Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Ứng dụng Enzyme Pectinase để thu nhận dịch quả khế giàu hợp chất kháng oxy hóa

Trong nghiên cứu này chế phẩm pectinase được sử dụng dé thu nhận dịchquả khế giàu hợp chất phenolic, vitamin C và hoạt tính kháng oxy hóa.. Ảnh hưởngcủa hàm lượng chế phẩm pectinase và t

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ NGỌC THÚY

UNG DUNG ENZYME PECTINASE DE THU NHAN DỊCH

QUA KHE GIAU HOP CHAT KHANG OXY HOA

Chuyên ngành: Thực phẩm va đồ uốngMã số: 60 54 02

LUẬN VÁN THẠC SĨ

TP HO CHÍ MINH, tháng 12 năm 2014

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG - HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

TS Võ Đình Lệ TâmCán bộ chấm nhận xét 1: TS Hoàng Kim Anh

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Phan Ngọc HòaLuận văn thạc sĩ được bảo vệ tai Trường Đại học Bách Khoa, DHQG Tp HCM ngày

13 tháng 01 năm 2015Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1.TS Trần Bích Lam2 TS Phan Ngọc Hòa3 TS Hoàng Kim Anh4 TS Phan Thế Đồng5.TS Trần Thị Ngọc YênXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngànhsau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HO CHÍMINH CỘNG HÒA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập — Tự do — Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Thị Ngọc Thúy MSHV: 12110215

Ngày sinh: 12/05/1986 Nơi sinh: Phú Yên

Chuyên ngành: CN Thực Phẩm & Đồ Uống Mã số: 605402

I Tên đề tàiUNG DUNG CHE PHAM ENZYME PECTINASE TRÍCH LY DỊCH KHE

GIAU HOP CHAT KHANG OXY HOA

II Nhiém vu va noi dung

e Xác định điều kiện xử ly enzyme tối ưu để hoạt tính kháng oxy hóa là cao nhấttheo phương pháp bề mặt đáp ứng.

e Xác định các thông số động học của quá trình trích ly vitamin C và các hợp chấtphenolic

III Ngày giao nhiệm vụ: 07/07/2014IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28/12/2014

V Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn

TS Võ Đình Lệ Tâm

Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 01 năm 2015

Cán bộ hướng dẫn Chủ nhiệm bộ môn

Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học

LOI CAM ON

Đầu tiên tôi xin gửi lời cam ơn chân thành đến Thay PGS.TS Lê Van Việt Manvà Cô TS Võ Dinh Lệ Tâm, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thựchiện luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thành viên trong gia đình tôi, nhữngngười luôn ủng hộ tôi ca về mặt vật chất và tinh thần trong suốt thời gian tồi theo họcchương trình Cao học tại trường ĐH Bách Khoa TP HCM.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể quý thầy, cô bộ môn công nghệ thực phẩm,trường Đại học Bách Khoa TP HCM, những người đã nhiệt tình hỗ trợ các hóa chấtvà thiết bị cần thiết để tôi có thể thực hiện luận văn này

Sau cùng, tôi xin cảm ơn các anh, chị và các bạn học ở phòng thí nghiệm côngnghệ thực phẩm, những người bạn đồng hành cùng tôi trong thời gian thực hiện luận

~

van.

TP Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 12 năm 2014

Sinh viên thực hiện

LÊ THỊ NGỌC THÚY

ABSTRACTAverrhoa Carambola.L fruit has been found to contain antioxidants such asascorbic acid and phenolics compounds In this study, the effects of pectinasepreparation concentration and pectolytic time on the ascorbic acid content, totalphenolic content and antioxidant activity of the extract were investigated TheResponse Surface Methodology (RSM) was then applied to optimize the conditionsof enzyme-assisted extraction (EAE) for maximizing the antioxidant activity of theextract At the optimal pectinase concentration of 155.71 polygalacturonase units pergram of fruit weight (PGU/g) and pectolytic time of 92.73 minutes, by the ascorbicacid content raised up to 10.19 %, the total phenolics content increased 49.89%, andthe antioxidant activity of the extract augmented 68.66 % (using Ferric ReducingAntioxidant Potential (FRAP) assay) compared with those achieved in theconventional extraction The extraction rate constant, initial extraction rate andextraction capacity of phenolics in EAE increased approximately 1.05 fold, 1.55 foldand 1.67 fold respectively, compared with those obtained in the non-enzymatic-extraction (NEE) while those of ascorbic acid increased 1.28 fold, 2.5 fold and 1.67fold, respectively, compared with those obtained in NEE Therefore, EAE could be auseful method for the extraction of antioxidants from plant materials.

ii

TÓM TAT LUẬN VANQuả khế chứa nhiều hợp chất kháng oxy hóa như vitamin C và các hợp chấtphenolic Trong nghiên cứu này chế phẩm pectinase được sử dụng dé thu nhận dịchquả khế giàu hợp chất phenolic, vitamin C và hoạt tính kháng oxy hóa Ảnh hưởngcủa hàm lượng chế phẩm pectinase và thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng cáchợp chất phenolic, hàm lượng vitamin C và hoạt tính kháng oxy hóa của dịch khếđược khảo sát Phương pháp bé mặt đáp ứng được sử dụng dé tối ưu hóa điều kiệntrích ly sử dụng chế phẩm pectinase nhăm đạt được hoạt tính kháng oxy hóa của dịchtrích là cao nhất Khi hàm lượng enzyme tối ưu là 155.71 PGU/g chất khô và thờigian xử lý là 92/73 phút, hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích theo phương phápFRAP đạt 166.05 pmol TEAC/g chất khô cao hơn 68.66 % so với mẫu không xử lýenzyme Ở điều kiện xử lý tối ưu, hàm lượng vitamin C trong dịch khế dat264.12mg/100g chất khô cao hon 10.19 %; hàm lượng phenolic đạt 26.58 mg GAE/gchất khô nguyên liệu cao hơn 49.89 % so với mẫu đối chứng Kết quả khảo sát độnghọc quá trình trích ly các hợp chất phenolic và vitamin C từ dịch quả khế khi sử dụngchế phẩm enzyme pectinase cho thấy phương pháp xử lý enzyme làm tăng hằng sốtốc độ trích ly, tốc độ trích ly ban dau và khả năng trích ly lần lượt là 1.05, 1.55, 1.67lần (đối với vitamin C) và 1.28, 2.5, 1.67 lần (đối với hop chat phenolics) khi so sánhvới mẫu không xử lý enzyme Vì vậy, phương pháp trích ly sử dụng chế phẩmpectinase có thể được xem là phương pháp trích ly hiệu quả những hợp chất khángoxy hóa từ dịch quả khé.

lil

LOI CAM DOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của ban thân tác giả Các kếtquả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từbat kỳ một nguồn nao và dưới bat kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tàiliệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận án

