Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Khảo sát chất màu từ đậu đen

Hình 17: Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch màu chiết bằng nước theo thời gian ngâm ở 30oC và 60oC từ trái qua phải...28 Hình 18: Ảnh hưởng của nồng độ cồn lên hàm lượng anthocyanin và chỉ

Chất màu tự nhiên

Hiện nay chất màu chủ yếu gồm hai loại: chất màu tự nhiên, chất màu tổng hợp [1]

- Chất màu tự nhiên là các chất màu được chiết xuất hoặc được chế biến từ các nguyên liệu hữu cơ (thực vật, động vật) sẵn có trong tự nhiên Ví dụ: carotene tự nhiên được chiết xuất từ các loại rau quả có màu vàng, đỏ; anthocyanin được chiết xuất từ các loại rau quả có màu đỏ, tím…

- Chất màu tổng hợp: Chất màu tổng hợp là các phẩm màu đƣợc tạo ra bằng các phản ứng hóa học Ví dụ: amaranth (đỏ), beilliant blue (xanh), sunset yellow (vàng cam), taetazine (vàng chanh)

Chất màu tổng hợp thường đạt độ bền cao, không bị tác dụng do thời gian, ánh sáng hay nhiệt độ nhưng chúng có thể gây ngộ độc nếu dùng loại không nguyên chất Theo nghiên cứu, các chất màu tổng hợp có thể gây ung thư và có tác dụng không tốt cho cơ thể con người; còn chất màu tự nhiên thường không gây độc hại do được chiết xuất từ các thành phần thiên nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp chiết tách chất màu tự nhiên và ứng dụng vào trong ngành công nghiệp thực phẩm và các ngành khác là điều rất cần thiết

Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là họ màu phổ biến nhất tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy được trong một số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ tuy nhiên, đậu đen là đối tượng được xếp vào loại có chất màu có hoạt tính kháng oxi hoá cao.

Đậu đen

Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrica Skeels (Dolichos catjang Burm f) hay

Vigna catiang Endl var, thuộc họ cánh bướm Fabaceae (Papilionaceae) [1] Đậu đen là loài cây thân cỏ mọc thường niên, sống thành bụi nhỏ, toàn thân không có lông Lá có dạng kép gồm 3 lá chét mọc so le, có lá kèm nhỏ Lá chét mọc ở giữa to và dài hơn lá chét hai bên Hoa màu tím nhạt, dạng cánh bướm Quả giáp dài tròn, trong chứa từ 7- 10 hạt Khi còn tươi quả có màu xanh Khi già và khô thì teo lại và có màu nâu Đậu đen được chia làm 2 loại: đậu đen xanh lòng và đậu đen trắng lòng [1] Đậu đen cũng như những loài cây họ đậu khác có khả năng tăng độ màu mỡ cho đất trồng do trong rễ có những nốt sần, làm nơi cư trú cho những vi sinh vật cố định đạm như Nitrobacter baccilus Hạt đậu đen có rất nhiều công dụng, ngoài làm thực phẩm còn được sử dụng trong đông y để chữa bệnh, có tác dụng bổ thận thủy [2]

Cây đậu đen sinh trưởng tốt ở những vùng khí hậu nóng ẩm Ở nước ta, đậu đen được trồng nhiều ở miền Bắc để lấy hạt, thường thu hoạch vào tháng 5 và tháng 6

Hình 1: Ảnh cây và hạt đậu đen

Trong số các loại đậu làm thực phẩm thông dụng cho con người, đậu đen được các nhà dinh dưỡng đặc biệt quan tâm do trong đậu đen có thành phần dinh dưỡng rất phong phú Đậu đen là loại thực phẩm khá phổ biến của nhân dân ta Người ta thường sử dụng hạt đậu đen để nấu xôi, chè và làm thuốc chữa bệnh trong đông y

Chè đậu đen vừa được sử dụng như thức ăn và thức uống thanh nhiệt đặc biệt trong mùa hè

Trong đông y, đậu đen là một vị thuốc để chế thành đạm đậu xị, nước luộc đậu đen dùng bào chế nhiều vị thuốc Đậu đen có hoạt tính chống oxy hóa ở mức độ vừa phải, nên có tác dụng chống lão hóa, tăng sức đề kháng và miễn dịch của cơ thể Trong đậu đen chứa nhiều anbumin và acid béo không bão hòa nên có tác dụng hạ mỡ máu Đậu đen cũng được xác nhận là có tác dụng lợi tiểu và tiêu độc cơ thể Theo y học cổ truyền, hạt đậu đen có vị ngọt nhạt, tính bình, mát, có tác dụng bổ gan, thận, bổ huyết, trừ phong, thanh thấp nhiệt, hạ khí, lợi tiểu, giải độc, tiêu khát

Nhiều công trình nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng của đậu đen và đã công bố nhiều kết quả khả quan lên sức khỏe mà đậu đen mang lại Trong đậu đen có chứa nhiều chất xơ tan và không tan rất tốt cho những người bị tim mạch và tiểu đường Chất xơ giúp cơ thể đào thải bớt chất béo và cholesterol ra khỏi cơ thể giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch Ngoài ra, trong đậu đen chứa nhiều vitamin và khoáng chất như: vitamin A, vitamin C, vitamin B1, vitamin B12 và các khoáng chất như Fe, Mn, Mo, P rất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể Đậu đen được

9 xem là thức ăn giàu dinh dưỡng với các thành phần dinh dưỡng trong đó được đánh giá rất tốt do chất lượng và hàm lượng khá cao Đặc biệt trong đậu đen rất giàu Mo, folate, chất xơ, trytophan thành phần các chất dinh dưỡng này cung cấp có thể vượt quá nhu cầu hàng ngày của một người

Hình 2: Giá trị dinh dưỡng trong hạt đậu đen cung cấp tương ứng với nhu cầu dinh dưỡng hàng ngày

Protein: Đậu đen là nguồn thực phẩm rất giàu protein Protein có trong đậu đen rất thích hợp cho những người ăn chay và rẻ hơn so với nguồn protein từ động vật Tuy nhiên, nguồn protein này không chứa đầy đủ hết 9 loại amino acid Cho nên, đối với những người ăn chay, nhất thiết phải bổ sung ngũ cốc để cung cấp những amino acid còn thiếu Nhiều nghiên cứu về thành phần của đậu đen cho thấy đậu đen có đủ các loại protein thiết yếu, kể cả Arginin và 3 loại axit amin khác mà khoa học gọi là BCCAs, Leucin, Valin và Isoleucin Trong 100g đậu đen cung cấp: 0.97g Valin, 1.26g Leucin, 1.11g Isoleucin

BCAAs (axit amin chuỗi nhánh) bao gồm 3 axit amin thiết yếu đóng vai trò quan trọng Chúng thường được gọi là "axit amin căng thẳng" vì có khả năng phục hồi và sửa chữa tổn thương do căng thẳng thể chất, chấn thương nghiêm trọng hoặc phẫu thuật Bên cạnh đó, BCAAs còn hỗ trợ nhận thức và cải thiện trí nhớ sau những tổn thương não do bệnh tật hay tai nạn.

