Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Trích ly CO2 siêu tới hạn dầu hạt neem để ứng dụng trong bảo quản hạt bắp

Nhiệm vụ và nội dung - Tổng quan về: cây neem, thành phần của dầu neem, ứng dụng của dầu neem, khả năng kháng khuẩn của dầu neem, các phương pháp trích ly dầu neem, kỹ thuật trích ly bằ

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây neem

- Ngành : Angiospermatophyta - Lớp : Dicotyledoneae - Lớp phụ : Archichlamydeae - Nhóm : Dialypetalae - Bộ : Rutales - Bộ phụ : Rutinae - Họ : Meliaceae - Họ phụ : Melioideae - Tộc (chi): Melieae - Giống : Azadirachta - Loài : indica A Juss

2.1.2 Công dụng của cây neem

Cây neem có rất nhiều công dụng trong nông nghiệp và y học [2] Tại nhiều nước trên thế giới, cây neem không những mang lại hiệu quả đáng kể về kinh tế với nhiều sản phẩm đa dạng mà nó còn giải quyết được một số vấn đề về môi sinh Đây là một trong số ít những loài thực vật mà tất cả các bộ phận của nó đều mang lại những lợi ích thiết thực cho con người [3]

- Lá: lá có lượng đạm, khoáng, caroten tương đối cao nên có thể được sử dụng làm thức ăn cho gia súc Tại một số vùng Andhra Pradesh, nông dân thường cho gia súc ăn lá neem sau khi sinh con để gia tăng sự tiết sữa Ngoài ra, lá còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gia súc và kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh khác [4] Nhiều nơi còn dùng lá non làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa có thể phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột Ở Ấn Độ, dân gian thường lấy lá neem để gần trẻ em giúp ngăn ngừa bệnh ho gà Lá neem cũng được sử dụng trong bảo quản nông sản với liều lượng 2 – 5 kg lá neem/100 kg nông sản [3]

- Quả: quả neem dùng làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau và thuốc trị bệnh đường huyết niệu, bệnh trĩ Quả khô ngâm nước có thể điều trị được một số bệnh ngoài da Nước quả tươi khi phun lên cây có thể xua đuổi nhiều loại côn trùng [5]

- Hạt: nhân hạt neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có thể dùng làm thuốc giảm đau, thuốc sát trùng, thuốc ngừa thai [6] Ngoài ra, dầu neem còn được dùng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng và nhiều ngành công nghiệp khác [7]

- Vỏ cây: vỏ cây có chứa nhiều hợp chất minbin có khả năng tiêu diệt các loại côn trùng

- Rễ: dầu neem từ rễ cây neem được dùng làm thuốc cổ truyền trị bệnh ngoài da, suy nhược cơ thể do có chứa nhiều đường, nhựa, protein, tryptophan Bộ rễ phát triển khỏe, giúp hạn chế xói mòn đất và góp phần cùng với lá rụng phục hồi dinh dưỡng cho tầng đất canh tác [3]

2.1.3 Các hoạt chất sinh học chính trích ly từ cây neem

Từ neem, có thể chiết xuất ra rất nhiều hợp chất có khả năng phòng trừ nhiều loại côn trùng, bên cạnh đó chúng còn được dùng để làm thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, thuốc ngừa thai, mỹ phẩm, … và nhiều ứng dụng thực tiễn khác Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh neem có khả năng ức chế hơn 400 loài dịch hại, bao gồm: côn trùng, nấm, vi khuẩn, virut, tuyến trùng, … Trong đó, azadirachtin A (AZA), azadirachtin B (AZB), salanin, nimbin là những hoạt chất sinh học có tác dụng phòng trị côn trùng, được chiết chủ yếu từ hạt neem [1]

Azadirachtin là hợp chất chính trong cây neem, có công thức phân tử là

C 35 H 44 O 16 , nhiệt độ nóng chảy 154 – 158 o C, có hoạt tính kháng côn trùng mạnh nhất, đặc biệt là tác động xua đuổi và ức chế sinh trưởng

Azadirachtin có cấu trúc tương tự như hormone “ecdysone”, hormone này có tác dụng kiểm soát tiến trình biến đổi nội hóa học của côn trùng khi côn trùng chuyển từ dạng ấu trùng sang dạng nhộng để trưởng thành Azadirachtin được xem như chất ngăn cản sự tổng hợp các hormone cần thiết cho cơ thể côn trùng, do đó phá vỡ chu kỳ sống của côn trùng [8]

Azadirachtin tập trung nhiếu nhất trong nhân hạt neem Trung bình 1 g nhân hạt neem chứa từ 2 đến 4 mg azadirachtin Đặc biệt ở Senegal, 1 g nhân hạt có thể chứa đến 9 mg azadirachtin [8]

Hàm lượng azadirachtin trong nhân hạt neem cũng biến động tùy thuộc vào nguồn gốc, xuất xứ, điều kiện khí hậu ở nhiều vùng khác nhau Trong mỗi cây cũng có sự biến động về hàm lượng azadirachtin [8]

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của azadirachtin A (a) và azadirachtin B (b) [8]

Bảng 2.1 Sự biến động hàm lượng azadirachtin trong nhân hạt neem từ nhiều nơi khác nhau [9]

Xuất xứ Hàm lượng azadirachtin

Hàm lượng azadirachtin cũng phụ thuộc vào thời điểm thu hái, quả neem thu hoạch tốt nhất khi nó chuyển sang màu vàng hay vàng xanh, lúc này hàm lượng azadirachtin cao nhất Không nên để quả quá chín và rụng vì hạt thường bị giảm chất lượng khi bị rơi xuống đất [4]

Salannin cũng có hoạt tính gây ngán ăn mạnh và đặc biệt là chất chống lại sự lột xác của côn trùng Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất này tác động mạnh lên sự lột xác của con bọ cánh cứng trên dưa chuột (Acalymma vitta) và bọ cánh cứng Nhật Bản (Popillia japonica) Trong hạt neem, hàm lượng salanin thường từ 15 – 1247 mg/g [8]

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của salanin [8]

Nimbin cũng là một trong những hoạt chất đầu tiên được tách chiết từ hạt và lá neem Nimbin được phát hiện có trong mô sẹo nuôi cấy từ vỏ thân cây neem nhưng biến mất sau 3 tháng Nimbin có hoạt tính kháng virut mạnh, đặc biệt hiệu quả đối với virut gây bệnh trên cây cà chua, bệnh đậu mùa, bệnh trên gia cầm [6] Nimbin là thành phần chủ yếu gây ra vị đắng ở hạt neem cũng như trong dầu neem Nimbin chiếm khoảng 2% trong nhân hạt neem Nimbin cũng có hoạt tính kháng virut mạnh giống như azadirachin [8]

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của nimbin [8]

2.1.4 Tình hình nghiên cứu về cây neem 2.1.4.1 Trên thế giới

Cây neem đã được trồng phổ biến ở Ấn Độ và Burma như một loại cây thuốc có giá trị và cho đến nay, Ấn Độ vẫn là nước trồng cây neem nhiều nhất thế giới Tại đây, cây neem được trồng khắp nơi và được xem như là loài cây tiêu biểu của quốc gia

Hơn 14 triệu cây neem cho 418.633 tấn hạt/năm đã đem lại nguồn lợi hàng năm khoảng 1 vạn tấn dầu và 4 vạn tấn bánh dầu [9]

Năm 1959, nhà côn trùng học người Đức Heinrich Schmutterer chứng kiến nạn dịch châu chấu ở Sudan Ông quan sát thấy neem là cây duy nhất không bị châu chấu tấn công Từ đó ông bắt đầu quan tâm nghiên cứu các hoạt chất trong cây neem [1]

Năm 1962, Heinrich Schmutterer và các nhà khoa học Ấn Độ đã chứng minh rằng dầu hạt neem có khả năng xua đuổi được châu chấu và dầu neem từ hạt có hiệu lực hơn so với dầu từ lá neem [11]

Cây bắp

Bắp có hình dạng và kích thước khác biệt nhau rất nhiều giữa các giống

Dựa vào đặc tính này người ta có thể phân biệt được chúng Ngay trong cùng một trái bắp hạt cũng thay đổi về hình dạng và độ lớn Hạt ở đầu cuống trái bắp dường như có cùng khối lượng với hạt giữa trái bắp, có dạng ngắn hơn và to hơn Hạt của các giống bắp khác nhau nhưng đều cấu tạo gồm từ 3 phần chính: vỏ, phôi và nội nhũ

Tỷ lệ giữa các thành phần của hạt bắp được trình bày trong bảng sau

Bảng 2.2 Các thành phần phần chính trong hạt bắp [15]

Thành phần Vỏ Phôi Nội nhũ Mày

Phần trăm trong hạt (theo % chất khô)

 Vỏ: hạt bắp là loại hạt trần nên không có vỏ trấu mà chỉ có lớp vỏ quả và vỏ hạt

Chiều dày lớp vỏ khoảng 35 – 60 μm

Vỏ quả gồm có 3 lớp:

 Lớp ngoài cùng: tế bào xếp theo chiều dọc của hạt nên gọi là lớp tế bào dọc

 Lớp giữa: gồm những tế bào tương tự như lớp ở ngoài nhưng tế bào xếp thành chiều ngang Khi hạt còn xanh những tế bào của lớp giữa chứa những hạt diệp lục Khi hạt đã chín trong tế bào này trống rỗng

