Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm dạng bột chiết xuất từ hạt neem chứa hàm lượng hoạt chất cao (Azadirachtin 10-20%)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN TẤT THẮNG MSHV:1770008 Ngày, tháng, năm sinh: 10/10/1993 Nơi sinh: Kiên Giang Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DẠNG

BỘT CHIẾT XUẤT TỪ HẠT NEEM CHỨA HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT CAO (AZADIRACHTIN 10-20 %)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát qui trình ép dầu neem ở qui mô pilot

- Khảo sát qui trình chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid từ bánh neem (azadirachtin related limonoid – AZRL)

- Nâng cao hàm lượng hoạt chất azadirachtin và AZRL

- Khảo sát điều kiện tạo chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): Tiến sĩ LÊ XUÂN

Em xin dành lời cảm ơn cho các thầy cô bộ môn Kĩ thuật hữu cơ, khoa Kĩ thuật hóa học, trường đại học Bách Khoa luôn giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt luận văn Lời cảm ơn đặc biệt dành cho thầy Lê Xuân Tiến người luôn hướng dẫn và hỗ trợ nhiệt tình cho em trong quá trình thực hiện luận văn Thầy là người truyền cảm hứng và kinh nghiệm làm việc cho em Những kiến thức khi thực hiên luận văn dưới sự hướng dẫn của thầy là vốn quý trong con đường phát triển bản thân em

Cảm ơn hai em Phan Thị Tuyết Mai và Trần Hoàng Nguyên vì sự hỗ trợ nhiệt tình của hai em trong quá trình thực hiện luận văn Cảm ơn tập thể sinh viên thực hiện luận văn tại 401B2 luôn giúp đỡ anh thực hiện luận văn một cách tốt nhất

TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2020

Nguyễn Tất Thắng

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Quá trình tạo chế phẩm dạng bột chứa hàm lượng azdirachtin 10-20% từ hạt neem ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật được nghiên cứu Kết quả thu được chỉ ra rằng, điều kiện thích hợp cho quá trình ép dầu là: áp lực ép 190 MPa, độ ẩm nguyên liệu 4%, thời gian giữ áp lực ép 10 phút/lượt, số lần ép 3 lần cho hiệu suất thu dầu là 336 (mL dầu/1kg nhân hạt neem khô tuyệt đối), đạt 72.8% tổng lượng dầu có trong nhân hạt neem Dầu thu được có tỉ trọng 0.9104 g/mL (đo ở 28 oC) Quá trình chiết bánh neem có điều kiện chiết thích hợp là: nhiệt độ 60 oC, độ cồn 70 (%v/v), thời gian chiết 45 phút, tỉ lệ rắn-lỏng 1:7 (g/mL), số lần chiết 2 lần Cao chiết cồn thu được chứa hàm lượng AZRL trong cao chiết 5.7% AZRL với hiệu suất chiết cao (Hcc) đạt giá trị 45.29 (g cao/100g nguyên liệu) và hiệu suất chiết AZRL từ nguyên liệu (Hc) đạt giá trị 22.45 (mg AZRL/g nguyên liệu) Quá trình nâng cao hàm lượng AZRL xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình như sau: nhiệt độ 40 oC, thời gian chiết 15 phút, tỉ lệ rắn-lỏng 1:5, số lần chiết 2 đạt hiệu suất nâng cao làm lượng đạt 94.48% với hàm lượng AZRL trong cao EtOAc 45.60%, hàm lượng AZ trong cao EtOAc 19.17% Kết quả sấy phun cho thấy hệ chất mang chứa 80% MD và 20% GA cho kết quả bao hạt tốt nhất với hàm lượng AZRL trong bột sấy phun 11.43%, độ ẩm bột sấy phun 6.9%, hiệu suất sấy 93.84%

ABSTRACT

Azadirachta indica A.Juss, also known as neem, has been grown in Binh Thuan province Neem is well-known for its insecticidal properties from limonoid derivatives, such as azadirachtin This study aimed to optimize the process to produce powder from neem seed kernel extract (10-20% azadirachtin) Neem seed kernel was pressed by a hydraulic pressure machine at suitable conditions: pressure 190 MPa, moisture content 4%, pressing time 10 min/turn and 3 turns of press, to obtain oil volume 336 mL/1kg dried neem seed kernel Neem cake, a by-product of pressing process, was extracted with ethanol/water at suitable conditions: concentration of ethanol 70 (%v/v), temperature 60 oC, extraction time 45 min, solid-liquid ratio 1:7 (g/mL) and 2 times of extraction, to obtain 22.45 (mg AZRL/g neem seed kernel) with the concentration of AZRL is 5.70% in the ethanol-extract The ethanol-extract collected after the extraction process was enriched with ethyl acetate at 40 oC, extraction time 15 min, dispersion ratio 1:5 (g/mL), and 2 times of extraction to obtain ethyl acetate-extract (in powder form) that has 45.60% concentration of AZRL, and 19.17% concentration of AZ After that, ethyl acetate-extract was used as a material of the spray drying process with maltodextrin and gum Arabic (80% MD and 20% GA) The concentration of AZRL in the spray drying powder was 11.43%

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả trong luận văn là thành quả lao động của tôi thu được trong thời gian thực hiện luận văn và những số liệu này không bị chỉnh sửa Các kiến thức, thông tin cũng như số liệu thu thập khác trong luận văn đều được trích dẫn nguồn đầy đủ

TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2020 Nguyễn Tất Thắng

1.1 Tổng quan về cây neem 2

1.1.1 Khái quát về cây neem 2

1.1.2 Công dụng của cây neem 3

1.2 Thành phần hóa học trong hạt neem 5

1.2.1 Giới thiệu thành phân chính trong hạt neem 5

1.2.2 Phân loại các hoat chất chính trong hạt neem 5

1.3 Các hoạt chất chính trong hạt neem 8

1.3.1 Azadirachtin 8

1.3.2 Các hoạt chất khác 9

1.4 Tính bền của các hoạt chất 10

1.5 Phương thức tác động và phổ tác động của các hoạt chất 11

1.5.1 Đối với côn trùng 11

1.5.2 Đối với vi nấm 13

1.5.3 Đối với tuyến trùng 14

1.6 Tạo chế phẩm bằng phương pháp sấy phun 14

1.6.1 Các điều kiện ảnh hưởng lên quá trình sấy phun 15

1.6.2 Tính chất của vật liệu mang 16

1.7 Một số nghiên cứu về phương pháp chiết tách azadirachtin 18

1.7.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 18

1.7.3 Các bằng sáng chế 20

1.7.2 Các nghiên cứu trong nước 22

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 23

2.1 Mục tiêu đề tài 23

2.2 Hóa chất, thiết bị, địa điểm thực hiện 23

2.2 Khảo sát qui trình ép dầu neem ở qui mô pilot 24

2.2.1 Sơ chế nguyên liệu 24

2.2.2 Xác định hàm lượng dầu tổng bằng phương pháp chiết Soxhlet 25

2.2.3 Khảo sát qui trình ép dầu qui mô pilot 26

2.3 Khảo sát qui trình chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid (AZRL) từ bánh neem 27

2.3.1 Qui trình chiết bánh neem 27

2.3.2 Khảo sát qui trình chiết azadirachtin 28

2.4 Khảo sát qui trình nâng cao hàm lượng AZRL 29

2.5 Khảo sát điều kiện tạo chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun 30

2.6 Định lượng các hoạt chất 32

2.6.1 Qui trình định lượng hoạt chất bằng phương pháp UV-Vis 32

2.6.2 Định lượng bằng phương pháp HPLC 33

2.6.3 Một số kết quả phục vụ cho quá trình định lượng 34

2.6.4.Phương pháp phân tích số liệu 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 40

