Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu quy trình sản xuất Bromelain từ phế phẩm dứa

Do đó, luận văn “Nghiên cứu quy trình sản xuất Bromelain từ phế phẩm dứa” đã được đề xuất phương pháp chiết tách, tinh sạch, tạo chế phẩm enzyme có giá trị sử dụng cao từ phế liệu.. Mặc

TỔNG QUAN

Giới thiệu về dứa

Dứa là một trong những loại trái cây nhiệt đới có sản lượng đứng thứ 3 trên thế giới sau chuối và cam quýt và có nguồn gốc ở Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay) Dứa thuộc họ Bromeliaceae, chi Ananas tên khoa học là Ananas comosus L Merryl[1] Tương tự như các loại trái cây khác, dứa đóng vai trò quan trọng trong chế độ ăn uống của chúng ta vì có chứa enzyme, protein, vitamin và khoáng chất Thịt dứa tươi có thể dùng để sản xuất thành một loạt các sản phẩm như dứa đóng hộp, nước ép dứa cô đặc, và mứt dứa[2]

Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa, gồm 7 nhóm trong đó có 3 nhóm chính là nhóm Cayen, nhóm Queen và nhóm Spanish[3]

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng trong dứa

Bảng dưới đây cho thấy thông tin về giá trị dinh dưỡng của ba loại dứa chính ở Việt Nam

Bảng 2.1: Thành phần của các giống dứa ở Việt Nam (giá trị/100g dứa)

Thành phần Smooth Cayenne Pineapple MD2 Queen

Năng lượng 190kJ 215kJ 186kJ

Số liệu cho thấy dứa có độ ẩm khá cao (> 85g/100 g mẫu) cung cấp lượng năng lượng lớn (~200 KJ/100 g mẫu) Ngoài ra dứa cũng chứa một lượng tương đối vitamin C, magie, carbohydrate, canxi

2.1.3 Tình hình sản xuất trên thế giới và Việt Nam

Dứa là nông sản có ý nghĩa hết sức quan trọng, đứng thứ 2 sau chuối; đóng góp trên 20% sản lượng trái cây nhiệt đới trên thế giới

Hình 2.1: Phân bố địa lý của dứa năm 2018

Top 10 quốc gia sản xuất dứa lớn thay đổi qua các năm, tuy nhiên Brazil, Philippines vẫn là 2 nước có sản lượng dứa trong top 3 qua nhiều năm Từ số liệu ta thấy năng suất dứa trên thế giới tăng khá nhanh, cho thấy mức độ phát triển cũng như sự ưa chuộng mà trái dứa mang lại [4]

Bảng 2.2: Top 10 quốc gia có sản lượng dứa cao nhất trên thế giới trong những năm 1990, 2000, 2014

Thái Lan 1865 Thái Lan 2248 Costa Rica 2915

Brazil 1104 Philippines 1559 Philippines 2507 Ấn Độ 881 Ấn Độ 1020 Thái Lan 1915

Việt Nam 468 Trung Quốc 856 Nigeria 1465

Trung Quốc 462 Kenya 606 Trung Quốc 1433

Hình 2.2: Phân bố địa lý của năng xuất dứa Việt Nam năm 2018 Ở nước ta dứa được trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% ở phía Nam Các tỉnh trồng nhiều dứa ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc là 10 tấn/ha và ở miền

Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ Ở miền Bắc, vụ chính ra hoa vào tháng 2-3, thu hoạch tháng 6-7; trái vụ ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12 Ở miền Nam, cây dứa có thể ra hoa quanh năm, song thường tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10 [3]

Hơn 50% khối lượng của quả dứa là phế phẩm (lá, cùi, vỏ, chồi) Hằng năm có hơn 250,000 tấn phế phẩm dứa thải ra môi trường Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào sẵn có cho những nhà máy sản xuất Bromelain và thức ăn gia súc

2.1.5 Tình hình nghiên cứu các ứng dụng từ phế phẩm dứa trên thế giới và Việt Nam

- Nghiên cứu những hợp chất có khả năng chống oxy hóa từ phế phẩm dứa Năm

2002, Jie Sun và các cộng sự đã chỉ ra rằng khả năng chống oxy hóa từ 100 g dứa tương đương với 298 mg vitamin C bằng cách phân tích hàm lượng phenolic dạng tự do và dạng liên kết sau đó sử dụng phương pháp TOSC để đo tổng hoạt tính chống oxy hóa [5] Kết quả thu được tuy không cao nhưng cũng cho thấy hiệu quả của trái dứa đối với khả năng chống oxy hóa

- Sản xuất ethanol từ nước dứa và phế phẩm dứa Nhận thấy lượng dứa có chất lượng thấp bị bỏ đi rất lớn trên thế giới, K Tanaka và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sản xuất ethanol từ nước dứa bằng cách thủy phân saccharose thành glucose và fructose, sau đó lên men bằng vi sinh vật Z mobilis ATCC 10988 Kết quả cho thấy nước ép từ dứa bị loại bỏ là nguồn nguyên liệu giá rẻ để sản xuất ethanol [6]

- Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm từ phế phẩm lá dứa Năm 2005, T Taira, N

Toma và M Ishihara đã xác định được 3 chitinase từ lá dứa bằng cách sử dụng cột sắc kí ái lực cao Kết quả thu nhận cho thấy PL Chi-A không có hoạt tính kháng nấm trong khi PL Chi-B có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với Trichoderma ở nồng độ ion thấp Đối với nồng độ ion cao thì hoạt tính kháng nấm của PL Chi-B và C tương ứng là mạnh và yếu [7]

- Phạm Thị Trân Châu và ctv (1987) nghiên cứu một số tính chất của enzyme

Bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa có chứa hai protease và Bromelain có hoạt tính cực đại ở pH 6,5 và nhiệt độ tối ưu là 60 o C[8]

- Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng

Bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tinh sạch bromelin bằng phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao[9]

- Nghiên cứu về quá trình lên men từ chất thải dứa Năm 2015, Nguyễn Thúy Nga và Nguyễn Thế Trang đã nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men chất thải từ dứa bằng Methanobacterium Nhận thấy chất thải dứa thu được sau quá trình sản xuất chiếm tới 30-50% trọng lượng nguyên liệu; tuy nhiên trong những chất thải này còn chứa lượng đường, albumin, lipid và vitamin có thể phân hủy dưới tác động của vi sinh vật Sau khi nghiên cứu, nhóm tác giả nhận thấy chất thải dứa là nguyên liệu tốt để lên men tạo nguồn khí biogas lớn, điều này không những tạo nên những lợi ích to lớn trong kinh tế mà còn giúp bảo vệ môi trường[10]

- Nghiên cứu ảnh hưởng của siêu âm lên pectinase trong quá trình chế biến nước dứa từ bã Năm 2011, Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự đã nghiên cứu tập trung vào tác động của siêu âm đến hoạt tính xúc tác pectinase Kết quả cho thấy sự thay đổi về thời gian và nồng độ enzyme gây ảnh hưởng lớn đến hoạt tính pectolytic

Dung dịch sử dụng là pectinase chứa 63,3 đơn vị polygalacturonase/ml được siêu âm trong 60s với công suất 225 W Kết quả thu được pectinase tăng 5,6 % so với dung dịch ban đầu Từ đó cho thấy trong điều kiện nhất định siêu âm không làm giảm hay biến tính enzyme mà còn giúp tăng chất lượng nước dứa thu được [11].

Enzyme

Enzyme là một loại protein hoạt động như một loại xúc tác sinh học trong tế bào sống Nó giúp tăng tốc độ và khả năng phản ứng hóa sinh mà không bị hao hụt hay mất đi sau quá trình phản ứng[12]

Enzyme tồn tại trong hầu hết tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật, có thể xúc tác các phản ứng ngay ở trong và ngoài cơ thể

Xúc tác enzyme có các ưu điểm như:

- Làm giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết của các phản ứng hóa học

- Làm tăng tốc độ phản ứng nhưng không làm thay đổi chiều phản ứng

- Có tính đặc hiệu cao: mỗi enzyme đều có tính chọn lọc cao đối với một cơ chất hoặc một phản ứng nhất định, một vài enzyme có tính đặc hiệu hóa học lập thể (đặc hiệu quang học)

Cơ chế xúc tác của enzyme:

E+S → ES → ES*→ E+P - Ở giai đoạn 1: cơ chất S liên kết với enzyme E bằng liên kết yếu tạo ra phức hợp enzyme-cơ chất Phản ứng này thường rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng

- Ở giai đoạn tiếp theo: enzyme tác động lên cơ chất làm biến đổi cấu hình không gian và các liên kết bên trong cơ chất, từ đó phá vỡ liên kết và tạo ra sản phẩm

- Giai đoạn cuối cùng: sản phẩm được tạo ra tách khỏi enzyme

→ Do đó chỉ cần 1 lượng năng lượng nhỏ cũng làm biến đổi cơ chất S thành sản phẩm P

Trong dịch chiết thô từ thân dứa có tới 4 protein cysteine là Bromelain thân (thành phần chính), Ananain, Comosain (thường gộp chung vô nhóm Ananain do khi chạy sắc kí thì Comosain thường trùng peak với Ananain) và Bromelain quả

Còn trong dịch chiết từ trái dứa chứa chủ yếu là Bromelain quả và 1 lượng nhỏ Bromelain thân Ananain có trọng lượng phân tử gần bằng Bromelain quả trong khi

