Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Trích ly và thu nhận Glycosaminoglycans từ sụn ức gà bằng enzyme papain

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glycosaminoglycans thu nhận được trong quá trình xử lý nguyên liệu, thủy phân, … từ sụn ức gà.. 544.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong qu

TỔNG QUAN

Sụn ức gà

Sụn chứa một lƣợng lớn glycosaminoglycans, chiếm từ 10% đến 40% khối lƣợng chất khô), có thể đƣợc sản xuất thành các sản phẩm có lợi cho sức khỏe [40]

Nhiều loại sụn từ các nguồn nguyên liệu khác nhau là nguồn cung cấp GAGs nhƣ sụn từ vi cá mập, khí quản cá sấu, hàm cá sấu, khí quản vịt,… trong đó sụn ức gà là một trong những loại nguyên liệu tiềm năng [19], [20]

Hình 2.1: Sụn ức gà: khi còn mô và mỡ (a) và sau khi đƣợc làm sạch (b)

Sụn ức gà nằm ở phần chóp của bộ xương ức gà, có dạng hình khía, một đầu nhọn, đƣợc bao bọc xung quanh bởi lớp mô thịt và mỡ Có chiều dài từ 6 cm đến 7 cm, có đường kính đầu lớn khoảng từ 1 cm đến1,5 cm rồi nhỏ dần Khối lƣợng một cái sụn ức gà khi còn mô thịt và mỡ khoảng từ 8,5 g đến 11,5 g; khi đƣợc loại đi lớp mô thịt và mỡ thì khối lƣợng còn khoảng 2,5 g đến 3 g Sụn khi đƣợc làm sạch có màu trắng đục (Hình 2.1).

Chăn nuôi ở Việt Nam

2.2.1 Tình hình chăn nuôi gà ở Việt Nam

Chăn nuôi là ngành kinh tế quan trọng của Việt Nam, là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho người dân Đây cũng là ngành kinh tế giúp cho nông dân tăng thu nhập, giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động

Bảng 2.1: Sản lƣợng thịt gia súc, gia cầm của Việt Nam năm 2013 –

Theo số liệu thống kê cho thấy ngành chăn nuôi gia cầm chiếm ở vị trí cao, chỉ xếp thứ hai – sau ngành chăn nuôi lợn Năm 2013, sản lƣợng thịt gia cầm hơi khoảng 830,9 ngàn tấn; năm 2014 có khoảng 874,9 ngàn tấn và tiếp tục tăng ở năm 2015 là khoảng 908,1 ngàn tấn (Bảng 2.1)

Hình 2.2: Biểu đồ thể hiện sự phân bố sản lƣợng gia cầm theo địa phương năm 2011 – 2014 [1], [3] Đàn gia cầm tập trung chủ yếu ở vùng Đồng bằng sông Hồng khoảng trên 80 triệu con; tiếp đó vùng trung du miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và duyên hải miền Trung có khoảng trên 60 triệu con; và đàn gia cầm vùng đồng bằng sông Cửu Long tập trung khoảng trên 50 triệu con Tây Nguyên và Đông Nam Bộ là hai vùng có sản lƣợng gia cầm thấp nhất, lần lƣợt khoảng 20 triệu con và 30 triệu con (Hình 2.2)

Bảng 2.2: Sản lƣợng gà và thịt gà năm 2013 – 2015 [1], [2], [3]

Chỉ tiêu Đơn vị 2013 2014 2015 Đàn gia cầm Triệu con 317,7 327,7 341,9 Đàn gà Triệu con 234,5 246,0 259,3

Thịt gia cầm hơi Ngàn Tấn 830,9 875,0 908,1

Thịt gà hơi Ngàn Tấn 640,5 677,1 700,9

0 20 40 60 80 100 Đồng bằng sông Hồng Trung du miền núi phía Bắc Bắc Trung Bộ và DHMT

Tây Nguyên Đông Nam Bộ Đồng bằng sông Cửu Long

Tình hình chăn nuôi gà ở Việt Nam phát triển mạnh trong những năm qua Theo số liệu thống kê thì năm 2013 sản lượng gà trên cả nước là 234,5 triệu con, năm 2014 tăng lên 246 triệu con, đến năm 2015 là 259,3 triệu con tăng khoảng 11,5% so với cùng kỳ năm 2014 (Bảng 2.2)

Hình 2.3: Sản lượng gà phân theo địa phương [1], [3]

Từ hình 2.3 ta thấy, sản lƣợng gà tập trung đông nhất – gần 70 triệu con ở đồng bằng sông Hồng Ở vùng Bắc Trung Bộ và duyên hải miền

Trung và vùng trung du miền núi phía Bắc, sản lƣợng gà cũng chiếm lần lƣợt khoảng gần 50 triệu con và 60 triệu con Ở đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam Bộ có sản lƣợng gà chiếm thấp hơn, khoảng 30 triệu con Và Tây Nguyên là vùng có sản lượng gà thấp nhất nước, khoảng 15 triệu con

2.2.2 Tình hình tiêu thụ thịt gà ở Việt Nam

Lƣợng tiêu thụ thịt gia cầm cũng tăng mạnh, năm 2005 lƣợng tiêu thụ là khoảng hơn 350 ngàn tấn, tăng dần đến năm 2015 ƣớc tính sẽ tiêu thụ khoảng trên 820 ngàn tấn (Hình 2.4)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Đồng bằng sông Hồng Trung du miền núi phía Bắc Bắc Trung Bộ và DHMT

Tây Nguyên Đông Nam Bộ Đồng bằng sông Cửu Long

Hình 2.4: Tình hình tiêu thụ thịt gia cầm ở Việt Nam năm 1997 –

Bảng 2.3: Lƣợng thịt gà nhập khẩu vào Việt Nam năm 2012 – 2015 [1]

Lƣợng thịt gà (Đơn vị: Ngàn tấn) 39,5 49,6 80,3 124,4

Ngoài việc tiêu thụ thịt gà trong nội địa, nước ta còn nhập khẩu thêm thịt gà từ nước ngoài Từ năm 2012 đến 2015, lượng thịt gà nhập khẩu dao động từ 39,5 ngàn tấn đến 124,4 ngàn tấn (Bảng 2.3)

Trong 6 tháng đầu năm 2015, theo bài viết “Nhập khẩu gần 42.000 tấn thịt gà từ Mỹ” đăng trên website baohaiquan.vn, tổng lƣợng thịt gà nhập khẩu là 69.800 tấn, chủ yếu từ các nước như Mỹ, Brazil và Hàn Quốc (gần 100% gà nguyên con đƣợc nhập từ Hàn Quốc, trong khi 98% đùi gà đƣợc nhập từ Mỹ; còn 70% cánh gà đƣợc nhập từ Brazil), ba quốc gia này chiếm trên 80% tổng lượng thịt gà nhập khẩu cả nước.

