi làm lạnh nhanh, vớt ra làm ráo nước và để ngay vào tủ đông có nhiệt độ cố định -18 o C từ 18-24 giờ

Mục đích: làm nhỏ kích thước nguyên liệu trước khi thực hiện trích ly, tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme, dung môi với nguyên liệu, tăng hiệu suất trích ly

Phương pháp thực hiện: Hỗn hợp gồm lá và nước cất theo tỷ lệ được nghiền bằng máy xay Philips HR2118 trong 5 lần, mỗi lần 1 phút Sau đó hỗn hợp được chỉnh pH với dung dịch Na2CO3 0.2M hoặc dung dịch lactic acid 0.2M

Mục đích: chuẩn bị, nhằm tạo điều kiện thích hợp cho hoạt động của enzyme

Phương pháp thực hiện: Sau khi điều chỉnh pH, cân enzyme theo khối lượng và tỷ lệ enzyme 1:1, cho vào bình chứa hỗn hợp nghiền, đặt bình vào bể ổn nhiệt và ủ ở nhiệt độ để enzyme hoạt động

- Trích ly và bất hoạt enzyme:

Mục đích: Thông thường khi sử dụng enzyme để xúc tác làm biến đổi cơ chất trong nguyên liệu, phải thực hiện việc kết thúc phản ứng để vô hoạt enzyme Các phương pháp được sử dụng là gia nhiệt hoặc hiệu chỉnh pH của hỗn hợp Tuy nhiên, nhiệt độ và pH có thể làm ảnh hưởng đến chất lượng và cảm quan của sản phẩm Vì vậy, phương pháp được sử dụng để bất hoạt enzyme là sử dụng ethanol tuyệt đối; bên cạnh việc đình chỉ hoạt động của enzyme thì ethanol cũng có tác dụng trích ly các thành phần trong nguyên liệu

Phương pháp thực hiện: sau thời gian xử lý enzyme, lượng ethanol tuyệt đối được thêm vào sao cho tổng lượng dung môi được bổ sung có nồng độ ethanol là 60%, thời gian trích ly và bất hoạt enzyme với ethanol là 30 phút

Mục đích: thu nhận dịch trích lá kinh giới

Phương pháp thực hiện: hỗn hợp dung dịch lá kinh giới sau khi trích ly được lọc qua giấy lọc Whatman No.4 bằng thiết bị lọc chân không, thu nhận dịch trích để chuẩn bị cho quá trình phân tích.

Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Đo độ ẩm, carbohyrate tổng, protein tổng, lipid tổng, TPC,

CGA, RA, AC, tro của lá kinh giới tươi

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố của quá trình trích ly lá cây kinh giới có sự hỗ trợ của enzyme

Xác định ảnh hưởng của các thông số trích ly gồm, hàm lượng enzyme sử dụng, tỷ lệ cellulase/pectinase, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ cồn, pH, nhiệt độ trích ly, thời gian phù hợp để thu được sản phẩm có hàm lượng TPC, CGA, RA và AC cao nhất

Cân khoảng 10g lá kinh giới tươi cho mỗi lần thí nghiệm, thực hiện quá trình chần ở 80 o C trong 90 giây, lá được làm lạnh nhanh và cho vào tủ đông từ 18-24 giờ Sau khi lạnh đông, mang nguyên liệu đi xay nghiền Hỗn hợp lá kinh giới và dung môi nước sau khi xay nghiền được đựng trong erlen, điều chỉnh pH, thêm enzyme và được ủ trong bể điều nhiệt để thực hiện thủy phân/trích ly, sau đó ethanol được thêm vào để bất hoạt enzyme và trích ly Tiến hành lọc, thu nhận dịch trích và tiến hành phân tích Trong khi thay đổi 1 yếu tố khảo sát thì cố định các yếu tố còn lại

Hàm lượng polyphenol tổng (TPC), hàm lượng chlorogenic acid (CGA), hàm lượng rosmarinic acid (RA), hoạt tính chống oxy hóa (AC)

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố của quá trình trích ly

Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng enzyme tổng sử dụng trong trích ly

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) 1/14

Nhiệt độ trích ly ( o C) 50 o C Thời gian xử lý enzyme (phút) 30 phút Thời gian xử lý Ethanol (phút) 45 phút

Yếu tố thay đổi Hàm lượng enzyme tổng 0, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2

Thí nghiệm 3: Khảo sát tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w)

Hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) Kết quả thí nghiệm 2

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) 1/14

Nhiệt độ trích ly ( o C) 50 o C Thời gian xử lý enzyme (phút) 30 phút

Thời gian xử lý Ethanol (phút) 45 phút

Yếu tố thay đổi Tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w) 0/1, 1/0, 1/1, 1/2, 2/1, 3/1

Thí nghiệm 4: Khảo sát tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi

Hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) Kết quả thí nghiệm 2

Tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w) Kết quả thí nghiệm 3

Nhiệt độ trích ly ( o C) 50 o C Thời gian xử lý enzyme (phút) 30 phút Thời gian xử lý Ethanol (phút) 45 phút

Yếu tố thay đổi Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) 1/12, 1/13, 1/14, 1/15, 1/16

Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ Ethanol

Hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) Kết quả thí nghiệm2

Tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w) Kết quả thí nghiệm 3

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) Kết quả thí nghiệm 4 pH 5

Thời gian xử lý enzyme (phút) 30 phút Thời gian xử lý Ethanol (phút) 45 phút

Yếu tố thay đổi Nồng độ Ethanol (%v/v) 40, 50, 60, 70, 80 (%v/v)

Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của pH Yếu tố cố định Hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) Kết quả thí nghiệm 2

Tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w) Kết quả thí nghiệm 3

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) Kết quả thí nghiệm 4 Nồng độ Ethanol (%v/v) Kết quả thí nghiệm 5 Nhiệt độ trích ly ( o C) 50 o C

Thời gian xử lý enzyme (phút) 30 phút Thời gian xử lý Ethanol (phút) 45 phút

Yếu tố thay đổi pH 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0

Thí nghiệm 7: Khảo sát nhiệt độ trích ly

Hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) Kết quả thí nghiệm 2

Tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w) Kết quả thí nghiệm 3

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) Kết quả thí nghiệm 4 Nồng độ Ethanol (%v/v) Kết quả thí nghiệm 5 pH Kết quả thí nghiệm 6

Thời gian xử lý enzyme (phút) 30 phút Thời gian xử lý Ethanol (phút) 45 phút

Yếu tố thay đổi Nhiệt độ trích ly ( o C) 40, 50, 60, 70, 80 ( o C)

Thí nghiệm 8: Khảo sát thời gian xử lý enzyme

Hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) Kết quả thí nghiệm 2

Tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w) Kết quả thí nghiệm 3

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) Kết quả thí nghiệm 4 Nồng độ Ethanol (%v/v) Kết quả thí nghiệm 5 pH Kết quả thí nghiệm 6

Nhiệt độ trích ly ( o C) Kết quả thí nghiệm 7 Thời gian xử lý Ethanol (phút) 45 phút

3.3.3 Sàng lọc yếu tố thực sự ảnh hưởng đến đối tượng nghiên cứu

Thí nghiệm 10: Sàng lọc yếu tố

Khi có nhiều yếu tố tác động đến đối tượng nghiên cứu, quá trình sàng lọc các yếu tố sẽ giúp đơn giản hóa quá trình tối ưu hóa nhờ xác định được các yếu tố thực sự ảnh hưởng đến đối tượng nghiên cứu đồng thời xác định và loại bỏ được các yếu tố ít hoặc không tác động

Kết quả được kiểm tra bằng phần mềm Modde 13.1, sàng lọc 8 yếu tố ảnh hưởng theo ma trận Plackett-Burman dựa vào hàm lượng polyphenol tổng (bảng dưới) được phân tích phương sai (ANOVA) để xác định các mức ảnh hưởng và độ tin cậy Để đánh giá mức độ tin cậy của mô hình thí nghiệm, hai giá trị dùng để đánh giá là

R 2 và Q 2 Khi R 2 > 0.8 và Q 2 > 0.5 thì các giá trị hồi quy có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy [87]

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các yếu tố để tối ưu hóa điều kiện xử lý enzyme theo phần mềm Modde 13.1 Yếu tố thay đổi Thời gian xử lý enzyme (phút) 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90

Thí nghiệm 9: Khảo sát thời gian xử lý ethanol

Hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) Kết quả thí nghiệm 2

Tỷ lệ Cellulase/Pectinase (w/w) Kết quả thí nghiệm 3

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) Kết quả thí nghiệm 4 Nồng độ Ethanol (%v/v) Kết quả thí nghiệm 5 pH Kết quả thí nghiệm 6

Nhiệt độ trích ly ( o C) Kết quả thí nghiệm 7 Thời gian xử lý enzyme (phút) Kết quả thí nghiệm 8

Yếu tố thay đổi Thời gian xử lý Ethanol (phút) 0, 15, 30, 45, 60 (phút)

Nồng độ ethanol pH Nhiệt độ

Thời gian xử lý Enzyme

Thời gian xử lý ethanol

3.3.4 Tối ưu điều kiện trích ly polyphenol tổng cao nhất khi sử dụng 2 enzyme cellulase và pectinase

Thí nghiệm 11: Tối ưu hóa điều kiện trích ly α = 2 𝑘 ⁄ 4 k: số yếu tố thí nghiệm thu được sau thí nghiệm sàng lọc yếu tố Để đánh giá mức độ tin cậy của mô hình thí nghiệm, hai giá trị dùng để đánh giá là R 2 và Q 2 Khi R 2 > 0.8 và Q 2 > 0.5 thì các giá trị hồi quy có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy [87]

Phương trình hồi quy có dạng:

- b1, b2, b3, b4 là các hệ số bậc 1

- b11, b22, b33 b44 là các hệ số bậc 2

- b12, b23, b13, b14 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố

- X1, X2, X3, X4 là các biến độc lập

Các biến X1, X2, X3, X4 là các biến mã hóa vì vậy các biến này cần được chuyển sang biến thực theo công thức sau:

Ui: giá trị thực của yếu tố khảo sát

Xi: giá trị mã hóa của yếu tố khảo sát

Uo: giá trị mức cơ sở

3.3.5 Kiểm chứng giá trị tối ưu từ lý thuyết bằng thực nghiệm

Thí nghiệm 12: Kiểm chứng giá trị tối ưu từ lý thuyết bằng thực nghiệm

Sau khi tìm được các giá trị tối ưu từ phương trình hồi quy, Modde 13.1 sẽ dự đoán được giá trị cao nhất có thể thu được từ các thông số tối ưu trên

Tiến hành thí nghiệm kiểm chứng với các giá trị của mỗi yếu tố tại điều kiện tối ưu để đánh giá tính tương thích của mô hình Tính tương thích của phương trình hồi quy được kiểm tra bằng phần mềm Modde 13.1

Phương trình hồi quy sẽ tương thích với thực nghiệm nếu kết quả phân tích

“Lack of Fit” là không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05)

Các phương pháp phân tích

- Độ ẩm: phương pháp sấy đến khối lượng không đổi, sử dụng thiết bị đo độ ẩm hồng ngoại (Nielsen (2010)) [85]