Sử dụng kết hợp đậu đen và những ngũ cốc hoàn toàn có thể thay thế nguồn protein có trong các sản phẩm sữa, thịt tránh được sự cung cấp một lượng lớn năng lượng cũng như những chất béo bão hòa có trong những thực phẩm này

Khoáng chất: Đậu đen được đánh giá là nguồn thực phẩm dồi dào khoáng chất như Canxi (Ca), Sắt (Fe), Magie (Mg), Mangan (Mn) đặc biệt là hàm lượng cao Molypden (Mo)[3]

Mo: Sulfite là loại chất bảo quản phổ biến trong công nghiệp Một số người nhạy cảm với sulfites có thể bị tăng nhịp tim, nhức đầu, giảm sự tập trung Mo là nguyên tố đóng vai trò quan

11 trọng giúp cơ thể tránh khỏi sự dị ứng với sulfite Đây là thành phần thiết yếu của enzyme sulfite oxidase, là enzyme có khả năng giải độc sulfite Một chén đậu đen nấu chín (172g) cung cấp đến 172% nhu cầu Mo cần thiết cho cơ thể trong ngày Ngoài ra, khoa học còn cho biết một số những trường hợp thiếu Mo có thể dẫn đến bất lực ở nam giới

Mg: Được xem là một kênh chuyển hóa Ca trong tự nhiên Khi Mg hiện diện với lượng đủ, các động mạch và tĩnh mạch phát tín hiệu làm thư giãn, giảm lưu lượng máu, oxy cũng như chất dinh dưỡng qua cơ thể [3]

Fe: Là thành phần thiết yếu của hemoglobin, giúp vận chuyển oxy từ phổi đến các tế bào trong cơ thể Ngoài ra Fe cũng là chìa khóa của hệ thống enzyme để chuyển hóa và sinh năng lượng

Ngoài ra, trong đậu đen cũng chứa P, Mn

Nhiều nghiên cứu từ Journal of Agriculture and Food Chemistry cho biết, đậu đen có chứa những hợp chất có khả năng chống oxy hóa rất tốt, đặc biệt là anthocyanins Hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin trong đậu đen gấp 10 lần lượng tương ứng tìm thấy trong quả cam và tương đương với nho hay trong cây nam việt quất [2, 6] Nghiên cứu còn cho thấy, màu của vỏ đậu càng sậm thì hoạt tính của anthocyanin càng cao Đậu đen có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất theo sau là các loại đậu như đậu đỏ, đậu vàng và đậu trắng

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Đề tài sẽ bước đầu khảo sát quy trình trích ly chất màu từ hạt đậu đen có hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH với hai dung môi rẻ tiền là nước và cồn tuyệt đối Những kết quả của đề tài hi vọng sẽ mang lại triển vọng trong việc ứng dụng các chất màu tự nhiên vào trong công nghiệp thực phẩm và nâng cao giá trị sử dụng của các nguồn nguyên liệu tại Việt Nam Góp phần đẩy mạnh công tác nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm chuyên môn Thúc đẩy phát triển lĩnh vực hóa học hợp chất thiên nhiên của bộ môn

• Khảo sát quy trình xử lý nguyên liệu đậu đen

• Xây dựng quy trình trích ly chất màu có hoạt tính kháng oxy hóa

• Thử nghiệm tạo bột màu và hoạt tính bột màu

• Đánh giá sự ảnh hưởng của các chế độ xử lý và chế biến mẫu lên màu sắc và hoạt tính kháng oxy hóa của sản phẩm

Phương pháp đánh giá

Xác định độ ẩm

Mẫu được xác định ẩm độ bằng máy đo độ ẩm OHAUS- MT45 Các thông số cài đặt:

- Nhiệt độ : 105 o C - Thời gian: 0.0 (ở chế độ mặc định, máy sẽ cho kết quả khi khối lượng mẫu không đổi)

Các thí nghiệm được thực hiện nhiều lần Độ ẩm trung bình được xác định bằng cách lấy trung bình kết quả của các lần thí nghiệm n u w n i

= = 1 (3.1) với w: độ ẩm trung bình (%); w i : độ ẩm các lần thí nghiệm (%); n: số lần thí nghiệm

Xác định hàm lượng anthocyanin theo phương pháp pH vi sai

Hàm lượng anthocyanin trong bột được xác định theo phương pháp pH vi sai và được tính quy theo cyanidin-3-glucoside Cyanidin-3-glucoside được chọn vì đây là dạng phổ biến của anthocyanin trong tự nhiên

Phương pháp pH vi sai dựa vào sự chuyển đổi thành các cấu trúc khác nhau theo pH của các sắc tố anthocyanin, và thể hiện rõ qua phổ hấp thu khác nhau tương ứng Dạng oxonium có màu tồn tại ở pH 1.0 và dạng hemiketal không màu ở pH 4.5 Phương pháp này vừa nhanh và dễ dàng định lượng được các monomer anthocyanin

Hình 3: Cấu trúc chuyển hóa giữa dạng flavylium cation (A) và hemiketal (B) R=H hay nhóm glycoside

*Hoá ch ấ t Dung dịch đệm pH 1.0:

Hòa tan hoàn toàn 1,86g KCl vào 980ml nước cất trong bình thủy Đo pH bằng máy đo pH Schott Lab85 và điều chỉnh về pH 1,0 bằng dung dịch HCl 20% Tiến hành bảo quản trong bình kín để sử dụng sau Trước khi sử dụng, nên kiểm tra và hiệu chỉnh lại pH về 1,0 để đảm bảo độ chính xác.

Hòa tan hoàn toàn 54.43g CH3CO2Na.3H2O vào 960ml nước cất trong beaker Đo pH bằng máy đo pH hiệu Schott Lab85 và chỉnh về pH 4.5 bằng dung dịch HCl 20% Bảo quản trong chai kín để sử dụng sau Trước khi sử dụng nên kiểm tra và chỉnh về pH 4.5

*Xác đị nh hàm l ượ ng anthocyanin

Xác định quang phổ hấp thu cực đại (λ vis max )

Chỉnh đường nền bằng nước cất từ bước sóng 400 đến 700nm Định mức 100ml dịch chiết vỏ đậu đen bằng nước cất Cho dịch vừa pha vào cuvet và quét qua máy quang phổ với bước sóng từ 400 đến 700nm (phổ hấp thu cực đại của anthocyanin nằm trong khoảng từ 500 đến 550nm) Bước sóng hấp thu cực đại được ghi nhận là bước sóng tại đó độ hấp thu A đo được cao nhất

Xác định độ pha loãng mẫu (DF)

Xác định độ pha loãng mẫu thích hợp bằng dung dịch đệm pH 1.0 để độ hấp thu tại bước sóng cực đại (540nm) nằm trong khoảng tuyến tính trên đồ thị quan hệ giữa độ hấp thu và hàm lượng anthocyanin (độ hấp thu thường có giá trị từ 0.2 đến 1.2)

Pha loãng mẫu theo độ pha loãng vừa xác định được bằng dung dịch đệm pH 1.0 và dung dịch đệm pH 4.5

Xác định hàm lượng anthocyanin

Dung dịch ngâm và dịch trích ly sau lọc (M d ) được pha loãng theo hệ số pha loãng DF đã xác định trước bằng dung dịch đệm pH 1,0 (M1) và dung dịch đệm pH 4,5 (M2) để mẫu đạt trạng thái cân bằng trong 15 phút.

Chỉnh điểm 0 cho máy quang phổ bằng nước cất tại các bước sóng (λ vis max ) và 700nm (độ đục của mẫu) Đo độ hấp thu của hai dung dịch M1, M2 vừa pha tại các bước sóng (λ vis max ) và 700nm

Hàm lượng anthocyanin trong dịch ngâm và dịch trích được xác định theo công thức: a dd (mg/l) = l DF MW A × × × × ε

(2.2) với: A: mật độ quang (độ hấp thu của anthocyanin)

A = (A λvis max – A 700nm ) pH 1.0 – (A λvis max – A 700nm ) pH 4.5

MW = 449.2g/mol : khối lượng phân tử của cyanidin-3-glucoside DF: độ pha loãng ; l: bề dày cuvet (cm) ε = 26900: Hệ số hấp thu phân tử của cyanidin-3-glucosdie (l.mol -1 cm -1 )

Theo dõi chất lượng màu theo phương pháp polyanthocyanin

Chất màu anthocyanin sẽ liên kết với bisulfite tạo thành dẫn xuất acid sulfonic không màu Các phức màu polymer anthocyanin- tannin chống lại tác dụng tẩy màu của bisulfite, trong khi đó, các monomer sẽ bị tẩy màu Độ hấp thu tại bước sóng 420nm của mẫu chứa bisulfite đóng vai trò là một chỉ số quá trình nâu hoá Cường độ màu là tổng độ hấp thu tại bước sóng λ vis-max và tại 420nm Tỉ số giữa chất màu bị polymer hoá và cường độ màu thể hiện phần trăm chất màu nguyên liệu bị polymer hoá

Chỉ số phân hủy các chất màu anthocyanin rất hữu ích để theo dõi chất lượng màu trong các thực phẩm ứng dụng chất màu này

Hình 4: Phản ứng giữa anthocyanin và bisulfite

Dung dịch bisulfite: Hòa tan hoàn toàn 1g K2S2O5 trong 5ml nước cất Dung dịch chỉ sử dụng trong ngày

*Xác định sự biến đổi anthocyanin

Pha loãng dịch M với nước cất theo độ pha loãng đã xác định trước (M*) Hút 2,8 ml M* vào 2 cuvet, thêm vào một cuvet 0,2 ml dung dịch bisulfit và 0,2 ml nước cất vào cuvet còn lại Để mẫu ổn định trong 15 phút và đo độ hấp thu tại bước sóng tối đa (λ vis max ), 420 nm và 700 nm.