Tổng quan về Glycosaminoglycans

Các glycosaminoglycans (GAGs) là các polysaccharide không phân nhánh dài, trong đó có chứa các đơn vị disaccharide lặp lại Trong mỗi đơn vị disaccharide có chứa các đơn phân N-acetylgalactosamine hoặc N- acetylglucosamine và các acid uronic nhƣ iduronic hoặc glucuronic [5], [6]

GAGs tích nhiều điện tích âm; chủ yếu hiện diện ở bề mặt tế bào hoặc trong khuôn nền ngoại bào GAGs bao gồm các loại nhƣ chondroitin sulfate (CS), dermatan sulfate (DS), hyaluronan hay acid hyaluronic (HA), keratan sulfate (KS), heparin sulfate và heparin [7] (Hình 2.5) GAGs là một mucopolysaccharide liên kết với protein tạo thành proteoglycan, là một thành phần quan trọng trong cấu tạo các mô liên kết, mô sụn, mô mắt và thành mạch máu GAGs có độ nhớt cao, khả năng chịu nén thấp và rất lý tưởng trong việc bôi trơn các khớp xương [7]

Hình 2.5: Cấu tạo hóa học của các GAGs [8]

Tổng quan về Chondroitin sulfate

Chondroitin sulfate (CS) là một hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharides sulfate, đƣợc cấu tạo từ các monomer là disaccharide

Các disaccharide gồm hai đơn phân là D-acid glucuronic (GlcA) và N- acetyl-galactosamine (GalNAc) thông qua liên kết glycoside GlcA β(13) GalNAc; mạch không phân nhánh [7], [9], [10]

Thường được điều chỉnh bằng việc thay thế các nhóm sulfate vào một hoặc nhiều nhóm –OH ở carbon C-4 và C-6 của GalNAc; ở carbon C-2 và C-3 của GlcA Việc điều chỉnh này làm tạo ra các đồng phân của CS [11]

CS đƣợc tìm thấy trong khuôn ngoại bào và trên bề mặt tế bào trong các mô khác nhau từ các loài động vật có vú hoặc gia cầm và có phong phú nhất trong khuôn ngoại bào của mô sụn [4]

Hình 2.6: Cấu tạo hóa học của CS

Các CS đƣợc gắn với gốc serine của lõi protein tạo GAG-protein hay proteoglycan thông qua liên kết tetrasaccharide GlcA-Gal-Gal-Xyl (tương ứng với D-acid glucuronic, D-galactose, D-xylose) [12] (Hình 2.6)

Hình 2.7: Cấu tạo của CS trong ngoại bào

Trong cấu trúc ngoại bào của mô sụn, các proteoglycan chứa khoảng 100 chuỗi CS, mỗi chuỗi chứa từ 50 đến 60 đơn vị disaccharide, CS gắn liền với chuỗi polypeptide (lõi protein) dài gồm hơn 2000 acid amin [13] Dọc theo lõi protein, giữa vị trí của CS và vị trí lõi protein liên kết với HA là các keratin sulfate (KS) Có khoảng 50 chuỗi KS liên kết với lõi protein, và có khoảng 100 lõi protein gắn với chuỗi HA [14], [15], [16] (Hình 2.7)

Tùy vào vị trí của nhóm sulfate đƣợc thay thế cho nhóm –OH của carbon ở vị trí khác nhau trong đơn phân của CS mà ta có thể phân ra các loại CS cơ bản sau [16], [17], [18]: ˗ CS-O: CS không chứa nhóm sulfate ˗ CS-A: CS có nhóm sulfate gắn ở carbon C-4 của GalNAc

(Chondroitin – 4 – sulfate, CS-4); có trong sụn của gà, cá nhám, cá đuối ˗ CS-B: còn đƣợc gọi là dermatan sulfate, thay nhóm GlcA bằng nhóm L-acid iduronic, nhóm sulfate gắn ở carbon C-4 của GalNAc ˗ CS-C: nhóm sulfate gắn ở carbon C-6 của GalNAc (Chondroitin – 6 – sulfate, CS-6), có trong sụn của cá đuối ˗ CS-D: nhóm sulfate gắn ở carbon C-2 của GlcA và C-6 của GalNAc (Chondoitin – 2,6 – sulfate); có trong sụn của vây cá mập, cá nhám, cua Hoàng Đế ˗ CS-E: nhóm sulfate gắn ở carbon C-4 và C-6 của GalNAc (Chondoitin – 4,6 – sulfate); có trong sụn cá hồi, mực ống, cá sấu, gà ˗ CS-K: nhóm sulfate gắn ở carbon C-3 của GlcA và C-4 của GalNAc

(Chondoitin – 3,4– sulfate); có trong sụn của cua Hoàng Đế, hải sâm ˗ Trong các loại CS trên thì CS-A, CS-B và CS-C là phổ biến nhất, có cấu trúc hóa học nhƣ hình 2.8

Hình 2.8: Các đồng phân CS-A, CS-B và CS-C [7]

Cấu trúc và hàm lƣợng của CS phụ thuộc vào loài động vật, mô, phụ thuộc vào điều kiện sinh lý hay bệnh lý; cũng nhƣ các nguồn sinh học [12]

Trong các nghiên cứu khoa học đã đƣa ra hàm lƣợng CS của một số nguyên liệu Sụn từ xương hàm cá sấu và sụn ức gà là những nguyên liệu chứa nhiều CS, lần lƣợt là 14,84% và 14,08% tính theo trọng lƣợng sụn khô [19] Theo một nghiên cứu khác của Luo và cộng sự (2002) thì hàm lƣợng CS từ sụn ức gà chiếm 16,8% [20] Hàm lƣợng CS từ các sụn khác nhƣ: sụn xương ức cá sấu 11,55%, sụn khí quản cá sấu 9,51%, sụn vây cá mập 9,6%, sụn sườn cá sấu 5,56%, và sụn cá đuối 5,27% (tính theo chất khô)

[19] Hàm lƣợng CS trong khí quản vịt đƣợc nghiên cứu là khoảng từ 9,7% đến 10,6% theo hàm lƣợng chất khô [9] (Hình 2.9)

Hình 2.9: Một số nguyên liệu thu nhận CS [21], [22]

Theo nghiên cứu về đánh mối nguy của glucosamine và chondroitin sulfate của J N Hathcock , A Shao (2007), liều lƣợng CS sử dụng an toàn là 1200 mg/ngày [23]

 Phòng ngừa và hỗ trợ quá trình điều trị bệnh viêm khớp

Hình 2.10: Khớp gối của người khỏe mạnh (a) và của người bị bệnh viêm khớp (b) [24]

Viêm khớp là một bệnh mạn tính đặc trưng bởi tổn thương không thể phục hồi cấu trúc khớp, bao gồm hao mòn dần và mất đi phần sụn ở khớp dẫn đến sự ma sát giữa các xương, viêm màng hoạt dịch, và những thay đổi trong xương dưới sụn, dẫn đến đau và sưng [25] (Hình 2.10)

