ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Bản chất của quá trình lên men thạch cacao chính là quá trình sinh tổng hợp cenllulose của vi khuẩn để nghiên cứu chúng tôi sử dụng đối tượng là:
+ Vi khuẩn Acetobacter xylinum được lấy từ viện bảo tàng giống pasteur thành phố Hồ Chí Minh
+ Dịch quả cacao được lấy từ trung tâm chuyển giao công nghệ cacao Thành Đạt, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu
+ Nước dừa già: lấy từ quả dừa được mua tại vựa dừa Bến Tre, TPVT để so sánh kết quả lên men giữa nước cơm nhầy cacao và môi trường lên men khác
+ Saccharose Công ty sản xuất đường biên hòa) được mua tại siêu thị Coopmart
+ (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, Acid acetic, Pepton, Agar mua tại công ty hóa chất bách khoa TP Hồ Chí Minh.
Bố trí thí nghiệm
Thời gian nghiên cứu từ tháng 2/2015 đến tháng 6/2015 tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Hóa Học & CNTP Trường Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu
Và một số thí nghiệm được kiểm tra tại trung tâm Sắc Kí Hải Đăng, TP Hồ Chí Minh
Nghiên cứu quá trình lên men sản xuất thạch cacao bằng loài vi sinh vật
A Xylilum đã tiến hành thí nghiệm được bố trí như hình (2.1)
22 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch ép cacao/nước đến độ dày và khối lượng của thạch cacao
Mục đích: tìm ra tỷ lệ pha loãng thích hợp của dịch cơm nhầy với nước
Acid acetic Dịch ép cơm nhầy cacao
Lên men Đun sôi Để nguội
+ Thời gian 9 ngày lên men
+ Tỷ lệ dịch cơm nhầy:nước (v/v): kí hiệu N;
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố khảo sát và 3 lần lặp lại (bảng 2.1).Tổng số thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Bảng 2.1 Bố trí các nghiệm thức tỷ lệ dịch ép cơm nhầy : nước vào mẫu thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm
Tỉ lệ dịch cơm nhầy : nước 1 : 1 1 : 2 1 : 3 1 : 4 1 : 5
Chỉ tiêu phân tích: độ dày (đo bằng thước), khối lượng (cân bằng cân phân tích 4 số)
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống bổ sung vào môi trường lên men độ dày và khối lượng thạch cacao
- Mục đích: Tìm ra tỷ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men
+ Thời gian: sau 9 ngày lên men;
+ Tỷ lệ dịch ép cacao:nước (v/v) tìm được ở thí nghiệm 1
+ Tỷ lệ giống, kí hiệu G;
24 + Khảo sát ở 5 mức G1 (6%), G2 (8%), G3 (10%), G4 (12%), G5 (14%) Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố khảo sát và 3 lần lặp lại (bảng 2.2) Tổng số thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Bảng 2.2 Bố trí các nghiệm thức tỷ lệ giống vào mẫu thí nghiệm
Tỉ lệ giổng bổ sung 6% 8% 10% 12% 14%
Chỉ tiêu phân tích: độ dày (đo bằng thước), khối lượng (cân bằng cân phân tích 4 số)
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của Brix đến độ dày và khối lượng của thạch cacao
- Mục đích: Tìm ra hàm lượng đường thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn A xylinunm
+ Thời gian: sau 9 ngày lên men
+ Tỷ lệ dịch ép cơm nhầy : nước tìm thấy ở thí nghiệm 1;
+ Tỷ lệ giống bổ sung vào tìm thấy ở thí nghiệm 2
+ Khảo sát ở 5 mức B1 (4,5), B2 (6,5), B3 (8,5), B4 (10,5), B5 (12,5) Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố 3 lần lặp lại (bảng 2.3) Tổng số thí nghiệm: 5 x3 = 15
25 Bảng 2.3 Bố trí các nghiệm thức Brix vào mẫu thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm
Chỉ tiêu phân tích: độ dày (đo bằng thước), khối lượng (cân bằng cân phân tích 4 số)