 Lớp trong: gồm những tế bào hình ống xếp theo chiều dọc của hạt Chiều dày

Hình 2.5 Cấu tạo hạt bắp của lớp vỏ ngoài thay đổi theo tùy loại và giống hạt Trong cùng một hạt thì chiều dày của vỏ ngoài tại các vị trí khác nhau cũng không giống nhau [16]

Vỏ hạt gồm 2 lớp tế bào:

 Lớp ngoài: gồm những tế bào xếp rất xít với nhau và chứa đầy chất màu (sắc tố)

 Lớp trong: gồm những tế bào không màu và không ngấm nước, dễ cho nước đi qua

 Lớp aleurone: gồm những lớp tế bào lớn, thành dày, trong có chứa hợp chất của nitơ và những giọt nhỏ chất béo Lớp tế bào này có dạng nhỏ hình vuông hoặc chữ nhật Lớp aleurone dày khoảng 10 – 70 μm, trong lớp này hầu như không chứa tinh bột Chiều dày của lớp aleurone phụ thuộc vào giống, loại hạt và nhất là phụ thuộc vào điều kiện canh tác [15]

- Sau lớp aleurone là khối những tế bào lớn hơn, thành mỏng, có hình dạng khác nhau, xếp không có thứ tự rõ ràng, đó là tế bào nội nhũ

- Nội nhũ của hạt bắp được chia làm 2 phần, nội nhũ sừng và nội nhũ bột:

+ Lớp nội nhũ bột nằm bên trong, gần phôi, mềm và đục, chứa nhiều hạt tinh bột

Các hạt tinh bột của lớp nội nhũ lớn và trơn nhẵn Liên kết các tế bào trong lớp nội nhũ bột lỏng lẻo Trong phần nội nhũ bột, màng lưới các hạt protein mỏng và không bao bọc được xung quanh hết các hạt tinh bột

+ Lớp nội nhũ sừng cứng và trong mờ, nằm gần lớp vỏ, chứa nhiều hạt protein Hạt tinh bột của lớp nội nhũ hình đa giác, kích thước nhỏ, kết dính nhau rất sít

Bảng 2.3 Thành phần nội nhũ sừng và nội nhũ bột của hạt bắp (% chất khô) [15]

Thành phần Nội nhũ sừng (%) Nội nhũ bột (%)

Phôi nằm gần cuống hạt và dính liền với nội nhũ Trong những điều kiện thích hợp, cây non được phát triển ra từ phôi Tỷ lệ khối lượng các phần vỏ, nội nhũ và phôi phụ thuộc vào điều kiện canh tác Phôi của hạt bắp rất lớn, có thể chiếm 8 - 15% khối lượng hạt Các giống bắp đá và răng ngựa có phôi nhỏ, trong khi các giống bắp bột lại có phôi lớn Cấu trúc của phôi khá xốp và thành phần chứa nhiều chất béo nên rất dễ bị hư hỏng [15]

Thành phần hóa học của hạt bắp thay đổi tùy theo điều kiện khí hậu, giống, loại, kỹ thuật canh tác, đất đai, Thành phần hóa học của hạt bắp phân bố không đều trong hạt, nó có tỷ lệ khác nhau giữa 3 phần chính là vỏ, nội nhũ và phôi

Bảng 2.4 Sự phân bố các chất trong các phần của hạt bắp

Thành phần hóa học Vỏ Nội nhũ Phôi

Giữa các giống bắp khác nhau thành phần hóa học cũng khác nhau

Bảng 2.5 Thành phần hóa học trung bình của hạt bắp (% chất khô)

Từ thập kỷ 70 trở về trước, hạt bắp thường được bảo quản theo công nghệ truyền thống là đóng vào bao đay, xếp vào các kho bảo quản theo công nghệ mở Thời gian hạt bắp được giữ chỉ 3 đến 4 tháng là phải xuất, sau thời gian này chất lượng hạt bắp giảm nhanh [17]

Bảo quản kín là bảo quản trong điều kiện thiếu oxy, để hạn chế quá trình hô hấp của nông sản, khống chế sự phát sinh, phát triển phá hoại của VSV và côn trùng

Từ những năm đầu thập kỷ 80, ở một số nước trên thế giới đã nghiên cứu và áp dụng công nghệ bảo quản kín để hạn chế tác động xấu của oxy trong không khí đến lương thực trong quá trình bảo quản

Hóa chất thường sử dụng như: bromua metyl, SO 2 , natripirosunfit, picrinclorua

Hóa chất bảo quản nông sản có tác dụng:

Giống bắp Protein Tinh bột Đường Lipid Tro

+ Phòng chống sự sinh trưởng và phát triển của VSV

+ Hạn chế các hoạt động sinh lý, sinh hoá của hạt như: sự hô hấp, sự nảy mầm, [18].

Các phương pháp trích ly dầu neem

Hiện nay, dầu neem có thể được thu được bằng cách: ép cơ học, trích ly bằng dung môi, trích ly bằng dung môi siêu tới hạn [19]

Trong đó, phương pháp ép cơ học là phương pháp được sử dụng rộng rãi để lấy được dầu từ hạt neem [19]

2.3.1 Phương pháp ép cơ học Đây là cách thức đã được sử dụng từ rất lâu, dùng lực ép để ép lấy dầu từ hạt, thường sử dụng máy ép [19]

 Ƣu điểm: đơn giản, chi phí thấp

 Nhƣợc điểm: dầu thu được thường có độ tinh khiết không cao

2.3.2 Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ

Vì các hợp chất trong hạt neem có tính phân cực nên các loại dung môi hữu cơ phân cực được sử dụng để trích dầu từ hạt neem Các dung môi hữu cơ thường dùng như: etanol, ete dầu hỏa (petroleum ether)… [20]

 Ƣu điểm: hiệu suất thu hồi dầu và độ tinh khiết cao hơn so với ép cơ học [21]

 Nhƣợc điểm: dầu thu được không hoàn toàn tinh khiết do dung môi sử dụng để trích ly không được tách ra hết Và vì sử dụng dung môi hữu cơ nên không thân thiện với môi trường [22]

2.3.3 Phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn

Phương pháp trích ly này sử dụng dung môi là lưu chất ở trạng thái siêu tới hạn để trích ly dầu từ hạt neem

 Ƣu điểm: dầu thu được tinh khiết, thân thiện với môi trường, thu hồi được dung môi

 Nhƣợc điểm: chi phí cao hơn với các phương pháp trên, điểm tới hạn tùy vào từng loại lưu chất [23]

Dựa trên những ưu, nhược điểm của từng phương pháp ở trên, phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn có những ưu điểm quan trọng, đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong nhiều lĩnh vực

Dung môi siêu tới hạn được ứng dụng trong trích ly tinh dầu tràm, gấc, quế, trầm hương [24] Về neem, trên thế giới đã có những nghiên cứu sử dụng dung môi siêu tới hạn để trích ly hoạt chất sinh học như nimbin từ hạt neem [21], còn ở Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu Do đó, trong luận văn này, công nghệ trích ly bằng dung môi siêu tới hạn được nghiên cứu trích ly dầu từ hạt neem.

Phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn

Một hợp chất ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn Ở trạng thái siêu tới hạn, hợp chất này không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí [25]

Phương pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn là phương pháp trích ly sử dụng dung môi ở trạng thái siêu tới hạn [26]

Hình 2.6 Giản đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất [26] Điểm ba là nơi mà ba trạng thái rắn, lỏng và khí giao nhau Các đường cong là nơi hai trạng thái cùng hiện diện Quan sát dọc theo đường cong khí - lỏng hướng lên cao gặp 1 điểm, nơi đó nồng độ của khí và lỏng bằng nhau Điểm này được gọi là điểm siêu tới hạn và hợp chất lúc đó gọi là chất lỏng siêu tới hạn Tại điểm tới hạn, áp suất và nhiệt độ có các giá trị được gọi lần lượt là áp suất tới hạn (P c ) và nhiệt độ tới hạn (T c ) Hai giá trị này là đặc trưng cho từng chất [26]

Trạng thái lỏng Điểm ba Điểm ba Điểm tới hạn

Chất lỏng siêu tới hạn

Bảng 2.6 Một số dung môi có thể sử dụng cho phương pháp trích ly siêu tới hạn [26]

Dung môi Nhiệt độ tới hạn

( o C) Áp suất tới hạn (atm)

Bảng 2.7 So sánh các đặc tính của lưu chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn

Trạng thái Khối lƣợng riêng

(kg/m 3 ) Độ nhớt (μPa.s) Độ khuếch tán (mm 2 /s)

Lưu chất siêu tới hạn 100 -1000 50 - 100 0,01 - 0,1

Hình 2.7 Sơ đồ thiết bị trích ly bằng dung môi siêu tới hạn

Hệ thống siêu tới hạn gồm một nguồn cung cấp CO 2 , một máy bơm, một bộ làm lạnh, một bộ tăng nhiệt, bình chiết chứa dược liệu, bình tách sản phẩm và bình ngưng tụ