Cách điều trị hiện tại cho viêm khớp bao gồm làm giảm đau bằng thuốc giảm đau (acetaminophen, thuốc nhóm opiod), các thuốc kháng viêm không chứa steroid (NSAID), tập thể dục và phẫu thuật khớp [26]

CS là chất ức chế protease ngoại bào liên quan đến sự trao đổi chất của các mô liên kết Ngoài tác dụng chống viêm, trong điều kiện ống nghiệm (in vitro) CS kích thích tế bào sụn sản xuất proteoglycan; và cũng ức chế sản xuất cytokine sụn và ức chế quá trình chết của tế bào sụn khớp CS làm tăng độ nhớt của chất lỏng hoạt dịch Trong điều kiện in vivo, các triệu chứng khớp giảm sau bổ sung CS Trong xương, CS đẩy nhanh quá trình khoáng hóa và sửa chữa xương [16], [27], [28]

Hình 2.11: Một số sản phẩm bổ sung CS trên thị trường Việt

Trên thị trường hiện nay có nhiều sản phẩm giúp bổ sung CS phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh khớp nhƣng chủ yếu là nguồn ngoại nhập Các sản phẩm của Việt Nam còn ít và chủ yếu nhập nguyên liệu CS về phối trộn lại (Hình 2.11)

 Hỗ trợ trong điều trị bệnh khô giác mạc

Khô mắt là sự rối loạn của màng phim nước mắt (do nước mắt giảm tiết hoặc bốc hơi quá mức) gây tổn hại bề mặt nhãn cầu

Theo nghiên cứu của M B Limberg và cộng sự (1987), nước mắt nhân tạo có thành phần CS phối hợp với HA là có hiệu quả đối với các bệnh nhân bị khô mắt [32]

CS tạo nên hàng rào bôi trơn bền vững tránh làm mất nước ở giác mạc, tạo cảm giác thoải mái cho mắt người bệnh [32].

Tổng quan về enzyme protease

Protease (còn đƣợc gọi là peptidase hay proteinase), là những enzyme thủy phân cắt liên kết peptide trong protein Protease cần thiết cho quá trình dị hóa protein, tạo ra các acid amine; đồng thời tham gia vào kiểm soát nhiều quá trình sinh học trong tất cả các sinh vật sống Protease có thể đƣợc tìm thấy ở động vật (nhƣ trypcin, chimotrypcin, pepsin từ tuyến tụy và dạ dày), thực vật (nhƣ papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ (Carica papaya); bromelain từ quả, đọt và chồi dứa (Ananas sativa); phycin từ nhựa cây cọ (Ficus carica);…), ngoài ra protease có thể đƣợc thu nhận từ nấm, vi khuẩn, cổ khuẩn, vi rút [33], [34]

Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme

Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase Các endopeptidase cắt các liên kết peptide bên trong các chuỗi polypeptide, trong khi các exopeptidase cắt từng amino acid ở cuối mạch [34]

 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase được chia thành 2 loại [34]:

+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu –NH 2 của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide

+ Carboxypeptidsae: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu – COOH của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

 Dựa vào cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 6 nhóm [34]:

Aspartic, glutamic, và metallo proteases; cysteine, serine, và threonine proteases 6 nhóm này đƣợc xếp vào 2 nhóm lớn:

 Nhóm 1: Aspartic, glutamic, và metallo proteases

Cơ chế xúc tác: Nhóm proteases này sử dụng một phân tử nước được kích hoạt nhƣ một tác nhân nucleophile đến tấn công các liên kết peptide của cơ chất

+ Aspatic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo protease: Là nhóm protease đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

+ Glutamic protease: là một chuỗi polypeptide đơn, gồm 204 amino acid, có khối lƣợng phân tử là 21,969 kDa, và chứa ba cầu nối disulphide –

S-S– Glutamic protease duy trì cấu trúc và trung tâm hoạt động ở pH từ 2 đến 7; ở pH 8 trở lên, nhóm enzyme này bị biến tính không thuận nghịch [35]

 Nhóm 2: Cysteine, serine, và threonine proteases

Cơ chế xúc tác: Nhóm protease này sử dụng các tác nhân nucleophile là dư lượng acid amine (Cys, Ser, hoặc Thr, tương ứng vị trí hoạt động của nhóm protease) đến tấn công các liên kết peptide của cơ chất [35]

+ Serin protease: Là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastase Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng pH kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine protease: Là các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein protease bao gồm các protease thực vật nhƣ papain, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Threonine protease: sử dụng gốc rƣợu thứ cấp của threonine N-cuối nhƣ là một tác nhân nucleophile để thực hiện xúc tác

2.5.2 Sử dụng enzyme papain để thủy phân sụn ức gà

Trong nhóm cysteine protease có nhóm papain (C1) chứa các endopeptidase nhƣ papain (E.C 3.4.22.2); các endopeptidase có tính đặc hiệu hẹp hơn nhƣ glycyl endopeptidase (E.C 3.4.22.25); hay các protease vừa là endopeptidase, vừa là exopeptidase nhƣ dipeptidyl peptidase I (E.C 3.4.14.1), cathepsin B (E.C 3.4.22.1) và cathepsin H (E.C 3.4.22.16) [36], [37]

Enzyme papain (E.C 3.4.22.2) là một endopeptidase, đƣợc chiết tách từ nhựa quả đu đủ giống Carica papaya Gồm một chuỗi polypeptide đơn chứa 212 amino acid, xếp lại để tạo thành hai phần, ở giữa tạo thành khe

Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này; nhóm –SH hoạt động của cysteine 25 (Cys-25) nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 (His-159) nằm bên phải khe Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động này [38], [39]

Hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 đến 8,5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid (pH8,5) Nhiệt độ hoạt động từ 60 o C đến 70 o C

Theo nghiên cứu của W Garnjanagoonchorn và cộng sự (2007) đã sử dụng enzyme papain để thủy phân sụn ức gà để trích ly CS [19].

Tình hình nghiên cứu khoa học về GAGs và CS trên thế giới và ở Việt Nam

W Garnjanagoonchorn và các cộng sự (2007) đã sơ bộ đƣa ra quy trình tách chiết CS, sử dụng enzyme papain và từ đó so sánh khả năng trích ly CS từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ, sụn vi cá mập, sụn cá đuối, cá sấu và sụn ức gà và phân tích định lượng bằng phương hấp thu quang phổ FTIR, đã cho thấy có thể thu đƣợc hàm lƣợng CS từ 11,55% đến 14,84% [19]

A Srichamroen và cộng sự (2013) đã trích ly CS-peptied từ sự tự phân từ sụn gà thịt Hiệu suất trích ly CS-peptide lớn hơn 20g/100g sụn khô, chứa một lƣợng lớn CS-4 khoảng 82,5% [41]

T Xhao và cộng sự (2012) đã trích ly CS từ sụn cá tầm bằng NaOH

Hàm lƣợng CS thô thu đƣợc là 26,51%, sau đó ông tiến hành tối ƣu hóa điều kiện trích ly và hàm CS dự đoán từ phương trình hồi quy thực nhiệm là 26,54% [42]