Bromelain thân thì lớn hơn Tuy Ananain và Bromelain khác nhau về hoạt lực với cơ chất nhưng Ananain chỉ chiếm vài phần trăm trong tổng số protein trong dứa nên không cần phân tách trong quá trình tinh sạch[13]

Bromelain là một loại enzyme thu được từ thân và trái dứa chứa nhóm sulfhydryl thủy phân protein, chiếm khoảng 50% tổng lượng protein trong dứa

Ngoài ra trong dịch chiết Bromelain còn chứa 1 ít peroxidase, acid phosphate, một vài chất ức chế protease; tuy nhiên peroxidase chỉ tồn tại trong dứa tươi, còn khi lưu trữ Bromelain từ 3-6 tháng thì peroxidase sẽ biến mất [14]

Bromelain có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa [15] Người ta đã tìm được

2 loại Bromelain từ cây dứa là Bromelain thân (từ gốc dứa) và Bromelain quả (từ trái dứa); cả 2 loại này đều thuộc nhóm EC 3.4.22.4 Thành phần chính của

Bromelain thân là proteinase F4, F5 và proteinase F9; tuy proteinase F9 chỉ chiếm

2% tổng lượng protein nhưng hoạt tính lại cao hơn khoảng 15 lần so với thành phần chính là F4 Bromelain thân là một chuỗi 212 amino acid hoàn chỉnh, thường bắt đầu chuỗi bằng valine hoặc alanin Đối với pH, proteinase F4 và F5 tối ưu ở pH=44,5; trong khi F9 có pH tối ưu là trung tính [16]

Bromelain quả có amino acid ở đầu và cuối chuỗi đều là alanin; là 1 protein đơn giản, không chứa đường amino hay carbohydrate có trọng lượng phân tử khoảng 31kDa, pH = 4,6; một phần chuỗi amino acid là Ala-Val-Pro-Gln-Ser-Ile- Asp-Trp-Arg-Asp-Tyr-Gly-Ala Trong khi Bromelain thân là một glycoprotein cơ bản, có chứa một vài nhóm monosaccharide Trình tự acid amin trong Bromelain quả và thân giống hệt nhau, chỉ có khác nhau khối lượng, số lượng và cách sắp xếp các amino acid nhưng cũng thể hiện sự khác biệt đáng kể tới hoạt tính xúc tác Giá trị pH tối ưu là 8,0 và 8,3 đối với hemoglobin và casein [17]

Năm 1970, Yoko Yasuda và cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc của Bromelain thân và chỉ ra trong 1 đơn vị carbohydrate của Bromelain chứa 3 mannose, 1 frucose, 1 xylose và 2 N-acetylglycosamine [18]

Hình 2.3: Cấu trúc hóa học của Bromelain

Từ thực nghiệm ta thấy Bromelain thân có hoạt tính enzyme cao hơn nhiều so với Bromelain quả khi cho 2 enzyme này thủy phân gelatin [15]

2.2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bromelain

- Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những cơ chất khác nhau thì Bromlain có hoạt tính khác nhau Nếu cơ chất là Hemoglobin thì khả năng phân giải của Bromelain mạnh hơn Papain 4 lần, nếu cơ chất là Casein thì hoạt tính Bromelain tương tự như Papain hoặc nếu là BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì hoạt tính

Bromelain chỉ bằng 0,065 lần so với Papain [19]

- Ảnh hưởng bởi nhiệt độ

- Ảnh hưởng bởi pH: Xác định sự ảnh hưởng của enzyme Bromelain bởi pH bằng cách thử với Hemoglobin, ta thấy pH=2,9 và nhiệt độ 7C là điều kiện enzyme hoạt động tối ưu Còn khi thử với Azoalbumin thì pH=7,5 và pH=6,5 đối với Azocasein , cùng ở nhiệt độ 55C [20] Như vậy pH tối ưu của Bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt [12]

- Ảnh hưởng bởi ion kim loại: hoạt tính của Bromelain bị ức chế mạnh bởi HgCl2, thực tế cho thấy hoạt lực sẽ giảm 50% khi có HgCl2 0,45.10 -6 M [19]

- Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản

2.2.3 Công dụng của enzyme Bromelain

Năm 2001, Christian R Engwerda và cộng sự đã nghiên cứu sự tác động của enzyme Bromelain lên quá trình đáp ứng miễn dịch Bằng cách thử hoạt tính in vitro trên tế bào lá lách chuột và in vivo trên chuột cái từ 6-8 tuần tuổi đã nhận thấy

Bromelain có thể tăng cường receptor tế bào T (T cell receptor- TCR) và kích thích sự phát triển tế bào T qua CD28 trong splenocyt bằng cách tăng costimulatory Tuy vậy Bromelain đồng thời làm giảm sản xuất IL-2 trong splenocyt, được coi như tín hiệu kích thích tế bào T Do đó, Bromelain được nhận định là vừa kích thích và ức chế đáp ứng miễn dịch, có ý nghĩa quan trọng trong việc sản xuất vaccine hay thuốc điều hòa miễn dịch, thuốc chống viêm từ cây dứa [21]

Năm 1999, Klaus Eckert và cộng sự đã nghiên cứu tác động của Bromelain lên tế bào ung thư vú Nghiên cứu được thực hiện bằng đường uống trên 20 bệnh nhân ung thư vú chưa từng sử dụng thuốc hay liệu pháp chữa trị nào, với tình trạng bệnh 70 % và độ tuổi trung bình là 56 Song song với 20 bệnh nhân này, Klaus Eckert và cộng sự cũng kiểm tra ảnh hưởng trên 17 người tình nguyện khỏe mạnh với độ tuổi từ 28-51 Bromelain được dùng trong 10 ngày với liều dùng hằng ngày là 3000 đơn vị F.I.P Sau đó, tế bào monocyte và lymphocyte được lấy ra khảo sát ảnh hưởng sau khi sử dụng Bromelain Kết quả thu được cho thấy Bromelain làm tăng hoạt tính tế bào bMAK và tế bào MAK trên monocyte tới 2 lần và giảm CD4 trên lymphocyte của người bệnh; có khoảng 40% bệnh nhân thể hiện đáp ứng miễn dịch với Bromelain Trong khi đó, Bromelain lại ít ảnh hưởng tới monocyte của người tình nguyện, nhưng lại kích thích tiết IL-1 Từ đó cho ta thấy khả năng kích thích độc tính trong monocyte của bệnh nhân dưới tác động Bromelain, đây chính là lí do Bromelain có thể ứng dụng như chất chống ung thư [22]

Các nghiên cứu về enzyme Bromelain

Theo qui trình của Indumathy.S và cộng sự, 10g mẫu được đồng nhất hóa trong dung dịch đệm photphat 0,2M (pH-7) (điều kiện làm mát) (tỷ lệ 1:1) Dịch lọc là ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút Lớp dịch phía trên được lưu trữ và sử dụng làm nguồn enzyme với hoạt độ 12,3 U/mg[36] Các bước chính tham gia vào quá trình chiết xuất theo Ruchita Dubey như sau: Khoảng 160g dứa được làm sạch tốt bằng nước sau đó nghiền thành từng mảnh và thêm đệm natri acetate để chiết

Các trích xuất được phân tách bằng cách sử dụng bộ lọc giấy Sau đó, dịch chiết được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút thì hoạt độ đo được là 6,98 [37] Bốn dung môi được sử dụng trong thí nghiệm này: nước cất (DI), nước cất với 15 mM cystein và 2 mM EDTA (DI-CE), đệm natri phosphat 100 mM pH 7,0 (PB) và dung dịch đệm natri phosphat 100 mM pH 7,0 với 15 mM cysteine và 2 mM EDTA (PBCE) Vỏ dứa được trộn trong chất chiết lạnh với tỷ lệ 1:1 (w/v) trong 3 phút và sau đó được lọc thông qua một miếng vải phô mai Dịch lọc được ly tâm tại

10.000g trong 20 phút ở 4 o C Kết quả hoạt tính riêng như sau: DI (13,26 U/mg), DI- CE (11,79), PB (10,41) và PBCE (11,23)[38]

2.3.2 Các phương pháp tinh sạch Bromelain

Cơ sở kĩ thuật của phương pháp này là sử dụng 2 pha lỏng không hòa tan vào nhau để phân riêng các thành phần khác nhau trong hỗn hợp dựa vào tỉ trọng, độ hòa tan trong 2 pha Sử dụng hệ 2 pha nước là dung dịch polyethylene 18 % (PEG) và dung dịch kali phosphate 14 % Enzyme Bromelain sẽ tan chọn lọc trong PEG, tức là pha trên của dung môi Tách 2 pha ta sẽ thu được dung dịch Bromelain không lẫn các protein khác Kết quả thu được Bromelain tinh khiết gấp 4 lần và hoạt tính gấp 228 % dung dịch ban đầu [39]

Hay phương pháp chiết micellar ngược (RME) là 1 kĩ thuật chiết xuất lỏng- lỏng tiềm năng cho tinh sạch dòng các phân tử sinh học từ dung dịch loãng, thô ban đầu Cơ sở của phương pháp này là sử dụng chất hoạt động bề mặt cation có kích thước micella để kéo phân tử enzyme Bromelain ra khỏi hỗn hợp dịch chiết thô

