[ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP] NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT THẠCH CACAO TỪ DỊCH ÉP CƠM NHẦY CACAO NHỜ VI KHUẨN ACETPBACTER XYLINUM

MSSV: 1152020025 Lớp: DH11TP

PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI

ĐỒ ÁN/ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

(Đính kèm Quy định về việc tổ chức, quản lý các hình thức tốt nghiệp ĐH, CĐ ban hành kèm theo Quyết định số 585/QĐ-ĐHBRVT ngày 16/7/2013 của Hiệu trưởng Trường Đại học BR-VT)

Họ và tên sinh viên: Trịnh Văn Vũ Ngày sinh: 12/03/1993

1 Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất thạch cacao từ dịch ép cơm nhầy cacao nhờ vi khuẩn

Acetobacter xylinum

2 Giảng viên hướng dẫn: ThS Trần Thị Duyên TS Đặng Thu Thủy 3 Ngày giao đề tài: tháng 2/2015

4 Ngày hoàn thành đồ án/ khoá luận tốt nghiệp: tháng 7/2015

Bà Rịa-Vũng Tàu, ngày…….tháng… năm

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

TRƯỞNG BỘ MÔN TRƯỞNG KHOA

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài này, ngoài sự cố gắng của bản thân, còn có sự động viên, giúp đỡ của quý thầy cô Khoa Hóa Học & CNTP trường ĐH Bà Rịa -Vũng Tàu

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến TS Đặng Thu Thủy và ThS Trần Thị Duyên, là người trực tiếp hướng dẫn tôi làm đề tài này cùng quý thầy cô trong Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu đã truyền đạt những kiến thức hữu ích và có tính thực tiễn, là nền tảng để tôi áp dụng trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Minh Nhựt phụ trách phòng thí nghiệm đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Ngoài ra tôi cũng xin cảm ơn gia đình bạn bè và những người thân đã luôn bên cạnh ủng hộ động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận này

Trân trọng!

Vũng Tàu, ngày ,tháng , năm 2015

Sinh viên thực hiện đề tài

Trịnh Văn Vũ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đồ án này do tôi tự thực hiện và nghiên cứu đưới sự hướng dẫn của ThS Trần Thị Duyên và TS Đặng Thu Thủy

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã sử dụng các tài liệu ghi trong mục tài liệu tham khảo ngoài ra không sử dụng bất kì tài liệu nào khác mà không được ghi trong mục tài liệu

Nếu có sai tôi xin chịu mọi hình thức kỹ luật quy định

Sinh viên thực hiên

Trịnh Văn Vũ

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giá trị dinh dưỡng và hướng sử dụng lớp cơm nhầy cacao trong công nghệ chế biến thực phẩm 4

1.2 Đặc điểm của chủng vi sinh vật Acetobacter xylinum 8

1.2.1 Gốc sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum 8

1.2.2 Hình thái sinh lý học của vi khuẩn Acetobacter xylinum 9

1.2.3 Ứng dụng của A xylinum 13

1.3 Sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn (BC) A xylinum 13

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 13

1.3.2 Cấu trúc màng BC 14

1.3.3 Cơ chế sinh hóa của quá trình lên men tổng hợp BC 16

1.3.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tổng hợp BC 17

1.3.5 Những lĩnh vực ứng dụng của BC 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1.Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 21

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ(NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 bổ sung vào môi trường dịch ép cacao đến độ dày và khối lượng của thạch

cacao 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Nghiên cứu thành phần môi trường nuối cấy A xylinum 27

2.3.2 Phương pháp đếm số lượng tế bào 27

2.3.3 Phương pháp lưu trữ giống 28

2.3.4 Phương pháp phân tích 28

2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng acid tích lũy 28

2.3.6 Phương pháp xác định trọng lượng khô tuyệt đối 29

2.3.7 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh của thạch cacao 29

2.3.8 Phương pháp đánh giá cảm quan 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đường cong sinh trưởng loài A.xylinum 32

3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ ca cao/nước đến độ dày và khối lượng của màng thạch 33

3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến độ dày và khối lượng thạch 35

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ Brix đến độ dày và khối lượng của thạch 37

3.5 Ảnh hưởng của nồng độ pH đến khối lượng và độ dày màng thạch cacao 38

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của pH đến độ dày và khối lượng của màng thạch 38 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4bổ sung vào dịch quả lên men đến độ dày và khối lượng của thạch cacao 40 3.7 So sánh một số chỉ tiêu của thach cacao và thach dừa được lên men bởi A xylinum 42