- Hàm lượng protein tổng: phương pháp Kjeldahl Nessler (TCVN 10034:2013) [81]

- Hàm lượng lipid phương pháp Soxhlet (AOAC 920.85, 2000)

- Hàm lượng tro: theo Tiêu chuẩn 10TCN 848:2006: Phương pháp xác định hàm lượng tro thô trong nông sản thực phẩm [84]

- Hàm lượng đường tổng: theo TCVN 4594:1988: Đồ hộp – Phương pháp xác định đường tổng số, đường khử và tinh bột [82]

- Hàm lượng xơ thô: theo TCVN 5714:2007: Chè – xác định hàm lượng xơ thô [83]

- Hàm lượng TPC (mg GAE/g CK): theo TCVN 9745-1, 2013 [78]

- Hàm lượng CGA (mg GAE/g CK) theo TCVN 13001:2020 [93]

- Hàm lượng RA (mg/g CK) ệztỹrk và cộng sự, 2010 [80]

- Hàm lượng hoạt tớnh chống oxy húa theo DPPH (àmol TE/g CK): phương pháp DPPH (Brand–Williams và cộng sự, 1995) [86]

- Khảo sát hình thái tế bào lá cây kinh giới bằng phương pháp chụp SEM Nguyên tắc và phương pháp thực hiện: theo Phụ lục 1

Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại để tính kết quả trung bình Kết quả trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Sử dụng phần mềm Minitab 21 để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các giá trị trung bình được thực hiện bằng phân tích ANOVA một nhân tố và kiểm định Turkey (P ≤ 0.05).

KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN

Phân tích thành phần nguyên liệu lá kinh giới tươi

Bảng 4.1 Thành phần hóa học của lá kinh giới tươi

Thành phần Đơn vị tính Kết quả thực từ nguyên liệu ban đầu Độ ẩm % 82.18

Polyphenol tổng (TPC) * mg GAE/g CK 22.22

Chlorogenic acid (CGA) mg/g CK 10.93

Rosmarinic acid (RA) mg/g CK 4.76

Hoạt tớnh chống oxy húa (AC) àmol TE/g CK 651.46

*Kết quả được phân tích tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3

Chú thích: CK: Chất khô

Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của lá kinh giới (Bảng 4.1) cho thấy hàm lượng nước trong lá khá cao (82.18%), tạo điều kiện môi trường thuận lợi cho hoạt động của enzyme Polyphenol oxidase là tác nhân phá hủy hợp chất polyphenol gây sự hóa nâu Do đó, việc giảm lượng nước có trong nguyên liệu bằng phương pháp tiền xử lý chần, lạnh đông tạo điều kiện bất hoạt enzyme, ức chế hoặc ngưng hoạt động của quá trình sinh hóa, giúp ổn định các thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học trong nguyên liệu từ đó có thể tăng hiệu suất trích ly

Hàm lượng polyphenol tổng thu được là 22.20 mg GAE/g chất khô nguyên liệu Ở nghiên cứu Pudziuvelyte và cộng sự (2020) [76], trích ly lá cây kinh giới có hàm lượng là TPC 89.55 ± 3.91 mg GAE/g chất khô Trong khi đó, hàm lượng CGA,

RA và hoạt tính kháng oxy hóa cho kết quả lần lượt là 10.93 mg/g chất khô, 4.76 mg/g chất khụ và 651.46 àmol TE/g chất khụ Kết quả thu được gần giống hoặc hơn về hàm lượng so với nhóm nghiên cứu của Pudziuvelyte và cộng sự (2020) [76], trích ly lá cây kinh giới với kết quả CGA 10.477 ± 0.391 mg/g chất khô ; RA 0.115 ± 0.011 mg/g chất khụ và hoạt tớnh chống oxy húa 319.78 ± 4.51 àmol/g chất khụ Một nghiờn cứu gần đây điều tra các chất chiết xuất từ bạc hà, rau mùi tây và rau mùi thu được từ lá và thân, đã báo cáo lượng TPC cao nhất từ các chất chiết xuất từ lá (chiết xuất từ lá bạc hà ( họ Lamiaceae )—1.24 mg GAE/100 mL, chiết xuất từ rau mùi tây (Họ

Apiaceae Lindl.)—1.22 mg GAE/100 mL, chiết xuất lá rau mùi (Họ Apiaceae)—1.12 mg GAE/100 mL) Những kết quả này cho thấy giá trị TPC thu được từ chiết xuất lá cao so với các bộ phận khác Sự khác biệt có thể là do thành phần và lượng hợp chất phenolic khác nhau ở các bộ phận khác nhau của cây Sự khác biệt cũng có thể là do dung môi chiết được sử dụng để chiết, điều kiện chiết và chất lượng của nguyên liệu.

Ảnh hưởng của các yếu tố của quá trình trích ly lá cây kinh giới có sự hỗ trợ của enzyme

4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tổng lên quá trình trích ly

Hình 4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) đến hàm lượng

TPC, CGA, RA và AC

Các giá trị được ký hiệu với những chữ cái khác nhau trên các cột cùng màu thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tổng (%w/dw) đến hiệu suất trích ly TPC, CGA, RA và AC

TPC CGA RA AC theo

Khảo sát trích ly TPC, CGA, RA và AC từ lá cây kinh giới khi có sự ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tổng cellulase và pectinase theo tỷ lệ enzyme là 1/1 (w/w), ở hàm lượng 0%, 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% (w/dw), tương ứng lần lượt với hoạt độ enzyme cellulase là 0, 3.5, 17.5, 35, 52.5, 70 U/g chất khô và đối với pectinase tương ứng lần lượt là 0, 16.38, 81.90, 163.79, 245.69, 327.59 U/g chất khô