Bằng cách sử dụng hỗn hợp CTAB/iso-octane/hexanol/butanol trộn đồng thể tích với dung dịch chiết enzyme/muối nhằm hòa tan chọn lọc protein, sau đó thực hiện giai đoạn tách protein bằng cách thêm 1 dung dịch đệm đã biết pH có thêm KBr

Kết quả thu được Bromelain với độ tinh khiết gấp 5,2 lần và hoạt tính tăng 116%

Lực liên kết chính trong 1 chuỗi polypeptide và giữa các chuỗi với nhau giúp cho protein có hình dạng ổn định với mức năng lượng nhỏ nhất, bao gồm liên kết ion-ion, ion lưỡng cực, lưỡng cực-lưỡng cực và liên kết kị nước Cấu trúc của protein trong dung dịch phụ thuộc vào các phân tử và ion có trong dung dịch đó

Với nước là một dung môi phân cực mạnh; khi protein trong nước thì nước sẽ kéo các phân tử protein ra khỏi nhau bằng cách liên kết lưỡng cực với protein; do vậy giúp các phân tử protein lơ lửng được trong nước Nhưng khi thêm một số muối hoặc chất hữu cơ như amoni sulfate, NaCl, ethanol, acetone, v.v.vào thì những chất này liên kết cạnh tranh với protein, phá vỡ lớp liên kết protein-nước khiến các phân tử protein liên kết với nhau tạo thành đại phân tử và kết tủa Kết quả thu được từ nghiên cứu của Paulo Soares và các cộng sự cho thấy sử dụng phương pháp kết tủa với dung môi là ethanol thu được Bromelain tinh khiết hơn 2,34 lần và hiệu suất thu enzyme là 41,91 Đối với dung môi amoni sulfate thì độ tinh khiết thu được là 4,4 lần và hiệu suất là 44% [41]

Tinh sạch Bromelain bằng hấp phụ là phương pháp sử dụng các chất có hình dạng vật lí và tính chất hóa học đặc biệt như nhựa, hạt nano phức hợp sắt để giữ phân tử Bromelain ở trong, từ đó tách và tinh sạch enzyme ra khỏi hỗn hợp thô ban đầu Năm 2004, Dong-Hwang Chen và Shih-Hung Huang đã sử dụng các hạt nano hỗn hợp oxit sắt gắn lên PAA (polyacrylic acid) để hấp phụ phân tử enzyme

Bromelain Sau khi loại bỏ các hạt nano thì thu được Bromelain với hoạt tính

87,4% Phương pháp trên cho hiệu quả tinh sạch khá cao, thời gian ngắn nhưng cần kiểm tra kĩ về chất lượng của hạt nano theo yêu cầu về lực ion, kích thước, và hình dạng v.v.[42] Đối với nghiên cứu của Silveira và cộng sự, nhóm tác giả đã tiến hành tinh sạch Bromelain bằng cách hấp phụ enzyme cho dung dịch enzyme thô đi qua cột có chứa nhựa trao đổi ion Amberlite IRA 410 Sau quá trình rửa giải cột thì thu được hệ số tinh sạch khoảng 76,47 %, cho thấy mức độ tinh sạch khá cao nhưng khá tốn kém khi thực hiện bằng phương pháp này [43]

2.3.2.4 Phương pháp sắc kí trao đổi ion

Cơ sở kĩ thuật của sắc kí trao đổi ion là dựa trên điện tích bề mặt khác nhau của các phân tử protein, do vậy tùy theo lực liên kết giữa phân tử protein với cột sắc kí khác nhau thì sẽ thu được những chất khác nhau, giúp tinh sạch hỗn hợp ban đầu Đây là phương pháp phổ biến để tách protein, thu được những hợp chất tinh khiết; tuy nhiên chi phí cao và lượng mẫu cho một lần tinh sạch rất nhỏ.[44]

Năm 2010, Gautam và cộng sự đã sử dụng sắc kí trao đổi ion để khảo sát mức độ tinh sạch Bromelain Cột được nhồi bằng diethylaminoethyl (DEAE) cellulose, sử dụng dung dịch đệm là 25 mM Tris HCl và 25 mM NaCl để rửa giải

Kết quả thu được hoạt tính Bromelain cao nhất khi rửa giải dịch chiết từ thân là

14875 units/gam [15] Đối với kết quả của Devakate và cộng sự cho thấy sử dụng sắc kí trao đổi ion với nhựa cation thu nhận Bromelain với hiệu quả 80-90% và độ tinh khiết gấp 3,3 lần so với phương pháp kết tủa bằng amoni sulfate [45]

Công nghệ màng lọc là phương pháp được sử dụng nhiều gần đây để tách các thành phần của dung dịch dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử cũng như cô đặc protein mà không làm ảnh hưởng tới chất lượng cũng như hoạt tính của chúng

Ultra-filtration (UF) là một quá trình trong đó thành phần trọng lượng phân tử cao, chẳng hạn như protein và chất rắn lơ lửng đi vào dòng permate, trong khi tất cả các thành phần trọng lượng phân tử thấp đi qua màng một cách tự do Do đó có sự loại bỏ thấp các mono- và di-sacarit, muối, axit amin, chất hữu cơ, axit vô cơ hoặc natri hydroxit [46]

Năm 2009, FLG Lopes và cộng sự đã sử dụng màng polyvinyl fluorite với kích thước lỗ 0,1m để tiến hành khảo sát mức độ tinh sạch với dịch lọc dứa Dứa được xay và lọc qua vải cotton, sử dụng đệm phosphate pH bằng 7 và 7,5 để ổn định Sau đó dịch nước dứa này được li tâm ở 7000 rpm trong 20 phút rồi thực hiện chạy qua màng lọc với áp suất 0,05 bar Khảo sát hoạt tính dịch lọc cuối cùng cho thấy có thể thu hồi 90% enzyme và tổng thể tích giảm 10 lần sau quá trình lọc màng [47]

NỘI DUNG THỰC HIỆN

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu trong đề tài này là phế phảm dứa được thu nhận tại các chợ nông sản trên địa bàn TP HCM gồm có vỏ, mắt, chồi

Hình 3.1: Phế phẩm dứa 3.1.2 Hóa chất

Hãng Merck: Folin, Phenolphthalein, NaOH 0,1N, KNaC4H4O6.4H2O, DNSA

Hãng Xilong: Na2HPO4.2H2O; KH2PO4 99%; Na2CO3 98%;

CuSO4.5H2O; Na3C6H5O7, H2O2, HCHO, HCl, NaOH

Hãng Sigma: Bovine Serum Albumin (BSA), Glucose Gelatin A250 Bloom, France

Bromelain chuẩn: Shyuanya Chuẩn Vitamin: Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM Thiết bị

- pH kế: Thermo scientific-Eutech

− Máy quang phổ UV-Vis: DR 5000

− Hệ thống sắc ký lỏng: HPLC Agilent 1100

• 2 bể chứa nhựa HDPE 40 lít cho nguyên liệu và sản phẩm

• Máy bơm nước điện (Nhật Bản)

• Cột lọc chất lỏng Đài Loan 1 Micron được sử dụng làm tiền lọc (poly- propylene)

• Bộ vi lọc 0,2àm Đài Loan (MF)

• Hệ thống ống nhựa HDPE

• Một bộ trao đổi nhiệt dạng ống lồng ống và vỏ được tuần hoàn với nước được sử dụng để duy trì nhiệt độ không đổi của dịch chiết

• 2 đồng hồ đo áp suất của màng, 2 nhiệt kế của bể cấp liệu và bể sản phẩm

Hình 3.2: Hệ thống vi lọc (MF)

- Hệ thống siêu lọc và Nano:

• Bơm tăng áp Aqua 110 psi với lưu lượng 0,31 gpm

• Bộ lọc than hoạt tính Nano-Silver Đài Loan

• Màng lọc ceramic ⁓100kDa (UF)

• Bộ lọc NanoCeram ⁓10kDa (NF)

- Thiết bị sấy đông khô: Eyela model FDU-2110

Phương pháp nghiên cứu

Việc sản xuất bromelain được mô tả bởi Xian Lukee (2015)[63] Các bước bao gồm: (i) chiết xuất, (ii) thu hồi, (iii) tinh chế và (iv) sấy khô và nghiền, để sản xuất bột Bromelain cho mục đích thương mại hóa Trong bước chiết, các phần dứa được rửa sạch, cắt thành các mảnh nhỏ và trải qua quá trình ly giải cơ học bằng cách sử

Hình 3.3: Hệ vi lọc UF (trái) – Hệ lọc nano NF (phải)

Hình 3.4: Máy sấy đông khô Eyela FDU-2110 dụng lực cắt cơ học để phá vỡ các tế bào thực vật và tách enzyme ra khỏi tế bào bằng cách hòa tan enzyme trong nước hoặc đệm[45, 47] Tiếp theo, chiết xuất thô được áp dụng các kỹ thuật tinh chế khác nhau để loại bỏ các chất gây ô nhiễm cũng như để tăng hoạt động cụ thể của enzyme Nói chung, bất kỳ phương pháp nào phù hợp cho phân đoạn protein đều có thể được sử dụng để tinh chế Bromelain Tuy nhiên, đối với mục đích sản xuất, các phương pháp tinh chế giới hạn ở những phương pháp có thể scale-up với chi phí hợp lý[64] Sau khi tinh chế các enzyme đến mức mong muốn, các chế phẩm cần phải được làm khô bằng cách đông khô dịch chiết[45, 53] Dựa vào các nghiên cứu trước đó về sản xuất enzyme Bromelain và điều kiện hiện có phục vụ cho thực nghiệm ở trung tâm Lọc Hóa Dầu (đại học Bách Khoa) chúng tôi đề xuất quy trình tạo chế phẩm enzyme như hình 3.5