Phần trăm độ màu polyme được tính theo công thức sau:

CD: color density (dùng cho mẫu pha với nước cất)

CD = A 420 nm − A 700 nm + A λ vis − max − A 700 nm

PC: polymeric color (dùng cho mẫu pha với dung dịch bisulfite)

PC = A 420 nm − A 700 nm + A λ vis − max − A 700 nm

Phương pháp đo màu theo hệ CIE

Tiến hành đo màu bằng máy Minolta hiệu CR- 300, Nhật Bản Dịch hoà tan (M c ) đã chuẩn bị ở phần trên được cho vào cuvet Cuvet được đặt trên một giá cố định Giá có ba mặt được phủ nền trắng và một mặt trống để tiếp xúc đầu đo

Hình 5: Giá để cuvet sử dụng khi đo màu trên máy so màu Minolta

Rót dung dịch cần đo vào cuvet, đặt vào giá Chọn hệ đơn vị sử dụng trên máy là LCh Đặt đầu đo tiếp xúc với cuvet Đo và ghi lại kết quả Thực hiện ba lần, tính giá trị trung bình

Các giá trị sai biệt được tính theo các công thức:

Với i là giá trị tại thời điểm i cần khảo sát và 0 là thời điểm ban đầu Từ các giá trị sai biệt trên, độ sai lệch màu sắc được tính toán theo công thức:

So sánh giá trị LCh giữa các mẫu để đánh giá về màu sắc của sản phẩm

Hai không gian màu thuộc hệ thống CIE được sử dụng phổ biến nhất là CIE - Lab và CIE - LCh [1, 2]

Hình 6: Không gian màu CIELab và IELCh

Trong không gian màu này L biểu thị độ sáng giống với L trong không gian màu Lab, C là cường độ màu và h là góc tông màu Giá trị góc tông màu h được xác định khởi điểm tại trục a và được tính bằng đơn vị độ L: thể hiện độ sáng, có giá trị 0- 100 (gốc tọa độ là 50)

Góc màu được biểu diễn trên vòng tròn màu, theo chiều ngược kim đồng hồ, có những giá trị đặc biệt sau:

Xác định khả năng kháng oxy hóa

*Xác định giá trị IC50 Mẫu thử:

DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM Hoà tan cao mẫu trong DMSO với 8 nồng độ anthocyanin khác nhau: 100, 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05mg/l

Cho 100àl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800àl methanol, sau đú bổ sung 100àl mẫu thử (thực hiện lần lượt cho từng nồng độ) Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517nm

Mỗi nồng độ mẫu được thử nghiệm lặp lại 2 lần để tính giá trị trung bình

Mẫu đối chiếu (ascorbic acid): Cho 100àl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800àl methanol, sau đú bổ sung 100àl dung dịch ascorbic acid

Mẫu trắng: Cho 100àl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2900àl methanol

Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517nm

Mỗi nồng độ chất đối chiếu được thử nghiệm lặp 2 lần để tính giá trị trung bình

*Xác định hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH cho từng nồng độ (sàng lọc) a.Thực hiện với mẫu thử với nồng độ anthocyanin: 1mg/l, 0.5mg/l, 0.1mg/l

DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM Hoà tan dịch ngâm và dịch chiết trong EtOH theo các nồng độ trên

Cho 100àl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800àl methanol, sau đú bổ sung 100àl mẫu thử Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phũng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517nm b.Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng

Hoà tan ascorbic acid (vitamine C) trong DMSO ở nồng độ ban đầu 3mg/ml

Mẫu đối chiếu (ascorbic acid): Cho 100àl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800àl methanol, sau đú bổ sung 100àl dung dịch ascorbic acid nồng độ 3mg/ml

Mẫu trắng: Cho 100àl dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2900àl methanol

Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517nm

Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức sau:

Trong đó: A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử A0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu

Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu

Giá trị IC 50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế (đường chuẩn được xây dựng từ 8 nồng độ khác nhau).

Nội dung thực hiện

Khảo sát sơ bộ nguyên liệu và phương pháp đánh giá

Đậu đen sử dụng từ 2 nguồn: đậu Miền nam, thu mua tại siêu thị CoopMart và đậu thu hoạch tại miền trung (Quảng Nam, Việt Nam) Đậu được sấy khô, đóng gói trong bao kim loại và hút chân không để bảo quản Đậu được ngâm trong nước (tỷ lệ đậu/nước là 1/3 (g/ml) ) và tách vỏ Vỏ đậu được chiết với

18 dung môi (tỷ lệ rắn/lỏng là 1/8 (g/ml)) tại 60 o C, lọc tách bã Cả đậu và vỏ đậu được xác định độ ẩm

Tiến hành xác định quang phổ hấp thu cực đại của dịch chiết cồn từ vỏ đậu đen để xác định peak hấp thu cực đại Mẫu được xác định hàm lượng tổng anthocyanin, sau đó pha loãng ra các nồng độ anthocyanin từ 0.05- 100mg/l Lần lượt kiểm tra khả năng kháng oxy hóa dựa trên phương pháp DPPH để từ đó chọn ra nồng độ phù hợp để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát giai đoạn sau.

Khảo sát quy trình xử lý nguyên liệu đậu đen

Đậu được ngâm trong dung môi với tỷ lệ xác định Sau thời gian ngâm thì thu dịch ngâm và đậu được tách vỏ Vỏ đậu được chiết với dung môi với tỷ lệ chiết và tại nhiệt độ, thời phù hợp (theo hệ thống trong hình…) sau đó lọc tách bã Dịch ngâm và lọc được đánh giá các chỉ tiêu như hàm lượng anthocyanin, chỉ số polyanthocyanin, màu sắc LCh và khả năng kháng oxy hoá

Phương pháp luân phiên từng biến được sử dụng trong nghiên cứu này, trong đó điều kiện được thay đổi tuần tự theo từng thí nghiệm trong khi các thông số khác được giữ cố định Quá trình này giúp đánh giá tác động của các yếu tố khác nhau lên quá trình ngâm bằng cách thay đổi từng yếu tố một cách có hệ thống và theo dõi những thay đổi kết quả.

- Nhiệt độ ngâm : 30 o C, 60 o C - Thời gian ngâm : 10h, 14h, 18h

Hình 7: Hệ thống trích ly anthocyanin

Xây dựng quy trình trích ly chất màu có hoạt tính kháng oxi hoá

Quy trình xử lý nguyên liệu và chiết dịch màu tương tự như trên phần 2.3.2 với điều kiện ngâm theo kết quả thu được từ giai đoạn khảo sát 2.3.2

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly được thay đổi để khảo sát:

- Tỉ lệ thể tích dung môi (ml): khối lượng nguyên liệu 9g) (x): 4:1, 6:1, 8:1, 10:1 - Nồng độ dung môi (y): H2O, EtOH25, EtOH50, EtOH75, EtOH100

Đánh giá sự ảnh hưởng của các chế độ xử lý và chế biến mẫu

Quy trình xử lý nguyên liệu và chiết dịch màu tương tự như trên phần 2.3.2 Đối tượng chiết màu được thử nghiệm ở các điều kiện xử lý như: ngâm không bóc vỏ, ngâm bóc vỏ, không ngâm để mô phỏng sự ảnh hưởng của các chế độ xử lý và chế biến lên màu sắc và hoạt tính của sản phẩm Ngoài ra dung môi chiết có bổ sung thêm acid citric nhằm tăng độ bền của hoạt chất anthocyanin.