A Im và cộng sự (2010) đã trích ly và tinh sạch CS từ sụn và xương sống cá tầm bằng enzyme alcalase; thu đƣợc CS-4 từ sụn chiếm khoảng 88,8% và CS-6 từ xương chiếm khoảng hơn 60% trên tổng lượng CS [43]

S C Shin và cộng sự (2006) đã trích ly CS từ sụn ức gà bằng hai phương pháp trích ly bằng nước nóng và bằng enzyme alcalase Kết quả thu được là: trích ly bằng nước nóng thu được hàm lượng CS là 28,46% với hiệu quả trích ly là 40,09% ; hàm lƣợng CS thu đƣợc từ quá trình trích ly bằng enzyme là 26,61% với hiệu suất trích ly là 75,85% [43]

Tại Việt Nam đã có các nhà nghiên cứu Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú và cộng sự (2010) đã nghiên cứu thủy phân sụn cá đuối và cá mập bằng enzyme protease ngoại bào của 3 chủng vi khuẩn B26, Bio2, MF34, đƣợc phân lập từ 11 chủng giống vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease ngoại bào loài vi sinh trên cơ chất sụn Nhóm tác giả đã nghiên cứu điều kiện trích ly tối ƣu CS bởi từng loại protease của 3 chủng vi khuẩn trên, cho kết quả protease của chủng B26 và MF 34 có hoạt tính cao nhất tại pH 8,5, của chủng Bio 2 tại pH 7,5 Và protease của chủng B26, MF34 có hoạt tính cao nhất ở 50 o C; đối với chủng Bio 2 là 40 o C Hàm lƣợng CS trong sụn cá nhám (Carcharhinus Sorrah) theo từng chủng vi khuẩn khác nhau đạt khoảng 8,6%, hàm lƣợng CS có trong sụn cá đuối (Dasyatis Kuhlii) đạt khoảng 6,02% trong điều kiện từ 40 o C đến 50 o C [44].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

Sụn đƣợc mua ở Công ty TNHH Phạm Tôn, quận Gò Vấp, TP Hồ Chí Minh Sụn được tách khỏi bộ xương ức, xử lý sơ bộ, loại bớt mô thịt và mỡ, rửa lại bằng nước muối 5% để loại bụi bẩn còn bám lại trên bề mặt Sau đó đƣợc cho vào túi PE và cấp đông ở –18 o C

Enzyme papain đƣợc mua từ Công ty Sigma – Aldrich (Hoa Kỳ), đƣợc sản xuất từ nhựa đu đủ (Cabrica papaya) Enzyme papain thuộc cysteine protease (EC 3.4.22.2), hoạt động nhƣ một endopeptidase

Enzyme papain đƣợc sản xuất ở dạng mảnh nhỏ rắn, màu trắng ngà; có hoạt tính từ 1,5 đến 10 unit/mg rắn; hoạt động tối ƣu ở pH từ 6 đến 7 và nhiệt độ từ 60 o C đến 70 o C

Chế phẩm enzyme được xác định lại hoạt độ theo phương pháp Ason cải tiến trước khi sử dụng: 2256 AU/mg

3.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu

Chondroitin sulfate (Sigma – Aldrich, Hoa Kỳ) 1,9-dimethylmethylen blue (DMB) (Sigma – Aldrich, Hoa Kỳ) Glycine (Ấn Độ)

Folin – Ciocalteu (Merck, Đức) Acid trichloacetic (TCA) (Trung Quốc) Na 2 HPO 4 12H 2 O (Trung Quốc)

KH 2 PO 4 (Trung Quốc) NaOH, acid citric (Trung Quốc) NaCl (Trung Quốc)

KNaC 4 H 4 O 6 ã4H 2 O (Trung Quốc) CuSO 4 (Trung Quốc)

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Bình định mức 50 mL, 100 mL, 1000 mL Erlen 100 mL, 250 mL

Becher 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL Micropipet 10 – 100 μL, 100 – 1000 μL, 1 – 5 mL Pipet thủy tinh 1 mL, 5 mL Ống bóp cao su, phễu thủy tinh, đũa thủy tinh, nhiệt kế, thau, rổ, dao, thớt, bình hút chân không, ống nghiệm, curvet

Bếp điện từ, bể điều nhiệt, máy lắc Vortex, tủ sấy, pH kế, máy quang phổ UV-VIS, bơm chân không, cân điện tử hai số lẻ và bốn số lẻ, tủ đông, tủ lạnh, máy xay sinh tố.

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát quá trình tủa protein bằng TCA

- Tỷ lệ sụn:đệm - pH

- Hàm lƣợng E/S - Nhiệt độ - Thời gian

Hàm lƣợng GAGs là cao nhất

Hàm lƣợng GAGs là cao nhất Giá trị nhiệt độ và thời gian tối ƣu để hàm lƣợng GAGs là cao nhất

Hàm lƣợng các thành phần hóa học của sụn ức gà Phân tích thành phần hóa học của sụn ức gà

Xác định hoạt tính của enzyme

- Khảo sát các yếu tố của quá trình thủy phân sụn

- Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân sụn ức gà

Giá trị tối ƣu của các yếu tố trong quá trình thủy phân để hàm lƣợng GAGs là cao nhất

Hoạt tính enzyme papain - Độ ẩm

- Protein - Lipid - Tro - Carbohydrate tổng

- Nhiệt độ - Thời gian - Khảo sát các yếu tố của quá trình xử lý nhiệt sụn - Tối ƣu hóa điều kiện xử lý nhiệt sụn ức gà

Khảo sát quá trình tủa GAGs bằng Ethanol

Hàm lƣợng GAGs là cao nhất

Khảo sát thời gian bảo quản sụn

Phân tích chế phẩm GAGs thu đƣợc

Thời gian cấp đông Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol

- Độ ẩm - Protein - Lipid - Tro - Carbohydrate tổng - CS

- Hàm lƣợng các thành phần hóa học và hàm lƣợng CS của chế phẩm GAGs

- Khối lƣợng phân tử của chế phẩm GAGs

3.3.2 Quy trình thủy phân sụn ức gà bằng enzyme papain

Xử lý sụn Xử lý nhiệt

 Lựa chọn nguyên liệu sụn ức gà ˗ Mục đích: Đảm bảo nguyên liệu mang tính đồng nhất để dùng trong nghiên cứu ˗ Thực hiện: Nguyên liệu đƣợc mua tại Công ty TNHH Phạm Tôn, cùng một giống gà và cùng một lứa (thường từ 38 ngày tuổi đến 42 ngày tuổi) Nguyên liệu được giết mổ trong ngày, còn tươi, không có mùi lạ ˗ Yếu tố khảo sát: Thời gian bảo quản nguyên liệu