Hình 3.5: Quy trình tạo chế phẩm enzyme Bromelain từ phế phẩm dứa

Trong bước chiết, phế phẩm dứa bao gồm chồi (40%), vỏ (40%) và thịt (20%) được rửa sạch, cắt thành các mảnh nhỏ và trải qua quá trình trích ly bằng cách sử dụng lực cắt cơ học và hỗ trợ của siêu âm để phá vỡ các tế bào thực vật và tách enzyme, protein ra khỏi tế bào bằng cách hòa tan enzyme, protein trong đệm phosphate ở pH 7,0 Tỷ lệ giữa chất rắn và chất lỏng là 1:2 (w/v) Việc chiết xuất được tiến hành trong bể siêu âm trong khoảng thời gian 10 phút ở 4 o C Hỗn hợp này sau đó được lọc qua bộ lọc 35 phút để loại bỏ chất rắn lớn Dịch chiết thô thu được lắng ở 4°C trong 24 giờ Dịch sau khi lắng được tách ra và dẫn vào bể chứa vật liệu để được lọc bằng hệ thống màng MF, UF và NF Sau đó, dịch tinh sạch được cấp đông ở -60 độ và tiến hành sấy đông khô trong 24h

3.2.2 Trích ly enzyme trong phế phụ phẩm dứa

Trong quá trình chiết, enzyme từ nguyên liệu sẽ hòa tan và khuyếch tán vào dung môi Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hòa tan enzyme là pH, tỷ lệ dung môi và nguyên liệu, thời gian trích ly và nhiệt độ chiết Ngoài enzyme còn có các protein dễ tan, các carbonhydrat và nhiều chất khác nên cần xác định nhiệt độ thích hợp Bên cạnh đó, chất cần trích ly là enzyme khá nhạy cảm nên khảo sát pH từ 4 – 9 Thời gian trích ly là yếu tố cần khảo sát do hỗn hợp enzyme trích ly có mặt protease có thể tự phân nếu kéo dài thời gian chiết Tỷ lệ rắn lỏng cũng là một trong những yếu tố quan trọng vì nếu tỷ lệ dung môi thấp thì các chất chưa hòa tan hết trong dung môi, ngược lại nếu tỷ lệ quá cao thì nồng độ enzyme sẽ loãng và khó thu hồi

→ Khảo sát 4 yếu tố: pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9

Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (ml/g): 1, 2, 3, 4

Thời gian (phút): 5, 10, 15, 20, 25, 30 Nhiệt độ ( o C): 4, 15, 28, 50

3.2.3 Tinh sạch enzyme bàng kỹ thuật lọc màng

Trong dịch chiết enzyme thô, ngoài enzyme còn có các chất hòa tan, protein tạp, đường v.v Để tinh sạch dịch enzyme, tôi sử dụng kết hợp hai kỹ thuật lọc màng là vi lọc (MF) và siêu lọc (UF-NF) Lọc MF nhằm loại bỏ tạp chất kích thước lớn trong dịch enzyme đồng thời chuẩn bị cho quá trình siêu lọc Lọc UF - NF nhằm mục đích thu nhận dòng retentate chứa enzyme, kích thước màng lọc được chọn trên cơ sở phân tử lượng của enzyme cần thu nhận Ngoài ra, cần quan tâm đến thời gian lọc do trong hỗn hợp enzyme cần thu nhận có mặt protease sẽ xúc tác tự phân và/hoặc thủy phân enzyme khác Theo lý thuyết lọc màng thì hiệu quả quá trình lọc được đánh giá bằng thông số độ phân riêng, hiệu suất thu hồi cấu tử Hiệu suất thu hồi cấu tử sẽ được tính theo hiệu suất thu hồi enzyme là tỷ số giữa tổng hoạt độ enzyme trong dòng khảo sát và tổng hoạt độ enzyme trong dòng nhập liệu

Hình 3.6: Hệ thống lọc MF

3- Cột lọc thụ 1àm 4- Bộ vi lọc (MF) 5- Thiết bị trao đổi nhiệt

Yếu tố cố định: vật liệu màng polysulfone, chiều dài 10inch, kích thước màng lọc 1àm và 0,2àm

→ Khảo sát các yếu tố: Áp suất (kg/cm 2 ): 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0

→ Xác định áp suất qua màng và thời gian chạy màng thích hợp để thu được enzyme có hoạt độ cao và hiệu suất thu hồi enzyme cao sau lọc MF

3.2.3.1 Quá trình lọc UF - NF

• Quá trình siêu lọc UF:

• Thiết lập hệ thống bao gồm một bể cấp liệu được ngâm trong bể nước đá để điều chỉnh nhiệt độ nguyên liệu đầu vào ở 4 o C ± 0,4 o C Sự thay đổi nhiệt độ được duy trì dưới 10% trong toàn bộ quá trình khảo sát

• Dịch chiết thô, được tinh lọc bằng màng siêu lọc, trong đó chất thấm được thu riêng và chất giữ lại được tái chế vào bể cấp liệu trong các điều kiện vận hành được chọn trước (P = 110 psi, T = 4 ± 0,4°C, tốc độ dòng 55ml/phút) Áp suất, nhiệt độ và tốc độ dòng được chọn theo tính chất của mẫu và thiết lập thử nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu này Nồng độ Bromelain trong nghiên cứu này được đo cho đến khi thu hồi tối đa enzyme

→ Xác định hiệu suất thu hồi sau khi lọc UF

• Quá trình lọc nano NF:

• Điều kiện thiết lập và vận hành hệ thống tương tự như quy trình siêu lọc

• Dịch chiết đã được tinh sạch qua UF sẽ là nguyên liệu đầu vào của hệ NF và được cô đặc bằng màng lọc nano, trong đó những phần tử có kích thước bé hơn 10kDa sẽ đi ra theo dong permate còn các phần tử lớn hơn kích thước trên sẽ đi vào dòng retentate và tuần hoàn lại dòng feed Thí nghiệm được thiết lập để khảo sát VFR sao cho thu được enzyme có hoạt độ cao

Yếu tố cố định: vật liệu màng ceramic, áp suất bơm 110 psi

→ Xác định: độ tinh sạch enzyme Bromelain

Hình 3.7: Quy trình sấy đông khô

Sấy đông khô là một quá trình loại bỏ nước được sử dụng nhiều nhất trong ngành dược phẩm và hoạt động trong môi trường vô trùng Theo quy trình sấy đông khô ở hình 3.7, chất trợ sấy (cryoprotectant) ở pha rắn được pha loãng trong dung dịch đệm phosphat pH 7.0 theo nồng độ thích hợp Tiếp theo, chiết xuất enzyme thô được trộn với cryoprotectant được đông ở -60 o C trước khi hút chân không Quá trình sấy thăng hoa dược diễn ra trong 24h dưới áp suất chân không, nước chuyển từ trạng thái tinh thể băng sang hơi trực tiếp mà không qua pha lỏng [54] Nhiệt độ trong giai đoạn này được tăng dần để làm bay hơi tinh thể băng sau đó loại bỏ ẩm thoát ra khỏi mẫu Ưu điểm sấy đông khô duy trì cấu trúc vật lý và kéo dài thời hạn sử dụng của vật liệu[55]

Khảo sát các yếu tố sau để tìm ra điều kiện sấy đông khô thích hợp:

• Chất trợ sấy: Glucose, Maltodextrin, Skim milk, PEG 4000

• Nồng độ chất trợ sấy (%) : 5, 10, 15, 20, 25

• Tỉ lệ giữa chất trợ sấy và chiết xuất enzyme (ml/ml): 1:2; 1:4;

3.2.5 Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến enzyme protease

3.2.5.1 Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của Protease tinh sạch

Thí nghiệm nghiên cứu bằng cách ủ protease tinh khiết ở các mức pH khác nhau từ pH 3,0 – 10,0 ở 37°C sử dụng gelatin làm cơ chất Các chất đệm được sử dụng là dung dịch đệm axit citric nồng độ 0,1M (pH 3,0 và 4,0), đệm natri axetat (pH 5,0 và 6,0), đệm natri phosphat (pH 7,0 và 8,0) và đệm glycine - NaOH (pH 9,0 và 10,0) Ảnh hưởng của pH đến độ ổn định của protease cũng được xác định đồng thời bằng cách ủ trước enzyme tinh khiết trong các dung dịch đệm tương ứng trong 2 giờ và hoạt tính protease còn lại được thử nghiệm trong điều kiện tiêu chuẩn

3.2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự bền nhiệt của Protease tinh sạch

Thí nghiệm ở các nhiệt độ khác nhau từ 20 o C đến 80 o C sử dụng gelatin làm chất nền Độ bền nhiệt của protease được thử ở nhiệt độ tối ưu (30ºC đến 60ºC) thu được từ phân tích trên bằng cách ủ trước protease trong khoảng thời gian 2h ở các khoảng thời gian khác nhau (30, 60, 90 và 120phút) và các hoạt động protease còn lại đã được đo