Thử nghiệm tạo bột màu và hoạt tính bột màu

Quy trình xử lý nguyên liệu và chiết dịch màu tương tự như trên phần 2.3.2 với điều kiện ngâm theo kết quả thu được từ giai đoạn khảo sát 2.3.2 Để tạo bột màu, dịch được cô quay dưới điều kiện chân không đến khi loại hết dung môi

Để đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại của kết quả thí nghiệm, bột màu được bảo quản cẩn thận Trước hết, bột màu được kiểm tra độ ẩm Sau đó, bột màu được đóng gói kín để tránh ánh sáng Cuối cùng, bột màu được trữ ở nhiệt độ -5 độ C Trong mỗi thí nghiệm, các phép đo được thực hiện ba lần trong cùng điều kiện Giá trị được báo cáo là giá trị trung bình của ba lần đo.

KẾT QUẢ & BÀN LUẬN

Khảo sát sơ bộ nguyên liệu & phương pháp đánh giá

Việc sử dụng đậu đen nguyên hạt để tách chất màu gây nhiều khó khăn trong quá trình xử lý cũng như hao phí dung môi, nhiên liệu tách chiết Như các khảo sát sơ bộ trước đây của nhóm, nguồn thu chất màu hiệu quả nhất vẫn nằm ở vỏ hạt đậu đen Lõi hạt sau khi tách vỏ có thể sử dụng chế biến những dạng thực phẩm khác Đậu đen được trồng khắp nơi và mỗi vùng có đặc trưng khác nhau, ảnh hưởng đến chất lượng của chất màu thu được Đậu Quảng Nam có đặc trưng là hạt nhỏ, chắc và nhân xanh nên ngâm phải mất hơn 10h mới tách vỏ được Trong khi đó, đậu đen miền Nam hạt to hơn, vỏ dễ dàng bong ra sau khi ngâm 3- 4 giờ Có thể do cấu trúc hạt có khác biệt nên độ bám của vỏ cũng khác nhau Vỏ đậu đen miền Nam cấu trúc dễ hấp thu nước nên bong nhanh và vỏ có độ ẩm cao đến 65.24% [25] Trong khi đó, vỏ đậu Quảng Nam sau 10h ngâm, tách thì độ ẩm cũng chỉ 61.2% (bảng 3.1) Ẩm độ được xác định cho 2 dạng nguyên liệu cơ bản là đậu đen nguyên hạt và vỏ đậu đen Đồng thời tiến hành xác định độ tro của 2 dạng nguyên liệu nói trên

Bảng 2: Độ ẩm, độ tro của nguyên liệu

Chỉ tiêu Hạt đậu đen

Hình 8: Phổ hấp thu dịch chiết cồn từ vỏ đậu đen Đậu miền Nam ( chiết cồn) Đậu Quảng Nam (chiết cồn ))

400 500 700 λ (nm) Đậu Quảng Nam (ngâm)) Độ ẩm trung bình của nguyên liệu (hạt đậu đen) rất thấp 0.13% do đậu đen sau khi thu hoạch đã được hút chân không trước khi đóng gói bảo quản nhằm đảm bảo trong suốt quá trình thí nghiệm Riêng ẩm độ trung bình của vỏ đậu đen khá cao, vì vậy sau khi bóc vỏ cần sử dụng ngay để tránh làm hư hỏng nguyên liệu hay có thể bảo quản trong tủ đông ở -5 o C trong vòng 1 ngày để tránh mất mát anthocyanin có trong vỏ đậu

Kết quả quang phổ hấp thu cực đại của dịch chiết cồn từ vỏ đậu đen miền Trung cho thấy sự hiện diện của 2 bước sóng cực đại tại 540nm và 662nm.

Peak tại 540nm nằm trong khu vực màu đỏ, chính là khu vực đặc trưng của họ anthocyanin

Peak 662nm tương ứng với màu xanh, góp phần trong sự tạo ánh màu đỏ tím của hỗn hợp

Tuy nhiên vai trò tạo màu chính trong hạt đậu đen chủ yếu từ anthocyanin nên các khảo sát sẽ tập trung đánh giá tại bước sóng hấp thu cực đại λ = 540nm

So sánh giữa phổ dịch chiết cồn từ vỏ đậu của hai nguồn nguyên liệu khác nhau thì thấy có sự tương đồng ở hai peak hấp thu Tuy nhiên, với đậu đen miền Nam thì peak vùng đặc trưng của anthocyanin có độ hấp thu cao và rõ rệt hơn hẳn Sự khác nhau này có thể do thổ nhưỡng tạo nên Với dung môi chiết là cồn tuyệt đối thì dịch chiết thu được có màu tím Để đánh giá dịch chiết theo màu sắc khả kiến tổng thể, sử dụng phương pháp đo màu với hệ thống CIE- LCh

3.1.2 Đ ánh giá kh ả n ă ng kháng oxy hóa c ủ a d ị ch chi ế t màu tính trên hàm l ượ ng anthocyanin

Mẫu được xác định hàm lượng tổng anthocyanin, sau đó pha loãng ra các nồng độ anthocyanin từ 0.05- 100mg/l Lần lượt kiểm tra khả năng kháng oxy hóa dựa trên phương pháp DPPH

Vo dau den Vitamine C logC

Hình 9: So sánh khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin từ vỏ đậu đen và ascorbic acid theo phương pháp DPPH

Kết quả kiểm tra theo phương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH cho thấy khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin chiết từ vỏ đậu đen khá cao, gần tương đương với acid ascorbic Với nồng độ càng cao, khả năng kháng oxy hóa càng tăng Với các nồng độ lớn hơn 5mg/l, khả năng kháng oxy hóa gần 100% và thay đổi không đáng kể Tuy nhiên, hoạt tính kháng oxy hóa thay đổi rất lớn giữa các nồng độ 1, 0.5 và 0.01mg/l Qua xác định nồng độ ức chế 50% thu được kết quả IC50 của anthocyanin từ vỏ đậu đen khoảng 3.6mg/l (IC50 3.6 ± 0.4mg/l) thấp hơn IC50 của ascorbic acid (4.2mg/l) Dựa trên các kết quả đạt được ở trên, chọn 3 nồng độ anthocyanin 1, 0.5 và 0.1mg/l để tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa đối với từng mẫu dịch ngâm và dịch chiết

Anthocyanin là họ chất có khả năng kháng oxy hóa rất cao và chúng có mặt trong rất nhiều đối tượng thực vật Tuy nhiên, quá trình phân tách anthocyanin tinh khiết là khó khăn và tốn kém Bên cạnh đó, các chất khác đi kèm trong chiết xuất cũng có khả năng tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa Chính vì vậy khi khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa ứng với từng mẫu

22 dịch chiết, tiến hành giữ cố định 3 nồng độ 1, 0.5 và 0.1mg/l để đánh giá sự ảnh hưởng của anthocyanin theo từng điều kiện chiết cùng với ảnh hưởng của các chất đi kèm trong chiết xuất.

Khảo sát quy trình xử lý nguyên liệu đậu đen

Kết quả khảo sát tối ưu từ hạt đậu đen miền Nam [25] cho thấy, giữ nguyên điều kiện thí nghiệm, chỉ thay đổi thời gian ngâm phù hợp với đặc tính nguyên liệu Tiến hành khảo sát luân phiên để xem xét ảnh hưởng của thời gian ngâm (10, 14, 18 giờ), nhiệt độ ngâm (30 độ C, 60 độ C) và dung môi chiết (H2O, EtOH100) lên hàm lượng anthocyanin thất thoát, độ bền màu và khả năng chống oxy hóa của dịch ngâm và dịch chiết.

