Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình sản xuất natto đậu đen (Vigna cylindrica (L.) Skeels)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT NATTO ĐẬU ĐEN Vigna cylindrica

TỔNG QUAN

Tổng quan về natto

Nhật Bản là một trong những quốc gia có tuổi thọ cao nhất thế giới (WHO, 2016) Kết quả này được nhận định là do các yếu tố hỗ trợ sức khỏe trong chế độ ăn uống truyền thống giúp kéo dài tuổi thọ của người dân Nhật Bản Chính vì thế lối sống và chế độ ăn uống của người dân Nhật Bản đã và đang thu hút nhiều sự quan tâm của mọi người trên toàn cầu Một trong số những món ăn bổ dưỡng và được ưa thích nhất của người dân Nhật Bản phải kể đến là natto

2.1.1 Giới thiệu về sản phẩm natto

Natto, loại đậu nành lên men bởi chủng B subtilis natto, là một loại thực phẩm truyền thống được tiêu thụ thường xuyên ở Nhật Bản [9] Natto là một trong số ít sản phẩm có vi khuẩn chiếm ưu thế trong quá trình lên men Vi khuẩn dùng để lên men được xác định là B subtilis natto, một loại vi khuẩn gram dương hiếu khí có liên quan chặt chẽ với Bacillus subtilis (B subtilis) Natto thành phẩm có mùi và hương vị đặc trưng, bề ngoài được bao phủ bởi lớp nhầy (Hình 2.1) Đặc tính nhớt xuất hiện là do các polymer và sự dính là do acid glutamic từ vi sinh vật tạo ra Natto chất lượng tốt phải được bao phủ bởi chất nhầy màu trắng, hương vị đặc trưng, kết cấu mềm ngon, màu vàng nhạt, khi trộn hoặc khuấy bằng đũa sẽ tạo thành khối mịn và dính [10]

Sau khi lên men, các sản phẩm natto có thể ăn liền mà không cần đun nóng hoặc nấu chín và được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh (2 - 4ºC) hoặc tủ đông (≤ -18ºC) [5] Natto có thể được thưởng thức với nhiều nguyên liệu khác Ví dụ, trong các hộ gia đình Nhật Bản, natto truyền thống được ăn kèm với rong biển, hành tây thái lát mỏng, mù tạt và một lượng

5 nhỏ gia vị hoặc có thể ăn cùng cơm trắng như một món khai vị [11] Natto cũng có thể được sử dụng để tăng hương vị của các món thịt, rau và hải sản như một chất tạo hương vị cũng như là thành phần của nước sốt [12]

Natto có màu vàng nhạt, mùi đặc trưng và vị mềm, ẩm của đậu Khi khuấy bằng đũa, nó tạo ra chất nhầy và có thể kéo sợi dài Nếu kết hợp với các loại gia vị thích hợp sẽ tạo ra hương vị độc đáo, được người dân Nhật Bản vô cùng yêu thích và coi là một món ăn có hương vị thiết yếu Natto có lịch sử khoảng 1000 năm, có ý kiến cho rằng nó có nguồn gốc từ Trung Quốc và du nhập vào Nhật Bản thời nhà Đường Ban đầu, natto được lên men bởi vi khuẩn B subtilis natto trên rơm và được làm trong bếp chùa, là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho nhà sư và hoàng gia Nhật Bản Sau Minh Trị Duy Tân, natto dần trở nên phổ biến hơn đối với người dân Nhật Bản Năm 1980, Tiến sĩ Hiroyuki Sumi phát hiện enzyme nattokinase trong natto có khả năng làm tan huyết khối [13] Natto sau đó được sản xuất công nghiệp, và từ năm 1996, chính phủ Nhật Bản khuyến khích ăn natto, góp phần cải thiện chiều cao và tuổi thọ người dân Theo Thống kê Y tế Thế giới năm 2018, Nhật Bản có tuổi thọ trung bình cao nhất thế giới, đạt 84 tuổi, trong đó tuổi thọ của nữ là 87 tuổi và của nam là 81 tuổi [14] Chính nhờ việc sử dụng thực phẩm lên men truyền thống “natto” đã giúp Nhật Bản trở thành quốc gia có dân số sống lâu nhất thế giới

Có 3 loại natto chính: itohiki natto, hamanatto và daitokuji Itohiki-natto là loại phổ biến nhất và được sản xuất với số lượng lớn Thuật ngữ "natto" thường được dùng để chỉ loại itohiki-natto Itohiki natto được chế biến bằng cách cấy vi khuẩn và ủ trong 24 giờ, mà không cần thêm muối Hamanatto và daitokuji được chế biến bằng cách cấy nấm mốc, ủ trong 3 đến 6 tháng và có thêm muối Trước Thế chiến thứ hai, cơ sở hạ tầng giao thông không được phát triển tốt ở Nhật Bản Do đó, các loại natto khô, cứng, có thời hạn sử dụng lâu, thường được sản xuất và tiêu thụ [12] Trong ba loại natto, itohiki-natto là loại phổ biến nhất hiện nay ở Nhật Bản

2.1.4 Quy trình sản xuất natto

Sản xuất natto bao gồm các bước cơ bản sau: rửa sạch và ngâm đậu nành nguyên hạt qua đêm trong nước Sau đó, hạt được nấu trong 20 - 30 phút ở áp suất hơi 0,98 - 1,47 Bar

6 Đậu nấu chín được làm nguội đến 45°C trước khi được cấy một chủng vi khuẩn probiotic, sau đó natto được lên men trong 18 - 24 giờ ở 40 - 45°C [15]