3.8 Chỉ tiêu cảm quan của thạch cacao (có bổ sung hương lá dứa) 43

3.9 Một số chỉ tiêu vi sinh của thạch cacao 44

3.10 Đề xuất quy trình chế biến thạch cacao (bổ sung hương lá dứa) 45

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 50

MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lớp cơm nhầy cacao 7

Bảng 1.2 Một số ứng dụng của màng BC tronng các lĩnh vực khác nhau 19

Bảng 2.1 Bố trí các nghiệm thức tỷ lệ dịch ép cơm nhầy : nước vào mẫu thí nghiệm 23

Bảng 2.2 Bố trí các nghiệm thức tỷ lệ giống vào mẫu thí nghiệm 24

Bảng 2.3 Bố trí các nghiệm thức nồng độ Brix vào mẫu thí nghiệm 25

Bảng 2.4 Bố trí các nghiệm thức pH vào mẫu thí nghiệm 25

Bảng 2.5 Bố trí các nghiệm thức nồng độ (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 vào mẫu thí nghiệm 26

Bảng 2.6 Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm thach cacao (TCVN 3215 – 79) 30

Bảng 2.7 Bảng điểm đánh giá chất lượng sản phẩm 31

Bảng 3.1 Mật độ tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum từ ngày 3 đến ngày 12 32

Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch ép cơm nhầy cacao : nước đến độ dày và khối lượng của thạch 34

Bảng 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ giống bổ sung đến độ dày và khối lượng của thạch 35

Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ Brix đến độ dày và khối lượng của thạch 37

Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đến độ dày và khối lượng của thạch 38

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 bổ sung vào dịch quả lên men đến độ dày và khối lượng của thạch 40

Bảng 3.7 Tỷ lệ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thạch cacao 42

Bảng 3.8 Tỷ lệ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thạch dừa 42

Bảng 3.9 Các chỉ tiêu của thạch cacao và thạch dừa 43

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm thạch cacao 44

Bảng 3.11 Một số chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm thạch cacao 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoa cacao 5

Hình 1.2 Giống cacao Foratero 5

Hình 1.3 Giống cacao Crinollo 5

Hình 1.4 Giống cacao Trinitario 6

Hình 1.5 Thành phần cấu tạo quả cacao 6

Hình 3.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A xylinum 33

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch ép cơm nhầy : nước đến độ dày và khối lượng thạch cacao 34

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến độ dày và khối lượng màng thạch 36 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ Brix đến độ dày và khối lượng màng thạch 37

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến độ dày và khối lượng màng thạch 39

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 bổ sung vào dịch quả lên men đến độ dày và khối lượng của màng thạch 41

Hình 3.7 Quy trình sản xuất thạch cacao 45

Hình 3.8 Thạch cacao thu được sau khi lên men 46

Hình 3.9 Quy trình chế biến thạch cacao hương lá dứa 47

Hình 3.10 Ngâm thạch trong Na2CO3 0,1% 47

Hình 3.11 Sản phẩm thạch cacao 48

LỜI MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài

Trên thế giới cây cacao (Theobroma cacao) và những sản phẩm từ nó đã

có lịch sử lâu đời Những sản phẩm từ cây cacao luôn mang lại hiệu quả kinh tế cao Sản phẩm chính của cây cacao là hạt cacao được sử dụng làm nguyên liệu trong công nghiệp chế biến thực phẩm là làm sản phẩm hoàn chỉnh hay bán hoàn chỉnh trong các ngành công nghiệp khác

Hiện nay tại Việt Nam trong chiến lược phát triển cây công nghiệp của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, cây cacao đang rất được chú trọng Cây cacao được khuyến khích trồng nhiều ở nhiều địa phương trong đó có tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

Theo số liệu thống kê ước tính đến năm 2015 tổng sản lượng ca cao thu hoạch ở Việt Nam sẽ đạt hơn 82 nghìn tấn đây là một con số đáng nhìn nhận để thấy được ca cao Việt Nam đang trên đà phát triển Tuy nhiên, hiện nay Việt Nam cũng như trên thế giới chỉ mới tận dụng được hạt ca cao làm socola là chủ yếu một số ít dùng vỏ để làm phân hữu cơ, còn dịch cơm nhày từ hạt thì vẫn chưa được tận dụng và đa phần bị vứt bỏ đi một cách lãng phí Theo các nghiên cứu của Afoakwa (2010), phân tích thành phần hóa học trong 100g lớp cơm nhầy cho thấy: chứa 10% các loại đường glucose và fructose, 6% là đường saccharose, các acid hữu cơ chiếm 3%, 2% protein, 3% khoáng,… Đặc biệt hàm lượng pentosan có trong thành phần dịch ép thịt quả, đây là chất có hoạt tính sinh học cao có vai trò chống ung thư

