NOI DUNG VA NHIEM VU 2.1 Tổng quan về: cây lược vàng, thành phan polyphenol, hoạt tính kháng oxihóa, các phương pháp trích ly, kỹ thuật trích ly dùng lưu chất siêu tới hạn, các phươngphá
ĐẶT VAN DE
Cây lược vàng, còn gọi là cây lan vòi, có tên khoa hoc là Callisia fragrans
(Lindl.) Woods, thuộc họ Thai lai (Commelinaceae), có nguon sốc từ Trung Mỹ, sau đó được di thực đến nhiều nơi khác Hiện cây này mọc hoang hoặc được trồng nhiều ở Nga, Việt Nam, Úc
Từ năm 2006, bắt đầu rộ lên thông tin một số người dân ở Thanh Hóa sử dụng lược vàng làm thuốc dựa trên một số tài liệu không chính thức của Nga để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau thay có hiệu quả như viêm đường hô hap, viêm răng lợi, viêm đường tiết niệu, bệnh dạ day, đau xương khớp, các bệnh tim mạch, huyết áp thậm chí cả ung thư Từ đó, “con sốt lược vàng” bat đầu bùng phát ở Thanh Hóa, sau đó lan truyền ra nhiễu tỉnh và thành phố, từ Bắc chí Nam [1].
Theo dân gian, cây lược vàng có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu viêm, hóa đờm, cầm máu, hoạt huyết, dùng chữa lành viết thương, vết bam tím Dân gian còn dùng cây lược vàng làm phương thuốc chữa bệnh loét dạ dày, tá trang, lợi tiểu, ngăn ngừa và điêu tri các khôi u trong cơ thê.
Gan đây, một số nghiên cứu về thành phân hóa học cũng như các tác dụng của cây lược vàng đã công bồ cho thay trong cây lược vàng có chứa các chất có hoạt tính sinh học như: flavonoid, steroid, có lợi cho sức khoẻ Vậy, nhu cầu đặt ra tiếp theo làm sao dé khai thác triệt dé các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá cây lược vàng.
Các nghiên cứu trích ly các hợp chat từ cây lược vàng trước đó hau hết được thực hiện bang phương pháp chiết hồi lưu, phương pháp Soxhlet hay phương pháp ngâm dầm với các dung môi như hexan, ethyl acetat, ethanol, [I, 2, 3] Cho đến nay, chưa có một công bồ trong và ngoải nước nào nghiên cứu các thành phan cũng như các hoạt tính trong cao trích của cây lược vàng bang phương pháp CO2 siêu tới hạn Công nghệ chiết bằng lưu chất COa siêu tới hạn đã và đang được áp dụng pho biến dé chiết tách các hoạt chất sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, các hoạt chất thiên nhiên Một số nghiên cứu đã công bố hiệu quả tốt khi trích ly các hợp chất thuộc nhóm hợp chat phenolic băng phương pháp sử dụng lưu chất COz siêu tới hạn như:
—S Akay và các cộng sự đã nghiên cứu thu được kết quả hàm lượng polyphenol tong trong dịch trích của trái dâu tây bang phương pháp sử dụng lưu chất CO2 siêu tới hạn cao hơn trong dịch trích của trái dâu tây băng phương pháp trích ly với phương pháp Soxhlet với dung môi ethanol [4].
— Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu của quá trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ nho bằng phương pháp COa siêu tới hạn bởi K Ghafoor và các công sự đã cho thấy tiềm năng của phương pháp này trong quá trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học như: các hợp chất thuộc nhóm phenolic, nhóm anthocyanin từ các nguyên liệu thực vật [Š].
— J.Prakash Maran và các cộng sự cũng đã nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện trích ly các hợp chất flavonoid từ lá trà bằng phương pháp CO: siêu tới hạn [6].