− Tỷ lệ ngâm nước/ đậu đen (xn) : 3/1 (ml/g)

− Nhiệt độ nước ngâm (Tn) : 30 o C, 60 o C

10 14 18 thời gian ngâm (h) a (mg/l) ngâm 30độ ngâm 60độ

Hình 10: Ảnh hưởng của thời gian ngâm lên hàm lượng anthocyanin của dịch ngâm

Hình 11: Ảnh hưởng của thời gian ngâm lên chỉ số polyanthocyanin của dịch ngâm

Khi ngâm đậu đen trong nước, có thể thấy rõ chất màu thất thoát ra đáng kể trong nước ngâm Thời gian ngâm càng tăng từ 10 đến 18h thì hàm lượng anthocyanin thất thoát ra dịch ngâm càng tăng Ngâm ở nhiệt độ cao (60 o C) làm tăng sự thất thoát anthocyanin ra nước ngâm Với thời gian ngâm 10h thì khi ngâm ở nhiệt độ cao 60 o C hàm lượng anthocyanin thất thoát ra dịch ngâm (300.15 mg/l) cao hơn khi ngâm ở nhiệt độ thường 30 o C (299.23mg/l) nhưng không đáng kể (1.003 lần) Khi tăng thời gian ngâm lên 14h và 18h thì hàm lượng anthocyanin thất thoát ra dịch ngâm tăng 1.02 lần và 1.08 lần so với khi ngâm 10h ở 30 o C và tương ứng hàm lượng anthocyanin tăng 1.05 lần và 1.2 lần so với ngâm 10h (ở 60 o C) Điều

24 này chứng tỏ khi tăng thời gian ngâm và nhiệt độ ngâm làm tăng sự thất thoát anthocyanin ra nước ngâm và tác động rất đáng kể lên hàm lượng dịch chiết

Nước ngâm thấm vào làm trương nở cấu trúc vỏ và hạt nên quá trình khuếch tán các chất ra dung môi nhiều hơn Thời gian ngâm tăng khiến dung môi càng có nhiều thời gian thấm vào tế bào vỏ đậu và lôi kéo anthocyanin đi ra dung dịch, làm cho lượng anthocyanin thất thoát ra tăng theo, chính vì vậy mà lượng anthocyanin trong dịch chiết còn lại rất thấp Sự giảm hàm lượng chất màu trong dịch chiết không chỉ do thất thoát anthocyanin ra nước ngâm mà bởi sự biến tính của anthocyanin do bản chất không bền

Thời gian ngâm lâu không chỉ làm thất thoát hàm lượng anthocyanin mà còn làm tăng chỉ số polyanthocyanin Sau thời gian ngâm khá dài 10- 18h, dịch ngâm có màu sắc xấu đi, xu hướng ngả sang màu vàng và nâu Hiện tượng này do sự polymer hóa của anthocyanin với các polyphenol khác trong hệ gây ra hiện tượng nâu hóa chất màu Hình 11cho thấy chỉ số nâu hóa của dịch ngâm tăng theo thời gian ngâm do sự biến tính anthocyanin Chỉ số nâu hóa P% tăng 1.33 lần và 1.77 lần khi tăng thời gian ngâm từ 10h lên 14h và 18h ở nhiệt độ thường 30 o C Khi tăng nhiệt độ lên 60 o C với cùng thời gian ngâm 10h thì chỉ số nâu hóa P% cũng tăng 1.44 lần Tuy nhiên khi ở cùng nhiệt độ ngâm 60 o C, thay đổi thời gian ngâm 10-18h thì chỉ số nâu hóa P% của dịch ngâm chỉ tăng 1.19 lần và 1.3 lần

Bảng 4.5: Giá trị đo màu của dịch ngâm Thời gian ngâm

Quan sát màu sắc trong dịch ngâm ở nhiệt độ 30 o C và 60 o C có thể thấy dịch ngâm ở nhiệt độ thấp có độ sáng và cường độ màu tương đương với dịch ngâm ở nhiệt độ cao Tuy nhiên theo thời gian tăng (lên đến 18h) thì có sự khác biệt rõ về góc màu h

Anthocyanin là chất tan trong nước, dưới nhiệt độ thích hợp sẽ dễ dàng đi vào dung dịch hơn Với thời gian ngắn (khoảng 10h) tốc độ thất thoát tương tự nhau thể hiện qua độ sáng L và cường độ màu C tương đương Điểm đáng lưu ý chính là khác biệt giá trị góc màu h giữa các mẫu khảo sát Thành phần hỗn hợp chiết khác biệt sẽ làm lệch giá trị h này Khi tăng thời gian ngâm từ 10- 18h thì giá trị góc màu h thay đổi đối với 2 nhiệt độ ngâm Chính vì vậy, ngâm nước nóng sẽ khơi mào, thúc đẩy cho quá trình thoát ra dung dịch của anthocyanin dễ dàng hơn và thành phần dịch ngâm khác nhau

Sự tác động nhiệt này ảnh hưởng lên chất lượng của anthocyanin thất thoát ra trong dịch ngâm Ánh màu hay góc màu h của dịch ngâm do bị tủa màu nâu của quá trình polymer hóa và phân hủy nên làm màu sắc của dịch ngâm có xu hướng mất dần ánh đỏ và ngả sang vàng nên màu sắc dịch ngâm ở 18h có sự khác biệt Đây chính là hiện tượng “browing hóa” của anthocyanin và có thể thấy rõ qua độ polymer hóa tăng Góc màu h cũng phụ thuộc vào nhiệt độ Ở nhiệt độ 30 o C hoặc 60 o C, góc màu h phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ ngâm, bởi vì có sự biến đổi hoặc phân hủy các chất trong dịch ngâm

Như vậy, nhiệt độ ngâm ảnh hưởng lớn đến sự thất thoát anthocyanin trong dịch ngâm

Tuy nhiên, sự ảnh hưởng của nhiệt độ ngâm lên lượng anthocyanin thất thoát lại phụ thuộc khá nhiều vào yếu tố thời gian ngâm Kết quả khảo sát cho thấy, nồng độ anthocyanin thất thoát nhỏ nhất là 299.23mg/l ứng với thời gian ngâm 10h ở nhiệt độ ngâm 30 o C Đậu đen hay anthocyanin từ đậu đen được đánh giá là nguồn hợp chất kháng oxy hóa cao Khảo sát cũng đánh giá khả năng kháng oxy hóa của dịch ngâm Để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần phụ, nồng độ anthocyanin tổng trong mẫu đo được đưa vào với nồng độ như nhau

30 độ- ngâm 1mg/l 30 độ- ngâm 0.5mg/l 30 độ- ngâm 0.1mg/l

60 độ- ngâm 1mg/l 60 độ- ngâm 0.5mg/l 60 độ- ngâm 0.1mg/l

Hình 12: Ảnh hưởng của thời gian ngâm lên hoạt tính kháng oxy hóa của dịch ngâm ở 30 o C và 60 o C

Theo hình 12 nhìn chung hoạt tính kháng oxy hóa có xu hướng giảm khi tăng thời gian ngâm và nhiệt độ ngâm Đối với mẫu ngâm khi xác định ở nồng độ anthocyanin là 1mg/l, hoạt tính kháng oxy hóa thay đổi không đáng kể khi thay đổi thời gian và nhiệt độ ngâm Tuy nhiên đối với mẫu ngâm có nồng độ 0.5mg/l và 0.1mg/l có thể thấy hoạt tính kháng oxy hóa thay đổi rõ rệt Khi tăng thời gian ngâm từ 10 đến 18h, hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu ngâm có nồng độ anthocyanin 0.5mg/l ở 30 o C lại giảm đến 35% (89.57- 54.49%) Tương tự với mẫu ngâm có nồng độ 0.1mg/l ở 30 o C hoạt tính kháng oxy hóa cũng giảm đi 15% (30.61- 15.62%) Ở nhiệt độ ngâm 60 o C, sự tăng thời gian ngâm cũng làm giảm hoạt tính kháng oxy hóa Điều này cho thấy khi tăng thời gian ngâm 10- 18h thì các thành phần dịch ngâm có thay đổi và ảnh hưởng đến hoạt tính tổng

Ngoài thời gian ngâm, nhiệt độ ngâm cũng tác động đáng kể đến hoạt tính chống oxy hóa Nhìn chung, giá trị chống oxy hóa của mẫu ngâm ở 60°C thấp hơn so với mẫu ngâm ở 30°C và chênh lệch từ 8-20% Sự chênh lệch này càng rõ trong các mẫu ngâm ở nồng độ anthocyanin loãng 0,5 mg/l và 0,1 mg/l.