Kết quả ở hình 4.1 cho thấy hàm lượng enzyme có ảnh hưởng đến quá trình trích ly Khi tăng nồng độ enzyme từ 0% lên 1.5% thì hàm lượng TPC, CGA, RA và hoạt tính chống oxy hóa (AC) đều tăng và đạt giá trị cao nhất tại hàm lượng 1.5% với các kết quả lần lượt là, 16.839 ± 0.458 (mg GAE/ g chất khô), 5.109 ± 0.051 (mg/g chất khụ), 3.417 ± 0.016 (mg/g chất khụ) và 440.153 ± 5.671 (àmol TE/g chất khụ) Tương tự ở bảng 4.2, hiệu suất trích ly cũng thu được cao nhất ở hàm lượng 1.5% lần lượt 75.85%, 46.741%, 71.784% Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng hàm lượng enzyme lên 2% thì hàm lượng cũng như hiệu suất trích ly các chất trên có xu hướng giảm

Xử lý enzyme làm giúp các cơ chất được cắt thành những đoạn ngắn hơn, tăng khả năng phá hủy tế bào, tăng khả năng hòa tan, giảm độ nhớt dung dịch và giải phóng các hợp chất có hoạt tính sinh học [34],[35] Trường hợp thừa cơ chất, vận tốc phản ứng và hiệu suất trích ly tăng khi nồng độ enzyme tăng nhưng khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng và hiệu suất trích ly không thay đổi hoặc không tăng thêm/giảm khi tăng nồng độ enzyme [36]

Theo nghiên cứu của Ngoc, P T K và cộng sự (2016) [45], khảo sát hoạt tính chống oxy hóa khi trích ly bột củ cải trắng có sự hỗ trợ của enzyme ở nồng độ 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 và 2.5% khi các điều kiện phản ứng khác như sau: thời gian chiết 90 phút, nhiệt độ chiết 50°C và pH 5 Kết quả được hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở nồng độ cellulase 1.5% và khác biệt đáng kể so với các nồng độ khác Nồng độ thấp hơn không đủ để chiết xuất tất cả các chất chống oxy hóa; nhưng nồng độ cao hơn (từ 2.0 đến 2.5%) không làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Ở một công bố khác của Nguyen và Dao (2017) [46], nhóm tác giả sử dụng enzyme Alcalase and Protamex trong trích ly hạt đậu nành, khi tăng từ 0.5% lên 1.5%, tỷ lệ thu hồi protein hòa tan tăng, nhưng khi tăng từ 1.5% lên 2.5 %, tỷ lệ thu hồi protein hòa tan đạt trạng thái cân bằng

Những kết quả đã được công bố này gần giống với giá trị nghiên cứu của chúng tôi Theo phân tích của ANOVA, hàm lượng TPC, CGA, RA và AC có sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% tại hàm lượng enzyme 1.5% so với những hàm lượng khác Từ kết quả trên, nồng độ enzyme tổng 1.5% (tương ứng với hoạt độ cellulase 52.5 U/g chất khô và pectinase 245.69 U/g chất khô) được sử dụng làm giá trị cố định trong các thí nghiệm sau Với cùng nồng độ cơ chất, khi tăng lượng enzyme sử dụng, hỗn hợp sẽ có nhiều enzyme tiếp xúc và thủy phân cơ chất hơn nên sản phẩm tạo ra nhiều hơn Có thể giải thích rằng khi mức độ hoạt hóa enzyme tăng từ 0% lên 1.5% thì hàm lượng các chất và hiệu suất trích ly cũng được chứng minh là tăng lên

4.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme cellulase/pectinase lên quá trình trích ly

Hình 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme cellulase/pectinase (w/w) đến hàm lượng

TPC, CGA, RA và AC

Các giá trị được ký hiệu với những chữ cái khác nhau trên các cột cùng màu thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme cellulase/pectinase (w/w) đến hiệu suất trích ly TPC, CGA, RA và AC

TPC CGA RA AC theo

Khi thay đổi tỷ lệ nồng độ giữa hai enzyme cellulase và pectinase thì hàm lượng TPC, CGA, RA và AC thu được có giá trị cao nhất lần lượt là 16.920 ± 0.160 (mg GAE/ g chất khô), 5.538± 0.025 (mg/g chất khô), 3.435 ± 0.008 (mg/g chất khô), 443.099 ± 4.869 (àmol TE/g chất khụ) khi tỷ lệ giữa hai enzyme là 1/1 Nhỡn chung, ở bất kỳ tỷ lệ nào giữa hai enzyme thì hàm lượng, hiệu suất các hoạt chất thu được đều cao hơn so với việc không dùng enzyme (0/0) như kết quả ở hình 4.2, bảng 4.3, và kết quả ở mục 4.2.1 Tuy nhiên việc chỉ sử dụng cellulase hoặc chỉ sử dụng pectinase sẽ không hiệu quả bằng việc kết hợp sử dụng cả hai loại enzyme Nếu chỉ dùng enzyme cellulase (tỷ lệ cellulase/pectinase là 1/0) thì hàm lượng điển hình nhất là TPC và AC thu được 14.920 ± 0.027 (mg GAE/g chất khô NL) và 376.763 ± 2.961 (àmol TE/g chất khụ), tương tự nếu chỉ sử dụng pectinase (tỷ lệ cellulase/pectinase là 0/1) thì hàm lượng TPC và AC là 14.593 ± 0.083 (mg GAE/g chất khô NL) và 333.637 ± 4.824 (àmol TE/g chất khụ) Khi sử dụng kết hợp cả hai loại enzyme sẽ hiệu quả hơn vì cellulase sẽ thủy phân cellulose thành các mạch ngắn là thành phần chính trong vách tế bào, giúp giải phóng dịch bào tốt hơn; trong khi đó pectinase có tác dụng thủy phân pectin liên kết các thành phần trong cấu trúc của tế bào, do đó làm giảm độ nhớt giúp cho quá trình lọc dễ dàng hơn [48]