Khí CO 2 từ bình chứa có áp suất 45 - 55 bar được dẫn đến bộ phận làm lạnh để hóa lỏng, nhiệt độ CO 2 hóa lỏng khoảng 0 - 5 o C Trước khi đi vào bình chứa nguyên liệu, CO 2 lỏng có thể được trộn thêm các đồng dung môi (co-solvent) khác như: metanol, etanol, n–hexan … để tạo thành hỗn hợp dung môi tùy theo yêu cầu công nghệ [26]

Khí CO 2 trong bình chứa ở áp suất 45 - 50 bar và nhiệt độ 12 - 20 o C Khi được hạ nhiệt độ ở điều kiện đẳng áp thì CO2 chuyển trạng thái từ khí sang lỏng CO 2 lỏng có thể hòa trộn với các dung môi hỗ trợ một cách dễ dàng hơn Khi CO 2 ở dạng lỏng, có thể sử dụng bơm cao áp để nén lên áp suất cao và điều chỉnh lưu lượng vào bình trích thuận lợi hơn [26]

Làm lạnh Làm Bơm nóng Điều chỉnh

CO 2 lỏng được bơm qua van điều chỉnh lưu lượng nhờ bơm cao áp vào bộ phận trao đổi nhiệt để điều chỉnh thông số cho phù hợp với yêu cầu công nghệ Dòng CO 2 lỏng cao áp được giữ ở điều kiện đẳng áp và tăng nhiệt độ dần dần để chuyển sang trạng thái siêu tới hạn [26]

Trong suốt quá trình trích ly, nhiệt độ và áp suất của bình trích ly luôn luôn được giữ ổn định ở một giá trị định trước cho quá trình trích vì toàn hệ thống điều khiển được kết nối với máy tính [26]

Kết thúc quá trình trích ly, dịch trích ly được dẫn vào bình phân tách Tại đây quá trình tách chất tan ra khỏi dung môi thành những phân đoạn riêng được thực hiện bằng cách thay đổi các thông số áp suất và nhiệt độ Từ trạng thái siêu tới hạn sẽ được giảm áp đến trạng thái khí CO 2 sẽ trở thành chất khí và tách ra khỏi dịch trích ly để thoát ra ngoài để lại sản phẩm mong muốn

Với quy mô phòng thí nghiệm CO 2 không được thu hồi Tuy nhiên, trong sản xuất công nghiệp, khí CO 2 tách ra sẽ được tuần hoàn trong quá trình trích ly [27]

2.4.4 Ưu - nhược điểm 2.4.4.1 Ưu điểm [27]

- CO 2 là chất dễ kiếm, rẻ tiền vì nó là sản phẩm phụ của nhiều ngành công nghiệp hóa chất khác

- Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết Khi được đưa lên tới trạng thái tới hạn, CO2 không tự kích nổ, không bắt lửa và không duy trì sự cháy

- CO 2 không độc với con người và không duy trì sự cháy

- Điểm tới hạn của CO2 (Pc = 73 atm; Tc = 31 o C) là một điểm có giá trị nhiệt độ và áp suất không cao so với các chất khác nên sẽ tốn ít năng lượng hơn để đưa CO 2 tới vùng tới hạn

- Có khả năng hòa tan các chất hữu cơ ở thể rắn cũng như thể lỏng, đồng thời cũng hòa tan được cả các chất thơm dễ bay hơi, không hòa tan các kim loại nặng

- Khả năng khuếch tán tốt

- Độ chọn lọc cao với loại hợp chất cần chiết, vì thế chất chiết tương đối sạch

- Dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp

- Tốc độ phản ứng lớn

- Thiết bị chuyên dụng, đắt tiền

- Không thích hợp với mẫu trích ly dạng lỏng [25]

Lưu chất siêu tới hạn được ứng dụng trong rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm, trong công nghiệp, trong y học, …

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ hóa học và Dầu khí, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp HCM và Phòng thí nghiệm Vi Sinh, Trường Cao Đẳng Nghề Tp

Nguyên liệu và hóa chất

 Hạt neem khô được cung cấp từ Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Ninh Thuận

Hình 3.1.Hạt neem dùng trong thí nghiệm

Xử lý nguyên liệu: hạt neem khô sau khi đem về, được loại bỏ các hạt bị hư, sau đó bóc vỏ để thu được nhân hạt neem Nhân hạt neem được đem đi nghiền nhỏ, sau đó được đi ray có đường kính lỗ sàng 0,5 mm Mẫu nguyên liệu sau xử lý có độ ẩm 6

Hình 3.2.Quy trình xử lý hạt neem

Hạt neem (đã xử lý)

Dầu neem thị trường (trích ly bằng phương pháp ép cơ học), ký hiệu mẫu là DNTT, được mua từ Công ty TNHH một thành viên Dầu Dừa, địa chỉ 5/3A9, đường số

5 Tân Thới Hiệp, KP3, P Tân Thới Hiệp, Q.12, Tp HCM

 Các chủng VSV được mua từ phòng Phân Tích Vi Sinh Trường Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh bao gồm:

- Vi khuẩn Gram (+): Lactobacillus fermentum, Bacillus cereus (B cereus),

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (S aureus), Streptococcus agalactiae

- Vi khuẩn Gram (-): Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritica, Escherichia coli ATCC 25922 (E coli)

- Nấm mốc: Aspergillus flavus, Aspergillus niger

Vi khuẩn đối chứng sử dụng E coli ATCC 25922

Huyền phù tế bào vi khuẩn, nấm được chuẩn bị như sau:

Trên mặt thạch có chứa vi khuẩn, dùng que cấy vô khuẩn lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng Sau đó, lắc đều và so độ đục với ống McFarland Thực hiện đến khi ống nghiệm chứa huyền phù tế bào có cùng độ đục với ống McFarland, dịch khuẩn thu được có nồng độ khoảng 1x10 8 vi khuẩn/ml Sau đó, tiến hành pha loãng 100 lần để có mật độ 1x10 6 vi khuẩn/ml

 Hóa chất sử dụng để trích ly dầu neem

Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng để trích ly dầu neem

STT Hóa chất Công thức Thông số Nhãn hiệu Xuất xứ

1 Hexan kỹ thuật C 6 H 6 99,5 % Công ty TNHH TOP

 Hóa chất và môi trường nuôi cấy VSV

- Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) lỏng: sử dụng để tăng sinh một số loài vi khuẩn

- Nước muối sinh lý: sử dụng để pha loãng huyền dịch vi khuẩn

- Độ đục chuẩn (McFarland): được sử dụng để so sánh độ đục với huyền dịch VSV nhằm xác định nồng độ VSV/ml

- Dung dịch đệm PBS với thành phần được trình bày trong Phụ lục 2

- Môi trường Sabouraud: dùng cho thử nghiệm các loại nấm men và nấm mốc thành phần được trình bày trong Phụ lục 2

- Môi trường MHA: sử dụng cho thử nghiệm khả năng kháng khuẩn với thành phần được thể hiện trong Phụ lục 2.

Thiết bị và dụng cụ

Trong luận văn này, các thiết bị và dụng cụ sau được sử dụng: bộ dụng cụ trích ly Soxhlet 150 ml, hệ thống thiết bị trích ly CO 2 siêu tới hạn Thar SFC (S.N 11419), thiết bị cô quay chân không hãng Buchi (Thụy Sỹ), tủ lạnh, tủ ấm 37 o C (Binder - Germany), máy lắc Vortex (Velp - Italia, Ý), thước đo vòng vô khuẩn (straight ruler, hãng Win, đơn vị thước đo mm), giấy lọc Whatman hãng MERCK ký hiệu CAT No

2017006 loại AA đường kính 6 mm, dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh, cân phân tích (Ohausmodel: DV215CD Mỹ), máy đo độ đục (Turbidity meter Martini - Hungari), đèn cồn, nồi hấp, que cấy vi khuẩn, bình cầu 500 ml, pipette các loại, tủ cấy vô trùng,

Mục tiêu nghiên cứu

 Trích ly dầu hạt neem bằng:

 Phương pháp Soxhlet với dung môi: etanol, hỗn hợp hexan – etanol

 Phương pháp trích ly CO 2 siêu tới hạn: có và không có sử dụng đồng dung môi etanol

 Bước đầu khảo sát khả năng kháng VSV bao gồm: vi khuẩn, nấm men và nấm mốc của dầu neem được trích ly bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn

 Đồng thời khảo sát khả năng ứng dụng của dầu neem được trích ly bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn trong bảo quản hạt bắp

- Trích ly dầu hạt neem bằng dung môi: etanol, hỗn hợp hexan – etanol, CO2 siêu tới hạn có và không có sử dụng đồng dung môi etanol

- So sánh tỷ lệ thu hôi dầu từ các phương pháp trên

- Phân tích và đánh giá các chỉ số hóa lí (axit, peroxit, iot và xà phòng) của các sản phẩm dầu thu được và dầu thương mại

- Phân tích và so sánh thành phần axit béo trong dầu thu được từ các phương pháp trích ly trên và dầu thương mại

- Khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem trích được bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn

Khảo sát khả năng kháng nấm mốc Aspergillus flavus của dầu neem trong quá trình bảo quản hạt bắp trong điều kiện phòng thí nghiệm