3.2.5.3 Xác định các thông số động học của Protease tinh sạch

Phân tích tính đặc hiệu của chất nền và tốc độ của phản ứng enzyme được đo bằng cách sử dụng gelatin và casein làm cơ chất Enzym tinh khiết được ủ trong hỗn hợp phản ứng chứa dung dịch đệm photphat 0,1M ở pH 7,0 với các nồng độ cơ chất khác nhau từ 3mM đến 100mM trong 20 phút ở 30 o C và được đo hoạt độ của protease Một biểu đồ được vẽ bằng cách lấy đối ứng của dữ liệu hoạt độ so với đối ứng của nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng tối đa Vmax, hằng số Michaelis-Menten Km và độ đặc hiệu phản ứng Vmax/Km được xác định bằng cách sử dụng đồ thị Lineweaver-Burk

3.2.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm

Dựa trên các điều kiện tối ưu từ trích ly đến sấy đông khô dịch tinh sạch bằng hệ thống màng lọc sẽ tạo ra chế phẩm Bromelain dạng bột Tiến hành phân tích để đánh giá chất lượng sản phẩm so với một số sản phẩm thị trường[65, 66]

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu và phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm

STT Tên chỉ tiêu Phương pháp

1 Hoạt lực riêng của enzyme GDU

2 Hàm lượng Bromelain HPLC – RID

7 Tổng nấm men, nấm mốc ISO 21527-1:2008 8 Tổng vi sinh vật hiếu khí ISO 4833-1:2013

Các phương pháp phân tích

Định lượng protein trong chiết xuất enzyme bromelain thô được mô tả bởi Lowry et al (1951), sử dụng Bovine Serum Albumin (BSA) làm chất chuẩn[67]

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên hai phản ứng Thứ nhất, phản ứng Biuret trong điều kiện kiềm, các liên kết peptide trong protein phản ứng với đồng để tạo ra phức hợp Cu (II), phản ứng với thuốc thử Folin Thứ hai, phản ứng Folin-Ciocalteau là khử axit hỗn hợp phosphomolybdotungstate thành heteropolymolybdenum màu xanh Đo độ hấp thu của dung dịch này tại 730nm

- Chuẩn bị dung dịch thuốc thử

- Dung dịch A: 0,4g NaOH (0,1M) và 2g Na2CO3 (2%) pha loãng thành 100ml bằng nước cất

- Dung dịch B1: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha loãng thành 50ml bằng nước cất

- Dung dịch B2: 1,14g HOC(COONa)(CH2COONa)2.2H2O pha loãng thành 50ml bằng nước cất

- Dung dịch C: Hỗn hợp 0,5ml B1, 0,5ml B2 và 50ml A (trộn trước khi sử dụng)

- Thuốc thử Folin 0,5N: 1ml Folin 2N với 3ml nước cất - Đường chuẩn Albumin

- Pha loãng dung dịch albumin ở nồng độ 0, 20, 40, 60, 80, 100, 200, 350g/ml trong ống nghiệm được đánh số từ 1 đến 8

Bảng 3.2: Chuẩn bị đường chuẩn Albumin

Hình 3.8: Khảo sát scan bước sóng

Lấy 1ml mỗi nồng độ, thêm vào mỗi ống nghiệm 5ml dung dịch C, lắc đều ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

Bước sóng (nm) Độ hấp thu

Thêm 0,5ml dung dịch thuốc thử Folin, lắc sau đó để trong 30 phút Đo độ hấp thụ của dung dịch ở 730nm, ghi lại kết quả và thiết lập đường cong hiệu chuẩn

- Chuẩn bị mẫu Thêm 1ml dịch chiết enzyme thô (pha loãng 10 lần) vào ống nghiệm sau đó thêm 5ml dung dịch C Sau 10 phút, thêm 0,5ml thuốc thử Folin Đợi trong 30 phút, sau đó đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 730 nm

Dựa trên đường chuẩn tính được hàm lượng protein

Hoạt tính phân giải protein của protease thô có thể được xác định với các chất nền khác nhau Ví dụ: casein, gelatin hoặc tripeptide nhiễm sắc thể[68-70] Trên hết, protease thô có hiệu quả hơn trong việc thủy phân gelatin khi so sánh với casein[71] Do đó, nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích GDU để xác định hoạt động của enzyme Bromelain

- Chuẩn bị dung dịch thuốc thử - 5% Gelatin: Chuẩn bị 100ml trong nước cất bằng Gelatin A250 Bloom

- Dung dịch H2O2 3%: Pha loãng 10ml dung dịch H2O2 30% bằng 101,7ml nước cất

- Phenolphtalein 0,1% : Hòa tan 0,01g Phenolphtalein trong 10ml cồn 95%, đậy kín sau đó bảo quản trong chai thủy tinh màu nâu sẫm y = 0.0023x + 0.0089 R² = 0.9996

Nồng độ àg/g Đường chuẩn BSA

- Lấy cốc sạch và khô sau đó chuẩn bị dung dịch trong bảng sau:

Bảng 3.3: Xác định hoạt tính của enzyme

Mẫu thử : Thêm 1 ml enzyme và 25ml gelatin 5%, lắc đều và cho vào bể nước 45 o C Sau 20phút, thêm 0,1ml H2O 3% và ủ thêm 5 phút nữa

Sử dụng dung dịch NaOH 0,1N tiêu chuẩn để điều chỉnh pH 6,0, khuấy với 10ml HCHO 37% Thêm 4 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N tiêu chuẩn Màu sắc thay đổi từ không màu sang màu hồng sáng cho thấy độ pH 9,0

Ghi lại thể tích NaOH chảy xuống, đó là thể tích chuẩn độ cho mẫu thử T

Mẫu trắng : Lặp lại tiến trình trên nhưng theo trình tự ngược lại, H2O2 phản ứng với gelatin trước, sau đó thêm 1ml dung dịch enzyme thô sau 20phút

Cuối cùng, ghi lại thể tích NaOH chảy xuống, đó là thể tích chuẩn độ cho mẫu trắng

Những phương pháp này bao gồm sấy lò, sấy hồng ngoại và sấy vi sóng Tất cả ba trong số các phương pháp này là đo nhiệt độ[72]

Khi các phương pháp suy luận được sử dụng, độ ẩm được xác định gián tiếp

Một tính chất vật lý liên quan đến độ ẩm trong chất được đo (ví dụ: độ dẫn điện)

Những phương pháp này bao gồm các phương pháp điện dung và quang phổ

Nghiên cứu này đã sử dụng máy phân tích độ ẩm là cách nhanh chóng và chính xác để xác định độ ẩm bằng máy phân tích độ ẩm Sartorius-MA35[73]

3.3.4 Hàm lượng Bromelain (HPLC-RID) [74]

- Cột Ultrahydrogel 250, 6 àm, 7,8 x 300 mm, 1kDa – 80 kDa - Pha động: nước khử ion được lọc qua màng 0,2 àm chứa 10% acetonitril và axit trifluoroacetic 0,2% và siêu âm để đuổi bọt khí trong 60 phút trước khi sử dụng

- Chế độ đẳng dòng với tốc độ dòng động của pha động là 1,0 ml.min -1 - Hệ thống sắc ký lỏng được trang bị đầu dò khúc xạ

- Nhiệt độ cột và máy dò tương ứng là 50°C và 35°C

Axit ascoricic hoặc vitamin C đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của thực vật Một quả dứa chín khỏe mạnh có thể cung cấp khoảng 16,2% nhu cầu hàng ngày cho vitamin C[75] Vitamin này chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn và virus là một chất chống oxy hóa hiệu quả, hỗ trợ sự hình thành collagen trong xương, mạch máu, sụn, cơ bắp cũng như giúp cơ thể hấp thụ chất sắt[76] Mặt khác, vitamin C là một chất nhạy cảm có thể dễ dàng bị mất trong nhiều điều kiện như tiếp xúc với ánh sáng, nhiệt độ cao và oxy[77] Thêm vào đó, giữa việc gọt vỏ, pha trộn, lọc, xả (loại bỏ không khí ra khỏi lon dứa) và thanh trùng, quá trình gọt vỏ đã thu được tỷ lệ vitamin C cao nhất trong dứa với 41,8% [78]

Bảng 3.4: Các thông số chạy máy HPLC-UV

Tốc độ dòng 1 ml/min Đầu dò UV 250 nm

Kiểm tra các chỉ tiêu sau: Coliform, Escherichia coli, tổng số nấm men, nấm mốc và tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) theo chuẩn ISO Các chỉ tiêu này được thực hiện bởi Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP.HCM

Vi khuẩn Coliform là các tế bào hình que, không hình thành bào tử, có tính hiếu khí hoặc kỵ khí và tạo ra axit và khí bằng cách phân hủy đường sữa trong vòng 48 giờ Thuật ngữ coliform được sử dụng trong lĩnh vực vi khuẩn vệ sinh thực phẩm và bao gồm nhiều Enterobacteriaceae, chẳng hạn như các loài trong chi Citrobacter, Enterobacter, Escherichia và Klebsiella[80]