Lê Thị Ngọc Thúy

IV

MỤC LỤC

LOI CAM 0910 ‹::‹:+1 iABSTRACT wiececsccccscssssssesscscsesscsesscssscsscssscsscsesssssesecscsesecscscsucscsesusscsesessssesececsesesecscaeees iiTOM TAT LUẬN VAN ucccccccscccscccecscscscecscscscscecececececececsesevevevevavacacacacesecececececeesasavees iiiLOI CAM 629.9) 57 -“ -:-1 ivMỤC LUC caceeecccsscscsssssssssesesscscsesscsesessesescscsescscsesessesssscscsssecsssesessssesecscsesesecsssssecssseeeeaes VM.9/:810/9:7.9 2 viiiDANH MUC HINH 1 XDANH MỤC CÁC TU VIET TẮTT se SE E2 SE SE ve rered xiMO DAU viceccccscscscccscsssesscscscscsscscsescsvsscscscsssvsscscscsvsssescscsssvsssscscsssvsssscscessvavsescsescessseeees |CHƯƠNG 1: TONG QUAN G1111 1 1E 9111115111 111111121 11111011 ng ng reg 31.1 Tổng quan về quả KhẾ ¿2 5256 +E9E2SE£E#EEEEEEEE E311 11211112111 x xe 31.1.1 Nguồn gốc, phân lOại ¿ - ¿6525223 EE‡E#E E233 EEEEEEEEEEErrkrrrrrred 31.1.2 Đặc tính thực VậtL - - - c1 S111 n1 11H HH ng nh crn 41.1.3 Giá trị cây khẾ - - c 1 123 1 15111111 111115 1111110110111 11 111101 11 1111111 61.1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất khế trên thé giới -. - 71.1.5 Thành phan hóa học cơ bản của quả khẾ + 5 + 52 s+s+sz£s+x+se>s2 81.2.5.1 Carbohydrate -cccQn ng ng SE vn rà 81.2.5.2 Acid hữu CƠ Q00 TH TH TT HT HT ng nh nh này 91.2.5.3 ACid amIn ccc eceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeneseeea 91.254 Vitamin 0 ccccecccecceecceccesceesueceecsueceeseueceueeeeeeeeeaeeds 101.2.5.5 Các hợp chat kháng oxy héa cece ceeceeeceeecesceeceesceeceaseueens 101.2.5.6 Các cấu tử dé bay hơi c CS n nh nh như như nhe ca 111.1.6 Công nghệ thu nhận dịch quả kh + 25 252 +s+£+£++szxezzscxee: II1.2 Tổng quan về enzyme pecfinaSe + ¿55252222 *‡E£EE£EvEererrrrrrererree 121.2.1 Định ngĩa - (<< <1 99900101 ke 121.2.2 Phân loại - ¿5E SE 21932 1 3911112111 111111111111 1101111111111 01111111 c 121.2.3 Cơ chế hoạt động - - 5S 3E 1 121115131511 21 1111511111111 11x 141.2.4 Tính chat enzyme pectinase - ¿5 5256222 SE2ESEEE2EEEEEEEErkrkrrerrreo 161.2.5 Các yêu tố ảnh hưởng đến hoạt tinh enzyme pectinase -. - 18

Vv

1.2.5.1 N6ng độ cơ chất -c- - tt 121515131511 1 111111111111 gg 181.2.5.2 NhiỆt dO eceessececcessnceecessececesssececesssacececesseeecesssaceceessaeeceessaees 18[.2.5.3 pH ẶQ Q.0 191.2.6 Cơ chat enzyme pectinase c.cccccccccccssssssesssessssssessssesesscsssessssssesscseseseeseseseees 201.2.7 Ung dụng chế phẩm enzyme pectinase trong sản xuất nước quả 21CHUONG 2: NGUYEN LIEU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU 24

2.[ Nguyên lIỆU - - << G00 nọ 242.1.1 Qua khẾ G1121 919191911115 111151011 0111010610 1111110119 ng ni 242.1.2 EMZyMe De€CKITIAS€ - - - < 000 nọ re 252.2 Phương pháp nghiÊn CỨU .- G0119 0001 vn 252.2.1 Mục đích nghiÊn CỨU G G009 re 252.2.2 Sơ đồ nghiên CỨU - ¿+ SE +E9EEE 2393 121911212111 21 2121112111111 11 262.3 Thuyết minh sơ đồ nghiên Cứu - ¿+ + 2S S£+E+E£E££E+Ee£E+EvEerererrerered 272.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý enzyme đến chất lượng dịch khế 272.3.2.T6i ưu hóa hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt(RSM) ou cceccccccesssssnecceceessssneeecceessssaeececessessaaeeceeessesaeeeeceeseeaeeeeeeesessaaaaeeeeeees 282.3.3.Xác định các thông số động học của quá trình trích ly các hop chấtphenolics và vitamin C từ dịch trich <5 «<< + EEssssseeees 292.4 Các phương pháp phân tÍch - + 19990010 ve 3024.1 Hàm lượng vitamin CC - «0n ng re 302.4.2 Hàm lượng các hợp chất phenoliC ¿5 + + ++s+s+£s+x+xeze+x+xerscxee 302.4.3 Hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp ABTS - 31244 Hoạt tính khang oxy hóa theo phương pháp FRAP - 312.4.5 Xác định hoạt độ enzyme pectinase - G SG SH re, 322.5 Phương pháp xử lý $6 liỆU ¿- - 5° SE +E2E+E#EEEESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErErrrrree 32CHUONG 3: KET QUÁ VA BAN LUẬN -G-G < + 1S S312 eEsEskekserersesed 333.1 Ảnh hưởng của quá trình xử lý enzyme pectinase đến chất lượng dịch quả khế1 333.1.1 Ảnh hưởng hàm lượng enzyme pectinase đến chất lượng dich quả 333.1.1.1 Hàm lượng vitamin CP HH ng re 33

3.1.1.2 Hàm lượng các hợp chất phenolic - + + s+s+cz+s+x+zszsexze 343.1.1.3 Hoạt tính kháng oxy hóÓa Ăn hen vờ 353.1⁄2.Ảnh hưởng thời gian xử lý chế phẩm enzyme pectinase đến chất lượngCICH QUẢ - G0000 Họ re 373.1.2.1 Hàm lượng vitamin CP - HH ng re 373.1.2.2 Hàm lượng các hợp chất phenolic - - + + s+s+ss+s+x+zzsexee 383.1.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóÓa - Ăn ng 393.2 Tối ưu hóa hoạt tính kháng oxy hóa của dịch khế thông qua hàm lượngenzyme và thời gian xử lý theo phương pháp FRAP ««««<<<+2 413.3 Các thông số động hoc của quá trình trích ly các hop chat phenolic và vitamin0000/00/3157 46CHUONG 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ - 5 se SE £eEsEsEseseeersesed 52n<‹ 1 524.2 Kiến nghị -5- C1 1 S13 1 15111111 1111211111111 0111111111010 11 011111 g1 re 52TÀI LIEU THAM KHAO G1121 3E 569191 8E 19311 3 5111115113 Enxcxreree 53PHU LỤC -G G0 Họ re 61Phụ luc A Cac phương pháp phân tich - << <5 S111 1 ke 61Phụ lục B Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme và thờigian xử lý đến chất lượng dịch Khế + + 2+2 E+E+E£E£EvEEErkererererrerered 68Phụ lục C Kết quả khảo sát động học quá trình trích ly vitamin C và các hợp chấtphenolic từ quả KhẾ - ¿56 52 2E2E9EE 23239 12121121121 211121 2111111111111 73

Vil

DANH MỤC BANG

Bảng 1.1: Giá trị y học của cây khẾ - ¿252523 2x3 2311211111111 xe 6Bang 1.2: Thành phan hoá học của khế trong 100g nguyên liệu tươi - - 8Bang 1.3: Thanh phan va hàm lượng đường trong vỏ khé trong quá trình chín 9Bảng 1.4: Thành phan acid amin trong qua Khế - + 2 2552 5s+s+s£s+x+zzzszxez 9Bang 1.5: Thành phan phenolic và hoạt chất chống oxy hoá trong 100g nguyên liệu0Ù 10Bảng 1.6: Thanh phan và phan trăm các cau tử bay hơi trong quả khé chín IIBang 1.7: Cơ chất và sản phẩm của các enzyme pectinase - + 2 scs+ssc: 15Bảng 1.8: Tinh chat sinh hoá của các loại enzyme pectinase -. - 16Bang 1.9: Dac tính pectinase từ Vi sinh VẬT - cọ ng ke 17Bảng 1.10: Một số chế phẩm pectinase thương mại thường được sử dụng trong sảnXuất NUGC QUA G6 S232 23935 1239111 21111211111211111 2111111111111 1111 1111.111 22Bảng 2.1: Bảng bồ trí thí nghiệm các thông số khảo sát của ma trận qui hoạch thực