Sản phẩm thạch hiện nay đã xuất hiện nhiều trên thị trường như thạch dừa hay thạch rau câu, nhưng thạch cacao thì vẫn chưa hề có mặt trên thị trường nên có thể nói sản phẩm này có thể rất hứa hẹn góp phần đa dạng cho thị trường thực phẩm tráng miệng

Từ những lý do trên chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu quy trình sản

xuất thạch cacao từ dịch ép cơm nhầy cacao nhờ vi khuẩn Acetobacter

xylinum” để làm luận văn này

2 Mục đích của đề tài:

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thạch cacao nhờ vi

khuẩn Acetobacter xylinum để từ đó đề xuất quy trình sản xuất thạch cacao

3 Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn Acetobacter xylinum

- Xác định tỷ lệ pha loãng dịch ép cơm nhầy cacao để đạt hiệu quả lên men tốt

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thạch cacao (tỷ lệ giống, pH, độ Brix, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4…)

- Kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm chế biến: cảm quan, một số chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm

- Xây dựng quy trình sản xuất thạch cacao từ dịch ép cơm nhầy trái cacao

4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp đếm số lượng tế bào - Phương pháp trữ giống

- Phương pháp phân tích: + Đường khử

+ Acid tích lũy

+ Trọng lượng khô tuyệt đối

- Phương pháp đánh giá cảm quan dựa trên phép thử cho điểm chất lượng tổng hợp sản phẩm theo TCVN 3215-79

- Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Statgraphic Centurion XV, phân tích phương sai ANOVA và kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa các nghiệm thức

5 Kết quả đạt được của đề tài

- Tỉ lệ dịch ép cơm nhầy cacao : nước tối ưu cho quá trình lên men thạch cacao là 1 : 4

- Tỉ lệ giống bổ sung vào môi trường lên men là 10%

- Nồng độ Brix để thu được độ dày và khối lượng tốt nhất trong quá trình lên men thạch cacao là 8,5

- Nồng độ pH cho quá trình lên men thạch cacao là 4,5

- Nồng độ (NH4)2SO4 =0,7g, (NH4)2HPO4 =0,2g là tốt nhất cho quá trình lên men thạch cacao

- Sản phẩm thạch cacao từ dịch ép cơm nhầy trái cacao sau thanh trùng có màu trắng ngà, vị thanh ngọt, dai chắc, đạt độ dày 2,06 cm và có mùi thơm đặc trưng của lớp cơm nhầy trái cacao

- Xây dựng được quy trình chế biến các sản phẩm của thạch cacao (bổ sung hương lá dứa)

6 Bố cục đề tài

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giá trị dinh dưỡng và hướng sử dụng lớp cơm nhầy cacao trong công nghệ chế biến thực phẩm

Cây cacao thuộc họ Sterculiaceae, giống Theobroma có nguồn gốc từ miền nam châu Phi Ở Việt Nam, cây cacao được du nhập vào rất sớm, theo chân các nhà truyền giáo phương Tây Năm 1974, hãng Soca 2 của Pháp đã cử một đoàn chuyên gia sang nghiên cứu hợp tác với Việt Nam trồng cacao ở đồng bằng sông Cửu Long và họ đã xác định vùng đất miền Tây và Đông Nam Bộ rất thích hợp để trồng cacao Sản lượng dự kiến sau 3-4 năm là 25000 kg/ha và cây có thể cho ra quả đến 30 năm Từ đó cây cacao đã được quan tâm và gieo trồng ở nhiều nơi [24]

Cacao là cây công nghiệp dài ngày, trồng thích hợp ở vùng nhiệt đới, thân gỗ, cao từ 5 - 7m (thường phát triển dưới tán) Sau 10 năm thì cây phát triển hoàn thiện Cây cacao có thể cho thu hoạch quả đến 50 năm Sau khi trồng từ 3 - 4 năm thì cây bắt đầu ra hoa Hoa cacao (hình 1.1) nhỏ, có đường kính khoảng 15mm, có màu vàng, đỏ, trắng hay tím tùy loài Hoa mọc trực tiếp từ thân cây và cành to chứ không mọc ở ngọn như những cây khác Hoa cacao thuộc loại lưỡng tính và thụ phấn chủ yếu nhờ vào côn trùng Có khoảng 0,5% hoa nở tạo quả, trong đó có 90% quả non sẽ bị khô và rụng [11] Quả phát triển trong 5 - 6 tháng, màu sắc biến đổi tùy theo loài Quả cacao có kích thước lớn, không nứt Trong quả thường có 5 hàng hạt bám xung quanh cùi Mỗi hạt có lớp vỏ nhày bao quanh

Cây cacao sinh trưởng và phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 20 đến 30oC, lượng mưa từ 1500 - 2000mm/năm và pH của đất ở 6,5 -6,7