Coliform là vi khuẩn, ở nhiệt độ quy định (nghĩa là 30°C hoặc 37°C như đã thỏa thuận) hình thành các khuẩn lạc đặc trưng trong môi trường thạch đường mật đỏ trung tính tím, và trong xét nghiệm xác nhận gây ra sự lên men của đường sữa với việc sản xuất khí các điều kiện thử nghiệm quy định trong tiêu chuẩn quốc tế này

Cấy phần mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc và ủ 24h ở 30 o C, khi ống thu được cho thấy có màu đục và/hoặc sinh khí thì cấy tiếp vào ống đựng môi trường khẳng định và ủ ở 30 o C trong 24h Kiểm tra ống thu được, nếu cho thấy đục thì khẳng định sự có mặt của coliform Đối với mỗi nồng độ pha loãng, đếm tổng số ống quan sát thấy có sinh khí Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính với mỗi nồng độ pha loãng

E.coli tự nhiên là một phần của hệ thực vật bình thường trong ruột của con người và các động vật khác[82] Trên thực tế, hầu hết E.coli được coi là vô hại đối với con người[83] Tuy nhiên, một số chủng có thể gây bệnh và nhiễm trùng vùng ruột và gây bệnh nặng[84, 85]

Cấy một lượng xác định mẫu thử trong môi trường tăng sinh chọn lọc và ủ 37 o C  1 o C trong 22h  2h Kiểm tra các ống này về sự sinh axit do lên men lactose

Các ống có sinh axit sẽ được cấy truyền vào môi trường thạch trypton-mật- glucoronid (TBX) và ủ 44 o C  1 o C trong 22h  2h Kiểm tra sự có mặt của các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh da trời, nếu có thì dương tính với sự xuất hiện của E.coli Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính với mỗi nồng độ pha loãng

3.3.6.3 Tổng số nấm men – nấm mốc[87]

Nấm men: vi sinh vật hiếu khí mesophilic ở 25°C sử dụng môi trường thạch nấm trong các điều kiện được mô tả trong phần này của ISO 21527, phát triển các khuẩn lạc tròn hoặc sáng bóng trên bề mặt của môi trường, thường có đường viền đều và lồi nhiều hoặc ít hơn bề mặt

Công thức tính toán

• Hoạt độ riêng của enzyme (GDU/g) :

Trong đó, T và B lần lượt là thể tích NaOH dùng để chuẩn độ cho mẫu thử và mẫu trắng, 14 là khối lượng mol của Nitơ, N là nồng độ đương lượng của dung dịch NaOH chuẩn (ở đây N = 0,1 N), Nồng độ protein (mg/ml)

• Hiệu suất thu hồi được tính như sau :

Trong đó, CR,i và CF,i là nồng độ (g/l) cấu tử i trong dòng khảo sát và nguyên liệu ban đầu, VR và VF là thể tích (l) của dòng khảo sát và nguyên liệu ban đầu

• Độ tinh sạch được tính như sau : Độ 𝑡𝑖𝑛ℎ 𝑠ạ𝑐ℎ = 𝐶 𝑏

Trong đó : Cb , CP lần lượt là hoạt độ riêng trong dòng nguyên liệu thô và dòng khảo sát (GDU/g protein)

Trong đó : Cp , Cd lần lượt là hoạt độ riêng ở điều kiện khảo sát và diều kiện chuẩn (GDU/g).

Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê trên phần mềm Excel

Mỗi thí nghiệm đều tiến hành lặp lại 3 lần và kết quả là trung bình cộng các lần thí nghiệm.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát quá trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô

Do tính chất nhạy cảm với nhiệt độ của enzyme nên cần tiến hành thí nghiệm để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Kết quả khảo sát thể hiện ở biểu đồ 4.1 Theo kết quả hình 4.1 cho thấy khi tăng nhiệt độ trích ly, hàm lượng protein tăng nhưng hoạt độ riêng của protease dịch chiết giảm

Hình 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ protease

Khi nhiệt độ chiết tăng, quá trình hòa tan và khuếch tán protein trong nguyên liệu vào dịch trích ly sẽ tăng Theo kết quả thí nghiệm, hàm lượng protein tan trong dịch trớch tang từ 744,35 àg/ml ở 4 o C đến 1088,26 àg/ml tại 50 o C Tuy nhiờn, hoạt độ enzyme giảm vì nhiệt độ cao làm biến đổi cấu trúc phân tử enzyme và giảm hoạt độ xúc tác của enzyme Hơn thế nữa, enzyme có thể bị biến tính do điều kiện trích ly như thời gian dài, nhiệt độ cao Vì thế thu nhận enzyme protease cần trích ly ở nhiệt độ 4 o C để đạt hiệu quả trích ly enzyme cao nhất với hoạt độ riêng protease là 564,25GDU/g protein Kết quả này tương tự như một số nghiên cứu trước đó của

Bianca C Martins (80,85 U/mg) và Débora A Camposa trong quy trình tạo ra dịch chiết enzyme ở 4 o C nhằm mục đích thu được dịch trích ly enzyme có hoạt độ riêng cao nhất[89, 90] Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi chọn nhiệt độ trích ly thích hợp là 4 0 C cho các nghiên cứu tiếp theo

4.1.2 Ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly

Bromelain có nhiều độ pH (3-10) nhưng pH tối ưu là 5-8 phụ thuộc vào cơ chất nền Bromelain thân đã được tinh khiết một phần có hoạt độ riêng cao nhất ở pH 6,0 và 8,0[12] Kết quả khảo sát được thể hiện qua biểu đồ 4.2, xu hướng chung giữa hàm lượng protein tổng và hoạt độ riêng của enzyme đều tang khi pH tăng từ 4 đến 7 và đạt cao nhất tại pH 7,0 với hàm lượng protein tổng và hoạt độ riêng lần lượt là 1047,83 àg/ml và 668,05 GDU/g protein Sau đú pH tăng dần từ 7 đến 9 thỡ protein tổng và hoạt độ cũng giảm mạnh Ferreira và cộng sự của ông cũng như Abdulrahman cũng cho thấy rằng ở pH 7,0 cho ra hoạt độ riêng cao nhất[92] Cùng xu hướng này, trong nghiên cứu của Ali J R AL-Sa'ady hoạt độ riêng cao nhất cho bromelain (131,25U/mg) thu được khi sử dụng đệm natri phosphate ở pH 7,0[93]

Bên cạch đó, khi sửa dụng đệm sodium citrate, Indumathy.S đã cho thấy rằng với pH tối ưu ở 4,2 thì đạt được hoạt độ cao nhất

Hình 4.2: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease 4.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ rắn lỏng đến quá trình trích ly

Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là một thông số kỹ thuật quan trọng khi trích ly enzyme Từ kết quả hình 4.3 cho thấy khi thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu từ 1 đến 4 (tăng dung môi), thì hàm lượng protein trích ly tăng do tăng gradient nồng độ nên quá trình trích ly hiệu quả hơn Tuy nhiên, không phải tất cả protein trong nguyên liệu đều là enzyme nên cần khảo sát hoạt độ riêng của protease ứng với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1 và 4 là thấp hơn ở mẫu tỷ lệ 2 Xu hướng này cho thấy rằng hoạt độ riêng của protease càng giảm khi lượng dung môi càng nhiều trong khi tỉ lệ trích ly là 1/1, lượng dung môi quá ít, không đủ để hòa tan hết các protein enzyme có trong nguyên liệu Khi tăng lượng dung môi trích ly đủ để hòa tan hết protein enzyme (theo khảo sát này là tỷ lệ 2/1) thì hoạt độ enzyme đạt giá trị cao nhất (703,06 GDU/g protein) Nhưng khi tiếp tục tăng thể tích dung môi trích ly sẽ gần giống như quá trình pha loãng nên tổng hoạt độ enzyme trong dịch trích ly không tăng mà có xu hướng giảm Bên cạnh đó, hàm lượng protein trích ly tăng chứng tỏ các protein vẫn được trích ly nhưng chủ yếu là olygopeptide, protein tạp

Hoạt độ riêng (GDU/g) pH dễ tan Do đó, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Hình 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ lỏng/rắn đến hoạt độ protease

Abdulrahman et al[92] cũng tìm cho thấy rằng tỷ lệ 1:2 (v:w) là tỷ lệ chiết tốt nhất với hoạt đọ riêng cao nhất Trong khi đó với tỷ lệ 1:1,5 (v:w) được sử dụng trong nghiên cứu của N Lakshminarasimaiah và cộng sự của ông cho ra kết quả xấp xỉ 600 CDU/mg và Ketnawa et al[94] cho thấy rằng 1:1 (v:w) là tỷ lệ chiết tối ưu cho enzyme Bromelain

4.1.4 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình trích ly

Thời gian trích ly thay đổi từ 5 đến 30 phút, hàm lượng protein, hoạt độ riêng protease được thể hiện trên các biểu đồ hình 4.4 khi tăng thời gian trích ly từ 5 phút lên 10 phút với kết hợp đánh siêu âm thì khả năng khuếch tán của protein enzyme vào dung môi tăng, hàm lượng protein trích ly tăng mạnh và rút ngắn được thời gian chiết Thời gian để quá trình trích ly đạt hiệu quả cao nhất là 10 phút với hoạt độ protease 776,84 GDU/g protein Khi quá trình trích ly diễn ra trên 10 phút thì hàm lượng protein trớch ly vẫn tiếp tục tăng nhẹ (từ 1081,30 àg/g chất khụ đến 1091,30 àg/g chất khụ) nhưng hoạt độ protease trong dịch chiết bị giảm Từ phỳt thứ 15 đến