Bảng 3.3: Hàm lượng vitamin C và phenolic tong trích ly theo thời gian 46Bảng 3.4: Giá trị nghịch đảotốc độ trích ly vitamin C và hợp chất phenolic theo thời20 - 47Bang 3.5: Các thông số động học của quá trình trích ly vitamin C và hợp chatphenolic từ dịch KhẾ - ¿E2 SE 2E£E9E9 E8 111515251521 17115 1511111511111 1021 y 50Bảng BI: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hàm lượng vitamin C 68Bang B2: Anh hưởng của hàm lượng enzyme đến hàm lượng hợp chat phenolic 68Bảng B3: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hoạt tính kháng oxy hoá theophương pháp AITS nọ 69

Bảng B4: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hoạt tính kháng oxy hoá theophương pháp FRAP Họ nọ 69Bảng B5:Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng vitamin C 70Bảng Bó: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng các hợp chất9/190 257 70Bảng B7: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hoạt tínhkháng oxy hoá theophương pháp AITS nọ 71Bang B8: Anh hưởng của thời gian xử ly enzyme đến hoạt tính kháng oxy hoá theophương pháp FRAP Họ nọ 71Bang B9: Kết quả kiểm tra thực nghiệm của phương pháp tối ưu hóa điều kiện xử lýtheo phương pháp RSM HH HH HS eee kreớ72Bảng C1: Hàm lượng vitamin C trong dịch khế theo thời gian xử lý bằng chế phẩmenzyme pecfinex Ultra SP — ÌU, - << «+ s01 0 ve 73Bảng C2: Hàm lượng các hợp chất phenolic trong dịch khế theo thời gian khi xử lýbang chế phẩm enzyne pectinex ultra SP — ÌL ¿+ 2 + s+s+£+££+++£ezezxerrsrree 74Bang C3: Giá trị nghịch đảo tốc độ trích ly vitamin C và nghịch đảo tốc độ trích lyhợp chất phenolic theo thời gian ¿ - ¿265252 2E+ESE‡E#EEEEEEEEEEEEEEEEEErErrkrkrreee 75

IX

DANH MỤC HÌNHHình 1.1: Hoa khé và quả Kh6 - + ¿+ S229 EE£E£E£EEEE£EEEEEEEEEEEEEEEEErrkrkrrererree 5Hình 1.2: Phân loại enzyme pectinase oo eee eeeceesssseceeeccesssseeeeeceessseeeeeeeesessees 13Hình 1.3: Vị trí cắt các enzyme Pectinase c.cccccccccsessssssesseseseesssesesseseseseseseseseeseseeen 14Hình 1.4: Vị trí cắt của Endo — PG và Exo — PG cc s ket EsEsEskskserersesed 14Hình 1.5: Cau trúc phân tử pectin - - ¿6-5252 2E+ESE E3 EEE E22 rrrreee 21Hình 2.1: Sơ đỗ quy trình sản xuất nước khẾ ¿+55 2 s+c+ce£s+xszezscree 24Hình 2.2: Sơ đỗ nội dung nghiên cứu +- + 2252 52+E+E££££E+E££E£EeErererrerered 26Hình 3.1: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme pectinase đến hàm lượng vitamin Ctrong dịch quả Kh6 ¿-:- ¿526 SE 2E9EEESE9E 1239111211121 2111 1121111211111 1 111111 33Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme pectinase đến hàm lượng các hợp chấtphenolic trong dịch quả khẾ -¿- - +6 5£ +E+EE£+E£E£EE£E£EEEEEEEESEEEEEEEEErErrrrererreee 34Hình 3.3: Ảnh hưởng hàm lượng chế phẩm enzyme đến hoạt tính kháng oxy hoá củadịch khé theo phương pháp ABTS và theo phương pháp FRAP - 36Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng vitamin C trongCICH QUA 01257557 37Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng các hợp chấtPhenolic trong đỊCh QUẢ << 5 6 1051181911501 99010 re 38Hình 3.6: Ảnh hưởngcủa thời gian xử lý enzyme đến hoạt tính kháng oxy hoá củadịch khé theo phương pháp ABTS và phương pháp FRAP - 2-5555: 40Hình 3.7: D6 thi RSM hoạt tính kháng oxy hoá theo phương trình hồi qui trên khônggian ba chiều và hai chiÊU + ¿5652 SE 2E9EEE2E9EE 1231121212111 21 111211111 44Hình 3.8: Hàm lượng vitamin C và hop chat phenolic trong dich khé theo thời gianHình 3.9: Đỗ thị biểu diễn mối quan hệ nghịch đảo tốc độ trích ly vitamin C vànghịch đảo của tốc độ trích ly hợp chất phenolic trong dịch khế theo thời gian xử lý

DANH MỤC CÁC TỪ VIET TAT

ABTS: 2,2 - Azinolis-(3-ethylBenzoThiazoline-6-Sulfonic acid)ANOVA: Analysis Of Variance — Phan tich su khac biét

CCC: Central Composite Circumscribed design — Quy hoạch thực nghiệm được giớihan quanh tam

DM: Dry Matter — Nguyên liệu khôDNS: Dinitrosalicylic Acid

FCR: Folin-Ciocalteu Reagent — thuốc thử Folin-CiocalteuFRAP: The Ferric Reducing Ability of Plasma hoac Ferric ion Reducing AntioxidantPower hoặc Ferric Reducing Power — Kha năng khử sat của huyết tương hoặc khanăng kháng oxy hóa được thể hiện qua sự khử ion Fe!"

IU: International UnitPAE: Pectin acetyl esterasePECTU: Pectinase UnitPG: PolygalacturonasePGU: Polygalacturonase Unit — Hoat tinh pectinase phan tich thong qua co chatpectin

PL: Pectate lyasePME: Pectin methyl esterasePMG: PolymethylgalacturonasesPNL: Pectin lyase

GAE: Gallic acid Equivalent — Ham lượng các hop chat phenolics tính theo đươnglượng acid gallic

RSM: Response Surface Modelling — Mô hình đáp ứng bề mặtTE hoặc TEAC: Trolox Equivalent hoặc Trolox Equivalent Antioxidant Capacity —hoạt tính khang oxy hóa tính theo Trolox

TPC: Total Polyphenols Content — Hàm lượng tổng của các hợp chat phenolicsTPTZ: 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine

XI

MỞ ĐẦU

Rau quả là nguồn cung cấp các chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợpchất có hoạt tính kháng oxy hóa, có lợi cho sức khỏe con người (Shui và Leong,2006; Wang và Lin, 2000) Theo nghiên cứu của Mohammed va cộng sự (2013) chorang các hop chất kháng oxy hóa trong khế gồm: các hợp chat phenolic (1429 —2099 „g/g nguyên liệu tươi), proanthocyanidins (896 — 1321 wg/g nguyên liệu tươi),các hợp chat flavonoid (103 — 148 zg/g nguyên liệu tuoi), Vitamin C (144 — 190pe/g nguyên liệu tươi) Ngoài ra còn cung cấp chất khoáng và nhiều vitamin khác

như vitamin Ba, vitamin A, vitamin E (USDA 2010).