3.6.1 Trích ly dầu neem bằng phương pháp Soxhlet

Hình 3.3 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi etanol

Thuyết minh quy trình: cân 30 g hạt neem (đã xử lý) cho vào hệ thống Soxhlet 150 ml Cho thêm vào 150 ml etanol để tiến hành trích ly Thời gian trích ly tính từ thời điểm có giọt lỏng hoàn lưu đầu tiên Nhiệt độ bình cầu từ 85 - 90 o C Sau khi trích ly xong, hỗn hợp etanol - dầu được đem đi cô quay chân không đuổi hết dung môi, thu được dầu neem và ký hiệu mẫu là DN1

Thời gian trích ly là 4 giờ

- Tương tự với hỗn hợp dung môi hexan - etanol (tỷ lệ thể tích 8 : 2) [19] và ký hiệu mẫu là DN2

3.6.2 Trích ly bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn Điều kiện vận hành [21]:

- Nhiệt độ: 35 o C - Áp suất: 230 bar - Lưu lượng CO 2 : 20 g/min - Thời gian trích ly: 4 giờ

Trích ly Hạt neem (đã xử lý) Etanol

3.6.2.1 Không sử dụng đồng dung môi etanol

Hình 3.4 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn

Thuyết minh quy trình: cân 20 g hạt neem (đã xử lý) cho vào bình trích 100 ml trong hệ thống CO 2 siêu tới hạn, khởi động hệ thống theo quy trình Khi hệ thống ổn định áp suất, bắt đầu tính thời gian Sau khi trích ly xong, thu được dầu neem ở bình chứa sản phẩm và ký hiệu mẫu là DN3

3.6.2.2 Sử dụng đồng dung môi etanol

Hình 3.5 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn có sử dụng đồng dung môi etanol

Trích ly Hạt neem (đã xử lý) CO 2 siêu tới hạn

Trích ly Hạt neem (đã xử lý) CO 2 siêu tới hạn

Thuyết minh quy trình: cân 20 g hạt neem (đã xử lý) cho vào bình trích 100 ml trong hệ thống CO 2 siêu tới hạn, khởi động hệ thống theo quy trình Dòng lưu chất CO 2 siêu tới hạn được hòa trộn với etanol theo tỷ lệ 6% etanol [21], trước khi qua bình trích Khi hệ thống ổn định áp suất, bắt đầu tính thời gian Sau khi trích ly xong, hỗn hợp dung môi - dầu được đem đi cô quay chân không thu được dầu neem và ký hiệu mẫu là

 Trình tự vận hành hệ thống trích ly bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn

Khởi động máy nén, mở van xả khí ra, khoảng 5 phút sau thì đóng van xả khí lại

Khởi động máy lạnh (làm lạnh hệ thống bằng etylen glycol), khởi động bơm, bật nút “Run” để bắt đầu làm lạnh Đưa hạt neem đã nghiền vào bình trích ly, trước đó đã bỏ bi thủy tinh vào bình trích ly nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu với dung môi trong quá trình trích ly

Khởi động máy vi tính và sử dụng phần mềm để thiết lập các điều kiện vận hành như nhiệt độ, áp suất, lưu lượng, tỷ lệ đồng dung môi

Kiểm tra lại các điều kiện vừa thiết lập và bắt đầu quá trình trích ly Sau thời gian xác định, thu được dầu ở bình thu mẫu

3.7 Tỷ lệ thu hồi dầu

Tỷ lệ thu hồi dầu của quá trình trích ly được tính như sau:

H  m  (1.1) Với: m 1 là khối lượng dầu neem trích ly được (g), m 2 là khối lượng mẫu hạt neem ban đầu (g) [28]

3.8 Phân tích các chỉ số axit, chỉ số iot, chỉ số xà phòng, chỉ số peroxit 3.8.1 Chỉ số axit

 Định nghĩa: chỉ số axit là số miligam kali hydroxit dùng để trung hòa axit béo tự do có trong 1 g dầu hoặc mỡ

 Nguyên tắc phương pháp đo điện thế: chuẩn độ bằng phương pháp đo điện thế các axit béo tự do có trong mẫu thử với dung dịch kali hydroxit trong isopropanol trong môi trường nước

Xác định chỉ số axit trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6127 : 2010 (ISO 660 : 2009) bằng phương pháp đo điện thế [29]

Chỉ số axit cho biết độ tươi của mẫu dầu Chỉ số axit càng cao thì dầu càng kém tươi

 Định nghĩa: chỉ số iot là khối lượng iot do mẫu thử hấp thụ dưới các điều kiện thao tác đã được quy định trong tiêu chuẩn 6122 : 2010 Chỉ số iot được biểu thị bằng g iot trên 100 g mẫu thử

 Nguyên tắc: hòa tan lượng mẫu thử trong dung môi và cho thêm thuốc thử

Wijs Sau một thời gian xác định cho thêm dung dịch kali iodua và nước, chuẩn độ iot đã được giải phóng với dung dịch natri tiosunphat [30]

Xác định chỉ số iot trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6122 : 2010 (ISO 3961 : 2009)

Chỉ số iot cho biết mức độ không bão hòa của dầu

 Định nghĩa: chỉ số xà phòng là số miligam kalihydroxit cần để xà phòng hóa 1 g chất béo dưới các điều kiện quy định của tiêu chuẩn 6126 : 2007

 Nguyên tắc: đun sôi mẫu thử với dung dịch kali hydroxit trong etanol và cho hồi lưu bằng bộ sinh hàn sau đó chuẩn độ lượng kali hydroxit dư với dung dịch chuẩn axit clohydric [31]

Xác định chỉ số xà phòng trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6126 : 2007 (ISO 3657 : 2002)

Chỉ số xà phòng cho biết phân tử lượng trung bình của axit béo có trong dầu

 Định nghĩa: chỉ số peroxit là lượng chất có trong mẫu thử, tính bằng mili đương lượng của oxy hoạt tính làm oxy hóa kali iodua trên kilogam dưới các điều kiện thao tác đã được quy định

 Nguyên tắc: xử lý phần mẫu thử trong môi trường axit axetic và cloroform bằng dung dịch kali iodua Chuẩn độ iodua tự do bằng dung dịch chuẩn natri tiosunfat

Xác định trị số peroxide trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6121 : 2010 (ISO 3960 : 2007) [32]

Chỉ số peroxit cho biết mức độ ôi của dầu, chỉ số này càng cao thì dầu càng ôi

3.9 Phân tích thành phần axit béo

Nguyên tắc: phân tích một lượng nhỏ tinh dầu bằng sắc ký khí trên cột có đường kính nhỏ và dài, thành trong của cột đã được phủ trước đó bằng pha tĩnh quy định hoặc bằng chất nền (cột được phủ bên trong bằng chất nền) trong các điều kiện quy định

Xác định thành phần axit béo trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 9614:

2013 bằng phương pháp phân tích sắc ký khí [33]

3.10 Khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem

Quy trình thực hiện thí nghiệm được tóm tắt như Hình 3.6 Dầu neem sau khi trích ly được tiến hành xác định khả năng kháng vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xác định nồng độ kháng VSV tối thiểu Sau đó, thử nghiệm khả năng ức chế Aspergillus flavus trên hạt bắp

Hình 3.6 Sơ đồ khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem

Khảo sát khả năng ức chế Aspergillus flavus trên hạt bắp

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Xác định khả năng kháng khuẩn

3.10.1 Thí nghiệm 1: khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem

Nguyên lý: dầu neem thử nghiệm được thấm vào trong khoanh giấy sau đó được đặt trên mặt môi trường thạch Meuler - Hinton đã được cấy sẵn các vi khuẩn thử nghiệm Dầu neem từ khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dầu neem được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy tẩm dầu neem [34]

Số lần lặp lại: 3 lần

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng kháng VSV sau thời gian ủ

Các bước tiến hành khảo sát định tính được thể hiện tóm tắt trên Hình 3.7

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dầu neem Ủ ở 37 o C trong vòng 24 h (hoặc 48 h) Tạo huyền phù tế bào vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Đặt khoanh giấy đã được thấm dầu neem Đo vòng vô khuẩn Cấy vi khuẩn, nấm men và nấm mốc lên đĩa thạch

Trích ly dầu neem

3.6.1 Trích ly dầu neem bằng phương pháp Soxhlet

Hình 3.3 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi etanol

Thuyết minh quy trình: cân 30 g hạt neem (đã xử lý) cho vào hệ thống Soxhlet 150 ml Cho thêm vào 150 ml etanol để tiến hành trích ly Thời gian trích ly tính từ thời điểm có giọt lỏng hoàn lưu đầu tiên Nhiệt độ bình cầu từ 85 - 90 o C Sau khi trích ly xong, hỗn hợp etanol - dầu được đem đi cô quay chân không đuổi hết dung môi, thu được dầu neem và ký hiệu mẫu là DN1

Thời gian trích ly là 4 giờ

- Tương tự với hỗn hợp dung môi hexan - etanol (tỷ lệ thể tích 8 : 2) [19] và ký hiệu mẫu là DN2

3.6.2 Trích ly bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn Điều kiện vận hành [21]:

- Nhiệt độ: 35 o C - Áp suất: 230 bar - Lưu lượng CO 2 : 20 g/min - Thời gian trích ly: 4 giờ