Kết quả cho thấy sử dụng kết hợp pectinase và cellulase có hiệu quả tốt trong hỗ trợ quá trình trích ly Việc sử dụng kết hợp các chế phẩm enzyme sẽ làm tăng hiệu suất trích ly phù hợp với kết quả của Yazdi và cộng sự (2019) [47], khi sử dụng kết hợp chế phẩm cellulase và pectinase để trích ly polyphenol tổng từ vỏ quả pistachio xanh hiệu suất trích ly polyphenol tổng tăng 2.4 lần so với chỉ sử dụng pectinase và gấp 4.3 lần khi chỉ sử dụng enzyme cellulase Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về hiệu suất trích ly polyphenol khi sử dụng hỗn hợp enzyme so với việc bổ sung pectinase và cellulase riêng lẻ như nghiên cứu của Drevelegka và Goula (2020) [48], khi trích ly hợp chất phenolic từ vỏ và hạt nho

Theo nghiên cứu của Sabater và cộng sự (2018) [49], sử dụng cellulase (Celluclast®1.5L) để trích ly pectin từ phụ phẩm cây atiso (Cynara scolymus L.) cho thấy hàm lượng pectin trích ly tăng đạt cực đại rồi giảm khi hàm lượng cellulase tăng Ở nghiên cứu của Hong và cộng sự (2013) [50], giải thích khi tăng nồng độ cellulase hàm lượng polyphenols tổng và khả năng bắt gốc tự do có xu hướng giảm được là do sự ức chế ngược lại quá trình thủy phân do nồng độ enzyme cao đến mức bão hòa so với lượng cơ chất Kết quả này tương đồng với kết quả của Meini và cộng sự (2019) khi nghiên cứu quá trình trích ly polyphenol từ bã ép nho đã nhận thấy cellulase đã làm tăng hàm lượng phenol từ bã nho so với pectinase [51]

Trong nghiên cứu của Manuel Pinelo và cộng sự (2008) về việc sử dụng enzyme để trích ly polyphenol trong vỏ táo, khi chỉ sử dụng cellulase hoặc pectinase thì hàm lượng polyphenol thu được tương ứng là 91.24 và 96.04 (mg/L), trong khi đó việc kết hợp cả hai loại enzyme với tỉ lệ 1/1 sẽ thu được 98.45 (mg/L) [52] Từ những kết quả trên, tỷ lệ nồng độ enzyme cellulase/pectinase được chọn để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo là 1/1 (w/w) tương ứng với 1 cellulase (52.5 U/g chất khô) / 1 pectinase (245.69 U/g chất khô)

4.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lên quá trình trích ly

Hình 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) đến hàm lượng

TPC, CGA, RA và AC

Các giá trị được ký hiệu với những chữ cái khác nhau trên các cột cùng màu thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) đến hiệu suất trích ly TPC, CGA, RA và AC

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

TPC CGA RA AC theo

Trong quá trình trích ly, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi có ảnh hưởng rất lớn đến sự thu hồi các hợp chất phenolic và khả năng kháng oxy hóa trong nguyên liệu Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu được khảo sát ở năm tỷ lệ khác nhau từ 1/12 đến 1/16 (Hình 4.3) Dễ dàng nhận thấy rằng hàm lượng TPC, CGA, RA và AC đạt giá trị cao nhất tại 1/13 lần lượt 17.628 ± 0.044 (mg GAE/ g chất khô), 5.842 ± 0.022 (mg/g chất khụ), 3.481 ± 0.015 (mg/g chất khụ), 462.346 ± 17.408 (àmol TE/g chất khụ) Đồng thời hiệu suất trích ly tăng 1.2-1.3 lần đạt mức cao nhất ở tỷ lệ 1/13 (Bảng 4.4.) gồm, 79.41% đối với TPC, 53.45% đối với CGA, 73.13% đối với RA và 70.97% đối với

AC Theo ANOVA, kết quả không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hàm lượng TPC và AC tại tỷ lệ 1/12, 1/15, 1/16 Điều này có thể thấy rằng, khi tăng lượng dung môi lên 1/14, 1/15 và 1/16 (w/v) thì hàm lượng hoạt chất, hiệu suất trích ly có dấu hiệu giảm xuống cho đến mức không đổi, nguyên nhân bởi vì khi tỷ lệ thể tích dung dịch tăng thì diện tích bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất càng lớn, khi tỷ lệ dung môi quá thấp thì enzyme không đủ tiếp xúc và tương tác với cơ chất làm giảm khả năng phân cắt mạch cellulase giảm [53] Khi tỷ lệ thể tích quá cao, thì cơ chất và enzyme bị pha loãng, làm giảm khả năng thuỷ phân của enzyme, dẫn đến giá trị TPC và khả năng kháng oxy hóa giảm nhẹ Khi nghiên cứu về quá trình trích ly polyphenol từ thịt và vỏ quả cà phê, Tran, T T và cộng sự (2020) [54], cũng có kết quả tương tự, khi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/6 đến 1/10, lượng polyphenol tổng trích ly tăng