Trên thé giới cây khế được nghiên cứu khá kỹ va được trồng như một cây ăn quảcó giá trị Các quốc gia đi đầu trong lĩnh vực nghiên cứu cây khế như Malaysia, ĐàiLoan, Mỹ, Brasil, Nam phi, đã phát triển nghé trồng khế rất thành công và thươngmại hóa các sản phẩm quả khế (Nakasone H.Y and R.E Paul, 1999), Tuy nhiên, quảkhế Việt Nam vẫn chưa được đánh giá cao Sản xuất khế của nước ta vẫn ở tìnhtrạng tự phát Thời gian gần đây một số giống khế mới ra đời đã khơi dậy nghềtrồng khế ở nước ta song vẫn chưa xứng với tiềm năng và giá trị nhiều mặt của loàicây rất gần gũi này Hiện tại quả khế dùng để ăn tươi là chủ yếu, chưa có các sảnphẩm từ quả khé trên thị trường

Sử dụng enzyme pectinase để xử lý dịch quả được nhiều tác giả nghiên cứu vàứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm dé làm tăng hiệu suất, tăng hàmlượng chất răn hòa tan hoặc cải thiện tính năng kỹ thuật của sản phẩm như làm tăngđộ trong, tăng độ màu, giảm độ nhớt hoặc giảm cặn lang trong quá trình bảo quảnsản phẩm Theo nghiên cứu Abdullah và cộng sự (2007), đã tối ưu hóa điều kiện xửly enzyme pectinex Ultra SP-L trên dịch quả khế nhằm làm trong dich quả, tăng độmàu và giảm độ nhớt.

Đến nay, chưa có các công bố khoa học về sử dụng chế phẩm enzyme pectinaseđể thu nhận dịch quả khế giàu hợp chất kháng oxy hóa Trên cơ sở đó, đề tài nghiêncứu “ứng dụng chế phẩm enzyme pectinase để thu nhận dịch quả khế giàu hợp chấtkháng oxy hóa” được thực hiện nhằm góp phần đa dạng hóa các sản phẩm từ quảkhé.

CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 Tổng quan về quả khé1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Quả khế có tên khoa học là Averrhoa carambola, là một trong những trái câynhiệt đới thuộc về dòng Oxalidace Tên đồng nghĩa: Averrhoa acutangula Stokes,Averrhoa pentandra Blanco, Connaropsis philippica Villar Tên phố biến:Carambola, Coolie Tamarind (Trinidad), Coromandel Gooseberry, CountryGooseberry, Five Corner (Australian), Five Fingers (Guyana), Starfruit, Star Pickle(Lim,2012).

Cho đến nay cây khé vẫn chưa rõ nguồn gốc, nhiều nhà nghiên cứu cho rang câykhế có nguồn gốc ở Ceylon (SriLanKa) và Moluccas (Indonesia), nhưng nó đã đượctrồng ở Đông Nam Á và Malaysia trong nhiều thế kỷ nay Theo trại nghiên cứuRehovoth cây khế được trồng quanh nhà làm cây cảnh và thu hoạch quả ở Israel từ1935 Một số nhà nghiên cứu khác cho răng nó có mặt ở Nam Florida (Mỹ) trướcnăm 1887 (Mrton, 1987).

Qua khé phan loai khoa hoc nhu sau :GIới: Plantae-Plants

Phan giới: Tracheobionta-Vascular plantsNgành: Spermatophyta-Seed plants

Phan nganh: Magnoliophyta-Flowering plantsLớp: Magnoliopsida-Dicotyledons

Phan lớp: RosidaeBo: GeranialesHo: Oxalidaceae-Wood-Sorrel FamilyChi: Averrhoa L.-Averrhoa

Loai: Averrhoa carambola L.-Carambola(National Plant Database 2004)

Cây khế có nhiều ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới Trên thế giới, cây khế đãđược trồng sản xuất hang hóa tập trung ở một số quốc gia và vùng lãnh thé (Mỹ,Malaysia, Thái lan, Đài Loan, Nam Mỹ, ) Ở Việt Nam, cây khé phân bé rải ráckhắp nước từ Bắc vào Nam Dựa theo nguồn gốc địa phương nơi xuất xứ, đặc điểmchất lượng giống khế Việt Nam có một số tên gọi như sau :

VY Khế Bắc Biên (còn gọi là khế vàng): cau trúc nhụy cao hơn nhị Quả thondai, khối lượng quả trung bình > 70g vị quả chua ngọt, độ Brix trong khoảng 7 — 9

Y Khuế Huế (còn gọi là khế xanh ): cau trúc hoa nhụy thấp hơn nhị Qua hơitròn, khối lượng quả trung bình > 70g, vi quả ngọt, độ Brix > 10

*x Khế chùm sao 1: Chọn tạo từ giỗng khế Malaysia Khối lượng quả trung bình95 — 105g, cánh quả day 3,25 cm, khi chín màu vàng sam, quả ngọt, độ Brix 9

VY Khế ngọt Bến Tre: cấu trúc hoa nhụy thấp hơn nhị Hình dáng quả cat dọctròn, khối lượng quả trung bình 100 — 150g Vị quả chua ngọt

Y Khế chua Kon Tum: vị chua thanh được dùng làm rau bán rộng rãi tại chợPleiku và Kon Tum Hình dáng quả cắt dọc dai (tỷ lệ chiều dài/ chiều rộng > 2cm).Chiều dai quả hái xanh khoảng 5 cm, hái chín khoảng 10 em

* Khế chua Điện Biên: Cau trúc hoa nhụy cao hơn nhị Hình dáng quả cắt dọcdài, múi khế rất nông nên cắt ngang có hình ngũ giác Kích thước quả nhỏ, khốilượng quả trung bình 30 — 50g Quả có vi chua thanh dùng làm rau.

VY Khế ngọt QS9: cau trúc hoa nhụy thấp hơn nhị Hình dáng quả cắt doc thondài, khối lượng quả trung bình 90 — 150g, vị quả ngọt, độ Brix khoảng 11(NguyễnVăn Hoan, 2006).

1.1.2 Đặc tính thực vật* Thân cây: chiều cao dao động 4m — 12m Trong sản xuất đại trà, chiều caocây có thé khống chế dé dễ thu hái bằng biện pháp cắt tỉa tạo tán và trồng cây ghép

Thân cây non thường có mau nâu nhạt, cây trưởng thành có màu nâu xâm Vỏ trơn,

nhẫn, màu sắc phụ thuộc vào tuổi của cây và tương đối khác nhau giữa các giống

s* Ré: thuộc loại rễ cọc mọc sâu 100 em — 160 cm, xung quanh là rễ chùm Khi

cây trưởng thành hệ thông rễ chùm phân bố xung quanh gốc khoảng 1m tạo thànhmột lớp rễ ngang rất dày

“+ Lá: dang lá kép lông chim, số lá chét khoảng 3 — 8 cặp hình oval hoặc elip, láchét phía dưới nhỏ lá chét phía trên Cuống lá có thé dài tới 20 cm Lá non có màuxanh lơ hay đồng nhạt và trở nên xanh đậm khi trưởng thành Phiến lá dài khoảng2.5 cm — 9.5 cm và rộng khoảng lcm — 4 cm Mặt trên của lá có một lớp lông tơ baophủ, mặt dưới trơn nhãn.

s* Hoa: nhỏ, lưỡng tính mọc thành chùm sim, mỗi chùm có 5 — 50 hoa Cau trúcđài hoa khế có 5 cánh màu đỏ nhạt bao quanh tràng hoa màu tím, cuống hoa trònngăn (1 mm) mau đỏ đậm Bau nhụy dài khoảng 15 — 25 mm chia làm 4 hoặc 5ngăn, trong mỗi ngăn có từ 2 đến 4 noãn, kiểu bầu thượng, lối đính noãn trụ giữa.Hoa mọc chủ yếu ở nách lá, trên cành cấp 1 — 2, trên thân chính và cả trên gốc, đôikhi có giỗng hoa năm trên đỉnh sinh trưởng của cành Thời gian từ lúc xuất hiện nụhoa cho đến khi hoa nở kéo dài khoảng 2 tuần

* Qua: mong nước, chiều dai dao động 5 em — 13 cm và chiều ngang 3cm — 6cm Mặt cắt ngang có hình ngôi sao năm cánh Mau sắc khi chín thường có màuxanh, vàng nhạt đến màu vàng cam đậm Hạt khế phân bố ở giữa quả trong múi khế,trung bình một múi có | — 6 hạt hạt nhỏ det, màu nâu, hình trứng dài 0.5 — | cm.Hạt khế có nội nhũ nạc và phôi thăng, bao quanh hạt là lớp dịch nhờn (Lim, 2012 vàPatil, 2010).