Hình 1.1 Hoa cacao

Trên thế giới có 3 giống cacao chủ yếu là giống Forastero, Crinollo và

Trinitario [13]

- Giống Forastero (hình 1.2) có xuất xứ từ Tây Phi, Brazil, Indonesia,

Malaysia Đặc tính thực vật là quả khi chín màu vàng, hình dài, nhọn, ít khía, mặt trơn, hạt hơi lép, lúc tươi có vị chát đắng, 60 -80 hạt/quả Chất lượng hạt trung bình, năng suất cao và kháng sâu bệnh tốt, chiếm 80% thị phần ca cao thế giới Ở Việt Nam Forastero là giống được trồng nhiều nhất

- Giống Crinollo (hình 1.3) có xuất xứ từ Nam Trung Mỹ (Mehico, Clombia, Guatemala, ) Đặc trưng của giốngCrinollolà quả khi chín màu đỏ

sậm, hình dạng dài, vỏ sần sùi, hạt tươi có màu trắng hoặc hơi vàng, hạt khô có mùi thơm mạnh, ít đắng, 20 - 40 hạt/quả Năng suất thấp và khả năng kháng sâu bệnh thấp nhưng chất lượng hạt cacao là tốt nhất Từ hạt của giống cacao này có thể làm ra loại chocolate ngon nhất, chiếm 5% thị phần ca cao thế giới

Hình 1.2 Giống cacao Forastero Hình 1.3 Giống cacao Crinollo

- Giống Trinitario (hình 1.4) là giống lai tạo từ 2 giống Crinollo và

Forastero Đặc điểm của giống Trinitario là mang tính chất trung gian giữa 2

giống trên Cụ thể là giống Trinitario có phôi nhũ màu tím nhạt, quả dẹp, quả

có rãnh sâu không rõ nét, chứa nhiều hơn 40 hạt/quả Năng suất cao và khả năng kháng bệnh tốt, đây là giống đạt chất lượng trung bình, chiếm 10 - 15% thị trường cacao thế giới

Hình 1.4 Giống ca cao Trinitario

Quả cacao được cấu tạo bởi 4 thành phần (hình 1.5): lớp ngoài cùng là lớp vỏ cứng (vỏ quả), tiếp theo là lớp vỏ cơm nhầy (vỏ thịt), lớp vỏ trấu (vỏ hạt) bao quanh lớp hạt ở trong cùng hay còn gọi là nhân

Trong quả cacao có các thành phần hóa học như nước, chất béo (bơ cacao), cacbohydrates, nitrogen, acid hữu cơ, muối khoáng, Các thành phần này có hàm lượng khác nhau ở chất nhầy, vỏ hạt và nhân

Hình 1.5 Thành phần cấu tạo quả cacao

Hạt cacao được bao xung quanh bởi một lớp cơm nhày, mà trong quá trình chế biến sẽ được tách ra khỏi hạt cacao, thu lớp cơm nhày này ta được dịch quả Dịch có mùi thơm, vị ngọt hơi chua Thông thường 10kg hạt cho 1,2-1,3 lít dịch quả Lượng dịch quả còn tùy vào mùa nắng hay mưa

Khác với thành phần hóa học của hạt và vỏ, trong lớp cơm nhày chứa hàm lượng lớn glucose, acid hữu cơ, vitamin C và khoáng chất (bảng 1.3)

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của lớp cơm nhầy cacao [20]

Lớp cơm nhầy có thể sử dụng làm nước sinh tố, kem hoặc cô đặc làm nước cốt trái cây hay sử dụng chế biến rượu vang Tuy nhiên các sản phẩm từ lớp cơm nhầy cacao này vẫn chưa được sử dụng rộng rãi cũng như chưa có một sản phẩm nào có mặt trên thị trường

Tuy chứa những chất có giá trị dinh dưỡng cao và có khối lượng đáng kể trong quả cacao nhưng phụ phẩm lớp cơm nhầy cacao chưa được đánh giá cao và sử dụng hợp lý Điều đó đã dẫn đến sự lãng phí nguyên liệu thực phẩm có ích cho sức khỏe con người Chính vì vậy nghiên cứu sản xuất các sản phẩm từ dịch ép cơm nhầy cacao này là rất cần thiết góp phần nâng cao giá trị kinh tế của trái cacao cũng như đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm cho người tiêu dùng Một trong những hướng sản xuất sản phẩm từ lớp cơm nhầy chính là

lên men thu nhận thạch cacao bằng chủng vi sinh vật Acetobacter xylinum

1.2 Đặc điểm của chủng vi sinh vật Acetobacter xylinum 1.2.1 Gốc sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum

Theo khóa phân loạicủa Bergey,Acetobacterxylinum thuộc:

Lớp : Schizomycetes Bộ : Pseudomonadales Bộ phụ : Pseudomonadiace Họ : Pseudomonadaceae Giống : Acetobacter

Acetobacterxylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic Quá trình lên men

acetic được coi là quá trình lên men dấm nhưng thực chất là một quá trình oxy hóa [2]

A.xylinum là loài vi khuẩn tạo được BC (Bacterialcellulose) nhiều nhất

trong tự nhiên Một tế bào A xylinunm có thể chuyển hoá 108 phân tử glucose

thành cellulose trong 1 giờ [22]

1.2.2 Hình thái sinh lý học của vi khuẩn Acetobacter xylinum

Đặc điểm hình thái:

Acetobacterxylinum thuộc giống Acetobacter Giống Acetobacter (hình

1.6)thuộc họ Pseudomonadieae những trực khuẩn hình que đến elip, kích

thước trung bình 0,6 - 0,8 m x1 - 3 m Các tế bào đứng tách riêng rẽ, một số xếp thành dạng chuỗi dài Một số loài đặc biệt có tế bào hình cầu, xoắn,chùy, hình chỉ hay hình bán nguyệt tùythuộc điều kiện pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy

Vi khuẩn acetic không có khả năng tạo bào tử Một số loài có thể di động nhờ tiên mao ở một đầu – đơn mao, hay chu mao, một số không có khả năng này Đây là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, bắt màu Gram âm khi còn non, khi già có thể đổi màu Gram

Trên môi trường đặc, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc

tròn, nhỏ, đều đặn, đường kính trung bình là 3mm Một số loài như A.aceti,

A.xylinum có khuẩn lạc rất nhỏ (d=1mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn

lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh Một số loài có khuẩn lạc lớn (d=4-5mm), bề mặt trơn bóng, không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dung que cấy gạt ra khỏi môi trường Một số loài tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường nên khó lấy ra bằng que cấy

Trên môi trường lỏng, vi khuẩn acetic chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành những lớp màng dày, mỏng khác nhau Một số loài tạo thành lớp màng dày như sứa, nhẵn, trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó một lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt Màng này có chứa sợi cellulose giống như sợi bông Loại thứ hai có màng mỏng như giấy xelofan Một số khác có màng không nhẵn mà nhăn nheo Một số nữa tạo màng mỏng dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong [ 1 , 9 ]

Hình 1.6 Vi khuẩn Acetobacter

Mang những đặc điểm hình thái chung của giống vi khuẩn acetic,

Acetobacter xylinum (hình 1.7) có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, kích

thước khoảng 2 m thay đổi tùy loài Các tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì vậy chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí

A.xylinum có khuẩn lạc nhỏ,tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa

khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn Sau 5 ngàynuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2-5mm

Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acidsulfuric (do phản ứng củahemicellulose) [2]

Acetobacter xylinum có thể tích lũy 4,5% acid acetic, sinh trưởng ở pH

thấp hơn 5 Acid acetic sinh ra do quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng sinh ra quá mức giới hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng

Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A

xylinum dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể

phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh

Khi nuôi cấy trong môi trường thạch, lúc còn non, A xylinum phát

triển thành từng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng cụm mọc theo đường cấy

Trong môi trường lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt,phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên Sau 36-48 giờ hình thành lớp váng trong và ngày càng dày [18]

Hình 1.7 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:

Những vi khuẩn acetic nói chung có nhu cầu dinh dưỡng rất đa dạng Chúng sử dụng đường, rượu và các acid hữu cơ làm nguồn carbon, dùng muối amon làm nguồn nitơ [5]

Vi khuẩn acetic không những oxy hoá được rượu etylic thành acid acetic mà còn oxy hoá được rượu propylic thành acid propionic, rượu butylic thành acid butyric, nhưng chúng không oxy hoá được rượu metylic và các

rượu bậc cao khác Trong môi trường đủ rượu etylic (5 - 13%) thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid acetic, còn nếu nồng độ rượu thấp hơn thì các vi khuẩn acetic oxy hoá triệt để rượu thành CO2 và H2O [10]

Vi khuẩn acetic có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột Ngoài khả năng oxy hoá

etanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin

B1, B2, oxy hoá được sorbit thành đường sorbose – dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hoá glycerin thành dioxyaceton, glucose thành acid

gluconic Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng hoá muối amon,

khả năng phân giải pepton yếu

Trong quá trình phát triển, vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với một số acid amin như acid pantothenic, valin, alanin, prolin, một số chất kích thích sinh trưởng như p - aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin,… và một số chất khoáng K, Ca, Mg, Fe, S, P, … ở dạng muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ Do đó, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây,… là

nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của Acetobacter [6]