 Làm sạch ˗ Mục đích: Tách phần xương với phần sụn ức, loại đi các bụi bẩn còn bám trên bề mặt ˗ Thực hiện: Xương ức gà sau khi được mua về sẽ được tách lấy phần sụn ức Sụn này sẽ được rửa qua nước muối 5%, làm ráo và cho vào túi PE, hàn kín; đem bảo quản ở nhiệt độ –18 o C cho đến khi sử dụng

 Xử lý nhiệt ˗ Mục đích: Giúp tách phần mô và mỡ ra khỏi sụn dễ dàng ở công đoạn sau, đồng thời làm mềm sụn tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nghiền ˗ Thực hiện: Sụn được cho vào nước và gia nhiệt lên Lượng sụn và lượng nước ở mỗi thí nghiệm là như nhau để đảm bảo tính đồng đều của nguyên liệu ˗ Yếu tố khảo sát: Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn và thời gian xử lý nhiệt sụn

 Xử lý sụn ˗ Mục đích: Tách bỏ phần mô và mỡ còn bám trên sụn, đồng thời loại bỏ phần xương còn sót lại trên sụn Giúp chuẩn bị nguyên liệu cho công đoạn sau ˗ Thực hiện: Dùng dao cạo sạch thịt, màng protein và mỡ bao quanh sụn, để ráo

 Nghiền ˗ Mục đích: Làm giảm kích thước của sụn nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa sụn với enzyme, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme hoạt động dễ dàng hơn ˗ Thực hiện: Sụn đƣợc nghiền bằng máy xay sinh tố Khối lƣợng sụn là 15 g và tốc độ xay ở mỗi nghiệm thức của thí nghiệm đƣợc giữ cố định ˗ Yếu tố khảo sát: Thời gian nghiền sụn

 Thủy phân ˗ Mục đích: Trích ly GAGs có trong sụn ức gà ˗ Thực hiện: Sụn đƣợc cho vào dung dịch đệm đã chỉnh pH, bổ sung enzyme Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong bể điều nhiệt có kết hợp lắc đảo 120 vòng/phút nhằm tăng khả năng tương tác giữa enzyme và sụn cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn ˗ Các yếu tố khảo sát: Tỷ lệ sụn:đệm, pH, hàm lƣợng E/S, nhiệt độ và thời gian thủy phân

 Vô hoạt enzyme ˗ Mục đích: Kìm hãm hoạt động của enzyme để tránh các biến đổi về sau quá trình thủy phân ˗ Thực hiện: Đun cách thủy mẫu thủy phân ở nhiệt độ 90 o C trong 10 phút, sau đó đem làm nguội

 Kết tủa 1 ˗ Mục đích: Kết tủa các protein còn sót lại trong mẫu, nhằm tăng độ tinh sạch cho chế phẩm GAGs ˗ Thực hiện: Hòa tan acid trichloroacetic (TCA) vào dịch sau thủy phân, để qua đêm ở nhiệt độ 10 o C ˗ Yếu tố khảo sát: Hàm lƣợng TCA

 Lọc ˗ Mục đích: Loại bỏ phần protein sau khi kết tủa bằng TCA, thu phần dịch trong ˗ Thực hiện: Tiến hành lọc chân không mẫu sau khi tủa TCA qua đờm, sử dụng giấy lọc với kớch thước lỗ 20 àm đến 25 àm

 Thẩm tích ˗ Mục đích: Loại bỏ những tạp chất có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn 14 kDa ra khỏi mẫu nhƣ TCA, các acid amine, muối khoáng, … ˗ Thực hiện: Cho dịch mẫu vào túi cellophane, có kích thước lỗ màng 14 kDa, đường kính màng là 44 mm Sau đó cho mẫu vào cốc nước cất để thẩm tích 4 giờ, định kỳ thay nước 30 phút/lần

 Kết tủa 2 ˗ Mục đích: Kết tủa GAGs có trong dịch mẫu sau khi thẩm tích ˗ Thực hiện: Cho dịch sau khi thẩm tích vào ethanol 96% với tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol khảo sát, để mẫu qua đêm ở nhiệt độ

10 o C ˗ Yếu tố khảo sát: Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol

 Sấy ˗ Mục đích: Loại bỏ phần nước và ethanol đã bổ sung vào mẫu Làm khô tủa, thu nhận thành phẩm GAGs; giúp thuận tiện cho quá trình bảo quản ˗ Thực hiện: Gạn bớt phần nước và ethanol ở phía trên, tách phần tủa bên dưới đem sấy ở nhiệt độ 60 o C và thu GAGs khô

3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của quá trình xử lý nhiệt sụn ức gà đến hàm lƣợng GAGs

Hàm mục tiêu cần đạt đƣợc: Hàm lƣợng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn đƣợc nhiệt độ của quá trình xử lý nhiệt sụn để tiến hành các thí nghiệm sau

Bảng 3.1: Điều kiện thí nghiệm 1

Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn ( o C) 60; 70; 80; 90; 100

Thời gian xử lý nhiệt sụn (phút) 10 [19]

Thời gian nghiền sụn (giây) 20

Tỷ lệ sụn:đệm (w/v) 1: 10 [19] pH 7,0 [19], [20], [45]

Thời gian thủy phân (phút) 180 [20]

Thời gian thẩm tích (giờ) 4

 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian quá trình xử lý nhiệt sụn ức gà đến hàm lƣợng GAGs

Hàm mục tiêu cần đạt đƣợc: Hàm lƣợng GAGs (%) cao nhất, từ đó chọn đƣợc thời gian của quá trình xử lý nhiệt sụn để tiến hành các thí nghiệm sau

Bảng 3.2: Điều kiện thí nghiệm 2

Thởi gian xử lý nhiệt sụn (phút) 5; 10; 15; 20; 25

Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn ( o C) Thí nghiệm 1

Thời gian nghiền sụn (giây) 20

Tỷ lệ sụn:đệm (w/v) 1: 10 [19] pH 7,0 [19], [20], [45]

Thời gian thủy phân (phút) 180 [20]

Thời gian thẩm tích (giờ) 4

 Thí nghiệm 3: Tối ƣu hóa các điều kiện của quá trình xử lý nhiệt sụn ức gà Để xác định được các kết quả tối ưu từ các thí nghiệm tương tác của các yếu tố đến hàm mục tiêu, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng

(Response Surface Methodology – RSM) và phần mềm Modde 5.0 để xử lý kết quả

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thành phần cơ bản của sụn ức gà

Sụn ức gà nguyên liệu khi còn mô thịt và mỡ có khối lƣợng khoảng từ 8,5 g đến 11,5 g Sau khi đƣợc làm sạch để loại đi lớp mô thịt và mỡ thì khối lƣợng còn khoảng từ 2,5 g đến 3 g Sụn khi đƣợc làm sạch có màu trắng đục, phần trăm khối lƣợng sụn so với nguyên liệu ban đầu là 27,5%

Sụn ức gà đƣợc làm sạch mô thịt, mỡ, lớp màng liên kết giữa mô và sụn rồi đem phân tích về thành phần hóa học cơ bản (Bảng 4.1)

Bảng 4.1: Các thành phần hóa học trong sụn ức gà

Tên chỉ tiêu Hàm lƣợng (%) Ẩm 77,74

Kết quả của bảng 4.1 ta có trong nguyên liệu nghiên cứu có hàm lƣợng ẩm chiếm 77,74% và hàm lƣợng chất khô chiếm 22,26% gồm 11,8% protein; 1,6% tro; 8,86% carbohydrate; không phát hiện lipid Từ đó ta có hàm lƣợng protein và carbohydrate tính theo chất khô trong nguyên liệu chiếm khoảng 53% và 39,8%

Kết quả này cho thấy điểm tương đồng với kết quả phân tích của S

C Shin và cộng sự (2006), với hàm lƣợng ẩm là 82,85%; hàm lƣợng protein là 11,78%; hàm lƣợng béo là 0,29%; hàm lƣợng tro là 1,21% và hàm lƣợng carbohydrate là 3,87% [43].