Trích ly Hạt neem (đã xử lý) Etanol

3.6.2.1 Không sử dụng đồng dung môi etanol

Hình 3.4 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn

Thuyết minh quy trình: cân 20 g hạt neem (đã xử lý) cho vào bình trích 100 ml trong hệ thống CO 2 siêu tới hạn, khởi động hệ thống theo quy trình Khi hệ thống ổn định áp suất, bắt đầu tính thời gian Sau khi trích ly xong, thu được dầu neem ở bình chứa sản phẩm và ký hiệu mẫu là DN3

3.6.2.2 Sử dụng đồng dung môi etanol

Hình 3.5 Quy trình trích ly dầu neem bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn có sử dụng đồng dung môi etanol

Trích ly Hạt neem (đã xử lý) CO 2 siêu tới hạn

Trích ly Hạt neem (đã xử lý) CO 2 siêu tới hạn

Thuyết minh quy trình: cân 20 g hạt neem (đã xử lý) cho vào bình trích 100 ml trong hệ thống CO 2 siêu tới hạn, khởi động hệ thống theo quy trình Dòng lưu chất CO 2 siêu tới hạn được hòa trộn với etanol theo tỷ lệ 6% etanol [21], trước khi qua bình trích Khi hệ thống ổn định áp suất, bắt đầu tính thời gian Sau khi trích ly xong, hỗn hợp dung môi - dầu được đem đi cô quay chân không thu được dầu neem và ký hiệu mẫu là

 Trình tự vận hành hệ thống trích ly bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn

Khởi động máy nén, mở van xả khí ra, khoảng 5 phút sau thì đóng van xả khí lại

Khởi động máy lạnh (làm lạnh hệ thống bằng etylen glycol), khởi động bơm, bật nút “Run” để bắt đầu làm lạnh Đưa hạt neem đã nghiền vào bình trích ly, trước đó đã bỏ bi thủy tinh vào bình trích ly nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu với dung môi trong quá trình trích ly

Khởi động máy vi tính và sử dụng phần mềm để thiết lập các điều kiện vận hành như nhiệt độ, áp suất, lưu lượng, tỷ lệ đồng dung môi

Kiểm tra lại các điều kiện vừa thiết lập và bắt đầu quá trình trích ly Sau thời gian xác định, thu được dầu ở bình thu mẫu.

Tỷ lệ thu hồi dầu

Tỷ lệ thu hồi dầu của quá trình trích ly được tính như sau:

H  m  (1.1) Với: m 1 là khối lượng dầu neem trích ly được (g), m 2 là khối lượng mẫu hạt neem ban đầu (g) [28].

Phân tích các chỉ số axit, chỉ số iot, chỉ số xà phòng, chỉ số peroxit

 Định nghĩa: chỉ số axit là số miligam kali hydroxit dùng để trung hòa axit béo tự do có trong 1 g dầu hoặc mỡ

 Nguyên tắc phương pháp đo điện thế: chuẩn độ bằng phương pháp đo điện thế các axit béo tự do có trong mẫu thử với dung dịch kali hydroxit trong isopropanol trong môi trường nước

Xác định chỉ số axit trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6127 : 2010 (ISO 660 : 2009) bằng phương pháp đo điện thế [29]

Chỉ số axit cho biết độ tươi của mẫu dầu Chỉ số axit càng cao thì dầu càng kém tươi

 Định nghĩa: chỉ số iot là khối lượng iot do mẫu thử hấp thụ dưới các điều kiện thao tác đã được quy định trong tiêu chuẩn 6122 : 2010 Chỉ số iot được biểu thị bằng g iot trên 100 g mẫu thử

 Nguyên tắc: hòa tan lượng mẫu thử trong dung môi và cho thêm thuốc thử

Wijs Sau một thời gian xác định cho thêm dung dịch kali iodua và nước, chuẩn độ iot đã được giải phóng với dung dịch natri tiosunphat [30]

Xác định chỉ số iot trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6122 : 2010 (ISO 3961 : 2009)

Chỉ số iot cho biết mức độ không bão hòa của dầu

 Định nghĩa: chỉ số xà phòng là số miligam kalihydroxit cần để xà phòng hóa 1 g chất béo dưới các điều kiện quy định của tiêu chuẩn 6126 : 2007

 Nguyên tắc: đun sôi mẫu thử với dung dịch kali hydroxit trong etanol và cho hồi lưu bằng bộ sinh hàn sau đó chuẩn độ lượng kali hydroxit dư với dung dịch chuẩn axit clohydric [31]

Xác định chỉ số xà phòng trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6126 : 2007 (ISO 3657 : 2002)

Chỉ số xà phòng cho biết phân tử lượng trung bình của axit béo có trong dầu

 Định nghĩa: chỉ số peroxit là lượng chất có trong mẫu thử, tính bằng mili đương lượng của oxy hoạt tính làm oxy hóa kali iodua trên kilogam dưới các điều kiện thao tác đã được quy định

 Nguyên tắc: xử lý phần mẫu thử trong môi trường axit axetic và cloroform bằng dung dịch kali iodua Chuẩn độ iodua tự do bằng dung dịch chuẩn natri tiosunfat

Xác định trị số peroxide trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 6121 : 2010 (ISO 3960 : 2007) [32]

Chỉ số peroxit cho biết mức độ ôi của dầu, chỉ số này càng cao thì dầu càng ôi.

Phân tích thành phần axit béo

Nguyên tắc: phân tích một lượng nhỏ tinh dầu bằng sắc ký khí trên cột có đường kính nhỏ và dài, thành trong của cột đã được phủ trước đó bằng pha tĩnh quy định hoặc bằng chất nền (cột được phủ bên trong bằng chất nền) trong các điều kiện quy định

Xác định thành phần axit béo trong các mẫu dầu thu được theo TCVN 9614:

2013 bằng phương pháp phân tích sắc ký khí [33].

Khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem

Quy trình thực hiện thí nghiệm được tóm tắt như Hình 3.6 Dầu neem sau khi trích ly được tiến hành xác định khả năng kháng vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xác định nồng độ kháng VSV tối thiểu Sau đó, thử nghiệm khả năng ức chế Aspergillus flavus trên hạt bắp

Hình 3.6 Sơ đồ khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem

Khảo sát khả năng ức chế Aspergillus flavus trên hạt bắp

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Xác định khả năng kháng khuẩn

3.10.1 Thí nghiệm 1: khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem

Nguyên lý: dầu neem thử nghiệm được thấm vào trong khoanh giấy sau đó được đặt trên mặt môi trường thạch Meuler - Hinton đã được cấy sẵn các vi khuẩn thử nghiệm Dầu neem từ khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dầu neem được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy tẩm dầu neem [34]

Số lần lặp lại: 3 lần

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng kháng VSV sau thời gian ủ

Các bước tiến hành khảo sát định tính được thể hiện tóm tắt trên Hình 3.7

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dầu neem Ủ ở 37 o C trong vòng 24 h (hoặc 48 h) Tạo huyền phù tế bào vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Đặt khoanh giấy đã được thấm dầu neem Đo vòng vô khuẩn Cấy vi khuẩn, nấm men và nấm mốc lên đĩa thạch

Sau khi tạo xong huyền phù tế bào VSV sẽ tiến hành cấy lên đĩa thạch MHA bằng cỏch sử dụng micropipette hỳt 20 àl huyền phự tế bào vi khuẩn hoặc nấm bơm vào đĩa môi trường Sau đó dùng que cấy trang vô khuẩn, trang đều trên mặt thạch sao cho vi khuẩn hoặc nấm khuếch tán đều lên mặt thạch

Giấy lọc hình tròn, đường kính cỡ 0,6 cm đã được khử trùng đặt lên trên mặt đĩa petri đã trải khuẩn Đặt các đĩa giấy sao cho mặt của đĩa giấy áp sát vào mặt môi trường, mép ngoài của khoanh giấy cách thành trong của đĩa khoảng 15 mm Các đĩa giấy cách nhau 20 mm và đặt 4 đĩa giấy trên một hộp petri

Nhỏ trực tiếp dầu neem lờn đĩa giấy Thể tớch dầu neem nhỏ lờn mỗi đĩa là 20 àl tiếp theo bỏ trong tủ lạnh trong khoảng 2 h để dầu neem khuếch tán đều trên mặt thạch sau đó tiến hành ủ ở nhiệt độ 37 o C, trong thời gian 24 giờ (đối với vi khuẩn, nấm men) và 48 giờ (đối với nấm mốc)

- Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng kháng khuẩn/kháng nấm sau khi ủ

- Cách đo vòng kháng khuẩn/kháng nấm

Số lần đo: 3 lần trên một vòng vô khuẩn, ghi nhận Kết quả là số trung bình của các vòng kháng khuẩn trên mỗi hộp petri

Thực hiện song song với chủng đối chứng là chủng chuẩn Escherichia coli

ATCC 25922, kháng sinh sử dụng là ampicillin 10 ppm

3.10.2 Thí nghiệm 2: khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu VSV (MIC) của dầu neem

- Mục đích: bước đầu xác định khoảng nồng độ hoạt chất tối thiểu có khả năng kháng các loại VSV

- Nguyên lý: các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch (MHA) có nồng độ dầu neem khác nhau Nồng độ dầu neem tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi trên đĩa thạch chỉ còn 1 – 3 khuẩn lạc mọc[35]