3.1 Ép dầu qui mô pilot 40

3.1.1 Đánh giá tính chất nguyên liệu 40

3.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện xử lí nguyên liệu 40

3.1.3 Ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu 41

3.1.4 Khảo sát thời gian giữ áp lực và số lượt ép 43

3.1.5 Ảnh hưởng của áp lực 44

3.1.6 Thành phần hóa học của dầu neem 44

3.1.7 Kết luận 45

3.2 Qui trình chiết AZRL từ bánh neem 47

3.2.1 Ảnh hưởng của dung môi 47

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 48

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 49

3.2.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn-lỏng 50

3.2.5 Ảnh hưởng của số lần chiết 51

3.2.6 Đánh giá hiệu quả của qui trình chiết AZRL từ bánh neem 52

3.3 Nâng cao hàm lượng AZRL trong cao chiết nhân hạt neem 53

3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ phân tán cao-ethylacetate 53

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 54

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 55

3.3.4 Ảnh hưởng của số lần chiết 56

3.3.5 Đánh giá hàm lượng AZ thu được sau quá trình nâng cao hàm lượng 57

3.4 Khảo sát qui trình sấy phun tạo bột AZRL 58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tính chất lý hóa của azadirachtin 8

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của một số loại dung môi lên quá trình làm giàu azadrachtin 20

Bảng 1.3 Bảng kết quả đánh giá độ bền của các chế phẩm 21

Bảng 2.1 Một số hóa chất sử dụng trong luận văn 23

Bảng 3.1 Độ ẩm nguyên liệu tương ứng với thời gian sấy 42

Bảng 3.2 Thành phần acid béo có trong dầu neem sau khi ép 46

Bảng 3.3 Kết quả quá trình nâng cao hàm lượng AZRL từ cao chiết cồn 58

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thành phần chất mang đến sản phẩm sấy phun 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái các bộ phận của cây neem 2

Hình 1.2 Một số hoạt chất có cấu trúc tricyclic diterpene trong hạt neem 6

Hình 1.3 Hoạt chất có cấu trúc triterpene trong hạt neem 6

Hình 1.4 Hoạt chất có cấu trúc limonoid với hệ thống vòng nguyên vẹn trong hạt neem 7

Hình 1.5 Hoạt chất có cấu trúc limonoid mở vòng trong hạt neem 7

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của azadirachtin 9

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của nimbin và nimbidin 10

Hình 1.8 Cấu trúc của maltodextrin 16

Hình 1.9 Cấu trúc đại diện cho gum Arabic 17

Hình 2.1 Qui trình sơ chế hạt neem nguyên vỏ 24

Hình 2.2 Hệ thống chiết Soxhlet 25

Hình 2.3 Hạt neem nguyên vỏ (trái) – nhân hạt neem sau khi xay (phải) 26

Hình 2.4 Máy ép thủy lực 26

Hình 2.5 Túi vải chứa hạt, tấm thép (trái) và Máy xay dược liệu (phải) 27

Hình 2.6 Qui trình chiết AZRL từ bánh neem 28

Hình 2.7 Qui trình nâng cao hàm lượng AZRL trong cao chiết 29

Hình 2.8 Qui trình tạo chế phẩm sấy phun với hàm lượng azadirachtin cao 31

Hình 2.9 Sự thay đổi độ hấp thu của dịch sau phản ứng theo bước sóng 34

Hình 2.10 Đường chuẩn A = f(C) theo phương pháp UV-Vis 35

Hình 2.11 Đường chuẩn S = f(C) theo phương pháp HPLC 36

Hình 3.1 Kết quả so sánh lượng dầu thu được theo các điều kiện xử lí nguyên liệu 41

Hình 3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến lượng dầu thu được từ quá trình ép 42

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian giữ áp lực đến lượng dầu thu được từ quá trình ép43Hình 3.4 Ảnh hưởng của áp lực ép đến lượng dầu thu được từ quá trình ép 44

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 49

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian chiết lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 50

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn –lỏng lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 51

Hình 3.9 Ảnh hưởng của số lần chiết lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 52

Hình 3.10 Ảnh hưởng của tỉ lệ phân tán lên quá trình nâng cao hàm lượng 54

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nâng cao hàm lượng 55

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian chiết lên quá trình nâng cao hàm lượng 56

Hình 3.13 Ảnh hưởng của số lần chiết lên quá trình nâng cao hàm lượng 57

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Lượng dầu thu được theo các điều kiện xử lí nguyên liệu 68

Phụ lục 2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hiệu suất thu dầu 68

Phụ lục 3 Lượng dầu thu được cộng dồn theo thời gian 68

Phụ lục 4 Ảnh hưởng số lượt ép lên lượng dầu thu được 68

Phụ lục 5 Ảnh hưởng của áp lực ép lên hiệu suất thu hồi dầu 69

Phụ lục 6 Ảnh hưởng của độ cồn lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 69

Phụ lục 7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 69

Phụ lục 8 Ảnh hưởng của thời gian chiết lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 70

Phụ lục 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn –lỏng lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 70

Phụ lục 10 Ảnh hưởng của số lần chiết lên quá trình chiết AZRL từ bánh neem 70

Phụ lục 11 Ảnh hưởng của tỉ lệ phân tán rắn-lỏng lên quá trình nâng cao hàm lượng 71Phụ lục 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nâng cao hàm lượng 71

Phụ lục 13 Ảnh hưởng của thời gian chiết lên quá trình nâng cao hàm lượng 71

Phụ lục 14 Ảnh hưởng của số lần chiết lên quá trình nâng cao hàm lượng 72

Phụ lục 15 Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao từ quá trình nâng cao hàm lượng AZRL 72

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp đã từ lâu đời và nông nghiệp cũng là ngành chiếm tỷ trọng lớn đối với nền kinh tế nước ta Tuy nhiên, nền sản xuất nông nghiệp nước ta đang gặp phải những thách thức lớn nếu muốn đưa sản phẩm nông nghiệp Việt Nam ra thị trường quốc tế Một trong số những nguyên nhân cho việc này đó là hàm lượng tồn dư các hóa chất bảo vệ thực vật vượt mức cho phép của các tiêu chuẩn để xuất khẩu

Thực trạng hiện nay nền nông nghiệp nước ta phải đối mặt với nhiều loại sâu, bọ hại cây trồng nên việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật là điều không thể tránh khỏi, trong đó các biện pháp hóa học đang được sử dụng nhiều nhất Dù được sử dụng rộng rãi nhưng các biện pháp hóa học ngày càng bộc lộ những khuyết điểm của nó Đầu tiên, dư lượng thuốc trừ sâu thải ra môi trường ngày càng lớn, ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường, sức khỏe của con người và gây mất cân bằng sinh thái Điều nghiêm trọng hơn là việc sử dụng quá liều lượng, không đúng qui trình sử dụng thuốc và thời gian thu hoạch đã để lại dư lượng thuốc trừ sâu vượt quá mức qui định cho phép trong nông sản

Đứng trước tình trạng này, việc đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loại sâu bộ hại cây trồng mà không ảnh hưởng đến môi trường cũng như sức khỏe con người Xu hướng nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc nghiên cứu sử dụng vi nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch hay các loại hợp chất thứ cấp từ thảo mộc để kiểm soát sinh học cây trồng Những chế phẩm sinh học này ít ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không gây độc cho người tiêu dùng và dễ sử dụng

Cây neem (Azadirachta Indica A Juss) là một trong những loại thực vật có đặc tính

kháng sâu bọ, côn trùng đang được nghiên cứu sử dụng ở nước ta và nhiều nước khác trên thế giới Bánh neem sau khi ép dầu là một phụ phẩm có thể được sử dụng cho mục đích này Với mục đích tận dụng phụ phẩm từ qui trình ép dầu neem, cần tiến

hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm dạng bột chiết xuất

từ hạt neem chứa hàm lượng hoạt chất cao (Azadirachtin 10-20%)”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây neem

1.1.1 Khái quát về cây neem

Cây neem có tên khoa học: Azadirachta indica A.Juss được nhà khoa học Andriew

Henri Laurent de Jussieu miêu tả khoa học lần đầu tiên năm 1830, tên thường gọi: neem tree (tiếng Anh), xoan Ấn Độ, nim (tiếng La-tinh), xoan chịu hạn