Khảo sát kháng oxy hóa của dịch ngâm cho thấy thời gian ngâm càng lâu, nhiệt độ ngâm càng cao thì dẫn đến suy giảm hoạt tính kháng oxy hóa của dịch ngâm một cách đáng kể Nếu muốn sử dụng dịch ngâm như tác nhân tạo màu hay dịch màu có hoạt tính thì cần cân đối giữa 2 yếu tố này Kết quả cho thấy khả năng kháng oxy hóa tốt nhất là ở mẫu ngâm 10h, nhiệt độ 30 o C và đó cũng là mẫu ngâm ít thất thoát hàm lượng anthocyanin nhất

Trên cơ sở đã khảo sát hàm lượng anthocyanin (a), chỉ số polyanthocyanin (P%) và khả năng kháng oxy hóa (Q%) của dịch ngâm ứng với thay đổi nhiệt độ ngâm (30 o C, 60 o C) và thời gian ngâm (10h, 14h, 18h), tiếp tục tiến hành trích ly với dung môi H2O và EtOH

Hình 13: Hàm lượng anthocyanin của dịch chiết theo thời gian ngâm (ngâm ở 30 o C và 60 o C)

Hình 14: Chỉ số polyanthocyanin của dịch chiết theo thời gian ngâm (ngâm ở 30 o C và 60 o C)

Hình 15: Tỷ lệ phần trăm hàm lượng anthocyanin của dịch chiết

Kết quả thực nghiệm cho thấy, có sự khác biệt rõ rệt về xu hướng thoát ra của anthocyanin trong quá trình chiết khi xử lý ngâm mẫu ở nhiệt độ 30 o C và 60 o C Điều này phù hợp với kết quả của quá trình ngâm Khi tăng thời gian ngâm, lượng anthocyanin thất thoát nhiều hơn nên lượng còn lại trong quá trình chiết sẽ giảm

Khi ngâm mẫu ở 30 o C, thời gian ngâm càng dài khiến cho lượng anthocyanin chiết được trong mỗi gam vỏ đậu càng giảm Giá trị anthocyanin cực đại chiết được là 85.06mg/l (dung môi nước) và 144.28mg/l (dung môi cồn) đạt được tại tn = 10h Khi ngâm thêm 8h thì lượng anthocyanin chiết được đã giảm 1.12 lần (75.90mg/l) và 1.2 lần (119.93mg/l) tương ứng với dung môi nước và cồn so với tại 10h

Xây dựng quy trình trích ly chất màu có hoạt tính kháng oxy hóa

3.3.1 Ả nh h ưở ng n ồ ng độ c ồ n c ủ a d ị ch chi ế t Điều kiện thí nghiệm:

• Tỷ lệ trích ly (x) : 8:1 (ml:g)

• Thời gian trích ly (t) : 45phút

• Nồng độ cồn (y) : H2O, EtOH25, EtOH50, EtOH75, EtOH100

Hình 18: Ảnh hưởng của nồng độ cồn lên hàm lượng anthocyanin và chỉ số polyanthocyanin trong dịch chiết

%EtOH Q (%) chiết 1mg/l chiết 0.5mg/l chiết 0.1mg/l

Hình 19: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn lên hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết

Khảo sát cho thấy hàm lượng anthocyanin trong dịch màu có xu hướng tăng theo nồng độ cồn và đạt cực đại tại nồng độ EtOH50, sau đó giảm dần đến nồng độ EtOH100 Đồng thời, giá trị polyanthocyanin cũng có xu hướng giảm dần theo nồng độ cồn (Hình 18) Với EtOH50, hàm lượng anthocyanin trong dịch màu đạt cực đại (187.86mg/l) gấp 1.4 lần so với khi dùng EtOH100 (133.76mg/l) Chỉ số polyanthocyanin lại giảm theo nồng độ cồn trong dung môi trích ly và thay đổi không đáng kể nữa khi tăng nồng độ cồn lên hơn 50%

Sự khác biệt màu sắc ngoại quan rất rõ rệt khi thay đổi nồng độ cồn Chỉ cần có mặt EtOH dù nồng độ nhỏ, góc màu h cũng đã dịch chuyển ngay về vùng sắc đỏ (h< 35) Cường độ màu C tăng theo nồng độ cồn nhưng sắc màu tổng lại không đẹp bằng Vùng độ cồn 50- 75% cho góc màu h nhỏ, tương ứng dịch màu đỏ nhất

Anthocyanin là hợp chất tan trong H2O cho nên sử dụng H2Ogiúp anthocyanin dễ dàng thoát ra Tuy nhiên, do H2O là dung môi dễ hòa tan đường, tinh bột trong quá trình chiết tách nên cản trở nhiều quá trình thoát của anthocyanin EtOH có tính chọn lọc cao hơn nên chỉ hòa tan một số hợp chất nhất định do đó, hạn chế bớt sự hòa tan của một số thành phần tinh bột, đường có trong vỏ đậu, tạo điều kiện cho anthocyanin đi ra dễ dàng hơn, đồng thời cũng tiết kiệm dung môi hơn Chính vì thế sử dụng cùng lượng dung môi, hàm lượng anthocyanin chiết được khi sử dụng EtOH sẽ cao hơn khi dùng H2O Ngoài ra, khi tăng nồng độ EtOH sẽ làm tăng tính chọn lọc của dung môi chiết, chính vì thế càng lôi kéo được nhiều anthocyanin và hạn chế được những tạp chất khác Do đó, tăng nồng độ EtOH làm tăng lượng anthocyanin chiết ra được Khi sử dụng EtOH50 do nồng độ cồn vừa đủ để lôi kéo một lượng khá lớn anthocyanin đi ra đồng thời giúp tiết kiệm được dung môi

Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly có xu hướng giảm khi tăng nồng độ cồn Ở nồng độ anthocyanin 1 mg/l hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly ở các nồng độ EtOH75, EtOH50, EtOH25 đều lớn hơn 95% và cũng tương đương với hoạt tính của dịch chiết nước ở cùng nồng độ Độ cồn tăng dẫn đến hoạt tính kháng oxy hóa

31 giảm ở cả 3 nồng độ anthocyanin ở 1 mg/l, 0.5mg/l, 0.1mg/l Khi dung môi có nồng độ cồn từ 25- 50%, sự thay đổi hoạt tính kháng oxy hóa không nhiều Tuy nhiên, khi độ cồn tăng lên 75 và 100%, hoạt tính giảm rất mạnh Rõ rệt nhất ở thử nghiệm tại nồng độ anthocyanin là 0.1 m/l, hoạt tính kháng oxhi hóa từ vùng 34- 35% đã giảm mạnh xuống 21- 13% khi nồng độ cồn tăng lên

Như vậy qua khảo sát này dung môi có nồng độ EtOH50 là tối ưu cho quá trình trích ly dịch màu anthocyanin vì đáp ứng đầy đủ yêu cầu đặt ra là khả năng kháng oxy hóa tốt và hàm lượng anthocyanin thu được là cao nhất

3.3.2 Ả nh h ưở ng c ủ a nhi ệ t độ trích ly Điều kiện thí nghiệm

• Tỷ lệ trích ly (x) : 8:1 (ml:g)

• Thời gian trích ly (t) : 45phút

• Dung môi trích ly (y) : EtOH 50%

Hình 20: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly lên hàm lượng anthocyanin và chỉ số polyanthocyanin của dịch màu

40 60 80 90 nhiệt độ (oC) Q (%) chiết 1mg/l chiết 0.5mg/l chiết 0.1 mg/l

Hình 21: Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly theo nhiệt độ chiết

Kết quả thực nghiệm cho thấy, khi tăng nhiệt độ trích ly từ 40 o C lên 80 o C, hàm lượng anthocyanin tăng nhưng khi nhiệt độ chiết lên 90 o C khiến hàm lượng anthocyanin giảm xuống (Hình 20) Chỉ số polyanthocyanin có xu hướng tăng theo nhiệt độ chiết