19.9% và khả năng chống oxy hóa theo DPPH tăng 12.1% Tiếp tục tăng tỷ lệ NL:DM lên tỉ lệ 1/12 và 1/14 thì hiệu suất trích ly chất khô tăng không đáng kể trong khi TPC và khả năng chống oxy hóa giảm Dựa vào những kết quả trên, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thu được hiệu suất trích ly cao nhất là tỷ lệ 1/13 (w/v) và đây cũng là giá trị được sử dụng cho các thí nghiệm sau

4.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên quá trình trích ly

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol (%v/v) đến hàm lượng TPC, CGA,

Các giá trị được ký hiệu với những chữ cái khác nhau trên các cột cùng màu thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol (%v/v) đến hiệu suất trích ly TPC,

TPC CGA RA AC theo

Hiệu suất trích ly các hợp chất phenolic và hoạt tính kháng oxy hóa từ thực vật phụ thuộc vào loại dung môi sử dụng, đặc biệt là độ phân cực của dung môi Trong quá trình trích ly, chúng tôi lựa chọn loại dung môi trích ly là ethanol vì đây là loại dung môi dễ tìm, giá rẻ, độ phân cực cao, dễ thu hồi và an toàn sử dụng trong thực phẩm; đây cũng là loại dung môi rất phổ biến sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu trích ly nguyên liệu thực vật Ảnh hưởng của của nồng độ dung môi ethanol đến khả năng trích ly các hợp chất phenolic được thể hiện ở hình 4.4 và bảng 4.5 Hàm lượng TPC tăng dần khi tăng nồng độ ethanol từ 0% đến 60% với giá trị tăng từ 11.237 ± 0.039 (mg GAE/ g chất khô) đến 17.780 ± 0.076 (mg GAE/ g chất khô) Tuy nhiên, không có sự khác biệt ý nghĩa khi trích ly giữa nồng độ ethanol 70 và 80% (P> 0.05) Tương tự đối với CGA, RA và AC cũng thu được hàm lượng cao nhất tại nồng độ ethanol 60%, tăng khoảng 1.6 lần so với nồng độ 0%, với giá trị lần lượt là 6.648 ± 0.435 (mg/g chất khụ), 3.489 ± 0.019 (mg/g chất khụ), 475.168 ± 10.620 (àmol TE/g chất khô) Hiệu suất trích ly tại 60% là hiệu suất thu được cao nhất các hợp chất TPC (80.09%), CGA (60.82%), RA (73.30%), AC (72.94%) Điều này có nghĩa là có sự chênh lệch giữa nồng độ ethanol và nước cất giúp cho sự khuếch tán các chất cần trích ly một cách tốt nhất để tăng hiệu suất trích ly Và ở các nồng độ 70% và 80% kết quả cho giá trị TPC, CGA, RA và AC theo DPPH thấp hơn ở nồng độ 60% bởi vì dung dịch trích ly đã đạt sự cân bằng Nồng độ ethanol càng cao, khả năng bay hơi càng nhanh, lượng dung môi giảm, đây cũng là nguyên nhân dẫn đến hiệu suất trích ly không tăng ở các dung dịch ethanol có nồng độ cao hơn giá trị tối ưu [57] Ở nghiên cứu của Vy và cộng sự (2018) [56], khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol (50, 60, 70, 80, 90%) đến hiệu quả trích ly các hoạt chất sinh học từ vỏ bưởi, tăng nồng độ ethanol lên 80 và 90% thì hàm lượng TPC giảm Nồng độ ethanol có ảnh hưởng đến quá trình trích ly Độ hòa tan của polyphenol vào trong dung môi ở nồng độ ethanol nguyên chất (99.5%) thường thấp do liên kết hydro chặt chẽ giữa polyphenol và protein Khi thêm nước vào dung môi hữu cơ sẽ làm giảm liên kết hydro trong dung dịch nên tính hòa tan của polyphenol gia tăng Tuy nhiên, nếu lượng nước cho vào quá nhiều làm cho dung môi trích ly bị giảm hoạt tính và dung dịch sau trích ly bị loãng

Theo Phương và Nhân (2022) [55], cho thấy rằng hệ dung môi kết hợp (ví dụ, nước-ethanol) hiệu quả hơn để chiết xuất các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực vật so với khi sử dụng một dung môi nguyên chất (nước hoặc ethanol nguyên chất)

Cụ thể, hàm lượng các chống oxy hóa thích hợp với độ phân cực của ethanol 60-80% nên khả năng được trích ly cao hơn so với trích ly trong ethanol tuyệt đối

Kết quả nghiên cứu của về ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol (50, 60,

Sàng lọc yếu tố thực sự ảnh hưởng đến đối tượng nghiên cứu

Thiết kế và phân tích dữ liệu sàng lọc 8 yếu tố ảnh hưởng theo ma trận Plackett- Burman dựa vào hàm lượng polyphenol tổng

Bảng 4.10 Thiết kế thí nghiệm sàng lọc yếu tố

Nồng độ ethanol (%v/v) pH Nhiệt độ ( o C)

Thời gian xử lý Enzyme (phút)

Thời gian xử lý ethanol (phút)

Hàm lượng TPC (mg GAE/g CK)

Bảng 4.11 Các hệ số mô tả giữa điều kiện xử lý enzyme và hàm lượng polyphenol tổng của mẫu trong thí nghiệm sàng lọc yếu tố

Giá trị hệ số (Coeff SC)

Tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi (w/v) 0.0351947 0.0174501 0.09029 Loại

Thời gian xử lý enzyme (phút) 0.435288 0.0174501 2.73206E-07 Nhận Thời gian xử lý ethanol (phút) -0.00016783 0.0174501 0.992633 Loại