Vì thế, dé tài luận văn này bước đầu khảo sát sơ bộ quá trình trích ly các hop chất polyphenol — là một trong những nhóm chất có hoạt tính sinh học có lợi trên sức khỏe con người — từ lá cây lược vàng bằng phương pháp dùng lưu chất CO siêu tới hạn Với bước đầu thăm dò sơ bộ các yếu tô vận hành thiết bị COa siêu tới han, đề tài mong muốn thu nhận được cao chiết lá lược vàng chứa nhiều hàm lượng polyphenol tong, hàm lượng flavonoid tông và hoạt tính kháng oxi hóa cao hơn cao chiết lá lược vàng được trích ly bằng phương pháp Soxhlet với dung môi ethyl acetate Hy vọng kết quả khảo sát này sẽ đóng góp nhiều thêm cho những nghiên cứu ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây lược vàng tiếp theo như thức uống, thực phâm chức nang, được chê biên từ lá lược vàng.
Mục tiêu nghiên cứu Dé tài bước dau khảo sát sơ bộ các thông sô của thiệt bị CO2 siêu tới hạn trong quá trình trích ly lá lược. Đề tài mong muốn thu nhận được cao chiết lá lược vàng bang phương pháp mới: trích ly COa siêu tới hạn chứa nhiều hàm lượng polyphenol tông và có hoạt tính kháng oxi hóa cao hơn hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết bằng phương pháp với dung môi ethyl acetate.
TÔNG QUAN
Polyphenol là các hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng Benzen, trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm hydroxyl Dựa vào đặc trưng của cầu trúc hóa học mà hợp chất polyphenol được chia thành ba nhóm chính:
Nhóm hop chat phenol Cs — Ci: axit gallic Nhóm hop chat phenol Co — Cs: axit caffeic Nhóm hop chat phenol Cs — Ca — Ce: catechin, flavonoid
Polyphenol được chú ý bởi kha năng chống oxi hóa Chúng có khả năng chuyển electron trong chuỗi hô hap bình thường ở trong ty thé vì chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do đó làm mat hoạt tính xúc tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng nhận các gốc tự do tức là có khả năng ngừng các quá trình tạo các sốc tự do.
Ngoài ra, các hợp chất polyphenol còn có khả năng kháng khuẩn, hấp thụ tia cực tím, phòng tránh các bệnh về tim mach và xơ vữa động mạch (nghiên cứu trên chuột), khả năng phòng ngừa ung thư (cũng được nghiên cứu trên chuột), ngăn ngừa những anh hưởng bat lợi của độc tô nam đền sức khỏe con người.
Flavonoid là những hợp chất màu của phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, hoa, quả , chúng có khung carbon chung là Cs— C3 — Ce Flavonoid gồm hai vòng benzene A, B va vòng pyran C, trong đó A kết hợp với C tạo thành khung chroman.
Phân lớn hợp chât flavonoid dê tan trong nước và có màu vàng nên được gọi là
“flavonoid” (flavus — tiêng Latin, có nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên không phải các flavonoid đều có màu vàng, một sô sac tô xanh, đỏ, tím hoặc không mau cũng được xêp vào nhóm flavonoid nêu chúng có chung đặc điểm câu tạo hóa hoc.
Trong tự nhiên, flavonoid ton tại ở hai dạng: dạng tự do và dạng liên kết với đường (glycoside) Các glycoside khi thuỷ phân bang axit hay enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycone.
Flavonoid được chia thành các nhóm với cau trúc cơ bản khác nhau, dựa vào việc sinh tong hợp Chalcon hiện diện ít trong tự nhiên, flavanol va flavanonol cũng hiếm gặp, flavon và flavonol phân b6 rộng rãi trong thiên nhiên.
2.2.3 Tác dung sinh học cua Flavonoid [8]
Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú Cơ chế đóng vai trò quyết định là tác dụng chống oxi hóa Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phòng chống bệnh tật.
Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxi hoá dây chuyên sinh ra bởi gốc tự do hoạt động Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng chất flavonoid cụ thể Do bản chất cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc trong cơ thé dong vat chiu tac động của các biến đối oxi hoá khử, bị oxi hoá từng bước và ton tại ở dang hydroxyl, semiquinon, quinon Semiquinon hoặc quinon là những gốc tự do bền vững gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu là ArO” Chúng có thé nhận điện tử và hydrogen từ chất cho khác nhau dé trở lại dang hydroquinon Các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng.
Sự có mặt của các nhóm hydroxyl! nhân thơm của các flavonoid cũng như các polyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với các protein Tương tác này có thé làm hoạt hoá hay ức chế hoạt động của enzyme Tác dụng của flavonoid lên các enzyme 1a một trong những cơ sở hoá sinh để định hướng cho việc sử dụng các chat flavonoid dé chữa bệnh.
2.3 Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu 2.3.1 Nguôn gốc cây lược vàng a Vài nét về chỉ Callisia
Callisia là một chi nhỏ thuộc họ Commelinaceae (Thai lai) Chi này có khoảng
20 loài tập trung ở châu Mỹ với trung tâm phân bồ là Mexico Những loài thuộc chi có dang thân thảo, sống nhiều năm hiếm khi là cây một năm Rễ mảnh, vài loài có dạng củ Thân trườn hoặc bò sát đất Lá lưỡng phân hoặc xếp xoắn ở ngọn, không cuống Cụm hoa dạng xim, như tán, xếp xít, không cuống, được bao bởi lá bắc; phát hoa ở ngọn hoặc nách lá, thường gom nhiéu chùy hoặc gié, đơn vi được tao thành bởi các cặp xim Lá bắc khó nhận, nhỏ hon lcm; không có mo; có các lá dạng lá bắc tồn tại Hoa lưỡng tính (cả lưỡng tinh và có hoa đực ở C repens), đối xứng tỏa tròn; dai rời, gan bằng nhau; cánh hoa rời, trang hoặc hồng (hiếm khi có màu xanh), dai bang nhau, có dạng vuốt [1]. Đa số các loài thuộc chi Callisia được trồng làm cảnh như Callisia repens (Jacquin) Linnaeus, Callisia elegans Alexander ex H E Moore Ở Trung Quốc chi có | loài là Callisia repens (Jacquin) Linnaeus được nhập trồng làm cảnh ở Hồng Kong [9] O Viét Nam, chua phat hiện thay các loài thuộc chi nay phan bồ trong tự nhiên Trong vai năm trở lại day loài Callisia fragrans (Lindl.) Woods được nhập trong vào nước ta với tên gọi là lan vòi hay lược vàng [1]. b Loài Callisia Fragrans (Limmdl.) Woods
Dac diém thuc vat: Callisia fragrans (Lindl.) Woods là thực vật có than mong nước có thé dài tới 100 cm hoặc hơn, phân nhánh với thân bò ở gốc Lá moc tập trung ở ngọn than; rải rác ở phía dưới, dạng mác thuồn, dài 18-25 cm, rộng 3,5-4 cm, cuồng lá có gân rõ, ôm thân, có lông mịn và thường có sọc tía Hoa mọc thành cụm 2-3 hoa dạng xim trên phát hoa hình chuy dài tới 60 cm, mỗi cặp xim được ôm bởi các lá bắc dạng răng cưa (3 răng) dải 10-15mm; lá đài trong suốt, màu trăng, khô xác, dạng mác, dài 5-6 mm; cánh hoa bóng, trong suốt, màu trắng, mỏng, có dạng trứng hẹp; nhị 6.
Cây ra hoa vào mùa xuân [1].
Cây ưa những nơi dat mau mỡ, am, thoát nước tot và che bóng một phan Nêu trồng ở nơi nhiêu ánh sáng, lá thường chuyên sang màu tía và thân mọc thâp Cây được nhân trồng băng hạt và cành giâm [1].