Giới : Plantae Bộ : Sapindales Bộ phụ : Rutineae

Họ : Meliaceae (Mahogany family) Chi : Azadirachta

Loài : A Indica

Hình 1.1 Hình thái các bộ phận của cây neem

A-Cành B-Lá neem C-Quả neem D-Hạt neem E-Nhân hạt neem Cây neem lớn rất nhanh, thông thường cây đạt chiều cao khoảng 30 m, chu vi vòng cây khoảng 2.5m Lá cây neem thường xanh quanh năm, chỉ khi gặp hạn và thiếu nước nghiêm trọng thì sẽ rụng lá Cây Neem có thể chịu hạn do cây có cành ngắn và dày, vỏ cây có nhiều rãnh, và rễ có thể xâm nhập sâu vào đất

Cây bắt đầu cho quả khi trồng từ 3 đến 5 năm, cho năng suất cao và ổn định sau 5 đến 10 năm, trung bình một cây trưởng thành cho từ 30-35 kg quả/ năm Quả trơn láng hình bầu dục dài khoảng 2 cm, khi chín có màu vàng hoặc màu vàng xanh, thịt quả ngọt Quả phát triển và chín trong vòng 1-2 tháng Hạt gồm vỏ và nhân, có 1-3 nhân trong một hạt Một năm, cây neem cho hai vụ thu hoạch quả vào tháng 4-6 và tháng 10-12 [1]

Hiện nay, cây neem sống ở các khu vực nhiệt đới và bán nhiệt đới, chúng được trồng rộng rãi ở ít nhất 30 quốc gia Ấn Độ là nước trồng xoan chịu hạn lớn nhất thế giới, tại đây cây neem được trồng khắp nơi và được xem như là loài cây tiêu biểu của quốc gia với gần 25 triệu cây neem cho 442 300 tấn hạt/năm, tạo ra khoảng 88 400 tấn dầu neem và 353 800 tấn bánh dầu [2]

Ở Việt Nam, neem được trồng nhiều ở các nơi như Kiên Giang, Châu Đốc, Ninh Thuận, Bình Thuận Một năm, cây neem cho hai vụ thu hoạch quả vào tháng 4-6 và tháng 10-12 [3]

1.1.2 Công dụng của cây neem

Cây neem có khả năng thích nghi rộng với môi trường sống và có tính đa dạng trong các sản phẩm Ngoài khả năng chịu hạn thì cây neem có công dụng lớn trong ngành trồng trọt như giúp chống xói mòn, xâm thực, bảo vệ đất Bên cạnh đó, gỗ neem là loại gỗ rất bền nên có giá trị trong lĩnh vực chế tạo hàng gia công mỹ nghệ

Ngoài các công dụng phổ biến nêu trên, cây neem còn có thể khai thác giá trị từ các bộ phận khác như hoa, hạt, nhân hạt, lá, vỏ cây với nhiều mục đích khác nhau Trong đó khả năng sử dụng chúng để làm dược liệu, mỹ phẩm, phân bón và thuốc bảo vệ thực vật đã được ứng dụng từ lâu và thu hút được công trình nghiên cứu trên thế giới

 Neem dùng làm dược liệu

Các dịch chiết từ vỏ cây, lá cây và dầu neem cho thấy tác dụng giảm đau, kháng viêm, và hạ sốt Nhiều báo cáo khoa học đã xác định được các hoạt chất trong dịch chiết từ neem, trong đó:

- Hạt chứa nimbidin, azadirachtin, nimbin, nimbolide, gedunin, mahmoodin có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm

- Vỏ cây chứa gallic acid, catechin, margolone, margolonone và margolonone có khả năng điều hòa hệ miễn dịch, kháng khuẩn Bên cạnh đó, vỏ cây còn chứa NB-2-peptidoglucan; polysaccharides G2A, G3A; polysaccharides G1A, G1B có hoạt tính hỗ trợ hê miễn dịch, kháng viêm, kháng ung thư

iso Lá chứa xyclic trisuphide và xyclic tetrasuphide có tác dụng kháng khuẩn và nấm [2]

 Neem dùng trong mỹ phẩm

Dầu neem có hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm tốt, có khả năng tiêu diệt các loại vi khuẩn gây mụn nên thường phối chúng vào nền dầu của sản phẩm mỹ phẩm, hoặc dùng trực tiếp lên da để điều trị mụn trứng cá và mụn nhọt [4]

Do khả năng kháng khuẩn mà dịch chiết lá neem có thể tiêu diệt được vi khuẩn, mảng bám men răng Dịch chiết neem có thể được phối vào kem đánh răng sử dụng hàng ngày để giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh về răng miệng như nha chu [2]

 Neem dùng trong phân bón và thuốc bảo vệ thực vật

Vào những năm 1990, các nghiên cứu chỉ ra rằng các dịch chiết từ cây neem cho tác dụng lên khoảng hơn 200 loại côn trùng khác nhau trong đó phổ biến là các loại côn trùng ăn cây Công dụng trên là do các limonoid trong cây có tác dụng gây ngán ăn, ức chế vòng đời sinh trưởng của côn trùng và xua đuổi côn trùng rất hiệu quả Do đó các bộ phận như lá, nhân hạt neem, bánh dầu neem, dầu neem đều có thể được sử dụng để sản xuất chế phẩm phòng trừ sâu bệnh và côn trùng [1]

Bên cạnh đó, bánh dầu neem là một phụ phẩm có giá trị của công nghiệp ép dầu Bánh dầu thường sử dụng làm phân bón hữu do có chứa hàm lượng nitơ, kali, phốt-pho có thể bổ sung dưỡng chất cho cây trồng Đồng thời, loại phân hữu cơ này có một số tính chất hữu ích cho nông nghiệp sạch như: dễ phân hủy, tăng độ phì nhiêu đất trồng, kháng nấm, kháng côn trùng có hại [5]

1.2 Thành phần hóa học trong hạt neem

1.2.1 Giới thiệu thành phân chính trong hạt neem

Các thành phần trong nhân hạt neem gồm: lipids (29.27%), proteins (12.10%), cellulose (43.98%), khoáng (4.72%) và một số hoạt chất Trong đó, nhân hạt neem có chứa khoảng 45% là dầu với tỉ lệ giữa chất béo không bão hòa và chất béo bão hòa khoảng 60% Dầu neem có màu vàng nâu, có mùi hăng và vị đắng Thành phần chính trong dầu neem gồm : acid béo (oleic acid (41.91%), linoleic acid (19.59%), stearic acid (18.71%) và palmitic acid (15.59%); triglycerides; sterols; tocopherols; Trong đó một số thành phần gây vị đắng đã được xác định trong dầu neem là nimbin (0.12%), nimbinin (0.01%), nimbidin (1.4%) và nimbidiol (0.5%) [6]

Hạt neem có hơn 300 hoạt chất khác nhau đã được phân lập và xác định tính chất Có thể chia thành 2 nhóm chính là isoprenoid và non-isoprennoid

- Isopenoid gồm diterpenoid và triterpenoid như là các protomeliacin, limonoid, azadirone và dẫn xuất của chúng, gedunin và dẫn xuất của chúng, các hợp chất dạng vilasinin và C-secomeliacin (nimbin, salanin và azadirachtin)

- Non-isoprenoid gồm protein, amino acid, carbohydrate, hợp chất có chứa lưu huỳnh, hợp chất polyphenolic như flavonoid, glycoside của chúng, dihydrochalcone, coumarin, tannin, chất béo,

Một phần ba trong số các hoạt chất có trong hạt neem là các tetranortriterpenoid (limonoid) như: azadirachtin, nimbin, nimbidin,…Các hợp chất này có mặt chủ yếu ở nhân hạt neem [7]

1.2.2 Phân loại các hoat chất chính trong hạt neem

Hai nhóm chất chính thường được nghiên cứu là diterpenoid và triterpenoid, trong đó limonoid là thành phần chính và cũng là nhóm đặc trừng cho thành phần trong cây

 Diterpenoid

Trong các loại terpene thì loại diterpene gồm 3 vòng 6 cạnh (tricyclic diterpene) được tìm thấy nhiều nhất Đa số các tricyclic diterpene trong hạt neem được báo cáo có hoạt tính sinh học cao như khả năng ức chế tế bào ung thư, kháng sinh và hoạt tính trừ sâu cao [8]