Vi khuẩn acetic rất hiếu khí Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng [14]

Nhiệt độ tối thích đối với sinh trưởng của các loài vi khuẩn acetic là 20 - 30 oC, pH tối thích là 5,5 - 6,2 Chúng có tính chịu acid cao, một số loài vẫn phát triển được ở pH = 3,2

Đối với loài A xylinunm chúng có khả nănghấp thụ đường glucose từ

môi trường nuôi cấy Trong tế bào vi khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào Kế đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme Enzyme này có thể polymer hóa glucose

thành cellulose [1]

A xylinunm này tạo nên lớp cellulose dày là do môi trường nuôi cấy

trong môi trường nước dừa có bổ sung có dưỡng chất cần thiết Cellulose là những polysaccharide không tan trong nước mà tan trong môi trường kiềm Đó cũng là thành phần chính của màng tế bào thực vật

Acetobacter xylinum , phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập

được các vi khuẩn này từ trong không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm,

dấm, rượu, bia, hoa quả Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được

phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loại có ý nghĩa kinh tế

1.2.3 Ứng dụng của A xylinum

Vi khuẩn Acetobacter xylinum được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực

khác nhau Hiện nay chức tạo màng cellulose được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, y tế, mỹ phẩm, môi trường

1.3 Sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn (BC) A xylinum

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum

được nhà bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886 Tuy nhiên đến nửa sau thế kỉ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BC [22]

Năm 1943 - 1954, Hestrin và các cộng sự nghiên cứu về khả năng tổng

hợp BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum, họ chứng minh rằng

A xylinum có thể sử dụng đường và O2 để tạo nên cellulose

Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được

A xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP Càng ngày, cấu

trúc của BC càng được hiểu rõ theo tiến bộ của khoa học kỹ thuật

Năm 1989, nhóm I.M Saxena trường Đại học Texa thu nhận được

enzyme cellulose synthase tinh sạch của A xylinum Enzyme này gồm 2

chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử là 83 và 93 kD Trong đó, tiểu phần 83 kD liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết Năm 1990,

nhóm đã xác định được gen tổng hợp cellulose ở A xylinum (dòng hoá và

giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose)

Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấu trúc, cơ chế tổng hợp và ứng dụng của BC [4]

1.3.2 Cấu trúc màng BC

BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant cellulose - PC) (hình 1.8), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối 1,4 - glucan Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5 nm Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước từ 3 - 4 nm và chiều rộng 70 - 80 nm

Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm, còn theo Brown và cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn, BC có độ polymer hóa từ 2000 - 6000, có trường hợp lên đến 16000 hay 20000 Trong khi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 - 14000 [15]

Hình 1.8: Cấu trúc của BC và PC [26,27]

Trong tự nhiên, cellulose kết tinh phổ biến ở dạng I và II Cellulose I có thể chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II thì không thể chuyển ngược lại thành cellulose I Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế Thông thường, dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn

Cellulose I có chiều dài 0,05 - 0,1 m; được tổng hợp bởi đa số thực

vật và vi khuẩn A xylinum trong môi trường lên men tĩnh Các chuỗi

-1,4 - glucan xếp song song với nhau theo một trục

Năm 1984, Atalla và V Hart đã xác định được cấu trúc của cellulose I và cellulose I cấu tạo bởi glucose dạng hay

Cellulose II: được tổng hợp ở một số nấm mốc và vi khuẩn

như Sarcinaventriculi Là dạng sợi cellulose ổn định nhất về nhiệt động

lực học, các chuỗi glucan xếp đối song nhau hay phân bố tự do Cellulose II thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc Khi đó BC tạo ra ở dạng huyền phù phân tán, các sợi cellulose thường uốn cong, đường kính khoảng 0,1 - 0,2 m [4]

1.3.3 Cơ chế sinh hóa của quá trình lên men tổng hợp BC

Khi nuôi cấy vi khuẩn A xylinum trong môi trường có nguồn dinh

dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [17]

Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau:

các tế bào A xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá

trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [17]

Hình 1.9: Con đường dự đoán sinh tổng hợp cellulose trong

tế bào vi khuẩn A xylinunm [15]

Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharide nội bào, lượng oligo và polysaccharide nội

bào đạt tới 60% khối lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh vật Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharide Tất cả các oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách thêm một đơn vị monosaccharid vào chuỗi saccharid có trước Đơn vị monosaccharid tham gia phản ứng dưới dạng nucleotid, monosaccharid được hoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin - diphosphat (UDP - X) nhưng đôi khi là các nucleotid purin và pyrimidin khác