Callisia fragrans được trồng làm cảnh ở nhiều nước bởi có thân bò khá đẹp và dễ trồng Người ta thường trồng Callisia fragrans trong các chậu treo dé thân buồng rủ tạo dáng hoặc phủ kín mặt đất tạo thảm xanh trong vườn nhà Do khả năng phát triển nhanh, ở Florida - Mỹ, loài cây này được xếp vào danh sách “Các loài thực i | vi lộ at ;
2.3.2 Thanh phan hóa học chỉ Callisia Trong các loài Callisia có một số loài như C elegans, C fragrans, C insignis,
C macdougallii, C repens, C soconusensis đã được Maria A và cs khảo sát sơ bộ bang sắc ký giấy va sắc ký lớp mỏng cho thay đều có chứa flavon C-glycosid, một nhóm chất thường gặp trong các cây thuộc họ Commelinaceae [10] Lá của các loài
C elegans, C insignis, C macdougallii được xác định có cyanidin 3,7,3’-triglucosid acyl hóa [11].
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Cây lược vàng được thu mua tại khu vực Bà Điểm, huyện Hóc Môn, Tp HCM.
Những cây lược vàng có thân dài chứa từ 10 — 12 đốt, chưa có hoa, có lá trưởng thành với độ dài từ 18 — 25 cm, bề rộng lá từ 3,5 — 4 cm sẽ được chọn thu hái.
Tại vườn, phan lá lược vàng tươi, không héo vàng được giữ lại, phần thân bỏ đi Lá được rửa sạch dé loại bỏ đất cát, sau đó lá được nhúng côn 70% và lay ra liền, phơi khô trong bóng ram tránh ánh nang mặt trời trong khoảng 1 giờ Khi lá đã khô, tiến hành đóng gói trong bao tối màu dé tránh ánh năng mặt trời và được vận chuyển bang xe ba bánh về phòng thí nghiệm từ 1 — 1,5 giờ Khi về đến phòng thí nghiệm, việc thực hiện cắt nhuyễn lá được thực hiện ngay sau đó Kế đến, lá được đem sây 0 nhiệt độ 70°C trong khoảng từ 3 — 4 gid, đến độ âm không đổi; cuối cùng, lay lá ra và nghiền nhỏ thành bột. Độ âm trung bình của nguyên liệu sau 3 lần đo: 8,15% + 1,1269.
Hình 3-1: Sơ do xử lý nguyên liệu
3.2 Dụng cu - thiết bị - hóa chat 3.2.1 Hóa chất
Bảng 3-1: Hóa chất dùng trong thí nghiệm STT| Tênhóachất | Độ tỉnh khiết Xuất xứ
(CH:OH) NHGàu Iệt Nam
Chat chuan Khoa duge cua
3.2.2 Dụng cụ - thiết bị chính a Hệ thống thiết bị COa — SFC Thar, Ý
— Lưu lượng (CO + ethanol): 0 — 20 (g/ph).
— Ty lệ ethanol: 0 — 20 (% khối lượng).
Co-Solvent Current Method:| &:sthar service\running co2 with co-solyent C2H50H met Press| 0 Ba Temp ' GA mai
Current User, | Ädmin Press, | Bar
Static Mixer f CO Pom 2 Fan
Press! 0 0 Ba Flow Í T-DŨ g/min
[37 E 0 Bar ple Valve w/Rupture Disc aes /50 E
@ System Ready ¢ System Data Logger Running Method Loaded: e:\thar servicewrunning co2 with co-solvent C2H50H met
Hình 3-3: Gian đô vận hành hiển thị trên máy tính b Bộ dung cụ Soxhlet.
— Thé tích ông chứa nguyên liệu: 250 ml
— Thể tích bình cầu: 500 ml c Hệ thong thiết bị cô quay chân không Buchi, Thuy Sĩ.