Trong khoảng nhiệt độ từ 40 o C đến 60 o C hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết tăng (1.16 lần) và khi tăng nhiệt từ 60 o C lên 80 o C thì hàm lượng anthocyanin trong dịch tăng nhưng không đáng kể (1.07 lần) Hàm lượng anthocyanin đạt cực đại tại nhiệt độ chiết 80 o C (201.18mg/l) Khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 90 o C hàm lượng anthocyanin giảm mạnh 1.35 lần chỉ còn 149.09mg/l Tăng nhiệt độ trích ly khiến chỉ số polyanthocyanin của dịch trích ly cũng tăng theo Nhiệt độ thích hợp sẽ tạo điều kiện cho anthocyanin đi ra dung môi Nhiệt độ quá thấp chỉ khiến một lượng nhỏ anthocyanin có trong vỏ đậu đen đi ra, nhiệt độ cao giúp anthocyanin đi ra nhiều hơn nhưng cũng làm một lượng lớn anthocyanin vừa chiết được bị phân hủy Chính vì thế với nhiệt độ thấp như 40 o C chỉ có thể lôi kéo một lượng nhỏ

32 anthocyanin nên hàm lượng anthocyanin trong dịch màu thấp Với 60- 80 o C nhiệt độ thích hợp làm lượng anthocyanin khuếch tán tương đối lớn và không bị phân hủy nhiều do tác động của nhiệt độ Với 90 o C nhiệt độ quá cao làm cho lượng lớn anthocyanin thoát ra nhưng cũng làm phân hủy nhiều chất màu, nên hàm lượng anthocyanin còn lại giảm và nhỏ hơn cả khi chiết ở 40 o C

Nhiệt độ cao thúc đẩy quá trình polymer hóa anthocyanin làm giảm chất lượng dịch màu

Chính vì vậy với nhiệt độ chiết tăng khiến chỉ số polyanthocyanin của dịch màu cũng tăng cao Vùng nhiệt độ 60- 80 o C cho các kết quả tốt cả về hàm lượng anthocyanin lẫn chỉ số polyanthocyanin

Theo kết quả ở hình 21 thì hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết ở nồng độ anthocyanin ở 1mg/l và 0.5mg/l thay đổi không đáng kể khi tăng nhiệt độ, nhiệt độ trích ly thay đổi hầu như không làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính Riêng ở nồng độ anthocyanin là 0.1mg/l thì cho sự ảnh hưởng rõ rệt Khi tăng nhiệt độ từ 40 o C lên 60 o C thì hoạt tính kháng oxy hóa tăng lên khoảng 13%, đạt giá trị 34.87% Sau đó, khi tăng nhiệt độ lên 80 o C và 90 o C thì hoạt tính lại giảm xuống còn 30.78% và 24.69% Hai quá trình cạnh tranh phân tán vào dung dịch và sự phân hủy nhiệt xảy ra đồng thời làm cho dịch chiết có hoạt tính thay đổi

Như vậy, khi gia nhiệt ở 60 o C dù hàm lượng anthocyanin thu được không phải cao nhất trong tất cả các trường hợp khảo sát nhưng khả năng kháng oxy hóa tại nhiệt độ này tốt và ít bị ảnh hưởng của quá trình polymer hóa anthocyanin làm giảm chất lượng dịch màu Do đó, 60 o C là nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ vỏ đậu đen vừa cho hiệu quả cao vừa tiết kiệm được năng lượng

3.3.3 Ả nh h ưở ng c ủ a th ờ i gian trích ly Điều kiện thí nghiệm

• Tỷ lệ trích ly (x) : 8:1 (ml:g)

• Thời gian trích ly (T) : 30, 45, 60, 75phút

• Dung môi trích ly (y) : EtOH 50%

30 45 60 75 thời gian trích ly (phút) a (mg/l) P (% )

Hình 22: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích

30 45 60 75 thời gian trích ly (phút) Q (%) chiết 1mg/l chiết 0.5mg/l chiết 0.1mg/l

Hình 23: Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly

33 ly lên hàm lượng anthocyanin và chỉ số polyanthocyanin của dịch màu theo thời gian chiết

Thời gian trích ly tăng từ 30 đến 60phút thì hàm lượng anthocyanin có xu hướng tăng nhưng khi tăng thời gian lên 75phút hàm lượng anthocyanin gần như không tăng nữa (Hình 22) Chỉ số polyanthocyanin cũng có xu hướng tăng theo thời gian trích ly

Trong khoảng thời gian từ 30 đến 45phút hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết tăng 1.13 lần và khi tăng thời gian từ 45phút lên 60phút hàm lượng anthocyanin chỉ tăng 1.05 lần

Hàm lượng anthocyanin đạt cực đại ở thời gian chiết 60phút (197.18mg/l) Khi tiếp tục tăng thời gian chiết lên 75phút thì hàm lượng anthocyanin có xu hướng không đổi Điều này chứng tỏ thời gian chiết quá lâu cũng không làm tăng hàm lượng anthocyanin

Đánh giá sự ảnh hưởng của các chế độ xử lý và chế biến mẫu

Sau khi đã chọn điều kiện tối ưu của quá trình ngâm và chiết chất màu từ vỏ hạt đậu đen, luận văn tiếp tục khảo sát hàm lượng anthocyanin và hoạt tính kháng oxi hoá tại các điều kiện chế biến thực phẩm khác nhau Ở những thử nghiệm này có ý nghĩa đánh giá sự ảnh hưởng của các chế độ xử lý và chế biến lên màu sắc và hoạt tính của sản phẩm Đối tượng chiết màu được thử nghiệm ở các điều kiện xử lý như: ngâm không bóc vỏ, ngâm bóc vỏ, không ngâm Ngoài ra dung môi chiết có bổ sung them acid citric nhằm tăng độ bền của hoạt chất anthocyanin Điều kiện thí nghiệm:

• Tỷ lệ ngâm nước/đậu đen (xn) : 3/1 (ml/g)

• Nhiệt độ nước ngâm (Tn) : 30 o C

• Dung môi chiết : H2O, acid citric 1% (C6H8O7)

0 50 100 150 200 ngâm không bóc vỏ ngâm bóc vỏ không ngâm a(mg/l) P (%)

0 50 100 150 200 ngâm không bóc vỏ ngâm bóc vỏ không ngâm a (mg/l) P (%)

Hình 28: Ảnh hưởng của điều kiện ngâm và dung môi chiết đến hàm lượng anthocyanin và chỉ số polyanthocyanin của dịch chiết bằng nước và acid citric (từ trái qua phải)

Với 3 điều kiện xử lý mẫu khác nhau, hàm lượng anthocyanin cao nhất thu được ứng với các trường hợp chiết bằng nước so với bằng dung dịch acid citric 1% Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly bằng nước với điều kiện ngâm bóc vỏ cao gấp 3.35 lần và 3.05 lần so với ngâm không bóc vỏ và không ngâm, tương đương với dịch trích bằng acid citric là 3.05 lần và 3.26 lần Điều này một lần nữa khẳng định thành phần anthocyanin chủ yếu nằm ở lớp vỏ của hạt đậu đen và vỏ là đối tượng thích hợp nhất để chiết màu Giữa điều kiện ngâm không bóc vỏ và không ngâm, hàm lượng anthocyanin thu được tương đương nhau Như vậy khi chế biến thực phẩm, hạt đậu đen vẫn cho dịch nấu có chất lượng màu tương tự nhau dù điều kiện mẫu khác nhau Với điều kiện không ngâm, hạt đậu đen chưa được trương nở nên với cùng thời gian và nhiệt độ trích ly, hàm lượng anthocyanin thoát ra không nhiều

0 20 40 60 80 100 ngâm không bóc vỏ ngâm bóc vỏ không ngâm

0 20 40 60 80 100 ngâm không bóc vỏ ngâm bóc vỏ không ngâm

Hình 29: Ảnh hưởng của điều kiện ngâm và dung môi chiết đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết bằng nước và acid citric (từ trái qua phải)

Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly bằng dung môi nước cao hơn nhiều so với trích ly bằng dung môi acid citric Do acid citric có thể làm biến tính một số thành phần và

38 khả năng khuếch tán các hoạt chất thay đổi nên làm giảm khả năng kháng oxy hóa Đối với 2 thí nghiệm xử lý mẫu mô phỏng điều kiện chuẩn bị mẫu cho quá trình chế biến thực phẩm, chế độ xử lý mẫu không ngâm cho dịch nấu có hoạt tính cao hơn trường hợp ngâm không bóc vỏ Tuy nhiên không có sự khác biệt hoạt tính với 2 điều kiện sử dụng dung môi acid citric

Dịch trích ly bằng nước với điều kiện ngâm bóc vỏ có hoạt tính kháng oxy hóa cao gấp 2.11 lần và 2.02 lần so với ngâm không bóc vỏ và không ngâm, cao gấp 2.19 lần so với dịch trích ly bằng acid citric ở cùng điều kiện ngâm

Như vậy qua khảo sát ứng dụng cho thấy nên sử dụng dung môi là nước trong các quá trình chế biến hạt đậu đen vì nước an toàn, rẻ, dễ sử dụng và không làm mất hoạt tính kháng oxy của đậu đen Đậu đen cũng không cần phải ngâm trước khi nấu như cách xử lý đậu thông thường.