Khảo sát ảnh hưởng các yếu tố trong quá trình xử lý nhiệt sụn ức gà đến hàm lƣợng GAGs

4.2.1 Nhiệt độ quá trình xử lý nhiệt

Hình 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý nhiệt đến hàm lượng GAGs

Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình lặp lại 3 lần, lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Những giá trị nghiệm thức có các ký tự giống nhau không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p 0,8, giá trị biến thiên ảo là Q 2 = 0,667 > 0,5 và độ sai lệch của chúng là 0,290 thuộc

[0,2; 0,3] (Phụ lục C3) Cho thấy các giá trị hồi quy là có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy Nhƣ vậy kết quả thí nghiệm là phù hợp khi tiến hành quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0 [49]

Sự ảnh hưởng của các biến thể hiện trong bảng 4.5 với mức ý nghĩa là 5% Các giá trị a 1 , a 2 có tác động dương, trong khi các biến a 1 2 , a 2 2 có tác động âm đến hàm mục tiêu hàm lƣợng GAGs (%), thể hiện ở giá trị p0,05 và giá trị này được loại khỏi phương trình hồi quy

Phương trình hồi quy thực nghiệm có dạng sau:

Thế các giá trị x 1 , x 2 , vào phương trình (*) ta thu được phương trình biến thiên theo số thực nhƣ sau:

Trong đó: Z 1 : Biến thực của giá trị nhiệt độ xử lý nhiệt sụn

Z 2 : Biến thực của giá trị thởi gian xử lý nhiệt sụn

Tính tương thích của phương trình hồi quy được kiểm tra bằng phần mềm Modde 5.0 Phương trình hồi quy sẽ tương thích với thực nghiệm nếu kết quả phân tích “Lack of Fit” là không có ý nghĩa thống kê [50]

Giá trị “Lack of Fit” = 0,081 là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) nên phương trình hồi quy có sự tương thích cao với thực nghiệm (Phụ lục C3) Nhƣ vậy, mô hình thống kê này có thể sử dụng để dự đoán điều kiện tối ƣu của quá trình thủy phân

Sự ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đến H GAGs (%) được thể hiện trên bề mặt đáp ứng nhƣ trong hình 4.3

Hình 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý nhiệt nguyên liệu đếnhàm lƣợng GAGs

 Kết quả kiểm chứng giá trị dự đoán H GAGs (%) tối ƣu hóa từ mô hình với giá trị thực nghiệm Điều kiện tối ƣu hóa cho quá trình thủy phân đƣợc xác định bởi phần mềm Modde 5.0 cho thấy tại điều kiện nhiệt độ = 85,85 o C và thời gian 20,65 phút thì H GAGs (%) cao nhất là 13,648% Để kiểm chứng chính xác các giá trị nhận được từ phương trình hồi quy, tiến hành thí nghiệm lập lại 3 lần với các thông số tương đương điều kiện ở trên: nhiệt độ xử lý sụn = 86 o C và thời gian xử lý = 21 phút cho quá trình xử lý nhiệt nguyên liệu

Thí nghiệm đƣợc tiến hành với điều kiện thủy phân nhƣ sau: pH 7,0; nhiệt độ = 65 o C; hàm lƣợng E/S = 0,4% (w/w pro ) và thời gian thủy phân

Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 4.6

Bảng 4.4: Kết quả H GAGs (%) từ phương trình hồi quy và thực nghiệm

H GAGs (%) từ phương trình hồi quy 13,65 a H GAGs (%) từ thực nghiệm 13,62 ± 0,24 a

Nhận xét: Từ kết quả thu đƣợc ở bảng 4.6, hàm lƣợng GAGs (%) từ phương trình hồi quy là 13,65% và từ thực nghiệm là 13,62 ± 0,24% không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê (p>0,05), cho thấy rằng phương trình hồi quy xây dựng ở trên là phù hợp với thực tiễn thí nghiệm (Phụ lục C.3).

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nghiền đến hàm lượng GAGs

Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút

Hình 4.4: Ảnh hưởng của thời gian nghiền sụn đến hàm lượng GAGs

Thời gian nghiền sụn (giây)

Kết quả từ hình 4.4 cho ta thấy, H GAGs (%) tăng dần từ khi tăng dần thời gian nghiền sụn lên Ở 10 giây, H GAGs = 8,09 ± 1,86%; khi tăng lên 20 giây và 30 giây thì H GAGs cũng tăng lên lần lƣợt là 13,43 ± 1,34% và 13,36 ± 1,21%, ở hai mức khảo sát này H GAGs không có sự khác biệt có ý nghĩa (p>0,05) (Phụ lục C.4) Tiếp đó, H GAGs tăng lên đạt giá trị cực đại ở nghiệm thức 40 giây và 50 giây, lần lƣợt là 14,04 ± 0,91% và 14,00 ± 3,11% Sau đó giảm xuống còn 11,74% khi thời gian nghiền sụn là 60 giây (Phụ lục B.4)

Việc nghiền sụn ra những kích thước nhỏ hơn tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân Khi thời gian nghiền dần tăng lên, thì kích thước sụn càng nhỏ đi; giúp tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, từ đó enzyme cắt các mạch của protein dễ dàng hơn, GAGs đƣợc giải phóng ra nhiều hơn nên H GAGs tăng

Tuy nhiên, việc tăng thời gian nghiền giúp enzyme hoạt động tốt hơn, các mạch cắt ra sẽ ngắn hơn; khi tiến hành bước thẩm tích, các GAGs có kích thước nhỏ hơn 14 kDa sẽ thất thoát ra môi trường ngoài, gây thất thoát, do đó dẫn đến H GAGs giảm

Kết luận: Ở hai mức khảo sát thời gian nghiền là 40 giây và 50 giây, H GAGs đạt giá trị cao nhất nhƣng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; do đó để tiết kiệm thời gian nghiên cứu, tôi chọn thời gian nghiền sụn là 40 giây để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ sụn:đệm đến hàm lượng GAGs

Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây

Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ sụn:đệm đến hàm lượng GAGs

Kết quả hình 4.5 cho ta thấy, khi tăng tỷ lệ sụn:đệm lên thì H GAGs cũng tăng theo Ở tỷ lệ 1:4, H GAGs = 8,33 ± 0,72%; sau đó tăng dần lên ở tỷ lệ 1:06, 1:08 lần lƣợt là 13,13 ± 0,95% và 13,45 ± 1,43%, H GAGs ở hai tỷ lệ này khác nhau không có ý nghĩa thống kê, p>0,05 (Phụ lục C.5) H GAGs đạt cực đại ở tỷ lệ 1:10 là 13,96 ± 2,02%, nhƣng đến tỷ lệ 1:12 thì H GAGs giảm xuống còn 12,05 ± 2,44%

Do sụn là nguyên liệu rắn ta dùng trích ly GAGs nên cần môi trường dung dịch để trích Dung dịch đệm không những là môi trường cho chất tan mà còn là điều kiện ổn định hoạt động của enzyme Khi tăng tỷ lệ sụn:đệm lên từ 1:4 đến 1:10, môi trường hoạt động của enzyme tăng lên, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất Tuy nhiên, đến một giới hạn nhất

Tỷ lệ sụn:đệm định, càng tăng dung dịch đệm thì càng làm loãng hàm lƣợng enzyme (tỷ lệ sụn:đệm = 1:12), dung dịch trở thành môi trường làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất

Kết quả khảo sát trên có sự tương đồng với nghiên cứu của W

Garnjanagoonchorn và cộng sự (2006), tỷ lệ sụn:đệm phù hợp là 1:10 [19]

Từ kết quả khảo sát trên tôi chọn tỷ lệ sụn nước là 1: 10 để tiến hành các thí nghiệm sau.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình thủy phân đến hàm lƣợng GAGs

4.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH trong quá trình thủy phân đến hàm lượng GAGs Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây ˗ Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10

Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH trong quá trình thủy phân đến hàm lượng

Kết quả từ hình 4.6 cho thấy, khi tăng dần pH từ 5,5 đến 7 thì H GAGs cũng tăng theo; ở pH = 5,5; 6; 6,5 có H GAGs đạt đƣợc lần lƣợt là 9,63 ± 1,55%, 11,1 ± 2,21% và 11,81 ± 0,6% Ở pH = 7, giá trị H GAGs đạt cực đại là 14,40 ± 0,85%; tuy nhiên, khi tiếp tục tăng pH lên 7,5 và 8 thì H GAGs giảm xuống còn 12,03 ± 1,02% và 11,38 ± 1,08% Trong đó, giá trị H GAGs ở pH 6,5 và 7,5 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Phụ lục C.6.1)

Khi mức pH càng cao thì mức độ thủy phân càng giảm, điều này chứng tỏ khoảng pH từ acid yếu đến trung tính là thích hợp cho enzyme papain hoạt động để thủy phân sụn ức gà đạt kết quả cao nhất

Từ kết quả của khảo sát trên, tôi chọn pH = 7 trong quá trình thủy phân để tiến hành các thí nghiệm sau

4.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng E/S trong quá trình thủy phân đến hàm lượng GAGs Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây ˗ Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10 ˗ pH: 7

Hình 4.7: Ảnh hưởng của hàm lượng E/S trong quá trình thủy phân đến hàm lƣợng GAGs

Từ kết quả của hình 4.7 ta có, khi không sử dụng enzyme trong quá trình trích ly GAGs thì hàm lƣợng GAGs rất thấp là 5,08 ± 1,93% Khi tăng hàm lƣợng enzyme lên, H GAGs cũng tăng nhanh theo; ở các hàm lƣợng E/S

0,2% và 0,4% có H GAG thu đƣợc lần lƣợt là 7,19 ± 1,98% và 13,16 ± 3,88%

Khi hàm lƣợng E/S lên đến 0,6% thì H GAGs đạt giá trị cực đại là 14,34 ±

0,99% Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng hàm lƣợng E/S thì H GAGs thay đổi không có ý nghĩa thống kê, p>0,05 (Phụ lục B.7)

Hàm lƣợng E/S thấp không đủ thủy phân lƣợng cơ chất nên GAGs đƣợc giải phóng ra ít do đó HGAGs thấp Lƣợng cơ chất đƣợc phân giải càng nhiều dẫn đến H GAGs càng cao khi hàm lƣợng E/S tăng dần lên nhƣng khi tăng đến một giá trị nhất định thì H GAGs không tăng nữa, do enzyme ở nồng độ cao sẽ cạnh tranh cơ chất dẫn đến hoạt động xúc tác giảm nên hàm lƣợng không thể tăng cao

Từ kết quả khảo sát trên, để H GAGs đạt giá trị cao nhất và đồng thời tiết kiệm enzyme (do sự khác nhau giữa H GAGs ở các hàm lƣợng E/S từ 0,6% đến 1,2% không có ý nghĩa thống kê, p>0,05 – Phụ lục C.6.2) tôi chọn hàm lƣợng E/S là 0,6% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

4.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thủy phân đến hàm lượng GAGs Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây ˗ Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10 ˗ pH: 7 ˗ Hàm lƣợng E/S: 0,6% (w/w pro )

Hình 4.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiêu suất thu hồi

Từ kết quả hình 4.8 cho thấy, khi quá trình thủy phân diễn ra ở nhiệt độ thấp: 55 o C thì H GAGs đạt đƣợc ở mức thấp 6,13 ± 3,93% Khi tăng dần nhiệt độ 60 o C, H GAGs tăng mạnh tương ứng với 12,16 ± 2,32% và đạt cực đại ở 65 o C, với H GAGs = 14,15 ± 0,84% Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng cao nhiệt độ thủy phân thì H GAGs bị giảm thấp chỉ đạt 12,80 ± 1,18% ở 70 o C và 8,68 ± 1,05% ở 75 o C

Mỗi enzyme có một khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp riêng, do đó khi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 55 o C đến 60 o C, khả năng cắt mạch protein của enzyme không cao, dẫn đến H GAGs thấp Khi tăng nhiệt độ đạt đến nhiệt độ để enzyme hoạt động thì cho HGAGs cực đại; khi tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân, enzyme chịu tác động của nhiệt dẫn đến giảm hoặc mất hoạt tính Sự biến tính này là không thuận nghịch và khó phục hồi, dẫn đến H GAGs giảm

Từ kết quả khảo sát trên, ta thấy đƣợc nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme papain là 65 o C; vì vậy, tôi chọn nhiệt độ này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

4.5.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trong quá trình thủy phân đến hàm lượng GAGs Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây ˗ Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10 ˗ pH: 7 ˗ Hàm lƣợng E/S: 0,6% (w/w pro ) ˗ Nhiệt độ: 65 o C

Hình 4.9: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng GAGs

Thời gian thủy phân (phút)