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ dày và khối lượng của thạch cacao
- Mục đích: nhằm đánh giá tác động của pH lên khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A.xylinum, từđó xác định được khoảng pH tối ưu cho vi khuẩn trong quá trình sinh tổng hợp cellulose
+ Tỷ lệ dịch cacao:nước tìm được ở thí nghiệm 1;
+ Tỷ lệ giống bổ sung vào tìm ở thí nghiệm 2;
+ Brix tìm được ở thí nghiệm 3
+ Nồng độ pH, kí hiệu P;
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố và 3 lần lặp lại (bảng 2.4) Tổng số thí nghiệm 5 x 3 = 15
Bảng 2.4 Bố trí các nghiệm thức pHvào mẫu thí nghiệm
26 Chỉ tiêu phân tích: độ dày (đo bằng thước), khối lượng (cân bằng cân phân tích 4 số)
2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ(NH 4 ) 2 SO 4 và (NH 4 ) 2 HPO 4 bổ sung vào môi trường dịch ép cacao đến độ dày và khối lượng của thạch cacao
- Mục đích: tìm ra nồng độ (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4thích hợp để bổ sung vào môi trường dịch ép cơm nhầy khi lên men sản xuất thạch
+ Thời gian: sau 9 ngày lên men;
+ Tỷ lệ dịch cacao : nước tìm được ở thí nghiệm 1;
+ Tỷ lệ giống bổ sung vào tìm ở thí nghiệm 2;
+ Nồng độ Brix tìm được ở thí nghiệm 3;
+ Độ pH tìm được ở thí nghiệm 4
+ Nồng độ (NH4)2SO4, kí hiệu S;
+ Nồng độ (NH4)2HPO4, kí hiệu H;
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố và 3 lần lặp lại (bảng 2.5).Tổng số thí nghiệm 4 x4 x 3 = 48
Bảng 2.5: Bố trí các nghiệm thức (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 vào mẫu thí nghiệm
Chỉ tiêu phân tích: độ dày (đo bằng thước), khối lượng (cân bằng cân phân tích 4 số)
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nghiên cứu thành phần môi trường nuối cấy A xylinum Để nuôi cấy vi khuẩn A xylinum sử dụng môi trường với các thành phần như sau: Saccharose: 20 g, (NH4)2SO4: 8g, (NH4)2HPO4: 2g, acid acetic: 5ml, pepton: 5g, nước dừa già: 1 lít, chủng vi sinh vật được nuôi dưới môi trường lỏng [18]
2.3.2 Phương pháp đếm số lượng tế bào
Xác định số lượng tế bào vi khuẩn, tiến hành bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch [3] Để định lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi khuẩn lạc chỉ được hình thành từ một tế bào Do dịch tế bào sử dụng trong phòng thí ngiệm có nồng độ cao, thường nhiều hơn 10 6 tế bào/ml, nên phải pha loãng trước khi cấy Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng để giản nồng độ tế bào từ 10 đến 100 lần cho đến khi đạt vài nghìn tế bào/ml
Dùng pipet vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa Dàn đều bằng que gạt thủy tinh, lật úp đĩa petri Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc
Số lượng tế bào vi khuẩnđược tính theo công thức: ố ế à ẫ =
Trong đó: n - số khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri ở độ pha loãng nhất định
V - thể tích dịch mẫu đem cấy (ml)
2.3.3 Phương pháp lưu trữ giống
Sử dụng phương pháp cấy truyền định kỳ: giống sau khi được xác định hình thái tế bào, tiến hành hút 1ml dung dịch chứa vi khuẩn cho vào môi 9ml môi trường nuôi cấy, gián nhãn và cho vào tủ bảo quản ở nhiệt độ 4 o C
Có sổ ghi chép theo dõi (3 tháng cấy truyền 1 lần)
Xác định lượng đường khử theo phương pháp bectrand [8]
Lấy 5ml dịch môi trường và 20ml Felhing, đun sôi 3 phút gạn lấy tủa Sau đó, hòa tan tủa bằng 10ml Fe2(SO4)3 chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây (vc)
Khối lượng Cu (g1) có trong dịch mẫu cần phân tích: g1= vc * 6.36