Cơ chế của quá trình tổng hợp các loại polysaccharide phân nhánh hiện nay vẫn còn chưa rõ Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharide phụ thuộc vào các loại enzyme transferase [2]

1.3.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tổng hợp BC

Ảnh hưởng của (NH4)2SO4:

Tỉ lệ thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ý nghĩa quyết

định đối với sự sinh trưởng và phát triển của Acetobacter xylinum Nhân tố

(NH4)2SO4 là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của

Acetobacter xylinum (NH4)2SO4 là yếu tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển

Để xác định được ảnh hưởng của (NH4)2SO4 tới quá trình tạo màng

nhày, trước tiên cấy hai chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.sp T7 và

Acetobacterxylinum A24 trên môi trường cơ bản và thay đổi nồng độ của

(NH4)2SO4 ở 8 nồng độ khác nhau: 0,25 ; 0,2; 0,15; 0,1; 0,08; 0,05; 0,03; 0,01 (%) Môi trường nuôi cấy tĩnh sau 20 ngày đem xác định độ dày của màng nhày ở các giá trị nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau Kết quả kiểm tra cho thấy độ dày màng tăng từ ngày thứ 5 trở đi và đạt giá trị cực đại ở ngày thứ 20 Ở

giá trị nồng độ (NH4)2SO4 là 0,08% thì hàm lượng hemicellulose tạo ra là cao nhất

Kết quả nêu trên được giải thích: mỗi loài vi sinh vật có một ngưỡng hấp thụ thích hợp các chất dinh dưỡng khác nhau là khác nhau (NH4)2SO4 là nguồn cung cấp nito cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Acetobacter xylinum Nồng độ (NH4)2SO4 là 0,25; 0,2; 0,15; 0,1% có thể là

cao quá đối với yêu cầu của Acetobacter xylinum do đó không hấp thụ hết

lượng sulphate amone, lượng còn lại trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn Vì vậy, lượng hemicellulose tạo ra thấp hơn so với môi trường có nồng độ (NH4)2SO4 là 0,08% Còn nồng độ sulphate amone là 0,05; 0,03; 0,01% có thể là thấp hơn so với yêu cầu cho sự phát triển của vi khuẩn nên lượng hemicelluloses tạo thành thấp hơn cả

Mặt khác, nitrogen còn có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo như acid nucleic, phospholipid, một số coenzyme quan trọng như ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình tạo thành hemicellulose Nếu hàm lượng các chất đó quá cao hay quá thấp sẽ ảnh hưởng đến tính chất lý hoá của môi trường, vì vậy ảnh hưởng tới quá trình tạo thành hemicelluloses

của vi khuản Acertobacter xylinum, vì thế độ dày màng giảm so với mức

0,08%

Ảnh hưởng của (NH4)2HPO4:

(NH4)2HPO4 vừa là nguồn cung cấp nitrogen, vừa là nguồn cung cấp phospho cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Acertobacterxylinum Sự ảnh hưởng của (NH4)2HPO4 tương tự như ảnh hưởng của (NH4)2SO4

- Ảnh hưởng của nồng độ chất khô: nồng độ chất khô thích hợp cho quá trình lên men thạch ca cao là 8 - 9oBx Nếu nồng độ chất khô quá cao, vi sinh vật có thể không sử dụng hết gây lãng phí đồng thời có thể gây ức chế hoạt

động vi sinh vật Nếu nồng độ chất khô quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho quá trình sống của vi sinh vật

1.3.5 Những lĩnh vực ứng dụng của BC

Mặc dù bản chất hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng nhờ sản xuất dễ dàng, đặc tính cơ học cao, tính ổn định dưới hóa chất và nhiệt độ cao, cellulose vi khuẩn là vật liệu được chọn cho nhiều ứng dụng[28]

Bảng 1.2 Một số ứng dụng của màng BC trong các lĩnh vực khác nhau

Thực phẩm

Thức ăn trángmiệng (thạchdừa, cocktail, Kombucha,trà Manchurian…

Các loạibánh snack,kẹo có nănglượng thấp

Chấtlàm đặc để bổ sung trong kem, dầutrộn salad Màng bao thực phẩm, màngbảoquản trái cây Chất ổnđịnh thực phẩm

Y tế

Màng trị thương, màng trị bỏng Tác nhân vận chuyển thuốc Da nhân tạo

Mạch máu nhân tạo Màng bao sụn

Mỹ phẩm

Kem thoa da Chất ổn định Màng nhân tạo

Chất là dày và tăng cứng cho thuốc đánh bóng móng tay

Môi trường Vật liệu hút vết dầu tràn hay chất độc hại Màng siêu lọc làm sạch nguồn nước