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng và lợi ích đến sức khỏe của natto

2.1.5.1 Giá trị dinh dưỡng của natto

Natto là sản phẩm có giá thành rẻ nhưng có hàm lượng dinh dưỡng cao sử dụng quy trình đơn giản và truyền thống nên mỗi hộ gia đình đều có thể tự thực hiện để thưởng thức

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của natto trên 175g sản phẩm

Thành phần Hàm lượng %Chất khô

Tổng chất xơ hòa tan 9,5g 25,00% Đường tổng 8,56g N/D

Natto được xếp vào nhóm "đậu và các sản phẩm từ đậu" Natto có nhiều loại carbohydrate Mỗi loại đều có nhiều ưu điểm riêng Trong đó đặc biệt có thể kể đến là chất xơ Natto còn là thực phẩm giàu protein Vì lượng protein được khuyến nghị chung trong chế độ ăn uống hàng ngày (RDA) cho người lớn là 0,8 g/kg/ngày, nên ăn natto ba bữa một ngày có thể được coi là cung cấp đủ lượng protein cần thiết cho một người Điều đó cũng cho thấy rằng natto là một nguồn protein bổ dưỡng và hữu ích [7]

Không những thế, natto còn chứa một nguồn vi chất dinh dưỡng dồi dào Thực phẩm natto cung cấp 13,0 mg vitamin C, 8,60mg sắt, 729mg kali và 217mg canxi,…Bên cạnh đó, natto còn chứa vitamin và các hợp chất quan trọng khác giúp tăng cường hệ thống miễn dịch [17] Hàm lượng vitamin K2 trong natto vượt quá 880 mg/100 g (gấp 124 lần so với đậu nành trước khi lên men), làm cho nó trở thành một loại thực phẩm lên men rất đặc biệt với hàm lượng vitamin K2 cao nhất thế giới [17]

2.1.5.2 Lợi ích sức khỏe của natto

Ngoài hương vị độc đáo và cách sản xuất tiện lợi, natto còn có nhiều tác dụng dinh dưỡng và hỗ trợ sức khỏe như chống tăng huyết áp [18], ức chế lipoprotein mật độ thấp (LDL), chống oxy hóa [19], làm tan huyết khối [20], chống đái tháo đường [21], chống lão hóa [22], giảm tỷ lệ tử vong do các bệnh về tim mạch[23], Natto chứa NK, isoflavone đậu nành, γ-polyglutamic acid (γ-PGA), vitamin K2, polypeptide phân tử nhỏ, Vì vậy, natto được mệnh danh là “thực phẩm siêu tốt cho sức khỏe” Chính bởi những tác dụng tăng cường sức khỏe mà natto mang lại đã thu hút sự chú ý của người dân trên toàn cầu và natto cũng được ví như một thực phẩm giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ [24]

Nattokinase là một loại enzyme serine protease [25] bền nhiệt và ổn định pH Nó có thể chịu được nhiệt độ lên đến 60 o C và khoảng pH từ 6 – 12 [26] NK có ít tác dụng phụ và ổn định hơn so với các dược phẩm tan huyết khối khác [27] Nó được sử dụng để điều trị bệnh tim mạch [28] và giảm nguy cơ bệnh Alzheimer [29], xơ vữa động mạch, đau tim và đột quỵ [30] Isoflavone đậu nành trong natto có đặc tính chống oxy hóa, giúp ngăn ngừa ung thư [31] và các bệnh mãn kinh [32], tim mạch, béo phì, tiểu đường và Alzheimer, nhiễm virus [32] Vitamin K2 trong natto ngăn chặn vôi hóa mạch máu, ngăn ngừa xơ cứng động mạch và xơ gan, và giúp tăng mật độ xương [14] Chất nhầy natto giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, bảo vệ hệ tiêu hóa và ngăn ngừa các bệnh tiêu hóa [14] Polyamines trong natto có lợi cho việc ngăn ngừa bệnh lão hóa, nhưng uống quá nhiều có thể gây hại [33]

2.1.6 Tình hình tiêu thụ natto trên thị trường

Từ xa xưa, natto đã xuất hiện trong ẩm thực Nhật Bản, mang lại nhiều lợi ích dinh dưỡng và y học Ngành công nghiệp natto tại Nhật rất phát triển, với nhiều sản phẩm đa dạng phù hợp thị hiếu vùng miền Các thương hiệu phổ biến như: Natto Okame (87.000 VND/ 45g×3 hộp), Hikiwari Natto Tokyo Derica (150.000 VND/ 300g/ gói), Natto Nattohya (85.000 VND/ 45g×3 hộp), Natto Furusato (52.000 VND/ 45g×3 hộp), Natto Asaichiban (65.000 VND/ 45g×3 hộp),…Và đặc biệt, natto được bán ở hình dạng nguyên thủy trong bó rơm có giá thành mắc hơn natto dạng hộp PSP, còn được coi là sản phẩm cao cấp ở Nhật Bản Natto có nhiều lợi ích như ngăn ngừa huyết khối, giảm cholesterol, điều hòa đường ruột, thúc đẩy hấp thu calcium, chống lão hóa và ngăn ngừa loãng xương Các sản phẩm chức năng chứa natto tồn tại dưới nhiều dạng như viên nén, dung dịch, bột khô