Hình 1.2 Một số hoạt chất có cấu trúc tricyclic diterpene trong hạt neem

 Triterpenoid

Có 7 loại tetracyclic triterpene (protomeliacin) đã được xác định là những thành phần khác nhau trong hạt neem Bảy loại trên bao gồm: meliantriol, nimbocinone và nimolinone, và azadirachtol, azadirachnol [8]

Hình 1.3 Hoạt chất có cấu trúc triterpene trong hạt neem

 Meliacin

Meliacin (limonoid) là những dẫn xuất của triterpene, có cấu trúc giống triterpene nhưng bị mất 4 nguyên tử carbon, các nguyên tử carbon còn lại đóng vòng tạo vòng furan Một hoặc nhiều hệ thống vòng của meliacin có thể mở khi thực hiện phản ứng oxy hóa khử Tất cả các meliacin đã được biết đến đều có nguyên tử oxy tại C-7, một nối đôi ở vòng D và một nhóm methyl tại C-8 Có hai loại limonoid:

- Limonoid với hệ thống vòng nguyên vẹn có cấu trúc tương đối giống

với tetracyclic triterpenoid Những limonoid này có vòng D nguyên vẹn

nhưng đã bị oxy hóa thành vòng epoxide tại C-14 và C-15 [8]

- Limonoid mở vòng có một hay nhiều vòng đã được mở hoặc thay đổi

bởi quá trình oxy hóa sự mở vòng đặc trưng xảy ra ở vòng C của nhóm nimbin Những limonoid bị oxy hóa mạnh nhất đều có phản ứng oxy hóa xảy ra ở cả vòng C và vòng D Ngoài sự thay đổi đặc biệt trên trong cấu trúc, các chất thuộc loại cấu trúc này cũng có những nhóm thế gắn vào mạch chính tương tự như các chất thuộc nhóm cấu trúc khác đã nêu trên Azadirachtin, là chất thuộc loại cấu trúc này được nghiên cứu nhiều

nhất [8]

Hình 1.5 Hoạt chất có cấu trúc limonoid mở vòng trong hạt neem

1.3 Các hoạt chất chính trong hạt neem

1.3.1 Azadirachtin

Azadirachtin (AZ) là hợp chất có hàm lượng cao và có hoạt tính nhất có trong

Azadirachta indica Hợp chất này có thể được tìm thấy các bộ phận khác của cây

neem (hạt, quả và lá) nhưng có nồng độ thay đổi khá đa dạng thể hiện ở hàm lượng nằm trong khoảng từ 0.25 ppm trong vỏ cây đến 48 000 ppm trong hạt AZ là một triterpenoid thuộc nhóm có cấu trúc giống với các hợp chất khác thu được từ hạt neem, như là nimbin và salanin AZ điểm nóng chảy ở 154 -158 °C và độ hấp thụ tối đa trong tia cực tím (UV) ở 217 nm Hợp chất AZ thể hiện tính chất ưa nước (logP = -0,13), thể hiện độ hòa tan vừa phải trong nước và độ hòa tan cao trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình AZ nhạy sáng và không bay hơi, độ bền của AZ phụ thuộc nhiều các điều kiện hóa lý AZ không ổn định trong môi trường acid mạnh, trong môi trường base và điều kiện nhiệt độ cao [9]

Bảng 1.1 Một số tính chất lý hóa của azadirachtin

Độ tan trong các dung môi hữu cơ

Tan rất nhanh trong ethanol, diethyl ether, acetone, chloroform, dichloromethane nhưng không tan

trong hexane

AZ có cấu trúc cực kỳ phức tạp với cấu trúc không linh động do sự có mặt của các liên kết hydro nội phân tử và một số lượng lớn các nhóm chức phản ứng ở các vị trí

gần nhau Cấu trúc hóa học của AZ bao gồm mười sáu trung tâm lập thể, bảy trong số đó là các nguyên tử carbon hóa trị 4 và chín là các nguyên tử carbon hóa trị 2 Thông thường, cấu trúc của AZ bao gồm mười sáu nguyên tử oxy được sắp xếp theo bốn nhóm ester, một nhóm hemiacetal và một nhóm epoxide, hai nhóm hydroxyl và một nhóm dihydrofuran Thông thường azadirachtin chứa hơn 70% azadirachtin A và ít nhất 8 dẫn xuất khác Có rất nhiều dẫn xuất có cấu trúc và hoạt tính tương tự với AZ, trong số đó các dẫn xuất azadirachtin từ B đến L đã được xác định và phân lập thành công [8, 9]

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của azadirachtin

Trong các limonoid, azadirachtin được xem là chất có hoạt tính mạnh nhất, bởi nó có thể tác dụng lên đa số các loại côn trùng khác nhau Dịch chiết của cây neem chứa lượng azadirachtin tương đương có khả năng trừ côn trùng, sâu hại mạnh hơn từ 3 đến 4 lần so với azadirachtin tinh khiết Khả năng hoạt động trừ sâu của các loài cây neem khác nhau có thể được dự đoán dựa vào tổng lượng azadirachtin và các limonoid có cấu trúc tương tự nó [10, 11]

1.3.2 Các hoạt chất khác

Meliantriol là hợp chất thuộc triterpenoid alcohol, đây là một tác nhân gây ngán ăn mạnh đối với côn trùng ngay cả khi chúng tiếp xúc với nồng độ thấp Nhiều loài côn trùng không ăn trong 2 đến 6 tuần sau khi tiếp xúc với chế phẩm có chứa meliantriol từ neem

Salannin cũng là một hoạt chất gây ngán ăn mạnh và là chất chống lại sự lột xác của côn trùng Một số nghiên cứu còn cho thấy salannin có tác động mạnh ức chế sự lột

xác của con bọ cánh cứng trên dưa chuột Acalymma vitta và bọ cánh cứng Nhật Bản

Popillia japonica Trong hạt hàm lượng salannin thường từ 15-1247 µg/g nhân hạt

neem

Nimbin và nimbidin được xem là những chất có hoạt tính kháng virus mạnh Chúng tỏ ra có hiệu quả đối với virus gây bệnh trên cây cà chua, bệnh đậu mùa và các bệnh trên gia cầm Eeswara và các cộng sự (1996) đã có nghiên cứu và báo cáo rằng nimbidin có trong hạt neem có hàm lượng từ 9-619 µg/g nhân hạt neem [12]

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của nimbin và nimbidin

1.4 Tính bền của các hoạt chất

Các yếu tố vật lý và hóa học ngoài thực tế như không khí, loại dung môi dùng để chiết xuất, giá trị pH, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng,… đều có thể ảnh hưởng đến độ bền của hoạt chất và làm mất hoạt tính

Ánh sáng, không khí: Khi tiếp xúc với không khí và ánh nắng mặt trời, tia UV và

oxy có thể oxy hóa và làm phân hủy azadirachtin Lượng azadirachtin trong dung môi acetone ít hơn 50% so với lượng ban đầu khi tiếp xúc trực tiếp với tia UV trong bảy ngày, và bị phân hủy hoàn toàn sau mười sáu ngày tiếp xúc [13]

Azadirachtin kém bền với ánh sáng là do cấu trúc có các thành phần kém bền như electron, liên kết ester, và vòng expoxide Cấu trúc azadirachtin bị đồng phân hóa hoặc phân hủy khi tiếp xúc với UV Đây là nguyên nhân chính cản trở việc sử dụng azadirchtin trong nông nghiệp do sự tồn tại của nó ngoài môi trường ngắn hơn thời gian tác độn lên côn trùng gây hại [14]

p-pH, dung môi: Nghiên cứu của Javis, Johnson, Morgan (1998) đã theo dõi ảnh hưởng

của pH đối với tính bền của azadirachtin ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối và thu được kết quả sau:

- Ở 35 oC, các hoạt chất bền khi pH trong khoảng 4 đến 5, các hợp chất bắt đầu phân hủy khi pH đạt 6 và phân hủy rất nhanh khi pH lớn hơn 7

- Nước không nên sử dụng để làm dung môi lưu trữ các hoạt chất trừ khi lưu trữ ở nhiệt độ lạnh sâu Các dung môi hữu cơ (như dichloromethane và chloroform) có thể làm dung dịch bền ở nhiệt độ phòng [15]