Từ kết quả hình 4.9 ta có, ở thời gian thủy phân 60 phút, H GAGs 9,77 ± 0,35% Khi kéo dài thời gian thủy phân lên, H GAGs đạt cực đại sau 180 phút thủy phân, 14,45 ± 0,42% Nhƣng khi tiếp tục thủy phân trong thời gian dài hơn nữa ở 300 phút , 420 phút và 540 phút thì HGAGs thay đổi không có ý nghĩa thống kê, p>0,05 (Phụ lục C.6.4) tương đương với 14,25 ± 2,44%, 14,3 ± 1,10% và 14,36 ± 1,81%

Enzyme hoạt động trong môi trường nhiệt độ cao và thời gian kéo dài nên bị giảm hoạt tính, đồng thời lƣợng cơ chất qua thời gian cũng giảm dần, do đó khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất cũng bị hạn chế

Kết quả khảo sát trên cũng có điểm tương đồng với nghiên cứu của S

L Xiong và cộng sự (2012), thời gian thủy phân bằng enzyme papain là 180 phút [43]

Từ kết quả của khảo sát trên, để tiết kiệm thời gian nghiên cứu đồng thời hàm lƣợng GAGs vẫn cao, tôi chọn thời gian thủy phân là 180 phút để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

4.5.5 Tối ưu các điều kiện trong quá trình thủy phân

Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng TCA trong quá trình kết tủa

 Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây ˗ Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10 ˗ pH: 7,1 ˗ Hàm lƣợng E/S: 0,62% (w/w pro ) ˗ Nhiệt độ: 65 o C ˗ Thời gian thủy phân: 230 phút

Hình 4.12: Ảnh hưởng của hàm lượng TCA (%) trong quá trình tủa protein đến hàm lƣợng GAGs

Hình 4.13: Ảnh hưởng của hàm lượng TCA (%) trong quá trình tủa protein đến hàm lƣợng protein hòa tan trong mẫu

Từ kết quả của hình 4.12, ta có H GAGs ở hàm lƣợng TCA 6% là 13,64

 0,89%, sau đó ở hàm lƣợng TCA 7%, H GAGs đạt cực đại là 14,44  1,28%

Tuy nhiên, khi tăng hàm lƣợng TCA lên từ 8% đến 10% thì HGAGs giảm dần xuống còn lần lƣợt là 12,95  2,16%, 8,63  2,32% và 7,97  3,00%

Từ kết quả của hình 4.13, ta có khi hàm lƣợng TCA tăng dần từ 6% đến 10% thì hàm lƣợng protein hòa tan giảm dần so với ban đầu (25,11  0,57%) từ 18,70  1,11% xuống 11,44  2,86%

Lượng protein có trong dịch mẫu sau thủy phân làm ảnh hưởng đến quá trình đo quang xác định hàm lƣợng GAGs, đồng thời làm lƣợng chất khô trong mẫu cao dẫn đến H GAGs thấp TCA dùng để tủa các chuỗi peptide còn lại trong dịch thủy phân [51], hàm lƣợng càng cao thì càng loại đi nhiều protein (Hình 4.19); sau khi tủa, hàm lƣợng protein trong mẫu giảm và H-

GAGs tăng lên Ở hàm lƣợng TCA cao (8%, 9%, 10%) giúp tủa một số đoạn peptide chƣa đƣợc loại hết khi tủa ở hàm lƣợng TCA thấp (6% và 7%) kéo

H àm lƣợn g prot ei n hòa tan (% )

Hàm lƣợng TCA (%) theo các GAGs vẫn còn gắn trên các peptide này dẫn đến H GAGs giảm do thất thoát (Hình 4.18)

Kết quả thí nghiệm trên có sự tương đồng với thí nghiệm của T

Nakano và cộng sự (2012), trong nghiên cứu trích ly CS từ sinh khối gà thịt [52]

Sau quá trình tủa loại protein, ở hàm lƣợng TCA 10%, hàm lƣợng protein là thấp nhất và có H GAGs thấp nhất Ở hàm lƣợng TCA 7%, hàm lƣợng protein hòa tan cao hơn ở 10% khoảng 1,6 lần nhƣng lại có H GAGs cao nhất Để thu giảm thiểu hàm lƣợng TCA trong sản phẩm và thu đƣợc nhiều GAGs, tôi chọn hàm lƣợng TCA 7% trong quá trình tủa protein để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

Khảo sát ảnh hưởng của Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol trong quá trình kết tủa GAGs đến hàm lƣợng GAGs

 Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây ˗ Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10 ˗ pH: 7,1 ˗ Hàm lƣợng E/S: 0,62% (w/w pro ) ˗ Nhiệt độ: 65 o C ˗ Thời gian thủy phân: 230 phút

Hình 4.14: Ảnh hưởng của Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol trong quá trình kết tủa GAGs đến H GAGs

Từ kết quả hình 4.14 ta có, ở Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol là

1:0,5; 1:1 và 1:2 thì H GAGs tăng lên lần lƣợt là 6,31  4,68%; 9,66  1,90% và 11,02  4,77% Ở tỷ lệ 1:3 và 1:4, H GAGs đạt cực đại với H GAGs lần lƣợt là

12,17  1,51% và 12,07  3,1%; sự khác nhau về H GAGs ở hai tỷ lệ này không có ý nghĩa thống kê, p>0,05 (Phụ lục C.8)

Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrate của GAGs và làm GAGs kết tủa Tuy nhiên tùy thuộc vào nồng độ ethanol mà ta có thể thu đƣợc hàm lƣợng GAGs cao nhất Ở tỷ lệ 1:0,5 và 1:1, ethanol không đủ để tủa đƣợc hết GAGs, do đó H GAGs thấp Ở tỷ lệ cao 1:2, 1:3 và 1:4, H GAGs tăng cao và đạt đƣợc giá trị cực đại

Kết quả nghiên cứu trên cũng có sự tương đồng với nghiên cứu của J

Xie và cộng sự (2014), khi chọn Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol là 1:3 để nghiên cứu [40]

Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol

Kết luận: Để thu đƣợc H GAGs cao nhất và tiết kiệm ethanol, tôi chọn Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol là 1:3 (tương đương với ethanol 72%) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản sụn ức gà đến hàm lƣợng GAGs

 Điều kiện cố định: ˗ Nhiệt độ xử lý nhiệt sụn: 86 o C ˗ Thời gian xử lý nhiệt sụn: 21 phút ˗ Thời gian nghiền sụn: 40 giây ˗ Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10 ˗ pH: 7,1 ˗ Hàm lƣợng E/S: 0,62% (w/w pro ) ˗ Nhiệt độ: 65 o C ˗ Thời gian thủy phân: 230 phút

Hình 4.15: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản sụn đến H GAGs

Thời gian bảo quản (Tuần)

Từ kết quả hình 4.15 ta có, H GAGs trong tuần 1 và 2 lần lƣợt là 14,03

 1,95% và 13,97  2,56%, các giá trị này khác biệt không có ý nghĩa so với H GAGs của nguyên liệu ban đầu (14,21  2,62%), p