Natto ngày càng được tiêu thụ rộng rãi ở Hoa Kỳ, Canada, Úc, Châu Âu và một số nước Châu Á khác Sản xuất natto đòi hỏi quy trình đặc biệt với vi khuẩn Bacillus subtilis natto Sản phẩm natto có thể xuất khẩu từ Nhật Bản hoặc các quốc gia khác Ở Việt Nam, natto chưa phổ biến do hương vị đặc trưng của sản phẩm này Tuy nhiên, lợi ích vượt trội của natto đã thu hút được sự quan tâm của người tiêu dùng Natto chỉ có tại các cửa hàng chuyên bán đồ Nhật hoặc khu vực có nhiều người Nhật sinh sống Các cửa hàng bán natto ở Việt Nam gồm Ribeto Gyomu Japan, Nam An Market, Tèobokki Công Ty TNHH Thương Mại Anphaco là nhà sản xuất natto tươi tại Việt Nam, với giá 35.000 VND/100g Công ty này cũng sản xuất men natto, natto đậu gà sấy khô, natto viên tía tô và bột đậu tương lên men

Hình 2.2: Một số sản phẩm natto trên thị trường.

Tổng quan về nguyên liệu

2.2.1.1 Giới thiệu về đậu đen Đậu đen (Tên khoa học: Vigna cylindrica ( L.) Skeels) là cây thuộc giới: Plantae; ngành: Magnoliophyta; lớp: Magnoliopsida; bộ: Fabales; họ: Fabaceae; chi: Vigna; loài: V ungiuculata (L.) Walp [34] Hạt đậu đen có tên gọi khác là ô đậu, hắc đại đại, hương xị, hay đậu rùa do lớp vỏ cứng màu đen bọc bên ngoài hạt đậu, tên tiếng anh của đậu đen là cowpea hay black bean Đậu đen được coi là có nguồn gốc ở Châu Phi [35], người dân ở châu lục này đã thuần hóa và trồng đậu trong nhiều thập kỷ để lấy protein cho bản thân và thức ăn chăn nuôi [36] Trong gần 6000 năm, cây đậu đã được sử dụng rộng rãi như một nguồn protein chính và rẻ trên khắp Châu Phi Nó đã dần dần xâm nhập vào chế độ ăn uống của

9 mọi người trên toàn thế giới [36] Từ Châu Phi cây đậu đen đã lan rộng khắp Châu Mỹ Latinh và Đông Nam Á [36] Ngày nay, đậu đen được trồng khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trên khắp Châu Á và Thái Bình Dương, Trung Đông, Nam Âu, Châu Phi, Nam Hoa Kỳ, Trung và Nam Mỹ [37] Đậu đen là cây trồng vụ mùa ấm áp, thích nghi tốt với nhiều vùng thuộc vùng nhiệt đới ẩm và vùng ôn đới ẩm, nơi có nhiệt độ trung bình hàng năm thay đổi từ 25°C đến 35°C Cây đậu chịu được nhiệt độ và điều kiện khô ráo, nhưng nhạy cảm với trời có sương lạnh [35] Cây sinh trưởng tốt trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng phát triển tốt nhất trên đất thịt pha cát, đất có khả năng thoát nước tốt hoặc đất có độ pH nằm trong khoảng 5,5 – 6,5 Cây không chịu được vùng có lũ lụt kéo dài hoặc nhiễm mặn Độ ẩm đất quá mức sẽ cản trở sự phát triển và thúc đẩy sự lây nhiễm của các bệnh nấm từ đất lên cây đậu đen Cây đậu thường được trồng làm cây phân xanh trên đất nghèo dinh dưỡng vì chúng có tác dụng làm giàu nitơ cho đất [37]

Hình 2.3: Đậu đen Đậu đen là loại cây dễ trồng, chăm sóc đơn giản, vốn đầu tư ban đầu thấp, thời gian thu hoạch ngắn hạn nên mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân Cây đậu đen có thể trồng quanh năm, nhưng để đạt năng suất cao thì ở Việt Nam cây sẽ được trồng vào hai thời vụ chính là tháng 2 đến tháng 6 và tháng 11 đến tháng 12 trong năm [38] Đậu đen được trồng phổ biến ở các tỉnh duyên hải miền Trung và vùng đất Tây Nguyên

2.2.1.2 Hình thái cây đậu đen

T.K Lim (2012) đã mô tả về đậu đen là một loại cây thân thảo phát triển quanh năm [37] Cây đậu đạt chiều cao lên tới 80 – 100 cm, phân chia mạnh mẽ thành nhiều nhánh, với

10 hệ thống rễ cái khỏe và nhiều nhánh rễ lan rộng trên bề mặt đất [34] Cây có 3 lá chét màu xanh đậm, hình bầu dục và mọc so le với nhau Hoa của cây đậu đen mọc ra từ nách lá, có màu tím nhạt đến màu trắng [34] Quả thường mọc thành chùm có 2 quả tạo hình chữ V, quả có hình trụ dài 6-15 cm với đường kính tròn 3-12 mm, bên trong quả có chứa từ 7-10 hạt đậu đen tạo cho quả có một vẻ ngoài đính cườm (Hình 2.4) Quả sẽ chuyển từ màu xanh sang vàng nâu khi chín và có thể tiến hành thu hoạch Khi các hạt sắp xếp thưa trong quả qua quá trình phát triển hạt đậu đen sẽ có hình dáng dạng thận Nhưng khi mật độ dày đặc trong vỏ tăng lên, hạt sẽ trở thành hình cầu Hạt đậu đen có lớp vỏ màu đen và nhân bên trong màu trắng hoặc màu xanh [34] Do đó, có hai loại đậu đen, là đậu đen lòng trắng và đậu đen lòng xanh có giá trị dinh dưỡng tương đương nhau