- Chuẩn bị các dung dịch dầu neem: dầu neem được pha với dung môi DMSO 10

% theo các tỷ lệ nhất định để thu được nồng độ mong muốn, sau đó lấy 2,5 ml dung dịch trung gian trộn với 22,5 ml thạch MHA Tỷ lệ pha được tóm tắt trong Bảng 1 (Phụ lục 2)

- Chuẩn bị các đĩa thạch kháng khuẩn: cân thạch theo công thức ghi trên hộp, đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 121 o C/15 phút sau đó để thạch nguội còn khoảng 40 – 50 o C, dùng ống đong để lấy 22,5 ml cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dầu neem đã được chuẩn bị theo các nồng độ như trong Bảng 1 (Phụ lục 2), lắc kỹ và đổ vào đĩa petri, khi thạch nguội bảo quản trong tủ lạnh 4 – 8 o C

- Chuẩn bị chủng vi khuẩn:

Tất cả các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn đều được cấy trong môi trường thích hợp ủ ở 37 o C trong 18 h đối với vi khuẩn, nấm men và 48 h đối với nấm mốc để thu được các chủng còn non Dùng que cấy vô trùng lấy các khuẩn lạc và khuyếch tán vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều bằng máy lắc Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland Nếu huyền dịch vi khuẩn không cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn

Pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland bằng cách lấy 1ml huyền dịch này cho vào 99 ml nước muối sinh lý để được huyền dịch nồng độ 10 6 vi khuẩn/ml

- Tiến hành: dựng micropipet hỳt 20 àl huyền dịch vi khuẩn, nấm men, nấm mốc với mật độ khoảng (1 - 1,5 x 10 6 CFU/ml) cho vào mỗi đĩa petri đã có chứa sẵn môi trường và dầu neem theo các nồng độ khác nhau Chờ cho các đĩa thạch khô (khoảng 15 phút – 20 phút) đem lật úp đĩa thạch và tiến hành ủ ở 37 o C trong 24 giờ đối với vi khuẩn và nấm men, 48 giờ đối với nấm mốc Sử dụng chủng chuẩn E coli ATCC

25922 làm mẫu đối chứng dương

- Chỉ tiêu theo dõi: số lượng đĩa mà tại đó các vi khuẩn, nấm men, nấm mốc bị ức chế phát triển chỉ còn 1 – 3 khuẩn lạc mọc

- Số lần lặp lại: 3 lần

Kết quả sau đó được phân tích phương sai bằng phần mềm Statgraphics Centurion XVI

Sơ đồ tóm tắt các bước tiến hành khảo sát định lượng được trình bày trên Hình 3.8

Hình 3.8 Sơ đồ tóm tắt quá trình khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu VSV của dầu neem

Tạo huyền dịch vi khuẩn, nấm trong nước muối sinh lý (nồng độ 10 8 CFU/ml) Điều chỉnh độ đục vi khuẩn, nấm (nồng độ 10 6 CFU/ml)

Cấy huyền dịch nồng độ 10 6 CFU/ml vào đĩa petri Hòa dầu neem vào môi trường

MHA/ Sabouraud và đổ đĩa petri

Phân tích kết quả Ủ 37 o C 24 h đối với vi khuẩn, nấm men, 48 h đối với nấm mốc

3.10.3 Thí nghiệm 3: thử nghiệm khả năng ức chế Aspergillus flavus của dầu neem trong bảo quản hạt bắp

Aspergillus flavus là một loại nấm thường có mặt trong môi trường và có thể gây bệnh trên các loại ngũ cốc tích trữ trong thời gian dài Chúng cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho người, liên quan đến bệnh ở phổi và đôi khi gây bệnh trên kết mạc, nấm tai và nhiễm trùng mũi hầu Nhiều dòng nấm sinh ra một lượng lớn độc tố aflatoxin, một trong những chất gây ung thư và gây độc cấp tính.

Mục đích nhằm khảo sát khả năng ứng dụng của dầu neem trong bảo quản các loại hạt Cụ thể là ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus trên hạt bắp.

Nguyên tắc: sau khi xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sử dụng dầu neem với nồng độ có khả năng ức chế nấm trên hạt bắp, thông qua việc phun trực tiếp dầu neem lên hạt bắp.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả phân tích các chỉ số

Hình 4.3 Chỉ số axit của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau.

Chỉ số axit cho biết mức độ axit béo tự do có trong dầu, chỉ số này của dầu càng cao thì dầu càng kém tươi So sánh chỉ số axit của các loại dầu cho thấy chỉ số axit của dầu trích bằng CO 2 siêu tới hạn là thấp nhất (13,9) bằng với chỉ số axit của dầu thị trường, chỉ số axit của dầu trích bằng CO2 siêu tới hạn + etanol là cao nhất (60,2), gấp 4,33 lần so với dầu thị trường Điều này có thể là do etanol hòa tan thêm các hợp chất axit khác có trong hạt neem dẫn đến dầu thu được có chỉ số axit cao

DN1 DN2 DN3 DN4 DNTT

Chỉ số axit (mg KOH/g)

Hình 4.4 Chỉ số peroxit của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau

Chỉ số peroxit cho biết mức độ bị ôi của dầu, chỉ số này càng cao thì dầu bị oxy hóa càng nhiều, làm giảm chất lượng dầu Dựa vào Hình 4.4 cho thấy dầu neem trích ly bằng dung môi etanol, hỗn hợp dung môi hexan – etanol, CO2 siêu tới hạn, CO 2 siêu tới hạn + etanol có chỉ số peroxit khá thấp so với dầu thị trường (3,55), chứng tỏ dầu thu được ít bị ôi, ít bị oxy hóa hơn Điều này có thể là do khi trích bằng CO 2 siêu tới hạn, điều kiện nhiệt độ trích thấp (40 o C) nên hoạt tính chống oxy hóa trong dầu được bảo toàn

DN1 DN2 DN3 DN4 DNTT

Chỉ số peroxide (meqO2/kg)

Hình 4.5 Chỉ số xà phòng của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau

Chỉ số xà phòng cho biết khối lượng phân tử trung bình của triglyceride trong dầu và tổng lượng axit béo có trong dầu Chỉ số này càng cao chứng tỏ dầu chứa nhiều axit béo phân tử lượng thấp Hình 4.5 cho thấy, chỉ số xà phòng cao nhất là dầu trích bằng CO 2 siêu tới hạn (204) cho thấy các axit béo trong dầu này có phân tử lượng trung bình thấp hơn các loại dầu khác Dầu trích bằng CO 2 siêu tới hạn + etanol có chỉ số xà phòng là 200 gần bằng với dầu trích bằng etanol là 198 cho thấy các axit béo trong các dầu này có phân tử lượng trung bình gần tương đương nhau Các giá trị nằm trong khoảng 175 - 205 theo bảng tính chất dầu neem chuẩn

DN1 DN2 DN3 DN4 DNTT

Chỉ số xà phòng (mgKOH/g)

Hình 4.6 Chỉ số iot của dầu neem trích ly bằng các phương pháp khác nhau

Chỉ số iot cho biết lượng iot cần thiết để bão hòa các liên kết đôi, là số đo mức độ không bão hòa của các axit béo có trong dầu Chỉ số iot giảm khi nhiệt độ tăng Chỉ số iot cao tương ứng với chất lượng dầu tốt Theo Hình 4.6, chỉ số iot của dầu neem trích ly từ dung môi CO 2 siêu tới hạn là cao nhất (74,6) chứng tỏ các phân tử nối đôi trong dầu hay hàm lượng các axit béo không no cao Dầu neem được trích ly bằng dung môi CO 2 siêu tới hạn không sử dụng đồng dung môi có chỉ số iot cao hơn so với CO 2 siêu tới hạn có sử dụng đồng dung môi etanol, điều này có thể giải thích là do etanol hòa tan thêm các hợp chất axit béo bão hòa nên dầu neem thu được có chỉ số iot thấp hơn

Các chỉ số axit, iot và xà phòng của dầu neem trích ly dung môi CO 2 siêu tới hạn đều tốt hơn so với dầu neem trích ly bằng bằng etanol, hỗn hợp hexan - etanol và CO 2 siêu tới hạn + etanol Nhìn chung, dầu neem trích ly được qua các dung môi khác nhau có giá trị khác nhau nhưng đều tốt hơn so với dầu thị trường Điều này có thể giải thích là do dầu thị trường được trích ly bằng phương pháp ép cơ học nên dầu thu được có độ tinh khiết không cao làm giảm chất lượng dầu

DN1 DN2 DN3 DN4 DNTT

Kết quả phân tích thành phần axit béo

Bảng 4.1 Bảng so sánh thành phần các axit béo tự do trích ly từ các phương pháp khác nhau (%)

CO 2 siêu tới hạn - etanol

Axit béo chưa bão hòa

Từ Bảng 4.1 có thể thấy rằng hàm lượng các axit béo chưa bão hòa của dầu neem trích ly bằng hỗn hợp dung môi hexan - etanol cao nhất (64,13g/100g) gần bằng so với trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn + etanol (64,00g/100g) Dầu neem trích ly được bằng hỗn hợp dung môi hexan - etanol có chất lượng tốt hơn vì lượng axit béo chưa bão hòa cao có tác dụng chống oxi hóa, ngăn chặn và làm giảm độ ôi của dầu Tuy nhiên, nếu yêu cầu cao về chất lượng sản phẩm thì nên sử dụng dung môi trích ly CO 2 siêu tới hạn không sử dụng đồng dung môi vì dầu neem trích ly bằng phương pháp này có các chỉ số phân tích khá tốt và đều nằm trong ngưỡng cho phép của tiêu chuẩn về dầu thị trường.