Nhiệt độ: Nghiên cứu của Morgan và cộng sự (1998) đã chỉ ra ảnh hưởng của nhiệt

độ với các hoạt chất ở dạng hạt rắn và trong dung dịch có nồng độ azadirachtin là 1 mg/cm3, kết quả thu được cho thấy:

Với ảnh hưởng của nhiệt độ, độ bền của các hoạt chất giảm dần theo thứ tự nimbin, azadirachtin, salannin Từ kết quả thu được có thể thấy các hoạt chất ở dạng rắn và độ tinh khiết cao bền hơn so với hoạt chất dạng hòa tan Nước là dung môi mà azadirachtin dễ bị phân hủy nhất Khi hòa tan trong methanol ở nhiệt độ cao, azadirachtin bị chuyển hóa thành 3-acetyl-1-tigloylazadirachtin, làm giảm đáng kể hoạt tính [15]

Độ ẩm: Nước là tác nhân thủy phân các hoạt chất và là môi trường dễ xảy ra sự phân

hủy của các hoạt chất trong quá trình lưu trữ Độ ẩm của hạt để duy trì độ bền của các hoạt chất thông thường ở mức thấp hơn 8% và phải bảo quản hạt ở nơi khô ráo Theo Stark, chu kỳ bán hủy của azadirachtin trong đất ở 25 oC là 20 và 31.5 ngày đối với đất không khử trùng và đất được khử trùng [16]

1.5 Phương thức tác động và phổ tác động của các hoạt chất

1.5.1 Đối với côn trùng

 Phương thức tác động

Azadirachtin và một số các hợp chất khác trong cây neem có cấu trúc phân tử gần giống với các loại hormone quan trọng của côn trùng nên có thể dễ dàng tiếp cận, xâm nhập và ức chế hệ nội tiết tố của côn trùng, làm rối loạn nội tiết tố của chúng Các hoạt chất này thường tác động lên côn trùng theo các phương thức chủ yếu sau:

Gây ngán ăn: Đây là một trong những phương thức tác động đặc trưng nhất của các

hoạt chất trong cây neem đối với các loài côn trùng, trong đó azadirachtin có hoạt tính gây ngán ăn mạnh nhất và phổ tác động rộng nhất Salannin và meliantriol từ cây neem cũng có khả năng này Côn trùng sau khi tiếp xúc với các hợp chất trên sẽ phát hiện và cảnh giác nên không tiếp tục ăn lá hoặc các bộ phận khác của cây [17]

Năm 1984, B.G.Joshi và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hệ huyền phù azadirachtin trong nước ở các nồng độ 0.5%, 0.7% và 1.0% đối với cây thuốc lá Kết quả cho thấy việc tiếp xúc với hệ huyền phù trên gây ngán ăn hiệu quả đối với

Spodoptera litura F (bắt đầu có tác động từ ngày thứ 2 và sau 7 ngày tác động thể

hiện mạnh nhất) mà không ảnh hưởng xấu đến chất lượng thuốc lá (ở nồng độ 0.5%) [18]

Xua đuổi: Một số hoạt chất có trong dịch chiết neem có mùi nặng giống tỏi, hơi khó

ngửi, khi phối vào nền thuốc trừ sâu chúng có thể bay hơi và tác động đến côn trùng từ xa thông qua cơ quan thụ cảm hóa học khứu giác Điều này gây ra bất lợi trong đời sống sinh học của côn trùng, chính vì thế chúng sẽ di chuyển ra xa vùng tiếp xúc Sản phẩm phối trộn dầu neem với kerosene (1% dầu neem) có thể sử dụng để xua đuỏi muỗi khi đốt [19]

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy các hoạt chất trích từ cây neem có thể xua đuổi nhiều loại côn trùng, nhất là muỗi, châu chấu và các loại bọ rầy Năm 1980, Saxena và các cộng sự đã thử nghiệm và cho thấy công thức chế phẩm chứa 20% dầu neem đạt hiệu quả xua đuổi 96% quần thể rầy nâu thí nghiệm [18]

Diệt côn trùng: Các hoạt chất từ neem ở nồng độ thích hợp có khả năng diệt côn

trùng (ruồi đục quả, nhện,…) ở một liều lượng nhất định [20] Côn trùng chết bởi nhiều tác động khác nhau, bao gồm tác động gây ngán ăn Dịch chiết từ neem với các nồng độ khác nhau có tác dụng lên một số loại côn trùng trong quá trình lưu trữ lương thực như : bọ Stephens, mọt gạo, mọt đỏ Cụ thể, bọ Stephens bị tác động mạnh nhất bởi dịch neem với các nồng độ 48, 23, và 7% azadirachtin cho LC50 lần lượt là 18.8, 37.0, và 127.3 ppm trong 6 tuần khảo sát [21]

Ảnh hưởng đến sự phát triển và lột xác: Theo Koul (1984), tác động của dịch chiết

neem đối với sự phát triển và biến thái của côn trùng thường được biểu hiện qua các

biến đổi như: giảm kích thước và trọng lượng, kéo dài thời gian phát triển, tạo ra những trưởng thành dị dạng như cụt râu, cụt cánh hoặc râu, cánh, chân bị biến dạng [22]

Ngoài các tác động trên, các hoạt chất từ cây neem còn làm giảm khả năng nuốt thức ăn hoặc ức chế quá trình tổng hợp chitin (polyacetyl glycosamine) – thành phần cơ bản của vỏ côn trùng, làm chúng không lột xác được [8]

Làm giảm khả năng sinh sản, gây vô sinh: Các hoạt chất sinh học từ cây neem có

khả năng ức chế sinh sản của nhiều loại côn trùng như ngăn chặn sự đẻ trứng và làm cho trứng không nở được [23, 24]

 Phổ tác động

Có khoảng 413 loại côn trùng, thuộc 16 bộ khác nhau chịu tác động của hoạt chất chiết xuất từ neem [25], trong đó chủ yếu là các bộ sau:

 Bộ cánh thẳng (Orthoptera): phương thức tác động chủ yếu là gây ngán ăn

 Bộ cánh cứng (Coleoptera): ngoài hiệu quả ngán ăn, còn có thể giết chết ấu

trùng khi tiếp xúc với nguồn thuốc

 Bộ cánh đều (Homoptera) và bộ cánh vảy (Lepidoptera): hiệu quả gây ngán ăn,

ức chế tăng trưởng, quá trình lột xác, biến thái và sinh sản của chúng bị rối loạn

 Bộ hai cánh (Diptera): tác động lên nhiều loài ruồi quả, ruồi nhà, muỗi,… với

hiệu quả xua đuổi tốt

 Bộ cánh nửa (Heteroptera): bị tác động bởi cơ chế ngán ăn, ức chế phát triển

và biến thái làm cho quần thể côn trùng dần dần bị suy thoái

 Bộ cánh tơ (Thysanoptera): phương thức tác động chủ yếu là ức chế phát triển

và sinh sản của đối tượng

1.5.2 Đối với vi nấm

Một số nghiên cứu đã cho thấy khả năng kháng nấm khá tốt của dịch chiết từ cây

neem Dầu neem có thể ức chế hoàn toàn Aspergillus niger, Fusarium monoliforme,

Macrophomina phaseolina và Drechslera rostrate [26] Dịch chiết từ lá neem có thể

ức chế hiệu quả loài nấm gây bệnh cháy lá ở lúa (Pyricularia oryzae) [27] Ngoài ra,

dịch chiết từ lá neem còn có tác dụng ức chế sinh tổng hợp độc tố của 2 loại nấm

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus [28]

1.5.3 Đối với tuyến trùng

Dịch chiết từ lá, hoa, quả và vỏ cây neem đều có độc tính cao đối với nhiều loại tuyến

trùng như: Helicotylenchus indicus Siddiqi, Hoplolaimus indicus Sher và Tylenchus

filiformis, Tylenchorchynchus brasscae, Rotylenchus reniformis và Meloidogyne incognita Chitwood [29] Nimbin và một số hợp chất thuộc nhóm limonoid khác có

khả năng ức chế giai đoạn trưởng thành, làm rối loạn chu kỳ sống và có thể gây chết cho đối tượng [30]