Hình 2.4: Hình thái cây đậu đen [34]

Hạt đậu đen chứa một lượng đáng kể carbohydrate, protein, lipid, khoáng chất và vitamin, là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho con người [36] Carbohydrate là thành phần chủ yếu trong hạt đậu đen chiếm tới 50 – 60%, protein chiếm 23 – 32% và chất béo ít hơn 1% [36] (Bảng 2.2) Hạt đậu đen có hàm lượng protein cao gấp 2 đến 4 lần so với ngũ cốc và cây lấy củ, đồng thời có hàm lượng lysine cao [36] Hạt đậu đen có nguồn acid amin như tyrosine, tryptophan, lysine và chứa một lượng đáng kể histidine, phenylalanine và cysteine [36] Sự thay đổi hàm lượng protein có thể là do các yếu tố môi trường, chẳng hạn như vị trí địa lý và mùa sinh trưởng, hay kiểu gen [39] Với thành phần dinh dưỡng tương đương với nhiều loại đậu khác thì đậu đen có giá thành rẻ hơn Do đó, đậu đen có thể được coi là một thực phẩm dinh dưỡng cần thiết trong chế độ ăn uống của con người

Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng của đậu đen

Nguồn: [37] Đặc biệt, hàm lượng khoáng chất (Ca, Fe, Zn,…), các loại vitamin, các acid amin cần thiết cho dinh dưỡng con người có trong đậu đen cao và hàm lượng chất chống oxy hóa cũng rất cao [34] Cây đậu đen có thành phần chất xơ, các vitamin quan trọng như phức hợp vitamin B, acid folic và vitamin K giúp tăng cường sức khỏe Hạt đậu đen được phát hiện là nguồn giàu khoáng chất như potassium, calcium, phosphorous, zinc và iron (Bảng 2.2) khi so sánh với khẩu phần ăn được khuyến nghị (NRC/NAS 1989) Các hợp chất có hoạt tính sinh học như phenolic, tocopherol, peptide, acid amin, chất xơ, tinh bột kháng, acid béo không bão hòa là những hợp chất quan trọng có trong đậu và có thể cung cấp khi sử dụng Acid amin cần thiết cho dinh dưỡng con người có trong đậu đen rất cao gồm lysin, metionin, tryptophan, phenylalanin, alanin, valin, leucin Màu sắc của vỏ đậu có màu đen là kết quả của quá trình sinh tổng hợp anthocyanin Các nghiên cứu trước đây cho thấy hàm lượng flavonol trong đậu đen cao bao gồm anthocyanin, quercetin và procyanindin Ngoài ra, màu

12 vỏ hạt là yếu tố chính quyết định sự hình thành flavonoid [34] Các thành phần phenolics và carotenoids cũng như sắc tố anthocyanin tham gia và duy trì quá trình đồng hóa và dị hóa tốt

Khả năng chấp nhận và sử dụng cây họ đậu nói chung của hạt đậu đen nói riêng đã bị hạn chế do sự hiện diện của một số yếu tố kháng dinh dưỡng nhất định, hiện diện ở mức độ khác nhau Acid phytic có đặc tính kháng dinh dưỡng vì nó có khả năng làm giảm khả năng sử dụng sinh học của các khoáng chất thiết yếu và tạo thành phức chất với protein, do đó ức chế quá trình tiêu hóa enzyme của các chất [40] Hạt chứa tổng lượng phenol tự do và tannin tự do tương đối cao hơn, lần lượt là 1,9 và 5,6 g/100 g so với các loại đậu được trồng phổ biến [40] Phenolics và tannin được biết là có tác dụng ức chế hoạt động của các enzyme tiêu hóa và do đó, sự hiện diện của tannin và phenolics ở mức độ thấp là không mong muốn khi xét theo quan điểm dinh dưỡng Tuy nhiên, tất cả các chất kháng dinh dưỡng như acid phytic, tanin,… đều không bền với nhiệt Do đó chúng có thể được loại bỏ bằng cách xử lý nhiệt ướt hoặc khô, quá trình ngâm và nấu được biết là làm giảm đáng kể aicd phytic, phenolics và tannin [40]

Hạt đậu đen mang lại giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein, carbohydrate, vitamin và khoáng chất Giá trị dinh dưỡng của hạt đậu đen ngày càng được để ý đến do khả năng trồng trọt dễ dàng ngay cả ở những vùng đất thiếu dinh dưỡng hoặc ít khoáng chất Những loại đậu này có chứa acid phytic và một số chất ức chế trao đổi chất làm giảm giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số phương pháp như ngâm, lên men hấp, nảy mầm hạt và giai đoạn tách vỏ được sử dụng để giảm thiểu lượng chất kháng dinh dưỡng của đậu nhằm làm tăng khả năng dinh dưỡng của đậu đen khi sử dụng [40]

2.2.2 Vi sinh vật Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí, thuộc giới: Bacteria; ngành: Firmicutes; lớp: Bacilli; bộ: Bacillales; họ: Bacillaceae; giống: Bacillus; loài: Subtilis (Keith H

Steinlraus, 2004)[41] Theo hệ thống phân loại hiện nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài và các loài phụ dưới loài [42]

Năm 1913, Tiến sĩ S Sawamura phân lập trực khuẩn natto và đặt tên là Bacillus natto

(B natto) [43] Năm 1928, Giáo sư J Hanzawa từ Đại học Hoàng gia Hokkaido đã sản xuất và tiêu thụ natto thương mại đầu tiên từ chủng B natto thuần khiết [43] Đến năm 1957, B natto được xác nhận là một chủng của B subtilis [43] Các nhà khoa học Nhật Bản gọi nó là