Kết phân tích cho thấy, hệ số biến thiên R 2 là 0.992 > 0.8 và giá trị biến thiên ảo Q 2 là 0.945 > 0.5 chứng tỏ kết quả thí nghiệm là phù hợp khi tiến hành sàng lọc yếu tố bằng phần mềm Modde 13.1

Dựa vào bảng mô tả giữa các yếu tố của điều kiện xử lý enzyme và hàm mục tiêu là hàm lượng polyphenol tổng (mg GAE/g CK) trong thí nghiệm sàng lọc yếu tố thì xác định được các yếu tố sau ảnh hưởng rõ rệt đến hàm lượng polyphenol tổng thu được và đều có P < 0.05, bao gồm, hàm lượng enzyme tổng, nhiệt độ và thời gian xử lý enzyme

Bảng 4.12 Kiểm định tính tương thích của kết quả thu được

Từ bảng 4.12 kết quả phân tích thống kê của 8 yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng cho thấy “Regression” có ý nghĩa thống kê (P < 0.05) và kiểm định “Lack of Fit” là không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05) nên phương trình hồi quy có sự tương thích cao với thực nghiệm

Như vậy, sau khi tiến hành thí nghiệm sàng lọc yếu tố, 3 yếu tố được chọn để tiếp tục thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa: hàm lượng enzyme tổng (%w/dw), nhiệt độ ( o C) và thời gian xử lý enzyme (phút) Trong một công bố của Puzerytė và cộng sự

(2023) [88], đã chọn yếu tố hàm lượng enzyme, nhiệt độ và thời gian để thực hiện tối ưu hóa quá trình trích ly có sự hỗ trợ của enzyme các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá hắc mai biển (Hippophae rhamnoides L.).

Tối ưu điều kiện trích ly polyphenol tổng cao nhất khi sử dụng 2 enzyme

Để xác định kết quả tối ưu hóa của các thí nghiệm ảnh hưởng tương tác của các yếu tố lên hàm mục tiêu, phương pháp bề mặt đáp ứng RSM (Response Surface Method) – sử dụng mô hình phức hợp trung tâm CCD (Central composite design) và phần mềm Modde 13.1 được sử dụng để xử lý kết quả

Sự thay đổi đồng thời của các yếu tố khảo sát trong quá trình quy hoạch có thể xác định quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này đến hàm mục tiêu Giá trị tại tâm của mỗi biến chính là các giá trị tốt nhất thu được trong các thí nghiệm trước Số thí nghiệm tối ưu trong quá trình này là 17 thí nghiệm, trong đó có 3 thí nghiệm ở tâm nhằm tăng mức độ chính xác của quá trình

Cánh tay đòn của phương án là α = 2 𝑘 ⁄ 4 = 1.682 (với k =3 là số yếu tố được sàng lọc)

Giá trị mã hóa của các biến độc lập được trình bày trong Bảng 4.13

Bảng 4.13 Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện xử lý enzyme

Biến độc lập Ký hiệu

Thời gian xử lý enzyme (phút) X3 34.77 45 60 75 85.23

Ma trận thực nghiệm 3 yếu tố, cánh tay đòn α với hàm mục tiêu Y là hàm lượng polyphenol tổng (mg GAE/g CK) được trình bày trong Bảng 4.14

Bảng 4.14 Ma trận tối ưu hóa theo mô hình phức hợp trung tâm

Phương trình hồi quy có dạng:

Thí nghiệm Biến chuẩn Hàm lượng TPC

Sử dụng phần mềm Modde 13.1 để tối ưu hóa thu được các hệ số của phương trình hồi quy được thể hiện trong Bảng 4.7

Bảng 4.15 Các hệ số trong phương trình hồi quy mô tả giữa điều kiện xử lý enzyme và hàm lượng polyphenol tổng

Kết quả cho thấy, hệ số biến thiên R 2 là 0.986 > 0.8 và giá trị biến thiên ảo Q2 là 0.905 > 0.5 chứng tỏ kết quả thí nghiệm là phù hợp khi tiến hành quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 13.1, cho thấy các giá trị hồi quy có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy

Dựa vào bảng mô tả giữa 3 yếu tố khi xử lý enzyme với hàm lượng polyphenol tổng thì các biến có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng thu được là X1, X2,

Hệ số Giá trị hệ số

(Std Err.) P Kết quả b0 19.7138 0.0795356 4.59364E-15 Nhận b1 0.108607 0.0373481 0.0227264 Nhận b2 -0.146871 0.0373481 0.00565758 Nhận b3 0.386561 0.0373481 1.70431E-05 Nhận b11 -0.371533 0.0411026 4.14687E-05 Nhận b22 -0.758162 0.0411026 3.41193E-07 Nhận b33 -0.351397 0.0411026 5.95089E-05 Nhận b12 -0.203803 0.0488001 0.00415653 Nhận b13 -0.0436182 0.0488001 0.401106 Loại b23 0.0474273 0.0488001 0.363493 Loại

Phương trình hồi quy thể hiện mối quan hệ giữa điều kiện xử lý enzyme và hàm lượng polyphenol được mô tả trong phương trình:

Các ảnh của các biến độc lập lên hàm mục tiêu có thể được đánh giá thông qua việc biểu diễn ở không gian ba chiều và bề mặt đáp ứng tương ứng với các yếu tố còn lại ở điều kiện tối ưu Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân được xác định bằng phần mềm Modde 13.1, có thể thấy tương tác giữa 3 yếu tố hàm lượng enzyme, nhiệt độ và thời gian xử lý enzyme đều có đường cong có giá trị cực đại Dường như hàm lượng enzyme tổng và nhiệt độ có thể là hai yếu tố ảnh hưởng cao nhất đến hàm lượng TPC của dịch trích (Hình 4.9)