—

«id

(a) (b)Hình 1.1: Hoa khé (a) va qua khé (b) (P.Dasgupta, 2013)

1.1.3 Giá trị cây khế

Cây khế cho năng suất cao, thời vụ thu hoạch kéo dài nên cho hiệu quả kinhtế cao Giá trị sử dụng của quả khế rất đa dạng: quả tươi, nguyên liệu chế biến (ômai, mứt khế, rượu khế, nước khế), rau gia VỊ (xào, nau canh cá, gỏi) ở Malaysiakhế được hầm với đường và đỉnh hương Thái Lan hoa và trái xanh nau với tôm.Ngoài ra, quả khế làm nguyên liệu chế biến mứt, ô mai, jam, trái cây ngâm đường,nước giải khát Ở Đài Loan quả khế thái lát theo chiều dọc ngâm đường phục vụxuất khẩu Ở Ấn Độ quả khé dùng làm mứt, kẹo, nước uống đóng chai O Hawaii,nước ép khế trộn với gelatin, đường, nước cốt chanh va nước dùng làm nước uốnggiải nhiệt Lá, hoa, thân và rễ khế được sử dụng trong đông y để chữa một số bệnh.Ngoài ra cây khế còn sử dụng làm cây cảnh trang trí hoa viên, sân vườn trong cáckhu đồ thị (Morton, 1987).

Trong y học, đã có nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng cây khế trongviệc điêu tri bệnh.

Bang 1.1: Giá trị y học của cây khé (P.Dasgupta, 2013)Bộ :

Giá trị được phầmphận

Re Dé điều tri đau khớp, bệnh mãn tinh, nhức dau, chảy máu cam va di

Điêu tri nam ngoài da và đau đâu Lá sắc nước uông tri bệnh viêm

miệng và đau thắt ngực Hơn nữa, lá được tìm thay là hữu ich trong

ban da, ngứa, say năng Tại Ấn Độ, những quả chín được sử dụng

như thuốc hạ nhiệt, nhuận tràng, kích thích sự thèm ăn Tại Brazil,quả khế khuyến cáo như thuốc lợi tiêu trong thận và bàng quang.Hoa Dùng làm thuôc tây giun, sôt và sôt rét, viêm da

1.1.4 Tinh hình nghiên cứu và sản xuất khé trên thé giới

Các nhà di truyền chọn giống đã nghiên cứu tương đối sâu về mặt di truyềnvà chọn tạo nhiều giống mới theo các hướng sử dụng (làm rau, quả tươi, chế biến,cây cảnh) Đa số các giống mới được chọn tạo đều có hàm lượng axit oxalic thấp,thịt quả cứng, dễ vận chuyền, chất lượng cao vị ngọt có pha vị chua phù hợp với thịhiểu người tiêu dùng VỀ biện pháp kỹ thuật đáng chú ý nhất là biện pháp bao quảbang túi giấy dé chống rudi đục quả và giữ màu sắc qua được sáng đẹp Công nghệsau thu hoạch đối với quả khế ở hai nơi này đã được nghiên cứu tương đối hoànchỉnh Quả khế không có đột phá hô hấp nên rất thuận tiện cho việc xuất khẩu bangđường biến Các sản phẩm từ khé rat đa dạng: nước khế, rượu khé, mứt khế, khé saykhô.

Hiện nay, cây khế được trồng quy mô lớn để xuất khẩu và chế biến công nghiệpkhông chỉ ở Malaysia, Đài loan mà còn tương đối phố biến trên thế giới như cácnước Nam Mỹ, một số quốc gia châu Phi, một số vùng ở Mỹ (Florida, Maiami) hayở Australia (Queensland) cũng có những trang trại lớn trồng khế đáp ứng nhu cầuthị trường trong nước (Nakasone H.Y and R.E Paul, 1999).

1.1.5 Thành phần hóa học cơ bản của quả khế

Thành phần dinh dưỡng của quả khế phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loài,điều kiện gieo trồng và chăm sóc, thời điểm thu hoạch, phương pháp tồn trữ Thànhphân hóa học của quả khế được trình bày ở bảng 1.2

Bang 1.2: Thanh phan hóa học qua khé trong 100g nguyên liệu tươi (Narian

Đường tong g 291+0.31 5.60 + 0.73Tinh bột g 1.92 + 0.37 1.04 + 0.02

Pectin g calcium pectate 1.64 + 0.98 1.02 +0.45Acid hữu co bị 0.98 + 0.07 0.36 + 0.02

Bang 1.3: Thanh phan và hàm lượng đường của vó khé trong quá trình

chín (Lieng- Hong chin và cộng sự, 1999 )Ngày

hi Rhamnose Fucose Arabinose Xylose Mannose Galactose Glucose

chin

0 43407 24403 41416 128408 60402 179408 14641512 46+06 22+04 415420 11.9411 65406 172410 16142624 43+08 2.1402 450421 11.9406 79406 160408 127406

(các giá trị đường được biêu diễn theo % mol)1.1.5.2 Acid hữu cơ

Theo P Dasgupta và cộng sự (2013), thành phan va ham lượng các acid hữucơ trong quả khế gồm có: acid tartaric (4.37 mg/100g quả tươi), acid oxalic (9.6 mg/100g quả tươi), acid a — ketoglutaric (2.2 mg/100g quả tươi), acid citric (1.32mg/100g quả tươi).

Valine 0.17 0.11

Isoleucine 0.03 0Gamma Amino Bytyric Acid 0.77 0.55

Ornithine 0.11 0.13

1.1.5.4 VitaminQuả khé là nguồn cung cấp các loại vitamin: Vitamin C (34.4mg/100g quatươi), Vitamin Be (0.017mg/100g qua tươi), vitamin A (61 IU/100g qua tươi),vitamin E (0.15mg/100g qua tuoi) (USDA 2010).

1.1.5.5 Cac hop chat kháng oxy hóaTheo Sultan Ayesh Mohammed và cộng sự (2013) hàm lượng và các hop chấtkháng oxy hóa trong khế gồm: các hợp chất phenolic (1429 — 2099 „g/g nguyênliệu tươi), proanthocyanidins (896 — 1321 g/g nguyên liệu tươi), các hợp chấtflavonoid (103 — 148 g/g nguyên liệu tươi), Vitamin C (144 — 190 wg/g nguyênliệu tươi).

Theo nghiên cứu Shui và Leong (2006), bã khé loại rất giàu các hợp chất có hoạttính kháng oxy hóa Hàm lượng các hợp chất tính trên g bã khô: hàm lượngphenolics tong 33.2 + 3.6 mgGAE/g, L-ascorbic acid 3412 + 290 mg/100g, hoạt

tính kháng oxy hóa theo ABTS” 5270 + 468TEAC/100g, hoạt tính kháng oxy hóa

theo FRAP 510.3 + 68.1 TEAC/g.Theo nghiên cứu Lim and Lee (2013) thành phan các hợp chat kháng oxy hóatrong 100g nguyên liệu khé tươi được trình bày ở bảng 1.5

Bang 1.5: Thanh phần các hop chất phenolic và hoạt tính kháng oxy hóa

trong 100ø nguyên liệu tươi (Lim and Lee, 2013)

Hàm lượng Hàm lượng Ham lượng

polyphenol flavanol acid ascorbic Hoạt tính kháng oxy hóa

Khé tong tong tong

FRAP DPPHTAE CAE AAE

GIÁ (CAI (BAAE) (IEFEA) (%Inhibiton)

Quả khế xanh 3695+7I7 1312+082 1.2440.18 048+40.09 5641+4.01Quả khé chín 98.19 + 13.83 33.31 + 4.35 I.56+0.24 I4I1x+I1.035 75.00+6.93

10

1.1.5.6 Các cau tử dễ bay hơiTheo nghiên cứu Liew Abdullah (2013) cho thay có 43 cau tử dé bay hơi trongdịch quả khế Thanh phan cau tử gồm : 13 alcohol, 4 aldehyde, 6 ketone, 13 ester, 3hydrocacbon và 4 cau tử thuộc các nhóm khác.