Tỷ lệ lỏng/ rắn (ml/g)

Hoạtđộ riờng(GDU/g) Protein tổng (àg/ml) phút thứ 30, hàm lượng protein gần như không tăng nữa trong khi hoạt độ enzyme tiếp tục giảm chứng tỏ lúc này chủ yếu diễn ra quá trình thủy phân bởi enzyme protease Kết quả cho thấy hoạt độ riêng của enzyme giảm hơn 30% trong 20 phút kể từ phút thứ 10 Nếu thời gian chiết quá thấp, không có đủ thời gian để tách tất cả protein ra khỏi nguyên liệu rắn, nhưng nếu thời gian quá dài hơn, sóng siêu âm có thể phá hủy cấu trúc của enzyme Bromelain[93]

Hình 4.4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ protease

Tóm lại, điều kiện tốt nhất để trích ly enzyme protease trong khoảng khảo sát từ phế phẩm Dứa như sau: dung môi là đệm photphase pH 7,0, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là 1/2, nhiệt độ trích ly 4 o C, thời gian trích ly là 10 phút, kết hợp đánh siêu âm

Từ dịch chiết enzyme thô, tôi tiến hành tinh sạch và cô đặc enzyme bằng phương pháp lọc màng trên cơ sở loại các tạp chất để thu nhận enzyme tinh sạch.

Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc màng

Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm thu nhận chế phẩm enzyme protease từ dịch trích ly enzyme bằng phương pháp lọc màng Các bước thực hiện như sau: từ dịch trích ly enzyme, tiến hành lọc thô sau đó lắng lấy phần dịch trong tiến hành vi lọc (MF), mô hình lọc đầu cuối (theo phương pháp lọc dead- end), kích thước màng MF lần lượt là 1μm và 0,2μm; phần qua màng tiếp tục thực hiện siêu lọc (UF), mô hình lọc ngang (phương pháp lọc cross-flow), sử dụng màng

Hoạtđộ riờng(GDU/g) Protein tổng (àg/ml) có kích thước lọc ⁓ 100kDa, thu nhận phần qua màng chứa enzyme tinh sạch và cô đặc lại qua NF với kích thước ⁓10kDa, thu nhận enzyme ở dòng retentate Quá trình thu nhận enzyme sẽ được đánh giá bằng hiệu suất thu hồi, tính theo tổng hoạt độ còn lại và khả năng loại tạp chất (độ tinh sạch), tính theo hoạt độ riêng của enzyme

Kết quả khảo sát màng vi lọc MF được thể hiện ở hình 4.5

Nhìn chung, hoạt độ của enzyme tăng dần từ 5 đến 15 phút và giảm trong suốt thời gian còn lại của quá trình Sau 5 phút lọc, hoạt độ riêng giữa các mức áp suất khác nhau thì gần như không có chênh lệch lớn, với xấp xỉ 520GDU/g Một điểm chung khác từ áp 0,2 đến áp 0,6 kg/cm 2 là hoạt độ đạt đến đỉnh cao nhất ở phút thứ 15, sau đó giảm hơn 23% sau 15 phút cuối quá trình Bởi vì trong khoảng thời gian thấp hơn 15 phút, thời gian là không đủ để lọc và loại bỏ các protein phân tử lớn

Trong khi từ 20 đến 30 phút, thời gian lọc quá dài, dẫn đến giảm hoạt động cụ thể như ma sát cao giữa dịch chứa enzyme và bề mặt đường ống sẽ phá hủy và phá vỡ cấu trúc của protein Tại thời điểm 15 phút, hoạt độ cao nhất của enzyme trong 3 điều kiện áp suất vận hành khác nhau từ 0,2 đến 0,6 kg/cm 2 đạt xấp xỉ 660 GDU/g ở áp suất 0,6 kg/cm 2 Trong khi ở áp 0,8 và 1,0 kg/cm 2 hoạt độ cao nhất ở phút thứ 10 và giảm nhẹ ở phút thứ 15 sau đó có xu hướng gảm đáng kể đến phút thứ 30 là do khi áp suất tăng thì tốc độ dòng chảy tăng do đó số vòng tuần hoàn cũng tăng trong 1 khoảng thời gian dẫn đến ở phút thứ 10 là hoạt độ cao nhất với 597,09 GDU/g và 557,08 GDU/g Nói chung, hoạt độ của enzyme tăng lên đáng kể ở áp suất 0,6 kg/cm 2 và giảm mạnh đối với áp 0,2 và 1,0 kg/cm 2

Hình 4.5: Hoạt độ của enzyme thông qua quá trình vi lọc

Theo Arunima Saxena và cộng sự để sản xuất bromelain quy mô lớn, điều cần thiết là phải chọn một kỹ thuật tinh chế, dễ dàng mở rộng quy mô với thông lượng cao, thân thiện với môi trường và thực tế Việc sử dụng các quy trình màng lọc để tinh chế bromelain là một sự thay thế đầy hứa hẹn vì công nghệ xanh này có thể đáp ứng các tiêu chí này với chi phí sản xuất tối thiểu Công nghệ này gần đây đã thu hút được sự chú ý đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học do khả năng tách kích thước và / hoặc protein dựa trên khối lượng phân tử với độ tinh khiết cao[95] Một nghiên cứu về việc giảm chi phí sản xuất bromelain bằng cách áp dụng các quy trình màng đã giảm chi phí đáng kể từ 6,5 đến 8,5 lần so với bromelain được sản xuất bằng chiết xuất lỏng[96] Bước tiếp theo là tinh sạch qua màng siêu lọc UF với kích thước ⁓ 100kDa nhằm mục đích loại bỏ các tạp chất hoặc các protein có kích thước lớn và hầu hết enzyme protease đều được qua màng, góp phần tránh hiện tượng tắt nghẽn màng ở cấp lọc NF Hình 4.6 dưới đây cho thấy tỷ lệ enzyme thu hồi được trong giai đoạn tinh sạch bằng UF của dịch chiết trong điều kiện (P = 110 psi; T = 4°C, tốc độ dòng 55ml/phút) với độ thu hồi enzyme Bromelain là 92,13%

Thời gian lọc (phút) ap 0.2 ap 0.4 ap 0.6 ap 0.8 ap 1.0

Ban đầu tốc độ dòng permeate là 115ml/phút sau đó giảm nhanh xuống 55 ml/phút do ban đầu đã có một lượng nước lưu sẵn trong hệ thống nên tốc độ dòng nhanh sau đó dịch chiết sau MF với hàm lượng chất khô hòa tan cao nên tốc độ dòng giảm, đồng thời các phân tử có kích thước lớn hơn 100 kDa sẽ tập trung ở bề mặt màng làm cản trở sự thấm qua màng của các phân tử nhỏ hơn 100kDa dẫn đến tốc độ dòng chảy chậm lại Trong gia đoạn thể tích dịch tinh sạch thu được tử lít thứ 3 đến lít thứ 8 thì tốc dộ dòng permeate gần như thay đổi rất ít từ 46 ml/phút đến 38 ml/phút nhưng đến khi thu được 9l dịch qua màng thì tốc độ lại giảm mạnh còn ⁓ 25 ml/phút Ở thời điểm này thì vấn đề tắt nghẽn màng đáng được lưu ý và để có thể tiếp tục lọc có hiệu quả phải vệ sinh màng

Hình 4.6: Tốc độ dòng permeate và thu hồi enzyme theo thể tích dịch chiết tinh sạch

Màng NF cho phép loại nước và các tạp chất phân tử nhỏ Hiệu quả quá trình được đánh giá bằng hiệu suất thu hồi enzyme, là tỷ lệ tổng hoạt độ enzyme trong dòng retentate và tổng hoạt độ enzyme trong dòng nhập liệu Độ tinh sạch hay khả năng loại tạp chất của màng NF tính bằng tỷ lệ hoạt độ riêng enzyme trước và sau

Thể tích dịch tinh sạch(lít)

Tốc độ dòng PermeateHiệu suất thu hồi khi lọc NF Để đảm bảo rằng enzyme không xuyên màng, việc chọn kích thước màng NF tuân thủ theo nguyên tắc kích thước màng phải nhỏ hơn từ 3 đến 5 lần so với khối lượng phân tử của enzyme Kích thước màng được chọn là ⁓ 10 kDa do kích thước phân tử Bromelain là ⁓ 30 kDa Trong giới hạn điều kiện thiết bị thí nghiệm, chúng tôi chỉ khảo sát độ giảm thể tích (VRF) nhằm mục đích thu được enzyme có độ tinh khiết cao Lưu lượng trong giai đoạn lọc nano được hiển thị trong hình 4.6 Trong quá trình này, tốc độ dòng permeate ban đầu là 90 ml/phút và giá trị giảm đáng kể trong lần đầu tiên 8 VFR và tiếp tục giảm chậm cho đến khi nó đạt đến giá trị cuối cùng của 45 ml/phút ở cuối của quá trình Không giống như giai đoạn lọc MF, sự giảm liên tục có thể liên quan đến việc cô đặc protein (bao gồm cả enzyme) Trong hệ lọc cross – flow, các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước của màng lọc NF sẽ được đi ra dòng permeate và các phần tử lớn hơn sẽ đi theo dòng retente[91]