1.6 Tạo chế phẩm bằng phương pháp sấy phun

Sấy phun là sấy phun là kỹ thuật tạo hạt được sử dụng rộng rãi nhất trong ngành công nghiệp Đây là một qui trình linh hoạt, liên tục, nhưng quan trọng hơn, sản phẩm sản xuất bằng phương pháp sấy phun còn có các đặc tính tuyệt vời như tính bảo vệ hoạt chất, ổn định, giúp hòa tan và giải phóng có kiểm soát các hợp chất có hoạt tính sinh học Các loại chất tạo hạt khác nhau đã được sử dụng để sấy phun; chúng bao gồm polysaccharide (tinh bột, maltodextrin, bột ngô và gum Arabic), lipid (stearic acid, mono và di glyceride) và protein (gelatin, casein) [31]

Vật liệu tạo hạt được đồng hóa với hoạt chất Hỗn hợp này sau đó được đưa vào máy sấy phun Nước bị bốc hơi do không khí nóng tiếp xúc với vật liệu Các hạt được tạo thành từ quá trình sấy được thu thập ở đáy của máy sấy [32] Trong qui trình sấy phun, nhiệt độ đầu vào và đầu ra phải phù hợp Vì lý do này, ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến việc giảm hoạt chất trong quá trình sấy phun cần được nghiên cứu Kết quả cho thấy nhiệt độ đầu ra của không khí sấy càng cao dễ dẫn đến sự biến tính hoạt chất Do đó, điều quan trọng là phải kiểm soát nhiệt độ sấy để giảm thiểu sự biến tính của hoạt chất Nếu nhiệt độ đầu vào quá thấp, nước sẽ không bay hơi hoàn toàn trong thời gian ngắn và bột sấy phun vẫn còn ướt và năng suất tạo hạt thấp Nếu nhiệt độ quá cao, sự nứt vỡ của các hạt xảy ra [33,34]

Những thay đổi về kích thước hạt và hình thái trong quá trình sấy phun có liên quan đến độ ẩm và nhiệt độ sấy Trong quá trình sấy, một lớp màng được hình thành ở bề mặt giọt và nồng độ các thành phần trong giọt khô tăng lên Cuối cùng, một hạt xốp,

khô được hình thành So với sấy thông thường, chi phí cho phương pháp sấy phun rẻ hơn 30 lần 50 lần [35, 36]

Các điều kiện sấy phun tốt nhất là sự kết hợp giữa nhiệt độ không khí cao, nồng độ chất rắn cao của dung dịch, và hạt được sấy khô dễ dàng mà không bị giãn nở và nứt vỡ sau khi sấy [37]

1.6.1 Các điều kiện ảnh hưởng lên quá trình sấy phun

 Ảnh hưởng của chất mang lên tính chất hạt

Nhiều loại chất mang đang được sử dụng phổ biến để bao hạt với các hợp chất limonoids như gum Arabic (GA), maltodextrin (MD), gelatin, sucrose, tinh bột, tinh bột biến tính và sodium caseinate Trong đó tính chất của maltodextrin có chỉ số Dextrose equivalent (DE) cao khoảng 24 là loại chất mang phù hợp với việc bao hạt các limonoids Do các loại đường có trọng lượng phân tử thấp trong maltodextrin đóng vai trò chất làm dẻo, do đó ngăn ngừa sự co rút của bề mặt trong quá trình sấy Trong một số trường hợp nhất định, các chất mang có tính chất hóa học khác nhau có thể kết hợp khi sử dụng mang lại cho sản phẩm bao hạt hiệu quả tốt hơn so với hiệu ứng được tạo ra khi chất mang được sử dụng riêng lẻ Bên cạnh đó một số chất mang còn đóng vai trò là chất trợ phân trong quá trình chuẩn bị dịch nhũ tương Các tính chất bề mặt này rất quan trọng, vì các limonoids không tan trong nước nên thường được đưa vào hệ huyền phù sấy phun

Tùy vào tính chất của hệ chất mang, tỉ lệ hoạt chất trên chất mang được xác định có ảnh hưởng quan trọng lên quá trình bao hạt Khi hê huyền phù có nồng độ hoạt chất quá cao sẽ dẫn đến hiệu suất bao hạt thấp Tính chất này xảy ra khi bao hạt với nhiều loại chất mang khác nhau như: tinh bột biến tính, gelatin và sucrose, gum Arabic, gellan gum và maltodextrin [38]

 Ảnh hưởng của các điều kiện sấy lên tính chất hạt

Tăng nhiệt độ không khí đầu vào (Ti ) làm tăng khả năng lưu giữ các hoạt chất Khi Ti

càng cao, tốc độ truyền nhiệt của hạt càng lớn và điều này cung cấp một động lực lớn hơn cho sự bốc hơi của độ ẩm Điều này làm cho độ ẩm trong sản phẩm cuối cùng thấp hơn Độ ẩm thấp trong bột có thể dẫn đến giảm xu hướng kết tụ, do đó làm giảm tiếp xúc với bột với các tác nhận oxi hóa trong môi trường Nhờ các yếu tố trên nên

khi tăng Ti làm tăng tính ổn định của limonoids trong các vi hạt sau khi sấy phun Tương tự, tỷ lệ nhập liệu thấp cũng có tác động tích cực đến việc tăng độ bền hoạt chất Tốc độ nhập liệu có liên quan mật thiết đến nhiệt độ đầu ra (To) và tốc độ nhâp liệu thấp hơn tương ứng với To cao hơn, do đó làm giảm độ ẩm

Theo đó, các thông số thích hợp cho quá trình sấy phun bao hạt limonoids là Ti có khoảng 80-120 °C và tốc độ nhập liệu 7-14 mL/phút [38]

1.6.2 Tính chất của vật liệu mang

 Maltodextrin

Maltodextrin (MD) có độ tan trong nước cao và độ nhớt thấp ngay cả với các dung dịch có nồng độ MD cao Nhờ vào tính chất trên MD làm tăng hàm lượng chất rắn trong dung dịch tạo điều kiện thuận lợi cho việc tạo hạt trong lúc phun

Hình 1.8 Cấu trúc của maltodextrin

MD có thể thay thế gum Arabic (GA), do chi phí thấp, nhưng cũng có thể được sử dụng kết hợp với GA, whey protein hoặc tinh bột biến tính để có được kết quả bao hạt tốt nhất MD có tính chất nhũ hóa kém, dẫn đến việc khó phân tán được các hợp chất ưa dầu làm giảm khả năng bảo vệ hoạt chất Mặc dù MD thiếu khả năng nhũ hóa, nhưng MD bảo vệ rất tốt cho các hoạt chất, do khả năng tạo lớp phim dày một cách nhanh chóng trong quá trình sấy phun Khi tốc độ sấy cao dẫn đến sự hình thành nhanh chóng của lớp phim khô xung quanh, nhờ đó MD có thể hạn chế sự khuếch tán hoạt chất qua bề mặt chất mang MD còn thể hiện tính chất dễ hòa trong một số môi trường, do cấu trúc hai chiều của nó bao gồm các đơn vị glucose đơn giản hơn, nhờ vậy mà hạt được tạo từ chất mang MD có khả năng giải phóng hoạt chất rất tốt [38]

 Gum Arabic

Gum Arabic (GA) là một polymer phân nhánh cao và có cấu trúc phức tạp, được hình thành chủ yếu bởi các đơn vị D‐galactose, L‐arabinose và tỷ lệ nhỏ của 4‐O‐methyl‐D‐ glucuronate và L‐rhamnose GA cũng chứa 1 đến 2% protein Đây là vật liệu bao hạt được sử dụng phổ biến nhất để tạo hạt với các hợp chất kỵ nước vì nó có đặc tính nhũ cao (do hàm lượng protein của nó), khả năng tạo màng phim trên hạt, độ hòa tan cao và độ nhớt thấp trong dung dịch nước