Bang 1.6: Thành phan và phan trăm các cau tử bay hơi trong quả khé chín

(Mahattanatawee và công sự, 2005)

STT Thành phân (%) STT Thanh phân (%)

1 Acetaldehyde 0.6 I3 1-pentanol 0.022 Methanol 3.64 I4 Hexanal 0.023 _ FEthanol 86.28 15 Ethyl butyrate 0.014 Acetone 0.26 16 ‘Trans -2-hexenal 4.795 2-propanol 1.23 [7 Cis-3-hexen-I-ol 0.396 Methyl acetate 0.02 18 Trans -2-hexenal-1-ol 1.097 — 1-propanol 0.06 19 I-hexanol 0.38 Ethyl acetate 0.7 20 1-octanol 0.039 2-methyl -1-propanol 0.06 21 Linalool 0.0310 I-butanol 0.02 22 ~~ a- terpineol 0.02II I-penten-3-ol 0.05 23 Carvone 0.02I2 3-methyl-I-butanol 0.01

1.1.6 Công nghệ thu nhận dịch quả khếQuá trình thu nhận dịch khế gôm hai giai đoạn chính: chuẩn bị nguyên liệu vàtách dịch Có nhiều phương pháp xử lý nguyên liệu làm tăng hiệu suất thu hồi dịchnhư cơ học, lạnh đông, enzyme, siêu âm, bức xa ion hóa, trường xung điện và xử lýnhiệt Phương pháp dễ thực hiện, mang lại hiệu quả kinh tế được áp dụng rộng rãihiện nay gdm có: co học, xử lý nhiệt va enzyme (Horvath-Kerkai, 2006)

* Xử lý cơ học: là quá trình xé nhỏ nguyên liệu, phá vỡ mô tế bao làm tăngdiện tích bề mặt Nếu sử dụng quá trình ép để tách dịch quả thì kích thước củanguyên liệu sau quá trình chuẩn bị phải có độ lớn nhất định và đồng nhất quá trìnhthoát dịch dé dàng hơn hiệu suất thu hồi cao Nếu kích thước các phan tử quá nhỏ,

II

chúng sẽ dễ dàng làm bít các kênh dẫn trong khối bã, từ đó làm giảm hiệu suất thuhỏi dịch qua.

s* Xử lý nhiệt: nguyên liệu sau giai đoạn chuẩn bị được gia nhiệt nhanh 80°C —

85°C thời gian ngăn sau đó làm lạnh nhanh Quá trình gia nhiệt làm biến tính

protein, thủy phân protopectin thành tế bào Kết quả, các chất hòa tan bên trong tếbào thoát ra ngoài dé dàng hơn Do do, làm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết từ 5%đến 10 %, đồng thời có thé cải thiện tính chất của dich quả như màu sắc, hương sảnphẩm

* Xử ly enzyme: là phương pháp thường xuyên sử trong công nghệ sản xuấtnước trái cây Sử dung enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase thủy phân các cơchất làm phá vỡ thành tế bào và mô quả giúp giải thoát chất chiết, đồng thời làmgiảm độ nhớt của nguyên liệu Điều kiện xử lý enzyme thường 0.5 giờ — lgiờ,nhiệt độ 50°C — 55°C Ezyme có ban chất protein nên nhạy cảm nhiệt và pH Nếunhiệt độ và pH không tối ưu thì thời gian xử lý kéo dài và nồng độ enzyme bồ sungvào nguyên liệu cao (Horvath-Kerkai, 2006).

1.2 Tong quan về enzyme pectinase1.2.1 Dinh nghia

Pectinase là một enzyme phân hủy pectin Pectin là một trong những hợp chatđược tìm thay trong thanh tế bao thực vat, được hình thành trong quá trình phânchia tế bao chất Do đó, pectinase giúp phá vỡ các thành tế bao làm tăng khối lượngdịch trích (tăng hiệu suất), giảm độ nhớt, giảm hiện tượng duc của nước quả Bêncạnh đó, nâng cao chất lượng cảm quan (màu sắc, hương vị), dinh dưỡng (vitamin,các chất có hoạt tính sinh học) và tính hiệu quả công nghệ (Pasha, 2013)

1.2.2 Phân loạiDựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế xúc tác, enzyme pectinase được chiathành 3 nhóm chính (Kashyap và cộng sự, 2001).

- _ Nhóm 1: Nhóm enzyme thủy phân liên kết ester — Pectinesterase- - Nhóm 2: Nhóm depolymer hóa mach pectin — Depolymerase- Nhóm 3: Nhóm enzyme thủy phân protopectin — Protopectinase

12

(EC 3.1.1.6)

DepolymeraseProtopectinase

- Polymethylgalacturonase: hydrolysis

- Pectin lyase (PL):transelimination EndoPL (EC 4.2.2.10)

- Polygalacturonase (PG):hydrolysis

Endo PG (EC 3.2.1.15)Exo PGI (EC 3.2.1.67)Exo PG2 (EC 3.2.1.82)- Pectate lyase (PGL):

transeliminationEndo PGL (EC 4.2.2.2)Exo PGL (EC 4.2.2.9)

- Rhamnogalacturonase(RG): hydrolysis- Rhamnogalacturonan

lyase (RGL):transelimination

Hinh 1.2: phan loai enzyme pectinase (Gummadi, 2007; Kashyap, 2001)

13

“smooth region” “hairy region” “smooth region”

PE: Pectinesterase AGal: ArabinogalactanaseRGal: Rhamnogalacturonase PL: Pectin Lyase PG: PolygalacturonaseAra: Arabinose OAc: Acetyl ester OMe: Methyl esterGala:Galacturonic acid Rha: Rhamnose Xyl: Xylo

Hình 1.3: Vị tri phân cắt các enzyme pectinase (Rensburg and Pretorius, 2000)s Vị trí phân cắt của Exo - polygalacturonase và Endo - polygalacturonase:

a COOH COOH — COOH COOH COOH

Exo-pectin lyase Endo-pectin lyase

Hình 1.4: Vi trí phân cắt của Endo-PG và Exo-PG (a) acid pectinic, (b) pectin

(Sieiro, 2012)

14

s% Sản phâm của enzyme pectinase: Ung với mỗi enzyme sẽ kêt hợp với một cơ

chất và phản ứng theo một kiểu nhất định tạo ra các sản phẩm khác nhau.Bang 1.7: Co chất và sản phẩm của các enzyme pectinase (Pedrolli và cộng sự,

2009).Enzyme Ký hiệu Cơ chất Sản phẩmProtopectinase Protopectin pectin

acid pectic,Pectin methyl esterase PME Pectin

methanol

Pectin acetyl esterase PAE pectin acid pectic, acetate

Rhamnogalacturonan acid pectic,

RG acetylesterase rhamnogalacturonanacetylesterase galacturonate

PMG (endo PMG, 6 methyl D Polymethyl galacturonase pectin

-exo PMG) galacturonatePG (endo PG, exo

Polygalacturonase PG) acid pectic D - galacturonateRhamnogalacturonan

RG rhamnohydrolase rhamnogalacturonan rhamnoserhamnohydrolase

Pectate lyase PGL acid pectic

45-D-galacturonatemethylPectin lyase PL pectin

oligogalacturonateRhamnogalacturonan

RG lyase rhamnogalacturonan galacturonate

yase

15

1.2.4 Tính chất enzyme pectinaseEnzyme pectinase có thê được sản xuât từ vi khuan, nam men, nam moc và thựcvật VI sinh vật có khả năng tông hợp nhiêu loại enzyme pectinase với cơ chê hoạtđộng và tính chất sinh hóa khác nhau Có nhiều nghiên cứu về khả năng hoạt động vàtính chat sinh hóa của những enzyme này Những enzyme này có khoảng pH tối ưu 3,5- 11 và nhiệt độ tối ưu 40°C — 75°C Bảng 1.8 cho thấy sự đa dang của enzymepectinase được tong hop tu vi sinh vat:

Bang 1.8: Tinh chat sinh hóa cua các loại enzyme pectinase (Sieiro và cộng sự,

2012)

; Nhiét d6 toi wuVi sinh vat Enzyme pH toi ưu 0

CC)

Vi khuanBacillus sp NT-33 Polygalacturonase 10,5 75Bacillus sp DT7 Pectin lyase 8 60Nam mốc

Aspergillus ficuum Pectin lyase 5 50Penicillium frequentans — Endopolygalacturonase 35-5 50

Sclerotium rolfsii Endopolygalacturonase 3,5 55

Penicillium paxilli Pectin lyase 5 35Nam men

16

base thường được sản xuất bởi vi khuẩn, đặc biệt là loài Bacillus, tuy nhiên một số

trường hợp được sản xuât từ nầm sợi và nâm men Ung dung trong tiên xử lý nước thải

trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ thực vật có chứa dư lượng pectin, chế biếnsợi dệt như hạt lanh, day và cây gai, bột giấy, cà phê và trà (Pedrolli và cộng sự, 2009)

Bang 1.9: Đặc tính pectinase từ vi sinh vật (Tapre and Jain, 2014)

Cloctridium thermo- Polygalacturonase

saccharolyticum hydrolase 210) 00

Pectinase kiém

Bacillus sp RKY PGL 10,0 Bacillus sp NT-33 PG 10,5 75Bacillus polymyxa PG 8,4-9 4 45Bacillus pumilis PATE 8,0-8 5 60Amucola sp Pectate lyase (PAL) 10,25 70Xanthomonas compestris PATE 95 25-30Bacillus No P-4-N PG 10-10,5 65Bacillus stearothermophillus PATE 90 70Penicillium italicum CECT 22941 Pectin lyase 8,0 50Bacillus sp DT7 Pectin lyase 8,0 60Bacillus subtilis PAL 8,5 60-65Pseudomonas syringae pv Glycinea PAL 8,0 30-40

-17

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme pectinase

Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiêu yêu tô như: nông độ enzyme,nông độ co chat, nhiệt độ, pH môi trường, các ion kim loại, các chat vô cơ và hữu cơkhác Dưới đây là một số yếu tố được trình bày cụ thé:

1.2.5.1 Nông độ cơ chấtNếu nông độ cơ chất thấp phản ứng tiễn hành từ từ Vì cơ chất không đủ để kết hợpvới trung tâm hoạt động của enzyme Khi nồng độ cơ chất tang, vận tốc phản ứng phụthuộc tuyến tính vào nông độ cơ chất Điều này là do có nhiều khu phức hợp enzyme —cơ chất được hình thành Vận tốc phản ứng đạt cực đại khi nồng độ cơ chất đủ lớn, nếutiếp tục tăng nồng độ cơ chất vận tốc cũng sẽ không tăng theo

Theo nghiên cứu Adesina và cộng sự (2013), ảnh hưởng nồng độ cơ chất đến hoạttinh enzyme pectinase từ Rhodotorulla ssp và Mucor mucorales trên cơ chất pectin.Kết quả, hoạt tinh enzyme tăng khi tăng nồng độ cơ chat Enzyme có hoạt tính caonhất ở nông độ cơ chất là 0.5% (w/v) Tuy nhiên, khi tăng néng độ cơ chất từ 0.5%đến 1% (w/v) thì hoạt tinh enzyme thay đổi không đáng kể (P<0.05)

1.2.5.2 Nhiệt độẢnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cũng có quy luật tương tự nhưtrên Theo nghiên cứu Srivastava va Tyagi (2013) khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệtđộ xử ly enzyme pectinase lên hiệu suất thu hồi dich quả táo Kết quả cho thay ranghiệu suất tăng khi nhiệt độ xử ly enzyme tăng từ 30° C đến 45° C, giá trị đạt cao nhất25 ml/50g mẫu ở nhiệt độ 45°C, tiếp tục tăng nhiệt độ 45°C đến 55°C hiệu suất batđầu giảm hầu như không đáng kế (P<0.05) Theo A.Rasheedha Banu (2010), anhhưởng nhiệt độ xử lý đến hoạt tính enzyme pectinase từ Penicillium Chrysogenum

Két qua cho thay hoạt tinh enzyme tang khi tăng nhiệt độ từ 20°C đến 50°C, hoat

tinh enzyme dat cao nhat 85 (U/mg protein) 6 50°C va khi tang nhiệt độ từ 50°C đến80°C hoạt tính enzyme bắt đầu giảm (P<0.05)

Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzyme cao nhất là nhiệt độ toi ưu (top) Dưới top , khinhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng Vì khi tăng nhiệt độ tăng chuyển động va chạm

18

giữa các bề mặt và các hoạt động cua enzyme tăng Trên t,,, enzyme bat dau bién tinhtốc độ phản ứng giảm dan Điều này xảy ra do các liên kết hydro và cau disulphidetrong trung tâm hoạt động enzyme bị phá vỡ, khu phức hợp enzyme và cơ chất khônghình thành Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng hóa họccũng như phản ứng enzyme là hệ số nhiệt Q¡o,

Hệ số Q¡o của phản ứng enzyme là từ 1 đến 2 (của phản ứng hóa học 2 đến 3) Nóicách khác khi tăng nhiệt độ không quá cao gây ra sự biến tính, nhiệt độ tăng lên 10°Cthì tốc độ phản ứng tăng ứng với hệ số nhiệt Qyo

Đa số enzyme có top vào Khoảng 40°C — 50°C Tuy nhiên top của một enzymekhông cố định mà có thé thay đối tùy co chất, pH môi trường, thời gian phan ứng,Nhiệt độ mà enzyme bị mat hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn thườngvào khoảng trên 70°C Ở nhiệt độ tới han enzyme bị biến tính, ít khi có khả năng phụchồi lại hoạt độ Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0C, hoạt độ enzyme tuy bị giảm nhưng cóthể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường (Lê Ngọc Tú, 2005)

1.2.5.3 pHẢnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme pectinase cũng theo quy luật chung.Vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bềnprotein enzyme Khảo sát enzyme pectinase từ Aspergillus oryzae trên cơ chất pectin —agar (Sabika và Gyna, 2012) cho thấy rang, khi tăng pH thì hoạt tính enzyme tăng,hoạt tính enzyme đạt giá trị cao nhất ở pH 4.5, hoạt tính enzyme giảm khi pH tăng từ4.5 đến 8 Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Sarkar (2014), hoạt tính enzymepectinase từ P.chrysogenum tăng khi pH tăng từ 3 đến 5, hoạt tính enzyme đạt giá trịcao nhất 1.032 ng/ml/phút, khi tăng giá trị pH từ 5 đến 9 thì hoạt tính enzyme giảm rõrệt (P<0.05).

19

1.2.6 Cơ chất enzyme pectinaseCơ chất của enzyme pectinase là các hợp chất pectin Pectin là hợp chất cao phântử, mang điện tích âm, tập trung chủ yếu ở mô và thành tế bào Cơ chất pectin thườngtim thay ở dạng canxi pectate và magié pectate (Jayani, 2005).