Tra bảng phụ lục xác định được khối lượng đường khử trong dịch mẫu phân tích (mg)
Trong đó: V – lượng dung dịch lấy để xác định hàm lượng đường khử (ml)
2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng acid tích lũy
Lấy 10ml dịch lên men,thêm 2 đến 3 giọt phenoltalein 0,1% thêm 20ml nước cất trung tính Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây [8]
29 Hàm lượng acid tổng số (g/l)
Trong đó: V - Số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng trung hòa 10ml dịch lên men
Vo - Số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng trung hòa 10ml dịch chưa lên men
2.3.6 Phương pháp xác định trọng lượng khô tuyệt đối
Cân chính xác khoảng 10g thạch cacao (lặp lại 3 lần) trong hộp đựng mẫu sạch, khô đã được cân chính xác Đem sấy khô ở 105 o C trong 5 giờ cho đến khi trọng lượng không đổi Sau khi sấy cho vào tủ hút ẩm để nguội 45 phút đem cân chính xác Cho tới khi bốc hơi hoàn toàn khi hai lần cân chỉ cách nhau vài mg (tối đa 5mg) [8]
Trọng lượng khô tuyệt đối được xác định theo công thức:
Trong đó: m1- khối lượng mẫu trước khi đem đi sấy khô (g) m2- khối lượng mẫu sau khi sấy khô (g)
2.3.7 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh của thạch cacao
Tổng số vi sinh hiếu khí: theo Phương pháp (PP) thử TCVN 4884:2005
E.Coli: theo PP thử TCVN 7924-2:2008
Tổng số nấm men nấm mốc: theo PP thử TCVN 8275-1:2010
E Coli: không quá 3 KL/g, PP thử TCVN 5155:90
2.3.8 Phương pháp đánh giá cảm quan
Sau khi chế biến, chất lượng cảm quan của sản phẩm thạch cacao được đánh giá bằng phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp sản phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 3215 - 79) [16,19]
Theo tiêu chuẩn (TCVN 3215-79) sử dụng hệ 20 điểm xây dựng trên một thang thống nhất có 6 bậc (từ 0÷5) và điểm 5 là cao nhất cho một chỉ tiêu
Dựa vào nội dung của tiêu chuẩn (TCVN 3215-79) ta xây dựng các thang điểm chỉ tiêu của sản phẩm thạch cacao theo (TCVN 3215 - 79)
Bảng 2.6 Thang điểm đánh giá tiêu chuẩn sản phẩm thạch cacao
Chỉ tiêu Hệ số trọng lượng
Sản phẩm bị biến màu 1
Màu sắc của sản phẩm bị hư hỏng 0
Biểu hiện của sự hư hỏng 0
Mùi thơm của hương lá dứa, không có mùi nấu
Mùi thơm hương lá dứa, có mùi nấu nhẹ 4 Mùi kém đặc trưng, mùi nấu rõ rang 3 Mùi không đặc trưng, có mùi lạ 2 Mùi lạ không thể chấp nhận được 1
Mùi của sản phẩm hỏng 0
Vị thanh ngọt hấp dẫn 5
Vị ngọt, thoảng vị lạ 3
Vị ngọt, vị lạ rõ 2
Quá ngọt hoặc quá nhạt 1
Vị của sản phẩm hỏng 0
Cách tiến hành đánh giá cảm quan
Hội đồng cảm quan gồm có 5 người:
1 Đặng Thanh Cương, sinh viên lớp DH11TP
2 Lại Thị Tươi, sinh viên lớp DH11TP
3 Trịnh Thị Khuyên, sinh viên lớp DH11TP
4 Nguyễn Viết Nam, sinh viên lớp DH11TP
5 Nguyến Thị Thu Tươi, sinh viên lớp DH11TP
Các cản quan viên đều có khả năng đánh giá cảm quan cao, có khả năng phân biệt cảm giác, có kiến thức chuyên môn và có kiến thức phân tích cảm quan tốt
Theo phương pháp cho điểm các kiểm nghiệm viên căn cứ vào kết quả ghi nhận được, đối chiếu với bảng mô tả các chỉ tiêu cụ thể ở trên và dùng số nguyên cho điểm từ 0 ÷ 5 Nếu có nhiều kiểm nghiệm viên cùng đánh giá thì điểm trung bình là kết quả trung bình cộng của các kiểm nghiệm viên Tích của điểm trung bình của mỗi chỉ tiêu với hệ số quan trọng của mỗi chỉ tiêu đó chính là điểm trung bình có trọng lượng
Theo TCVN 3215 - 79 qui định tính trên hệ điểm 20, chất lượng sản phẩm
Bảng 2.7 Bảng điểm đánh giá chất lượng sản phẩm