Hình 4.7: Tốc độ dòng permeate và độ tinh sạch theo VFR Đường cong giữa tốc độ dòng permeate và VRF trong giai đoạn lọc Nano có thể được chia thành hai giai đoạn : giai đoạn đầu VRF 0 đến 9, độ tinh sạch của enzyme tăng nhanh đáng kể và đạt 1,31 lần tại VRF 9,4 ; giai đoạn 2 từ VRF 9 đến VRF 21 mặc dù thể tích giảm đi đáng kể nhưng độ tinh sạch tăng lên chậm từ 1,31 lên 1,37 Tùy vào mục đích của nghiên cứu mà độ giảm thể tích VRF được chọn là

Tốc độ dòng Permeate (ml/min) Độ giảm thể tích (VRF)

Tốc độ dòng permeate Độ tinh sạch khác nhau [97] Độ tinh sạch tối ưu trong nghiên cứu này là 1,37 lần, cao hơn so với kết quả của Babu (1,2 lần), ông đã tinh sạch và cô đặc cùi dứa và chiết xuất vỏ bằng màng siêu lọc tấm (flat sheet ultra-filtration membrane) [98] Một công trình ngiên cứu khác cho kết quả tương tự được thực hiện bởi Chao và cộng sự, đã tinh sạch bằng cách ghép hấp phụ nano-TiO2 với hai giai đoạn UF (nano-TiO2 adsorption with two stages UF), đã đạt được độ tinh sạch là 1,4[99] Quá trình siêu lọc cũng có thể được kết hợp với các kỹ thuật lọc khác để tăng thêm sự tinh khiết của enzyme bằng cách sử dụng micellar đảo ngược cùng với kỹ thuật siêu lọc đạt được độ tinh sạch 8,9 lần[100]

Bảng 4.1: Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi qua quá trình lọc Dịch chiết

Hàm lượng Bromelain (mg/ml) Độ tinh sạch (lần)

Hiệu suất thu hồi dòng permeate(%)

Tóm lại, từ 20 lít dịch thô ban đầu với hoạt độ riêng 779,03 GDU/g protein, dịch trích ly đã trải qua ba cấp độ lọc từ MF đến NF thể hiện qua bảng 4.1 Hàm lượng protein của dịch sau MF giảm nhẹ so với dịch thô ban đầu do một số protein có kích thước phân tử lớn đã bị giữ lại trên bề mặt màng nhưng hàm lượng Bromelain lại tăng lên do dịch sau MF đã loại bỏ nhiều tạp chất do đó trong 1ml dịch mật độ enzyme sẽ cao hơn ban đầu Bên cạnh đó, qua mỗi cấp độ lọc MF và

UF hoạt độ riêng của enzyme đều tăng lên từ 664,37 đến 714,09 GDU/g và thu hồi được 96,33% và 92,13% sau bước lọc MF và UF Đặc biệt sau khi qua NF, enzyme được cô đặc lại do tách nước và một số chất có kích thước bé hơn 10kDa thì hoạt độ tăng lên hơn 60% so với dịch qua MF và đạt được độ tinh sạch 1,37 lần Kết quả thì nghiệm thu được tương tự với kết quả nghiên cứu của Francisco Luiz Gumes Lopes, sau quá trình lọc thu hồi được xấp xỉ 90%[101] và hiệu suất thu hồi đạt 93,3% sau khi lọc UF đối với Mohd Zuhair Mohd Nor[49]

Hình 4.8: So sánh độ tinh sạch của enzyme Bromelain thông qua sắc ký đồ HPLC

1/ mẫu chuẩn, 2/ dịch thô, 3/ dịch sau lọc MF, 4/ dịch sau lọc UF, 5/ dịch sau lọc NF

Kết quả Dựa vào kết quả sắc kí đồ hình 4.8 và bảng 4.1, ta có thể thấy rằng độ tinh sạch của enzyme Bromelain qua mỗi cấp lọc Đối với dịch thô thì sự hiện diện của peak tạp bên phải peak Bromelain là rất lớn với hàm lượng Bromelain (peak xuất hiện ở phút 9,729) đo được là 17,05 mg/ml Dịch qua lọc MF có một sự biến đổi hình dạng sắc kí đồ một cách rõ rệt, peak Bromelain đã dần hiện rõ ràng mặc dù peak tạp vẫn xuất hiện bên cạnh peak chính nhưnh gần như diện tích peak

Bromelain lớn hơn hẳn với hàm lượng 23,51 mg/ml, tăng 20,4% hàm lượng Bromelain Ở bước lọc MF, các cặn lắng có kích thước lớn mà mắt thường có thể nhìn thấy hay là một phần các protein tạp bị giữ lại trên bề mặt màng (phương pháp lọc dead-end) Tương tự xu hướng như MF, dịch qua UF và NF cũng cho thấy kết quả tinh sạch đáng chú ý, sau khi lọc qua màng UF gần như đại bộ phận các tạp chất có kích thước lớn hơn 100kDa đã được loại bỏ nhưng vẫn còn tồn tại những protein tạp có kích thước bé hơn 100kDa nhưng không phải là Bromelain cũng như là các loại saccaride và một số muối vô cơ chưa được loại bỏ Đó là lý do vì sao vẫn xuất hiện một vai nhỏ ở sắc kí đồ UF, ở giai đoạn này thì ta có thể thấy dịch đã được tinh sạch rất đáng kể so với dịch thô với hàm lượng 23,10 mg/ml tăng 35,5% so với dịch thô ban đầu Đến bước lọc NF thì các phân tử có kích thước bé hơn 10kDa như amino acid, một sô khoáng chất và đặc biệt là nước sẽ theo dòng permeate còn các phần tử còn lại bao gồm cả enzyme sẽ theo dòng retentate do đó một số các protein có kích thước từ >10kDa và 90% ở 30 °C sau một giờ ủ sau đó giảm còn 71% Trong khi đó, protease cho thấy độ bền nhiệt kém nhất ở 100°C, gần như enzyme mất toàn bộ hoạt độ Ở 60°C, hoạt độ tương đối có xu hướng giảm rất nhanh từ 100% xuống còn 28%, giảm hơn 70% sau 2 giờ ủ Kết quả của Corzo và cộng sự, phù hợp với đặc điểm của bromelain dứa, được tìm thấy là hoạt độ trong khoảng từ 40ºC đến 60ºC[20]

Nghiên cứu của Lại Thi Ngoc Hà cho rằng Bromelain là enzyme không chiu nhiệt và mức giảm hoạt tính phụ thuộc vào nhiệt độ tồn trữ khi enzyme này được ủ nhiệt độ 30 - 50 o C trong 72 giờ[108]

4.4.3 Động học phản ứng enzyme bằng phương pháp Lineweaver-Burk

Phân tích tính đặc hiệu của cơ chất và tốc độ của phản ứng enzyme được đo bằng cách sử dụng gelatin làm cơ chất Hằng số Michaelis - Menten (Km), tốc độ phản ứng tối đa Vmax và độ đặc hiệu của phản ứng Vmax/Km được xác định bằng

Hoạtđộ tương đối (%) cách vẽ dữ liệu hoạt độ ở pH và nhiệt độ tối ưu, như là một hàm của nồng độ cơ chất theo sơ đồ Lineweaver Burk

Các hằng số động học enzyme Km và Vmax là những ước tính tốt để xác định tính đặc hiệu cơ chất của một enzyme Giá trị Km cho protease cho thấy tính đặc hiệu của enzyme đối với cơ chất gelatin Cơ chất hiệu quả nhất được xác định bằng cách tính Vmax/Km, được gọi là năng lượng xúc tác enzyme Hằng số động học Km và Vmax để thủy phân chất nền gelatin bằng protease tinh sạch lần lượt là 11,98 (mg/ml) và 111,11 (GDU/g/phút) Hằng số Km đăc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn Ý nghia thực tiễn của hằng số Michaelis ở chỗ nó chính là giá tri của nồng độ cơ chất khi tốc độ phản ứng bằng 1/2 tốc độ tối đa Hằng số Michaelis là một hằng số rất quan trọng

Hình 4.14: Tuyến tính hóa dữ liệu động học của quá trình thủy phân gelatin

Kết quả tương tự đã được Silva và cộng sự tuyên bố bằng cách xác định các thông số động học của bromelain từ Ananas erectifolius[109] Corzo và cộng sự đã báo cáo các nghiên cứu động học enzyme của bromelain trái cây từ A comosus cho thấy kết quả cao nhất của Vmax và kết quả thấp hơn của KM đối với cơ chất azocasein và azo albumin [20] y = 0.1103x + 0.0088 R² = 0.9689

Đánh giá chất lượng sản phẩm

Sản phẩm của toàn bộ quá trình là chế phẩm enzyme dạng bột được mang đi đánh giá chất lượng sản phẩm dựa trên một số chỉ tiêu được công bố bởi các sản phẩm thị trường đến từ các nhà sản xuất nổi tiếng như là Beijing Geyuantianrun Bio-tech (China) và Super smart (USA)

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm

Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Chế phẩm

Cảm quan Màu vàng nhạt Đạt

Tính chất vật lý Độ ẩm ≤ 10,00% Đạt (4,50%)

Kích thước hạt 98% qua 80 mesh 99,2%

Coliform