Có 3 lớp câu trúc chính được tìm thấy trong tất cả các thành tế bào sơ cấp:homogalacturonan (HG), rhamnogalacturonan I và rhamnogalacturonan II HG cautao mach thắng bởi các đơn phan D - galacturonic qua liên kết a - 14 glucoside(Sharma, 2006) Những don phân D-galacturonic acid có thé acetyl và methyl hóa bởiester Tuy vào mức độ ester hóa phân loại HG như sau: pectin có nhóm — COOH bịmethyl hóa > 75%, acid pectinic có nhóm — COOH bị methyl hóa < 75%, acid pecticlà acid polygalacturonic nhóm — COOH không bi methyl hóa HG chiếm khoảng 60%— 65% tong cac hop chat pectin (Pedrolli, 2009 va Nikolovski, 2009)

Protopectin la dang pectin nguyén thuy Khi thuy phan gidi han protopectin sé taora pectin hoặc acid pectinic Protopectin là phức của pectin với các hợp chất hóa họckhác làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau (Kashyap và cộng sự,2001) Dưới đây là cau trúc phân tử pectin

20

= : nah ==

Homogalacturonan

Rhamnogalacturonan II

Rhamnogalacturonan |

Galacturonic acid (GaiA)Rhamnose (Rha)

Ketodeoxymanno-heptulopyranosylaric acid (Dha) octulopyranosylonic acid (KDO)

Hình 1.5: cấu trúc phân tir pectin A cau trúc cơ ban, B cau trúc phức tap

(Harholt và cộng sự, 2010; Caffall & Mohnen, 2009)

1.2.7 Ung dụng của chế phẩm enzyme pectinase trong sản xuất nước qua

Pectinase sản xuất từ sinh vật được quan tâm hơn cả và sử dụng pho bién trongsản xuất nước qua do chi phi cho sản xuất tương đối rẻ tiền và thân thiện với môitrường Hơn nữa, xúc tác enzyme được ưa thích hơn các phương pháp hóa học khác vìxúc tác enzyme là chọn lọc, nhiệt độ thấp và sản phẩm sau phản ứng hầu như không cóđộc tính (Carmen Sieiro, 2012).

Theo Anisa va Girish (2014) thì hiện nay nguồn gốc của vi sinh vật được thốngkê như sau: 50% có nguồn gốc từ nắm mốc va nắm men, 35% từ vi khuẩn, 15% còn lạilà từ thực vật và động vật Và cũng đã có nhiều nghiên cứu cô lập và sàng lọc nhiêu

21

chủng nam từ nhiêu nguôn vi sinh vật khác nhau đê sản xuât ra các loại enzympectinase phủ hợp với điêu kiện sản xuât.

Các chê phâm pectinase thương mại được sử dụng trong chê biên thực pham thườnglà tổ hợp các enzyme: polygalacturonases, lyases pectin và pectin methyl esterase,

Bang 1.10: Một số chế phẩm pectinase thương mại thường được sử dung trong

san xuất nước qua (Novozymes, Dan Mach)

Rapidase 115000 Aspergillus DSM

PolygalacturonaseVino Super AVJB/g niger ( Pháp )

Pectinex 7900 Aspergillus | Novozyme A/S

PolygalacturonaseUltra clear PGNU aculeatus (Dan Mach)

Pectinex Aspergillus | Novozyme A/S

Pectinmethylesterase 3.7 PEU/gYiedmash Extra niger (Dan Mach)

Pectinex 30000 Aspergillus | Novozyme A/S

Pectin lyase

SMASH XXL PECTU/ml niger (Dan Mach)

AspergillusPectin lyase

10000 niger Novozyme A/SPectinex XXL

PECTU/ml Aspergillus (Dan Mach)

Polygalacturonase

aculeatusAspergillusPectin lyase

Pectinex 10000 niger Novozyme A/S

Ultra AFP PECTU/ml Aspergillus (Dan Mach)

Polygalacturonase

aculeatus

San xuất pectinase chiếm khoảng 10% của tong thé chế phẩm enzyme được sửdụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm đặc biệt trong sản xuất nước trái câyvà rượu vang (Danielle Biscaro Pedrolli và cộng sự, 2009) Trong đó chế phẩm

22

Pectinex Ultra SP — L đã được nghiên cứu sử dụng trong sản xuất nhiều loại nước tráicây Minh và cộng sự (2014) đã tiễn hành xử lý dịch rose apple bằng chế phẩmPectinex Ultra SP — L, kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi chất chiết đạt 85.6% tăng10.4% so với mẫu đối chứng Hàm lượng chat rắn hòa tan đạt 14.1°Brix tăng 1.6% sovới mẫu đối chứng.

Tape và Jain (2014) tối ưu hóa điều kiện xử lý dịch chuối bang chế pham Pectinexultra SP — L Kết quả cho thấy, hiệu suất đạt giá trị cao nhất ở 64.76% tại nồng độenzyme 0.12%, nhiệt độ 38.84°C, thời gian 136.52 phút Khi khoảng khảo sát nồng độenzyme 0.05% — 0.15%, nhiệt độ 30°C — 50°C và thời gian 60 phut — 180 phut

Khandare va cộng sự (2011) đã sử dung enzyme pecinase từ Aspergillus niger déxử ly dich carrot đen Kết quả cho thấy hiệu suất dat 64% (tăng 33% so với mẫuchứng), các hợp chất phenolic đạt 382mg GAE/100mL (tăng 27% so với mau đốichứng), hoạt tính chống oxy hóa đạt 30 pmol TE/mL theo FRAP (tăng 30% so với

mẫu đối chứng) Ở điều kiện xử lý nhiệt độ 60°C, nồng độ enzyme 0.2% và thời gian

60 phút.Cho đến hiện nay vẫn chưa có công bố trên các tạp chí khoa học về việc ứng dụngchế phẩm Pectinex Ultra SP-L trong quy trình thu nhận nước khế giàu hợp chất khángoxy hóa Chính vì vậy, ché phẩm enzyme pectinase được sử dung trong nghiên cứunày để thu nhận dịch quả khế giàu hợp chất kháng oxy hóa

23

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Quả khéQuả khế được mua tại nhà vườn xã Bình Đức, huyện Châu Thành, tỉnh TiềnGiang.

Quả khế có màu vàng, không bị sâu bệnh và dập úng để sử dụng cho thí

Khế lạnh đôngnghiệm.

Khế mua về phân loại, rửa sạch, bảo quản lạnh đông -18°C được sử dụng cho tất cảcác nghiệm thức của một dot thí nghiệm Khi tiễn hành thi nghiệm khế sẽ được rãdong, chan ở nhiệt độ 90°C trong 2 phút, sau đó chà nhỏ băng máy chà (PanasonicMỊJ- 170, Malaysia, đường kính lỗ lọc khoảng 0.2 mm) rồi trộn déu Dịch chà thuđược pha loãng với nước tỉ lệ 1: 2, dịch khế pha loãng có pH 2.8 chỉnh đến pH 4.5bang Na,CO3 Sau đó cân mẫu vào các erlen 250ml với khối lượng déu nhau 50g vàxử lý bằng chế phẩm Pectinex Ultra SP - L Mẫu tiến hành ủ trong bé điều nhiệt(Memmert, Đức) với nhiệt độ nước trong bé 50°C, thời gian ủ mẫu tùy theo từng thínghiệm Sau thời gian ủ, mẫu được chỉnh về pH = 2 băng acid citric để vô hoạtenzyme rồi làm lạnh nhanh về 10°C Sau đó, mẫu được lọc chân không, dịch lọc sẽđược ly tâm 6000g/ phút trong 20 phút bằng máy ly tâm (Sigma 3K, Đức) dé tách cặnmịn Dịch sau ly tâm dùng để xác định các hàm mục tiêu.

2.2 Phương pháp nghiên cứu2.2.1 Mục dich nghiên cứu

Sử dụng chế phẩm pectinase để thu nhận dịch quả khế giàu hoạt tính kháng oxyhóa, đồng thời xác định các thông số động hoc của quá trình trích ly dịch qua

25