Hình 4.9 Đồ thị mô tả ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tổng và nhiệt độ lên hàm lượng polyphenol tổng

Hình 4.10 Đồ thị mô tả ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tổng và thời gian xử lý enzyme lên hàm lượng polyphenol tổng

Hình 4.11 Đồ thị mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý enzyme lên hàm lượng polyphenol tổng Bảng 4.16 Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy trong bài toán tối ưu hóa điều kiện xử lý enzyme

Mức độ phù hợp của mô hình cũng được đánh giá thông qua giá trị của “Lack of fit” Mô hình tương quan tốt cần sự phù hợp giữa số liệu thực tế và lý thuyết, vì vậy mô hình thu được với kiểm định “Lack of fit” (sự không phù hợp) không có ý nghĩa thống kê là điều mong muốn

Kết quả phân tích ANOVA Bảng 4.16 cho thấy kiểm định “Lack of Fit” không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05) nên phương trình hồi quy có sự tương thích cao với thực nghiệm Tại điều kiện tối ưu hàm lượng enzyme tổng 1.576% w/dw, nhiệt độ 48.944 o C, thời gian xử lý enzyme 68.363 phút thì hàm lượng TPC của dịch trích đạt cực đại là 19.832 (mg GAE/g chất khô)

Bảng 4.17 Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng, chlorogenic acid, rosmarinic acid và hoạt tính chống oxy hóa tại điểm tối ưu

Tối ưu hóa bằng phần mềm

Modde 13.1 Giá trị thực tế

Thời gian xử lý enzyme

Hoạt tính chống oxy hóa

(àmol TE/g chất khụ) - 562.513 ± 14.476 Để kiểm định các giá trị tối ưu thu được từ mô hình đã xây dựng, thí nghiệm được thực hiện theo các phương án tốt nhất đã đề ra Kết quả kiểm định được thể hiện ở Bảng 4.17, cho thấy kết quả thu được từ thực nghiệm tương đương với kết quả lý thuyết tính toán từ mô hình Hàm lượng TPC thực tế sau quá trinh trích ly thấp hơn giá trị lý thuyết nhưng không đáng kể Kết quả kiểm chứng tại giá trị tối ưu một lần nữa khẳng định tính chính xác cao của mô hình đã được xây dựng.

Khảo sát sự tác động của enzyme lên cấu trúc thành tế bào của lá cây kinh giới bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM) cung cấp hình ảnh chi tiết, có độ phân giải cao của hình dạng, cấu trúc thành tế bào lá cây kinh giới dưới sự tác động của enzyme ở các mức phóng đại khác nhau

Hàm lượng polyphenol tổng của dịch trích từ lá cây kinh giới khi có sự hỗ trợ thủy phân của enzyme cellulase và pectinase ở điều kiện tối ưu là 19.545 ± 0.053 (mg GAE/g chất khô) Giá trị này cao hơn từ 1.5 – 2 lần so với mẫu dịch trích được xử lý ở điều kiện tương tự (nhiệt độ ủ 49 o C và thời gian 68.5 phút) không xử lý enzyme Kết quả này khẳng định hiệu quả của trích ly có hỗ trợ của enzyme trong việc thu thập các hợp chất có hoạt tính sinh học

Hình 4.12 Tác động của enzyme lên cấu trúc bề mặt sau khi trích ly được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)

(A) Mẫu chưa qua tiền xử lý; (B) Mẫu trích ly không có enzyme; (C) Mẫu trích ly có sự hỗ trợ thủy phân của enzyme cellulase và pectinsase

Phân tích SEM cho thấy vết nứt trên bề mặt của mẫu đối chứng không sử dụng enzyme so với mẫu có sử dụng enzyme để hỗ trợ thủy phân (Hình 4.12) Ở hình 4.12A, có thể thấy bề mặt của thành tế bào lá kinh giới bề mặt lá nguyên vẹn, trơn, nhẵn, đều đặn, cứng cáp Mẫu trích ly không có enzyme (xử lý chần kết hợp lạnh đông) có mức độ phá vỡ cấu trúc thành tế bào nhiều hơn so với mẫu chưa tiền xử lý, bề mặt lá bắt đầu biến dạng, nhăn nheo, gồ ghề, mấp mô và cho cảm giác kết cấu lá bị thay đổi (Hình 4.12B) Cấu trúc của nguyên liệu có sự khác biệt hoàn toàn rõ rệt khi thủy phân bằng hỗn hợp enzyme cellulase và pectinase (Hình 4.12C), bề mặt tế bào trở nên thô ráp hơn, méo mó, nhăn nhúm, có thể xảy ra hiện tượng ly giải tế bào đáng kể và ngoài ra quan sát thấy rõ những lỗ thủng trên thành tế bào Sự phức tạp của thành tế bào thực vật đóng một vai trò quan trọng trong việc cung cấp sự hỗ trợ và bảo vệ cấu trúc chống lại sự giải phóng các thành phần nội bào [88] Hỗn hợp enzyme có thể phá vỡ tính toàn vẹn cấu trúc của thành tế bào thực vật và các thành phần thành tế bào bị thủy phân, do đó làm tăng tính thấm của thành tế bào, dẫn đến các hợp chất TPC và hợp chất kháng oxy hóa đủ thời gian khuếch tán vào trong dung môi trích ly, giúp năng suất chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học được cải thiện hơn [92] Một vài nghiên cứu của một số nhóm tác giả cũng đã chứng minh những thay đổi hình thái đáng chú ý ở thành tế bào sau quá trình trích ly có sự hỗ trợ thủy phân bằng enzyme [45], [88], [89], [90], [91].