Hình 1.9 Cấu trúc đại diện cho gum Arabic

GA có tính chất ổn định trong khoảng pH rộng đồng thời với khả năng tạo màng phim xung quanh các giọt phun của các hợp chất ái dầu, làm cho nó trở thành chất mang phù hợp với hệ các hợp chất phân tán ưa dầu Mặc dù có những tính chất tốt nhưng gum Arabic thường có nguồn gốc từ tự nhiên, do đó không ổn định với các nguồn cung ứng do đó khó kiểm soát tốt chất lượng, và cũng đắt tiền Với tính chất bảo vệ hoạt chất được bao trong hạt, GA cho thấy sự hạn chế trong việc chống lại các phản ứng oxy hóa các hợp chất, vì nó có tính chất một màng bán thấm và điều này có thể gây ảnh hưởng tới thời hạn sử dụng của sản phẩm Tất cả các lý do trên là nguyên nhân cho việc phải chọn lựa chất mang thay thế hoặc phối trộn một số loại chất mang khác để đạt được các tính chất kĩ thuật phù hợp với sản phẩm [38]

1.7 Một số nghiên cứu về phương pháp chiết tách azadirachtin

1.7.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

 Nghiên cứu qui trình chiết azadirachtin có sự hỗ trợ của sóng siêu âm và so sánh hiệu quả với phương pháp chiết ngấm kiệt thông thường

Năm 2015, Joelma Abadia Marciano de Paula cùng các cộng sự [39] đã tiến hành chiết azadirachtin từ hạt neem với sự hỗ trợ của sóng siêu âm và dùng phương pháp HPLC để định lượng hoạt chất Sóng siêu âm được tạo ra bởi thiết bị hoạt động ở 2800 A và 40 kHz và có 3 biến được khảo sát tối ưu cho qui trình chiết này đó là nồng độ ethanol (%w/w), nhiệt độ (oC) và tỉ lệ rắn-lỏng (g/mL) Kết quả thu được cho thấy với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, điều kiện tối ưu để chiết azadirachtin như sau: nồng độ ethanol từ 75-80% (w/w), nhiệt độ 30 oC, tỷ lệ vật liệu rắn-dung môi là 0.55 (g/mL) Ứng với điều kiện tối ưu trên ta thu được 0.431% azadirachtin (w/w), so với phương pháp chiết ngấm kiệt thông thường thì chỉ thu được 0.12% (w/w)

 Nghiên cứu qui trình chiết azadirachtin bằng dung môi ở nhiệt độ cao, áp suất cao

Năm 2011, G.C.Jadejaa cùng các cộng sự [40] đã nghiên cứu phương pháp chiết hoạt chất azadirachtin từ nhân hạt neem sử dụng dung môi ở nhiệt độ cao, áp suất cao Đây là phương pháp hiệu quả để thu hồi các hoạt chất từ cấu trúc của các dược liệu tự nhiên thông qua việc tiếp xúc giữa vật liệu và dung môi ở tốc độ cao dù lượng dung môi sử dụng ít Trong nghiên cứu này azadirachtin từ nhân hạt neem (đã khử béo) được chiết bằng methanol ở nhiệt độ cao, áp suất cao Các yếu tố nhiệt độ, áp suất, thời gian chiết, tốc độ dòng chảy, kích thước hạt vật liệu được nghiên cứu để tối ưu quá trình Hàm lượng azadirachtin sau khi chiết được định lượng bằng HPLC Kết quả thu được cho thấy điều kiện tối ưu để chiết là methanol ở nhiệt độ 50 oC, áp suất 50 bar, kích thước hạt vật liệu từ 60-80 mesh và tốc độ dòng chảy dung môi là 5 mL/phút Với điều kiện trên, 210.93 mg azadirachtin đã được chiết từ 100 g nhân hạt neem (đã khử béo) trong thời gian chiết 100 phút Một điều đáng chú ý là phương pháp này tiết kiệm khoảng 1.5 lần dung môi so với phương pháp chiết ngấm kiệt thông thường

 Nghiên cứu qui trình chiết tách azadirachtin và các limonoid khác ra khỏi dầu neem thô bằng phương pháp kết tinh

Limonoid trong dầu neem có thể được xem là một hệ cân bằng rắn-lỏng Vì vậy, chúng có thể được tách ra khỏi dầu bằng cách dịch chuyển hệ cân bằng đó Phương pháp phổ biến để dịch chuyển hệ cân bằng và làm kết tinh chất rắn là cho thêm dung môi mà khả năng tan trong pha dung môi đó của chất rắn kém hơn so với trong pha dầu Ở nghiên cứu này (2010), Elda Melwita, Yi-Hsu đã tách azadirachtin và các limonoid khác từ dầu neem thông qua phương pháp kết tủa bằng việc cho thêm dung môi hexane Các yếu tố như tỉ lệ dung môi/dầu neem, nhiệt độ kết tinh và thời gian kết tinh được khảo sát để đạt hiệu quả thu azadirachtin tối ưu Azadirachtin là một chất kém bền nhiệt trong dung môi hữu cơ, mà phương pháp nêu trên có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp nên sẽ không làm phân hủy hoạt chất chính Kết quả thu được điều kiện tối ưu khảo sát được tỉ lệ dung môi/dầu neem là 9 mL/g, nhiệt độ kết tinh là -5 oC, và thời gian kết tinh là 15 giờ Ngoài ra, kết quả phân tích còn cho thấy trong chất rắn thu được còn chứa một lượng TAGs (triacylglycerols) và phương pháp trên không thể tách hoàn toàn limonoid Nhưng lượng azadirachtin và limonoid thu được từ phương pháp trên có thể được sử dụng làm nguyên liệu đầu vào cho những quá trình tinh chế tiếp theo và ứng dụng vào những sản phẩm thuốc trừ sâu thương mại [40]

 Nghiên cứu phương pháp đơn giản để làm giàu azadirachtin từ hạt nhân hạt neem

Năm 1999, Sarojini Shnha cùng các cộng sự [41] đã nghiên cứu phương pháp làm giàu azadirachtin từ nhân hạt neem Bằng cách khảo sát các dung môi ethylacetate, chloroform, dichloroethane, dicloromethane, toluene kết hợp với việc sử dụng CCl4

sau khi loại dầu bằng hexane để loại bỏ các thành phần nimbins, salanin,

triterdpenoids Sản phẩm thu được có nồng độ azadirachtin đạt từ 27%-48.5%

Kết quả thể hện ở bảng 1.2 cho thấy, hai dung môi nổi bật cho khả năng chiết

azadirachtin là toluen và dichloromethane với hiệu suất chiết 52.0% và 48.7% Tuy nhiên ethylacetate mới là dung môi cho hàm lượng azadirachtin tinh khiết và tỉ lệ thu hồi hợp chất từ dung môi cao nhất

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của một số loại dung môi lên quá trình làm giàu azadrachtin

Dung môi Hiệu suất (g/kg)

Tỉ lệ Azadirachtin

Azadirachtin tinh khiết (g/kg)

Tỉ lệ

azadirachtin thu hồi (%)

- Công thức 1: 2.74 g bột chiết xuất hạt neem có chứa azadirachtin (45.02%) đã được thêm vào 87.26 g Sucrose bột mịn và 10 g methyl cellulose và trộn kỹ trong máy trộn trong 5-10 phút Hàm lượng azadirachtin trong công thức là 1.25% trọng lượng (Aza A 1.01%, Aza B 0.24%) mL

- Công thức 2: 13.4 g bột chiết xuất hạt neem khô có chứa azadirachtin (45.02%) đã được thêm vào 71.3 g sucrose bột mịn và 10 g methyl cellulose và trộn kỹ

trong máy trộn trong 5-10 phút Hàm lượng azadirachtin trong công thức là 6.11% (Aza A 4.93, Aza B 1.18)

Nhóm nghiên cứu đã thực hiện đánh giá độ bền của các chế phẩm và so sánh với chiết xuất azadirachtin nguyên chất (kí hiệu là I) bằng cách để chúng trong một hủ thủy tinh kín và ủ nhiệt ở 54 oC trong 28 ngày Mẫu vật được phân tích hàm lượng azadirachtin còn lại bằng phương pháp HPLC Kết quá thu được như sau:

Bảng 1.3 Bảng kết quả đánh giá độ bền của các chế phẩm

Hàm lượng

Mẫu/chế phẩm

I 36.16 8.86 91.32 93.46 86.44 91.75 83.49 90.07 Chế phẩm 1 1.01 0.24 93.07 95.83 93.07 95.83 90.10 95.83 Chế phẩm 2 4.93 1.18 93.31 95.76 92.49 94.92 88.44 94.92

Nhóm nghiên cứu cũng đã thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm đối với loài côn trùng

Spodoptera litura và cho thấy kết quả ức chế một số quá trình sinh trưởng cũng như

giết chết loài côn trùng trên của các chế phẩm là gần như ngang bằng khi so sánh với chiết xuất hạt nguyên chất ở nồng độ 50 ppm và thời gian tiếp xúc là 10 đến 14 ngày

 Nghiên cứu qui trình chiết xuất azadirachtin dạng rắn và chế phẩm bền dạng nhũ tương có chứa nước của azadirachtin

Năm 1998, Murali cùng các cộng sự [44] đã xây dựng qui trình để thu được chiết xuất giàu azadichrachtin để chế tạo chế phẩm bền, giàu azadirachtin và có chứa nước Nhân hạt neem được xay nhuyễn và được chiết theo phương pháp ngấm kiệt với hệ dung môi acetone:nước tỉ lệ 90:10 (v/v) Quá trình chiết được thực hiện lặp lại từ 3 đến 5 lần ở nhiệt độ 80 oC sau đó mang đi lọc, dịch chiết thu được tạm gọi là dịch chiết 1 Sau đó cho thêm vào 1 lượng tương đương thể tích dichloromethane vào dịch chiết 1, lặp lại quá trình này 3 lần và gom lấy dịch chiết dichloromethane (dịch chiết 2) Dịch chiết 2 được làm khan bằng cách cho thêm sodium sulfate vào, sau đó mang

đi chưng cất để thu hồi dichloromethane, lượng chất rắn giàu azadirachtin còn lại được thu hồi để phối chế sản phẩm

Cao chiết (nồng độ azadirachtin từ 50 000 – 70 000 ppm) được hòa tan trong hệ dung môi ethanol:nước tỉ lệ 70:30 (v/v) để thu được dung dịch có nồng độ azadirachtin từ 2 000– 4 000 ppm (w/v), sau đó thêm vào 0.2-30% (v/v) chất nhũ hóa non-inoic TWEEN 20 Thêm vào hỗn hợp trên 20-50% (v/v) dầu neem để hoàn tất hệ nhũ, chỉnh pH của hệ về khoảng 3.5-6.0 bằng cách thêm vào các dung dịch kiềm Sau khi đã đạt pH, thêm vào 1-2 5% chất chống nắng như para-amino benzoic acid (PABA) hoặc các ester của nó Nhóm nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong quá trình tạo nhũ, nếu cho thêm 1% oleic acid vào thì việc tạo nhũ sẽ thuận lợi hơn Sản phẩm cuối cùng thu được có thể duy trì được 65% hoạt tính sau 2 năm

1.7.2 Các nghiên cứu trong nước

Năm 1991, Lâm Công Định đã viết một cuốn sách nói về loài cây neem được nhập ngoại vào Việt Nam và công bố những nghiên cứu về điều kiện khí hậu, canh tác để phát triển loài cây này trên vùng đất cát nóng Tuy Phong – Bình Thuận [3]

Năm 2001, Dương Anh Tuấn và cộng sự thuộc Viện Hóa Học-Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia nghiên cứu thành công việc chiết tách và tinh sạch azadirachtin từ nhân hạt neem và thử nghiệm hoạt tính gây ngán ăn trên sâu khoang Kết quả thu được azadirachtin 92%, hiệu suất chiết tách 0.054%, với liều lượng 7.89 mg/cm3 đạt chỉ số gây ngán ăn trung bình 71.54% và đạt 87% với liều lượng 15.6 mg/cm3 [43]

Năm 2005, Vũ Văn Độ, Vũ Đăng Khánh và Nguyễn Tiến Thắng thuộc Viện Sinh học Nhiệt Đới-Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã đánh giá được

độ độc của chế phẩm phối trộn giữa dầu neem với Bt (Baccillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis armigara), sâu tơ (Plutella xylostella) Kết quả chế phẩm phối

trộn giữa dầu neem và Bt có tác dụng mạnh hơn so với sản phẩm chỉ chứa dầu neem hay Bt; hiệu quả gây chết mạnh nhất và rõ ràng nhất ở nồng độ 32% dầu neem và 10% hay 15% Bt [44]

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu đề tài

Việc sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu từ những nguyên liệu hóa tổng hợp tạo một hiệu ứng xấu cho sức khỏe người tiêu dùng đồng thời gây ô nhiễm môi trường Điều đó đòi hỏi cần phải có một loại thuốc trừ sâu vừa hiệu quả và vừa an toàn để sử dụng trong ngành trồng trọt Trong đó, cây neem và đặc biệt là hạt neem, vốn đã được sử dụng trong dân gian cũng như hiện tại ở một số quốc gia để đuổi côn trùng và sâu bệnh Nhân hạt neem thường dùng để thu hồi một lượng lớn dầu neem bằng các phương pháp ép dầu Phế phẩm của quá trình này là bã neem (còn được gọi là bánh neem), là một nguồn nguyên liệu quan trọng để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nghành bảo vệ thực vật Để tận dụng các giá trị đặc tính trên của cây neem đề tài này nghiên cứu các quá trình để chế biến hạt neem thành các chế phẩm có ứng dụng cao vào lĩnh vực bảo vê thực vật

Với mục tiêu trên, luận văn sẽ tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: - Khảo sát qui trình ép dầu neem ở qui mô pilot

- Khảo sát qui trình chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid từ bánh neem (azadirachtin related limonoid – AZRL)

- Nâng cao hàm lượng hoạt chất azadirachtin và AZRL

- Khảo sát điều kiện tạo chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun

2.2 Hóa chất, thiết bị, địa điểm thực hiện

 Hóa chất

Bảng 2.1 Một số hóa chất sử dụng trong luận văn

Vanillin Xilong Trung Quốc

 Địa điểm thực hiện

Luận văn được thực hiện tại trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-TPHCM và trường Cao đẳng công nghệ Đồng An, Bình Dương

2.2 Khảo sát qui trình ép dầu neem ở qui mô pilot

2.2.1 Sơ chế nguyên liệu

Hạt neem được thu hái tại vùng Bình Thuận vào tháng 8 năm 2019, lúc quả vừa chín tới, hạt sau khi phơi khô được chứa trong các bao vải bố để vận chuyển Qui trình sơ

chế được trình bày ở hình 2.1 Độ ẩm của hạt neem được xác định bằng máy đo độ

ẩm

Hình 2.1 Qui trình sơ chế hạt neem nguyên vỏ

Hat neem nguyên vỏ

(T= 40-45 oC)

Nhân hạt neem

Hạt neem được tách vỏ bằng phương pháp thủ công để thu được nhân hạt Nhân hạt sau đó được xay đến kích thước nhất định để xác định độ ẩm ban đầu Bên cạnh đó, nhân hạt được sấy ở nhiệt độ khoảng 40-45 oC để giảm độ ẩm hạt xuống mức yêu cầu Bước sấy này để chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình ép nhân hạt

2.2.2 Xác định hàm lượng dầu tổng bằng phương pháp chiết Soxhlet

Nhân hạt neem được xay đến kích thước nhất định (hình 2.3) trước khi thực hiện chiết

Soxhlet Mỗi mẻ chiết được thực hiện với 10 g nguyên liệu gói trong giấy lọc và đặt vào trong ống chiết, lượng dung môi sử dụng là 200 mL hexane Hệ thống chiết

Soxhlet sau khi lắp hoàn chỉnh được thể hiện ở hình 2.2 Thực hiện quá trình chiết

trong vòng 5 tiếng và kiểm tra dầu đã được chiết triệt để chưa bằng cách lấy dung môi trong ống chiết chấm lên giấy lọc, nếu không có vết dầu thì dừng chiết Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

Hình 2.2 Hệ thống chiết Soxhlet

Dịch chiết được lọc và cô quay đuổi dung môi để xác định hàm lượng dầu tổng có trong nguyên liệu