B subtilis natto để phân biệt với các chủng B subtilis khác Tuy nhiên do với những đặc tính mong muốn ở natto thành phẩm chỉ có thể được sản xuất bằng chủng B Natto [44]

2.2.2.3 Hình dạng vi khuẩn và hình thái khuẩn lạc

B subtilis natto là vi khuẩn hiểu khí gram dương, phát triển nhanh, có tế bào hình que thường dài 2-6 àm và cú đường kớnh dưới 1 àm So với cỏc tế bào nuụi cấy khỏc, B subtilis natto có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn đáng kể, trong điều kiện nuôi cấy với tốc độ nhân đôi trong khoảng 20 phút ở 30 - 35°C [45]

Hình 2.5: Hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus subtilis var natto phân lập được sau

48 giờ nuôi trên môi trường King’B rắn

Hình 2.6: B subtilis natto dưới kính hiển vi và khuẩn lạc của nó trên môi trường thạch máu

2.2.2.4 Đặc điểm của vi sinh vật Đặc điểm sinh lý

B subtilis natto là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3% B subtilis natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30

- 50 o C), tối thích là 37 o C Ở 55 o C, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra Nó có khả năng sinh nội bào tử, một dạng nghỉ của tế bào để giúp vi khuẩn có thể chống chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi của môi trường như khô hạn và thiếu dinh dưỡng [46] Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40 o C, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0 o C B subtilis natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6 Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [2] Trong những điều kiện tăng trưởng nhất định, các tế bào tạo thành chuỗi dài kết nối với các thành phần vách ngăn không xác định Trong điều kiện khắc nghiệt, thiếu chất dinh dưỡng, tế bào có thể trải qua quá trình phân chia hai tế bào phức tạp dẫn đến việc tạo ra nội bào tử; sự hình thành này được tạo ra bằng cách ly giải tế bào mẹ [47] Đặc điểm sinh hóa

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Natto ngày càng thu hút sự chú ý toàn cầu nhờ giá trị dinh dưỡng và lợi ích sức khỏe như khả năng chống lão hóa, ngăn ngừa bệnh tật Do đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để cải tiến và phát triển natto Năm 2010, Yongjin Hu và cộng sự đã nghiên cứu lên men đậu nành đen với B subtilis natto, cho thấy có sự tăng đáng kể độ ẩm, độ nhớt, màu sắc, polyphenol và anthocyanin, và giảm độ cứng sau 48 giờ lên men [5] Sự thay đổi của protease tiêu fibrin, caseinolytic, hoạt tính β-glucosidase, cũng được thể hiện trong bài báo cáo Kết quả cho thấy natto đậu nành đen có tiềm năng trở thành thực phẩm chức năng nhờ hoạt tính chống oxy hóa [5] Năm 2017, Fuzhong Zhou và cộng sự nghiên cứu lên men đậu gà để sản xuất nattokinase Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là độ ẩm 64%, pH 7,0, 31ºC, và thời gian lên men 36 giờ, đạt hoạt tính enzyme nattokinase cao [61] Nghiên cứu của dự án này cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất nattokinase hoạt tính cao sử dụng đậu gà làm nguyên liệu thô [61] Năm 2015, Ying-ying Ma và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sản xuất và bảo quản natto [62] Kết quả cho thấy thông số kỹ thuật sản xuất tối ưu là nhiệt độ nuôi cấy 39ºC, thời gian lên men 13 giờ và men cấy 11% và sử dụng lượng phụ gia natri benzoat là 0,25 g/kg natto [62] Cũng trong năm 2015, Shuang Jin và cộng sự nghiên cứu sản xuất natto pigeon pea với Bacillus natto cố định, đạt hoạt tính tiêu sợi huyết cao hơn và đánh giá cảm quan tốt hơn, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong ngành nông nghiệp thực phẩm và mở rộng quy mô sản xuất [63]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Natto không phổ biến trong ẩm thực Việt Nam và sản xuất còn hạn chế do hương vị và mùi lên men đặc trưng khiến cho sản phẩm này khó được đón nhận Tuy nhiên, lợi ích sức khỏe vượt trội của natto đang ngày càng thu hút được sự chú ý của người tiêu dùng quan tâm đến sức khỏe Năm 2013, Bùi Thị Nhung nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase dạng bột khô từ B subtilis trong natto Nhật Bản, xác định điều kiện lên men và

17 nghiên cứu một số đặc tính của protease đã tinh sạch sơ bộ [64] Năm 2020, Đoàn Thị Ngọc Thanh và cộng sự nghiên cứu đặc tính probiotic và khả năng làm tan huyết của B subtilis natto phân lập tại Việt Nam, cho thấy tiềm năng sản xuất probiotic và chất bổ sung thực phẩm chức năng [52] Năm 2014, Bùi Thị Nhung và Nguyễn Hữu Phúc phân lập vi khuẩn

B subtilis natto, chọn ra hai chủng B subtilis N18 và B subtilis N441 để sản xuất natto và enzyme giàu nattokinase tại Việt Nam [65] Năm 2017, Nguyễn Thị Minh Nguyệt và cộng sự xây dựng mô hình toán học tối ưu cho quá trình lên men natto thu nhận enzyme nattokinase, giúp Việt Nam chủ động nguồn enzyme cho nghiên cứu và sản xuất trong tương lai [4]