Thử nghiệm tạo bột màu và hoạt tính bột màu

Bột mảu tạo thành dạng tinh thể cứng, màu đen sậm Môi trường pH của dịch màu làm ảnh hưởng rất rõ rệt đến sắc màu cũng như tính chất vật lý của chúng

Hàm lượng anthocyanin ban đầu trong bột dịch màu đạt 11 mg/g, tương đương khoảng 1,1%, cao hơn các loại bột màu anthocyanin khác trên thị trường Tuy nhiên, sau 30 ngày, nồng độ anthocyanin giảm còn 7 mg/g (khoảng 65% so với ban đầu), đi kèm với sự tăng chỉ số nâu hóa P, góc màu h, dẫn đến sắc đỏ giảm đi Dù vậy, hoạt tính chống oxy hóa của bột màu vẫn ổn định theo thời gian, thể hiện độ bền của đặc tính này khi bảo quản.

Hình 30: Độ bền hàm lượng anthocyanin, chỉ số nâu hóa và góc màu của bột màu đậu đen

Hình 31: Độ bền khả năng kháng oxi hóa của bột màu đậu đen (tính trên khối lượng bột màu)

Như vậy, bột màu đậu đen sau 1 tháng tồn trữ ở nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng thì cũng không hạn chế được sự phân hủy và biến tính hàm lượng anthocyanin Chất lượng dịch màu sử dụng lại khi pha trong nước cũng có chút khác biệt Điểm nổi bật là tuy có biến đổi về tính chất màu và hàm lượng anthocyanin nhưng hoạt tính kháng oxy hóa lại được bảo tồn Điều này có ý nghĩa ứng dụng cao khi sử dụng bột màu như hoạt chất bổ sung vào sản phẩm để tăng hoạt tính Do điều kiện thí nghiệm hạn chế về thời gian nên các điều kiện xử lý trước khi tạo bột màu và các điều kiện tồn trữ khác chưa kịp thực hiện Các thí nghiệm này sẽ được tiến hành tiếp trong thời gian sắp tới

- Đã xây dựng quy trình trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen, nghiên cứu các thông số ảnh hưởng đến quá trình trích ly bằng nước, cồn tuyệt đối.- Thu được các điều kiện tối ưu để trích ly chất màu anthocyanin từ hạt đậu đen là sử dụng dung môi nước tỷ lệ 1:20 (m/v); thời gian trích ly 40 phút ở 90 °C; pH=3,5.- Sử dụng dung môi cồn tuyệt đối tỷ lệ 1:10 (m/v), thời gian trích ly 80 phút ở nhiệt độ 70 °C; pH=8.- Xác định được thành phần các hợp chất polyphenol, anthocyanin; xác định hàm lượng hợp chất anthocyanin, polyphenol tổng số trong cao chiết hạt đậu đen.

1.Các điều kiện để nghiên cứu và xử lý nguyên liệu:

• Quang phổ hấp thu cực đại của dịch trích ly cồn từ vỏ đậu đen là λ vis max =

• Thích hợp nhất để trích ly anthocyanin là sử dụng vỏ thay cho hạt đậu đen vì thu được dịch trích hàm lượng anthocyanin cao gấp 3.35 lần đối với dịch trích nước và gấp 3.05 lần đối với dịch trích acid citric từ hạt đậu đen

• Ở thời gian ngâm 10h và tại nhiệt độ phòng thì hàm lượng anthocyanin thất thoát trong dịch ngâm là bé nhất (299.23 mg/l)

• Trích ly bằng cồn sẽ thu được hàm lượng anthocyanin cao hơn nước

• Ở lần trích ly đầu tiên, hàm lượng anthocyanin thu được là cao nhất trên 70%, nên quy trình chỉ trích một lần

2.Các điều kiện thích hợp để trích ly dịch màu anthocyanin từ đậu đen:

• Vỏ đậu đen xử lý được trích ly với tỉ lệ trích 6/1 (g/ml) tại nhiệt độ 60oC trong thời gian 60 phút với dung môi cồn 50% đạt hàm lượng anthocyanin khoảng 300.58 mg/l và khả năng kháng oxy hóa khoảng 93.26% (ứng với nồng độ 0.5 mg/l)

• Chất màu anthocynin từ hạt đậu đậu đen qua khảo sát có khả năng tan trong các dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol

3.Khi chế biến đậu đen làm thực phẩm thì nước là dung môi thích hợp và nên nấu trực tiếp (không cần ngâm trước) để bảo toàn chất lượng màu và hoạt tính kháng oxy hóa Đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen bằng dung môi nước và cồn tuyệt đối đã hoàn thành hầu hết theo như dự định ban đầu Các kết quả thu được có giá trị nghiên cứu cũng như có thể áp dụng vào sản xuất công nghiệp vì có tính khả thi về mặt công nghệ

Trong đề tài này, hoạt chất anthocyanin và màu sắc sản phẩm được nghiên cứu với bốn thông số đáp ứng là phương pháp pH vi sai, phương pháp xác định chỉ số polymer và nâu hoá và phương pháp đo màu theo hệ CIE, phương pháp DPPH để đo hoạt tính kháng oxy hóa Các kết quả ở từng phương pháp bổ trợ cho nhau Việc áp dụng cả bốn phương pháp trên là để kiểm tra hàm lượng anthocyanin có trong dung dịch, nếu đề tài tiếp tục được phát triển theo hướng mới thì các phương pháp trên cũng được dùng để theo dõi độ bền và sự thay đổi màu sắc để đánh giá một cách tổng thể về chất lượng của dịch màu Đặc biệt đề tài đã đo hoạt tính kháng oxy hóa của dịch ứng với từng điều kiện thí nghiệm Đề tài anthocyanin ở Việt Nam đã

42 được nghiên cứu từ nhiều năm nay, mặc dù không quá mới mẻ nhưng đề tài nghiên cứu trích ly chất màu anthocyanin từ nguyên liệu đậu đen lại là một đề tài nghiên cứu mới Vì vậy, đề tài rất cần được tiếp tục nghiên cứu và triển khai trong thời gian sắp đến để có thể áp dụng vào thực tế sản xuất, mang lại một hướng đi mới cho nền công nghiệp sản xuất bột màu thực phẩm tại Việt Nam Hy vọng những nghiên cứu trong đề tài này sẽ là nền tảng cho việc nghiên cứu các đối tượng khác có hoạt chất anthocyanin tại Việt Nam

Các sản phẩm theo như hợp đồng triển khai đề tài và nội dung đăng ký:

TT Tên sản phẩm Số lượng Yêu cầu khoa học, kỹ thuật

1 Bột màu từ đậu đen 5g Đạt

2 Quy trình xử lý nguyên liệu Số liệu khảo sát Đạt 3 Quy trình trích dịch màu có hoạt tính kháng oxy hóa Số liệu khảo sát Đạt

4 Bài báo khoa học 1 bài Tạp chí khoa học chuyên ngành Đạt

Bài báo đã công bố:

Lê Thị Hồng Nhan, Phan Nguyễn Quỳnh Anh, Diệp Thanh Tùng (2012) "Khả năng kháng oxy hoá của chất màu từ đậu đen." Tạp chí Khoa Học & Công Nghệ 50(3A): 43-48

Tp.HCM, ngày tháng 03 năm 2013 Tp.HCM, ngày tháng 03 năm 2013

Chủ nhiệm đề tài TL HIỆU TRƯỞNG

(Ký và ghi rõ họ tên) TRƯỞNG PHÒNG KHCN&DA