Dầu mỏ Vật liệu thu hồi và tái sinh khoáng chất và dầu

Thể thao ngoài trời Lều dùng một lần và đồ dùng cắm trại Tiện ích cộng đồng Màng thẩm thấu ngược

Chăm sóc trẻ em Tã giấy dùng một lần có khả năng tái sinh Âm thanh Màng rung chuyển đổi âm thanh

Công nghiệp giấy Giấy lưu trữ hồ sơ Giấy làm tiền tệ Giấy điện tử Máy móc tự động và

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Bản chất của quá trình lên men thạch cacao chính là quá trình sinh tổng hợp cenllulose của vi khuẩn để nghiên cứu chúng tôi sử dụng đối tượng là:

+ Vi khuẩn Acetobacter xylinum được lấy từ viện bảo tàng giống pasteur

+ Saccharose Công ty sản xuất đường biên hòa) được mua tại siêu thị Coopmart

+ (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, Acid acetic, Pepton, Agar mua tại công ty hóa chất bách khoa TP Hồ Chí Minh

2.2 Bố trí thí nghiệm

Thời gian nghiên cứu từ tháng 2/2015 đến tháng 6/2015 tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Hóa Học & CNTP Trường Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu Và một số thí nghiệm được kiểm tra tại trung tâm Sắc Kí Hải Đăng, TP Hồ Chí Minh

Nghiên cứu quá trình lên men sản xuất thạch cacao bằng loài vi sinh vật

A Xylilum đã tiến hành thí nghiệm được bố trí như hình (2.1)

Để nguội

DAP SA Đường

- Yếu tố cố định:

+ Dịch lên men 500ml + Thời gian 9 ngày lên men - Yếu tố khảo sát:

+ Tỷ lệ dịch cơm nhầy:nước (v/v): kí hiệu N;

+ Thời gian: sau 9 ngày lên men;

+ Tỷ lệ dịch ép cacao:nước (v/v) tìm được ở thí nghiệm 1 - Yếu tố khảo sát:

+ Tỷ lệ giống, kí hiệu G;

+ Khảo sát ở 5 mức G1 (6%), G2 (8%), G3 (10%), G4 (12%), G5 (14%) Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố khảo sát và 3 lần lặp lại (bảng 2.2) Tổng số thí nghiệm: 5 x 3 = 15

Bảng 2.2 Bố trí các nghiệm thức tỷ lệ giống vào mẫu thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm

+ Thời gian: sau 9 ngày lên men

+ Tỷ lệ dịch ép cơm nhầy : nước tìm thấy ở thí nghiệm 1; + Tỷ lệ giống bổ sung vào tìm thấy ở thí nghiệm 2

- Yếu tố khảo sát: + Brix, kí hiệu B;

+ Khảo sát ở 5 mức B1 (4,5), B2 (6,5), B3 (8,5), B4 (10,5), B5 (12,5) Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố 3 lần lặp lại (bảng 2.3) Tổng số thí nghiệm: 5 x3 = 15

Bảng 2.3 Bố trí các nghiệm thức Brix vào mẫu thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm

- Mục đích: nhằm đánh giá tác động của pH lên khả năng tổng hợp

cellulose của vi khuẩn A.xylinum, từđó xác định được khoảng pH tối ưu cho

vi khuẩn trong quá trình sinh tổng hợp cellulose - Yếu tố cố định:

+ Dịch lên men: 500ml;

+ Tỷ lệ dịch cacao:nước tìm được ở thí nghiệm 1; + Tỷ lệ giống bổ sung vào tìm ở thí nghiệm 2; + Brix tìm được ở thí nghiệm 3

Chỉ tiêu phân tích: độ dày (đo bằng thước), khối lượng (cân bằng cân phân tích 4 số)

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ(NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 bổ sung vào môi trường dịch ép cacao đến độ dày và khối lượng của thạch cacao

- Mục đích: tìm ra nồng độ (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4thích hợp để bổ sung vào môi trường dịch ép cơm nhầy khi lên men sản xuất thạch

- Yếu tố cố định:

+ Dịch lên men: 500ml;

+ Thời gian: sau 9 ngày lên men;

+ Tỷ lệ dịch cacao : nước tìm được ở thí nghiệm 1; + Tỷ lệ giống bổ sung vào tìm ở thí nghiệm 2; + Nồng độ Brix tìm được ở thí nghiệm 3; + Độ pH tìm được ở thí nghiệm 4

- Yếu tố khảo sát:

+ Nồng độ (NH4)2SO4, kí hiệu S;

+ Khảo sát ở 4 mức S1 (0,3), S2 (0,5), S3 (0,7), S4 (0,9); + Nồng độ (NH4)2HPO4, kí hiệu H;