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng

3.1.1 Đậu đen Đậu đen được sử dụng trong bài nghiên cứu của Công Ty TNHH Thương Mại Dịch

Hình 3.1: Đậu đen Xuân Hồng 3.1.2 Vi khuẩn lên men

Chủng men Bacillus subtilis natto được sử dụng trong bài nghiên cứu là của thương hiệu Kawashimaya, có nguồn gốc xuất xứ từ Nhật Bản

Hình 3.2: Chủng khởi động Bacillus subtilis natto 3.1.3 Thiết bị thí nghiệm

Cân kỹ thuật 2 số lẻ Precisa LS3200C (Thụy Sĩ), cân kỹ thuật 4 số lẻ Precisa LS220A (Thụy Sĩ), máy ly tâm HermLe Z366 (Đức), máy ly tâm Hettich EBA 21 (Đức), máy quang phổ UH5300 UV-Vis Spectrophotometer Hitachi (Nhật Bản), nồi áp suất SUNHOUSE SH1550 (Trung Quốc), máy đo cấu trúc Brookfield Ametek CT3-1500-230 (USA), máy đo

19 lưu biến Thermo Scientific HAAKE RotoVisco 1, máy tiệt trùng ALP Model CL-40M (Nhật Bản), lò nung, tủ sấy, tủ ủ, tủ lạnh, bếp hồng ngoại

Thuốc thử Folin-Ciocalteu′s phenol reagent (Đức), Pepton (Trung Quốc), D-glucose (C6H12O6, Trung Quốc), Sodium carbonate (Na2CO3, Trung Quốc), Methanol (CH3OH, Trung Quốc), Sulfuric acid (H2SO4, Trung Quốc), 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Nhật Bản), L(+)-Ascorbic Acid (C6H8O6, Trung Quốc), Trichloroacetic Acid (C2HCl3O2, Trung Quốc), Casein (Trung Quốc), L-Tyrosine (Trung Quốc), Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O, Trung Quốc), Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4, Trung Quốc), Sodium hydroxide (NaOH, Trung Quốc), Dipotassium sulfate (K2SO4, Trung Quốc), Copper sulfate (CuSO4, Trung Quốc), Sulfuric acid (H2SO4, 95 - 98%, Trung Quốc), Petroleum ether (Trung Quốc), Diethyl ether (C2H6O, Trung Quốc).

Nội dung nghiên cứu

Hình 3.3: Sơ đồ nghiên cứu Đậu đen hạt

Xác định thành phần nguyên liệu

Xác định độ ẩm, hàm lượng protein, lipid, carbohydrate, tro, ẩm

Xác định chỉ số đo màu, tổng polyphenol, DPPH

TN 1: Khảo sát nhiệt độ môi trường lên men

Khảo sát nhiệt độ lên men: 35ºC, 40ºC, 45ºC, 50ºC Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, hoạt độ protease, độ cứng và độ nhớt

TN 2: Khảo sát tỉ lệ men giống

Tỉ lệ men vi sinh: 0,02%; 0,05%; 0,08%; 0,12% Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, hoạt độ protease, độ cứng và độ nhớt

TN 3: Ảnh hưởng của hàm lượng nước đến quá trình lên men

Hàm lượng nước lên men: 12% v/w; 15% v/w; 18% v/w; 22% v/w Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, hoạt độ protease, độ cứng và độ nhớt

TN 4: Khảo sát thời gian lên men

Thời gian lên men: 15 giờ, 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, hoạt độ protease, độ cứng và độ nhớt Đánh giá chất lượng sản phẩm natto đậu đen

Xác định các thành phần hóa học của sản phẩm natto đậu đen: độ ẩm, hàm lượng protein, lipid, carbohydrate và tro

Xác định độ cứng, độ nhớt, chỉ số đo màu, hoạt độ protease, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng hàm lượng polyphenol, DPPH và đánh giá cảm quan Đánh giá chất lượng sản phẩm trong thời gian bảo quản Đánh giá cảm quan, hoạt độ protease và độ nhớt trong các mẫu sau 5 ngày bảo quản

3.2.2 Quy trình sản xuất Natto từ đậu đen

3.2.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất

Hình 3.4: Sơ đồ quy trình sản xuất natto đậu đen Đậu đen

Hấp áp suất Để ráo

Cấy vi sinh vật Ủ lên men

Hàm lượng nước bố trí theo TN 3

Nhiệt độ và thời gian bố trí theo TN 1 và TN 4

Tỉ lệ men cấy bố trí theo TN 2

3.2.2.2 Thuyết minh quy trình công nghệ

Mục đích: Nhằm đảm bảo chất lượng đồng đều của hạt đậu đen, loại bỏ những hạt đậu không đạt yêu cầu và chỉ tiêu chất lượng, như hạt vỡ, hạt bị đục khoét, hạt lép, hạt có màu khác lạ,…Giúp tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm cuối [66]

Cách tiến hành: Hạt đậu đen đạt yêu cầu phải thỏa mãn các yêu cầu như: hạt nguyên vẹn, màu sắc đặc trưng của hạt đậu đen, hạt có kích thước đồng đều

Mục đích: Loại bỏ các tạp chất cơ học như cát, bụi,…từ quá trình sản xuất hoặc bảo quản nguyên liệu và làm giảm lượng vi sinh vật bên ngoài hạt đậu đen [66]

Cách tiến hành: Rửa sạch hạt đậu đen bằng nước sạch từ 3-4 lần

Mục tiêu: Giúp hạt đậu đen trở nên mềm hơn, tăng hiệu suất cho quá trình hấp tiếp theo Quá trình ngâm làm hạt hút nước, trương nở từ đó kích thước và khối lượng hạt tăng lên [66]