Kết quả khảo sát khả năng kháng VSV của dầu neem

Kết quả thu nhận từ thử nghiệm trên các chủng VSV được trình bày trong Bảng

4.2 Qua đó cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát đều bị ức chế bởi dầu neem

Trong đó, nhóm nấm men và nấm mốc cho kết quả đường kính vòng kháng lớn hơn

Nhóm vi khuẩn Gram (-) cho kết quả đường kính vòng kháng nhỏ hơn so với nhóm vi khuẩn Gram (+) Riêng chủng E coli ATCC 25922 (mẫu đối chứng) có đường kính vòng kháng đạt 16,11 mm Đối với nhóm vi khuẩn Gram (+) đường kính vòng kháng giao động từ 14,11 đến 18,44 mm, đường kính cao nhất thuộc về Staphylococcus aureus (18,44 mm), đường kính vòng kháng thấp nhất thuộc về Streptococcus agalactiae (14,11 mm) Nhóm vi khuẩn Gram (-) có đường kính vòng kháng từ 10,44 mm (Salmonella enteritica) đến 12,22 mm (Pseudomonas aeruginosa) Nấm men

Saccharomyces cerevisiae có đường kính 22,11 mm Nhóm nấm mốc có đường kính từ

18,56 mm (Aspergillus niger) đến 18,89 (Aspergillus flavus)

Bảng 4.2 Đường kính trung bình vòng kháng vi khuẩn, nấm men và nấm mốc

STT Vi sinh vật Đường kính vòng kháng (mm) Các vi khuẩn Gram (+)

Căn cứ vào bảng Kirby – Bauer (Phụ lục 2), Escherichia coli ATCC 25922 nhạy với kháng sinh ampicillin trong khi mức độ nhạy cảm của Escherichia coli ATCC 25922 với dầu neem chỉ ở mức trung bình Điều này chứng tỏ hiệu quả kháng

Escherichia coli ATCC 25922 của dầu neem thấp hơn so với kháng sinh ampicillin

Shamsuddeen (2014) [36] cho rằng dầu neem có khả năng ức chế các đối tượng nấm mốc Penicillium spp, Rhizopus spp, Aspergilus flavus, Aspergillus ocraceus, Aspergillus niger, Sporotricum spp, Alterbaria spp và Aspergillus fumigates Đồng thời tác giả cho rằng dầu đinh hương có hiệu quả cao hơn dầu neem rất nhiều về khả năng ức chế các loại nấm mốc khảo nghiệm Như vậy kết luận này của tác giả tương đồng với kết quả mà luận văn thu được về khả năng kháng nấm mốc của dầu hạt neem

Như vậy có thể nói neem là một loài thực vật có chứa các loại hợp chất quý có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm rất tốt Tuy nhiên, hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm của dầu neem thể hiện mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dầu neem được trích ly từ bộ phận nào của cây, loại dung môi dùng để trích ly, tuổi thọ của cây

Hình 4.7 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng VSV của dầu neem

1, 2, 3: đĩa giấy tẩm dầu neem 4: đĩa giấy tẩm DMSO 10% (đĩa giấy đối chứng)

Lactobacillus fermentum Bacillus cereus Staphylococcus aureus

Streptococcus agalactiae Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa

Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger Aspergillus flavus

Kết quả khảo sát MIC của dầu neem

Dựa trên kết quả khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn, nấm men và nấm mốc, nồng độ tối thiểu của dầu neem có khả năng ức chế VSV được tiến hành xác định với 7 nồng độ: 3200, 1600, 800, 400, 200, 100 và 50 ppm Các mẫu đối chứng gồm mẫu DMSO 10%, ampicillin 4 ppm và 2 ppm Kết quả được thể hiện trên Bảng 4.3

Bảng 4.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên vi khuẩn của dầu neem

STT Tên vi khuẩn Nồng độ dầu neem ức chế tối thiểu - MIC (ppm) Các vi khuẩn Gram (+)

Kết quả MIC thu được từ các thử nghiệm được so sánh với tính kháng khuẩn của một số dịch chiết từ những loài thực vật khác đã được các tác giả nghiên cứu So sánh khả năng kháng khuẩn của dầu neem với một số loại hợp chất có hoạt tính sinh học khác được tóm tắt trong Bảng 4.4

Bảng 4.4 So sánh kết quả thử nghiệm với các nhóm tác giả khác [37] Đối tượng vi sinh vật nghiên cứu Hoạt chất sử dụng Kết quả thử nghiệm (ppm)

Khi so sánh giá trị MIC của dầu neem so với một số loại cây truyền thống ở Việt Nam thì giá trị MIC của dầu neem thấp hơn nhiều Cụ thể như trên cùng vi khuẩn

Escherichia coli trong khi kết quả MIC của dầu neem chỉ 800 ppm thì MIC của gừng hoặc nghệ là hơn 4096 ppm lớn hơn rất nhiều lần Điều này khẳng định khả năng kháng khuẩn của dầu neem cao hơn một số loại sản phẩm truyền thống có hoạt chất sinh học khác thường được sử dụng trong thực phẩm

Tương tự như kết quả định tính, đối với dầu neem các vi khuẩn Gram (+) nhạy cảm hơn các chủng vi khuẩn Gram (-) Dầu neem ở nồng độ 200 ppm đã có chủng bị ức chế trong khi nhóm vi khuẩn Gram (-) thì từ 800 ppm trở lên mới có dấu hiệu kháng

Kết quả MIC của nghiên cứu này thấp hơn nhiều so với nhóm tác giả Khan và ctv (2014) [38] trên cùng các đối tượng nghiên cứu như B subtilis, S aureus, E coli và

S cerevisiae Giá trị MIC thu được từ kết quả này khá phù hợp với kết quả của nhóm tác giả Shenoy (2014) [39] trên vi khuẩn Gram (-) Escherichia coli nhưng trên vi khuẩn Gram (+) S aureus kết quả của luận văn thấp hơn rất nhiều

Bảng 4.5 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên nấm men và nấm mốc của dầu neem

STT Vi sinh vật Nồng độ dầu neem ức chế tối thiểu - MIC (ppm) Nấm men

Nhìn chung các chủng VSV, nấm men, nấm mốc thử nghiệm nhạy cảm với dầu neem Trong đó, nấm men và nấm mốc nhạy cảm với dầu neem hơn so với nhóm vi khuẩn Vi khuẩn Gram (-) kém nhạy cảm hơn vi khuẩn Gram (+)

Theo Kavitha (2014) dầu neem tiêu diệt được hầu hết các loại nấm do các hợp chất có hoạt tính sinh học trong dầu neem tác động làm ảnh hưởng đến sinh tổng hợp hoặc làm suy giảm hoạt lực của ergosterol trong đó ergosterol là một thành phần chính của màng nấm Nhiệm vụ chính của ergosterol có nhiệm vụ hỗ trợ cho việc điều khiển lưu động của màng nấm, nó cũng là một thành phần sterol chính cần thiết cho sự tồn tại của tất cả các loại nấm Nếu ergosterol bị tổn thương sẽ dẫn đến màng bị biến dạng và rò rỉ sau đó là tế bào sẽ chết đi [40].

Kết quả ứng dụng thử nghiệm dầu neem trong bảo quản hạt bắp

Sau khi xác định được giá trị MIC của dầu neem với các chủng vi sinh Việc ứng dụng để bảo quản thực phẩm được thực hiện trên đối tượng là hạt bắp Do khí hậu của Việt Nam thường xuyên nóng và ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển nên khả năng ức chế của dầu neem đối với các nấm mốc sinh độc tố trên hạt bắp được chọn để khảo sát

Hình 4.8 Ảnh hưởng của dầu neem trên sự phát triển của nấm Aspergillus flavus ở các mẫu hạt bắp thí nghiệm

Hạt bắp để tự nhiên (mẫu đối chứng)

Hạt bắp xử lý dầu neem Hạt bắp có cấy nấm mốc với mật độ 10 6 bào tử/g Hạt bắp có cấy nấm mốc và xử lý dầu neem

Qua Hình 4.8 có thể nhận thấy có sự khác biệt rất rõ về mật độ bào tử nấm mốc

Aspergillus flavus trên các mẫu thí nghiệm Ở mẫu thí nghiệm thứ nhất (mẫu đối chứng), hạt bắp không được phun dầu neem thì lượng bào tử Aspergillus flavus tăng dần về số lượng theo thời gian, cụ thể: số lượng bào tử tuần 2 là 3,60 log CFU/g cho tới tuần thứ 10 thì số lượng này tăng lên tới 4,12 log CFU/g Ở mẫu thí nghiệm thứ hai sử dụng dầu neem với nồng độ 400 ppm (kết quả của thí nghiệm xác định nồng độ MIC) phun trực tiếp vào hạt bắp, điều này đã làm cho mật độ bào tử nấm mốc