Cách tiến hành: Ngâm ngập hạt trong nước với tỉ lệ đậu : nước là 1:3 (w/w) thời gian

8 giờ, mỗi 3 tiếng thay nước mới một lần [66]

Mục tiêu: Làm chín hạt đậu đen giúp trở nên trương nở và mềm hơn, ức chế hoạt động của hệ vi sinh vật và enzyme, từ đó kéo dài thời gian bảo quản [66]

Cách thực hiện: Cho hạt đậu đen sau khi ráo nước vào nồi hấp, để hạt cách mặt nước khoảng 1 - 2 cm để hạn chế khi nước sôi làm các hạt va chạm nhau gây vỡ, nát hạt Thực hiện cài đặt chế độ hấp, giữ áp suất ở 80kPa trong vòng 20 phút để hạt ngậm nước hoàn toàn

Mục tiêu: Chuẩn bị cho quá trình lên men Khởi động chủng vi sinh vật Bacillus subtilis natto trên hạt đậu đen

Cách thực hiện: Cấy giống được thực hiện trong môi trường vô trùng Dụng cụ cấy sẽ được tiệt trùng ở 121ºC trong vòng 20 phút, và UV trước khi cấy 20 phút Để hạn chế sự phát triển của vi sinh vật ngoại lai Hoạt hóa vi khuẩn bằng nước cất đã được tiệt trùng Ủ lên men

Mục tiêu: Ổn định điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh trưởng và phát triển để hoàn thiện các tính chất đặc trưng của sản phẩm natto đậu đen

Cách thực hiện: Ổn định tủ ủ ở nhiệt độ khảo sát 1 - 2 giờ trước khi quá trình ủ lên men được bắt đầu Thực hiện kiểm tra nhiệt độ tủ ủ thường xuyên bằng cảm biến nhiệt, để đảm bảo nhiệt độ được ổn định trong quá trình lên men

Mục tiêu: Ức chế sự hoạt động của vi sinh vật từ đó giữ được những tính chất cảm quan đặc trưng và kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm natto đậu đen [66], [67]

Cách thực hiện: Sau khi kết thúc quá trình lên men thực hiện bảo quản natto đậu đen ở nhiệt độ dưới -18ºC [67]

Thí nghiệm 1 (TN1): Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến quá trình lên men natto

Mục đích: Xác định nhiệt độ lên men phù hợp với sản phẩm natto đậu đen

Yếu tố cố định: Thời gian lên men 24 giờ, lượng men bổ sung 0,05% và lượng nước bổ sung 15% v/w

Yếu tố thay đổi: Nhiệt độ lên men: 35 o C, 40 o C, 45 o C, 50 o C

Yếu tố đánh giá: Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, hoạt độ protease, độ cứng và độ nhớt

Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lên men natto đậu đen

Thí nghiệm 2 (TN2): Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ men cấy đến quá trình lên men natto

Mục đích: Xác định lượng men lên men phù hợp với sản phẩm natto đậu đen

Yếu tố cố định: Nhiệt độ lên men 40 o C, thời gian lên men 24 giờ và lượng nước bổ sung 15% v/w

Yếu tố thay đổi: Tỉ lệ men cấy: 0,02%; 0,05%; 0,08%; 0,12%

Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ men cấy lên men natto đậu đen

Thí nghiệm 3 (TN3): Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nước đến quá trình lên men Natto

Mục đích: Xác định lượng nước lên men phù hợp với sản phẩm natto đậu đen Đậu đen : nước : vi sinh vật

BBN35 BBN40 BBN45 BBN50 Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định hoạt độ protease, đo độ cứng và độ nhớt Đậu đen : nước : vi sinh vật

BBN002 BBN005 BBN008 BBN012 Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định hoạt độ protease, đo độ cứng và độ nhớt

Yếu tố cố định: Nhiệt độ lên men 40 o C, thời gian lên men 24 giờ và lượng men giống 0,05%

Yếu tố thay đổi: lượng nước pha dịch men: 12% v/w; 15% v/w; 18% v/w; 22% v/w

Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát hàm lượng nước lên men natto đậu đen

Thí nghiệm 4 (TN4): Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình lên men Natto

Mục đích: Xác định thời gian lên men phù hợp với sản phẩm natto đậu đen

Yếu tố cố định: Nhiệt độ lên men 40ºC, lượng nước bổ sung 15% v/w và lượng men giống 0,05%

Yếu tố thay đổi: Thời gian lên men: 15 giờ, 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ và 27 giờ

Hình 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men natto đậu đen Đậu đen : nước : vi sinh vật

BBNW12 BBNW15 BBNW18 BBNW22 Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định hoạt độ protease, đo độ cứng và độ nhớt Đậu đen : nước : vi sinh

BBN15 BBN18 BBN21 BBN24 Đánh giá cảm quan, xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định hoạt độ protease, đo độ cứng và độ nhớt

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học

Phương pháp xác định hàm lượng ẩm (Phụ lục 1)

Phương pháp xác định hàm lượng protein (Phụ lục 2)

Phương pháp xác định hàm lượng tro (Phụ lục 3)

Phương pháp xác định hàm lượng chất béo (Phụ lục 4)

Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate

Hàm lượng carbohydrate được xác định theo công thức sau [33]:

3.3.2 Phương pháp đánh giá cảm quan

Có 3 loại phương pháp đánh giá cảm quan được sử dụng trong nghiên cứu này:

Phương pháp mô tả cho điểm

Thực hiện đánh giá cảm quan các mẫu natto thông qua phép thử cho điểm mô tả dựa trên phương pháp được đề xuất bởi Ma Y và cộng sự (2015) [68] với một số thay đổi Phương pháp này được thực hiện nhằm kiểm tra và đánh giá tất cả các chỉ tiêu cảm quan hoặc từng chỉ tiêu riêng biệt (trạng thái, màu sắc, mùi, vị ) của từng mẫu natto trong từng thí nghiệm Mẫu natto đậu đen được đánh giá bởi một hội đồng gồm 8 thành viên, những người đã được đào tạo về mô tả cảm quan các sản phẩm natto Các sản phẩm natto được đánh giá thông qua 4 chỉ tiêu chất lượng là sợi nhầy, màu sắc, vị, mùi Người thử sẽ được thử các mẫu sản phẩm natto và đưa ra số điểm tương ứng với những thuật ngữ mô tả các đặc tính cảm quan dựa trên (Phụ lục 5)

Trước khi đánh giá, các mẫu natto đều được bảo quản ở nhiệt độ -18℃ ± 2℃ Sau đó mẫu natto được rã đông ở nhiệt độ phòng trong khoảng 45 phút Mỗi người thử đều được cung cấp ít nhất từ 20 – 30g mẫu

Phương pháp cho điểm thị hiếu

Phép thử cho điểm thị hiếu được thực hiện nhằm đánh giá về mức độ hài lòng, ưa thích của người tiêu dùng đối với sản phẩm natto về các chỉ tiêu màu sắc, mùi, cấu trúc và độ yêu thích chung trên thang điểm 9 Khi biết có sự khác nhau về mức độ ưa thích thì có thể kết hợp với pháp thử mô tả để tìm hiểu những tính chất đặc trưng nào được ưa thích Phương

27 pháp này được thực hiện với hội đồng 60 người đã từng sử dụng hoặc biết đến sản phẩm natto [69]

Tương tự như phương pháp cảm quan cho điểm mô tả

Phương pháp mô tả nhanh

Phép thử cho điểm mô tả được thực hiện nhằm đánh giá tổng quát mức độ chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi vị…Trạng thái chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng thang điểm cường độ [69]

Phép thử được thực hiện với hội đồng 10 người, thường xuyên sử dụng cũng như có sự hiểu biết và am hiểu về sản phẩm natto, đã qua quá trình huấn luyện kĩ lưỡng về thang đo Và hội đồng này được dùng để đánh giá và cho điểm chất lượng của từng chỉ tiêu của sản phẩm Điểm sau khi được tổng hợp sẽ được tính bằng điểm trung bình của các thành viên trong hội đồng [69]

Chuẩn bị mẫu: Tương tự như phương pháp cảm quan cho điểm mô tả

3.3.3 Phương pháp xác định độ cứng

Mục đích: Độ cứng của các mẫu natto được xác định bằng thiết bị CT3 của Brookfield với đầu dò TA-TPB-7F (đường kính 7 mm)

Cách thực hiện: Các mẫu natto đều được bảo quản ở nhiệt độ -18℃ ± 2℃ Trước khi phân tích lấy mẫu ra để yên rã đông ở nhiệt độ phòng khoảng 45 phút Sau đó, tiến hành phân tích độ cứng bằng CT3 của Brookfield Mẫu natto đậu đen trong điều kiện khảo sát được đo độ cứng bằng máy đo cấu trúc TPA với: đầu dò hình trụ (TA-TPB-7), đường kính 7mm và đặt tham số giá trị như bảng 3.1 sau:

Bảng 3.1: Tham số và giá trị cài đặt máy TPA

Thông số Giá trị cài đặt

Tải trọng kích hoạt 500 mN Đầu dò hình trụ TA-TPB-7 Đường kính 7 mm

Bảng cố định TA – BT – KIT

3.3.4 Phương pháp xác định độ nhớt

Các đặc tính lưu biến của mẫu natto đậu đen được phân tích bằng thiết bị đo lưu biến Thermo Scientific HAAKE Rheometer (Hoa Kỳ)

Chuẩn bị mẫu: Các mẫu natto đều được bảo quản ở nhiệt độ -18℃ ± 2℃ Sau đó, được để yên rã đông ở nhiệt độ phòng trong khoảng 45 phút trước khi phân tích Mẫu natto được pha loãng với nước theo tỉ lệ 2:1 Tiếp đến, đem hỗn hợp đựng trong erlen lắc ở tốc độ

Cách thực hiện: Thí nghiệm được bố trí dựa trên phương pháp được đề xuất bởi (Cooper và cộng sự, 2007) [70] với một số thay đổi Đặt mẫu natto đã pha loãng với nước lên đĩa lưu biến [71] Dữ liệu cắt (ứng suất cắt và tốc độ cắt) thu được từ máy đo lưu biến với tốc độ cắt thay đổi từ 1-100 s -1 , sử dụng dụng đầu dò dạng đĩa (plate) P35 Ti L(∅ 35mm)

Các dữ liệu thu được ứng với phương trình Herschel - Bulkley: σ = k(𝛾̇) n (2) Trong đó: k: hệ số nhất quán

𝛾̇: tốc độ trượt tại thời điểm 1/s n: chỉ số dòng chảy σ: ứng suất cắt

Cụ thể, khi 0< n< 1 thì chất lỏng có trạng thái giả dẻo và độ nhớt tỷ lệ nghịch với tốc độ cắt (Shear thinning fluid); khi 1