Mật độ nấm Aspergillus flavus

Aspergillus flavus giảm hẳn so với mẫu thí nghiệm 1 và trở thành mẫu có mật độ nấm mốc thấp nhất trong 4 mẫu theo dõi Ở tuần thứ 2 số lượng nấm mốc là 2,73 log CFU/g và sau 10 tuần theo dõi kết quả này tăng lên là 3,23 log CFU/g Ở mẫu thí nghiệm thứ 5 hạt bắp được cấy nấm mốc Aspergillus flavus với mật độ 10 6 CFU/g và không sử dụng dầu neem nên đã làm cho mật độ bào tử nấm mốc xuất hiện trên lô thí nghiệm này lớn nhất trong số 4 mẫu Ở tuần thứ 2 số lượng bào tử nấm Aspergillus flavus là 5,07 log CFU/g và sau 10 tuần là 5,31 log CFU/g Đối với mẫu thí nghiệm thứ 6 có sự phối hợp giữa việc cấy nấm Aspergillus flavus và kết hợp phun dầu neem nên dẫn đến kết quả là nấm mốc cũng bị hạn chế đáng kể về mặt số lượng Ở tuần thứ 2 mật độ nấm mốc là 2,87 log CFU/g sau 10 tuần là 3,41 log CFU/g Để xác định độ ổn định của dầu neem theo thời gian, tiến hành phun 3 nồng độ 400, 500 và 600 ppm của dầu neem lên các mẫu 2, 3, 4, 6, 7 và 8 Tốc độ phát triển của

Aspergillus flavus trên các mẫu thí nghiệm được thể hiện trên Hình 4.9

Hình 4.9 Ảnh hưởng của dầu neem trên sự phát triển của nấm Aspergillus flavus ở các mẫu hạt bắp không cấy nấm mốc

Hạt bắp để tự nhiên (mẫu 1 mẫu đối chứng)

Hạt bắp phun dầu neem ở nồng độ 400 ppm (mẫu 2) Hạt bắp phun dầu neem ở nồng độ 500 ppm (mẫu 3) Hạt bắp phun dầu neem ở nồng độ 600 ppm (mẫu 4) Qua Hình 4.9 và kết quả xử lý số liệu (Phụ lục 3) có thể nhận thấy ở nồng độ dầu neem 400 ppm số lượng bào tử nấm mốc giảm đáng kể so với mẫu thí nghiệm thứ nhất nhưng số lượng bào tử vẫn có chiều hướng tăng lên theo thời gian Trong 4 tuần đầu theo dõi tuy thu được kết quả khác nhau nhưng sự khác nhau này không có ý nghĩa về mặt thống kê ở P < 0,05 Điều này cho thấy ở 4 tuần đầu dầu neem chưa bị suy giảm

Mật độ nấm Aspergillus flavus hoạt lực Cho tới tuần thứ 6 thì số lượng bào tử nấm mốc gia tăng và sự khác nhau về mật độ bào tử nấm mốc giữa tuần 4 và tuần 6 là có ý nghĩa về mặt thống kê Điều này cho thấy bắt đầu từ tuần thứ 6 dầu neem có dấu hiệu suy giảm về hoạt lực Ở nồng độ dầu neem 500 ppm (mẫu 3) ngay từ những tuần đầu tiên mật độ nấm mốc đã giảm so với nồng độ 400 ppm (mẫu 2) Tuy nhiên qua Hình 4.9 và kết quả xử lý số liệu (Phụ lục 3) cho thấy số lượng bào tử vẫn có xu hướng tăng theo thời gian Ở

6 tuần đầu theo dõi số lượng bào tử nấm khá ổn định tuy có chiều hướng tăng về số lượng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê, tới tuần thứ 8 có sự gia tăng đột biến về số lượng của bào tử nấm mốc Aspergillus flavus và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê Điều này chứng tỏ ở tuần thứ 8 dầu neem đã bị suy giảm về hoạt lực Ở nồng độ dầu neem 600 ppm (mẫu 4) mật độ bào tử nấm mốc giảm so với hai nồng độ trước đó Kết hợp với kết quả xử lý thống kê nhận thấy không có sự khác biệt về số lượng bào tử nấm trong 10 tuần theo dõi Điều này cho thấy tại nồng độ 600 ppm dầu neem ức chế được sự phát triển về số lượng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus trong thời gian 10 tuần theo dõi

Vậy ở thí nghiệm đối với các mẫu hạt bắp không được cấy nấm mốc Aspergillus flavus ở nồng độ 400 ppm và 500 ppm dầu neem có hiệu quả cao về khả năng ức chế sự phát triển của loại nấm này Tuy nhiên, ở tuần thứ 6 và thứ 8 dầu neem đã có dấu hiệu suy giảm hoạt lực thể hiện bằng việc gia tăng số lượng nấm mốc Ở nồng độ 600 ppm dầu neem ức chế sự phát triển số lượng nấm mốc trong thời gian 10 tuần thử nghiệm Ở mẫu thí nghiệm 6, 7, 8 hạt bắp hạt được cấy nấm Aspergillus flavus với mật độ 10 6 CFU/g đồng thời sử dụng dầu neem phun lên mẫu thử nghiệm với 3 nồng độ 400, 500, 600 ppm kết quả được minh hoạ trên Hình 4.10 với mẫu đối chứng là kết quả thử nghiệm trên mẫu thí nghiệm 5 (hạt bắp chỉ được cấy nấm Aspergillus flavus)

Hình 4.10 Ảnh hưởng của dầu neem trên sự phát triển của nấm Aspergillus flavus ở các mẫu hạt bắp có cấy nấm mốc

Hạt bắp + nấm mốc (mẫu 5 mẫu đối chứng)

Hạt bắp + nấm mốc + dầu neem ở nồng độ 400 ppm (mẫu 6)

Hạt bắp + nấm mốc + dầu neem ở nồng độ 500 ppm (mẫu 7) Hạt bắp + nấm mốc + dầu neem ở nồng độ 600 ppm (mẫu 8)

Qua Hình 4.10 và kết quả xử lý số liệu (Phụ lục 3) nhận thấy: ở mẫu 5 (mẫu đối chứng) do có cấy thêm bào tử nấm mốc Aspergillus flavus với mật độ 10 6 CFU/g trong khi không phun dầu neem nên dẫn đến mật độ nấm mốc có trong mẫu tương đối lớn đồng thời sự gia tăng đáng kể về số lượng bào tử nấm theo thời gian Kết hợp với kết

Mật độ nấm Aspergillus flavus quả xử lý thống kê cho thấy ngay tuần thứ 2 số lượng bào tử tăng lên rất nhiều so với các lô thí ngiệm còn lại Tới tuần thứ 4 số lượng bào tử nấm tăng đột biến và sự khác biệt này là có ý nghĩa về mặt thống kê Ở nồng độ dầu neem 400 ppm (mẫu 6) mật độ nấm mốc giảm rất nhiều so với mẫu 5 (mẫu đối chứng) Tuy nhiên số lượng bào tử có dấu hiệu gia tăng về số lượng theo thời gian Bốn tuần đầu mật độ bào tử nấm mốc thấp và khá ổn định tuy có sự khác nhau giữa hai tuần nhưng chỉ là sai số ngẫu nhiên không có ý nghĩa về mặt thống kê.Ở tuần thứ 6 số lượng bào tử nấm gia tăng đáng kể và sự khác biệt này là có ý nghĩa về mặt thống kê Điều này chứng tỏ ở nồng độ 400 ppm tới tuần thứ 6 của thử nghiệm dầu neem có dấu hiệu bị suy giảm về hoạt lực Ở nồng độ dầu neem 500 ppm (mẫu 7) những tuần đầu tiên mật độ nấm mốc đã giảm so với nồng độ 400 ppm (mẫu 6) Tuy nhiên qua Hình 4.10 và kết quả xử lý số liệu (Phụ lục 3) cho thấy số lượng bào tử vẫn có xu hướng tăng theo thời gian Ở 6 tuần đầu theo dõi số lượng bào tử nấm khá ổn định tuy có chiều hướng tăng về số lượng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê, tới tuần thứ 8 có sự gia tăng đột biến về số lượng của bào tử nấm Aspergillus flavus và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê Điều này chứng tỏ ở tuần thứ 8 dầu neem đã bị suy giảm về hoạt lực Ở nồng độ dầu neem 600 ppm (mẫu 8) số lượng bào tử nấm giảm thấp, kết hợp với kết quả xử lý số liệu nhận thấy không có sự khác biệt nào có ý nghĩa về mặt thống kê Điều đó chứng tỏ ở nồng độ 600 ppm dầu neem không bị suy giảm hoạt lực trong 10 tuần thử nghiệm

Vậy ở các mẫu thí nghiệm có tiến hành cấy nấm mốc Aspergillus flavus với mật độ 10 6 bào tử/g dầu neem ở nồng độ 400 và 500 ppm tuy có khả năng ức chế sự phát triển loại nấm mốc nghiên cứu tuy nhiên đến tuần thứ 6 và thứ 8 thì hoạt lực đã bị suy giảm thể hiện bằng số lượng nấm mốc gia tăng đột biến Tuy nhiên, ở nồng độ 600 ppm dầu neem có thể ức chế được sự phát triển của nấm mốc trong 10 tuần thử nghiệm.