— Nhiệt độ bề điều nhiệt: 09C — 100°C.
— Nhiệt độ hệ thống làm lạnh làm việc tại 5,5°C.
30 d Thiết bị do quang UV-vis CT 2300, Đài Loan.
— Độ chính xác cua bước sóng: + | nm
3.3 Nội dung nghiên cứu s* So đồ nội dung nghiên cứu
Cô quay Dịch chiêt —— >| Cao, bỏ
Ngâm dầm I Soxhlet với d Oi etyl axetat voi hexan oxhlet với dung môi etyl axeta Cao CLE
Bá lá cd Trích ly ảnh hưởng của tỷ lệ Vv , ả lá câ
J ethanol Ham mục tiéu ảnh hưởng của lưu lượng : he vyone tổng (CO2 + ethanol) Vị Poiypaene
Cé quay 7| anh hưởng cua nhiệt độ khang oxi héa.
>| ảnh hưởng của áp suat
>| Chọn điều kiện trích kiệt
Hình 3-5: Sơ đô nội dung nghiên cứu
`4 Hàm mục tiêu - Hàm lượng polyphenol tổng.
- Hoạt tinh kháng oxi hóa.
3.3.1 Tách các hợp chất không phân cực
Trong quá trình trích ly, các hợp chất không phân cực sẽ ảnh hưởng không tốt đến quá trình phân tích chất lượng của cao chiết, ví dụ như diệp lục không tan trong nước nên diệp lục sẽ làm đục dung dịch, ảnh hưởng đến quá trình đo quang Do đó, bước dau tiên, các hợp chất không phân cực được tiễn hành tách bớt.
500 gam bột lá được đựng trong keo thủy tinh tối màu và có phủ kín giấy bạc bên ngoài Lượng bột lá này được ngâm dam với dung môi n-hexan trong hai tuần; mỗi ngày, bột lá ngâm được thay 1,5 lit nước dung môi n-hexan mới cho đến khi dịch trích gan như trong Sau khi kết thúc quá trình ngâm dam, bột lá được phơi khô ở nhiệt độ thường trong 1 ngày Các thao tác được thực hiện trong phòng tối râm Bột lá này được kí hiệu là LH.
3.3.2 Trích ly bằng phương pháp Soxhlet với dung môi ethyl acetate
Trong dé tài này, dung môi ethyl acetate được chon để trích ly lá lược vàng băng phương pháp Soxhlet vì theo kết quả một số nghiên cứu trước đó công bố: dịch trích thân bồ lược vàng với dung môi ethyl acetate có hàm lượng polyphenol tong va hoạt tính kháng oxi hóa cao nhất [1, 2, 3] Mặt khác, các hợp chất chính nhóm polyphenol trong cây lược vàng là các hợp chất flavonoid: quercetin, kaemferol có tính phân cực trung bình, nên dễ tan trong các dung mồi phân cực trung bình hơn các dung môi phân cực mạnh như methanol, ethanol, nước, Vì thế, mẫu cao chiết lá lược vàng với dung môi ethyl acetate sẽ được chọn là mẫu đối chứng cho cao chiết lá lược vàng bằng phương pháp dùng lưu chất COa siêu tới han.
15 gam bột lá LH được tiến hành quá trình trích ly băng phương pháp Soxhlet với 350 ml dung môi ethyl acetate, nhiệt độ bé từ 80°C — 85°C trong thời gian 6 tiếng.
Dịch trích với ethyl acetate được kí hiệu là DLE.
Dịch trích DLE được đem di cô quay chân không với nhiệt độ bể 35°C thu được cao trích, kí hiệu là CLE.
Cao trích CLE được tiến hành phân tích hàm lượng polyphenol tổng, hàm lượng flavonoid tổng, hoạt tính kháng oxi hóa và hàm lượng quercetin, kaemferol.
3.3.3 Trích bang phương pháp siêu tới hạn với dung môi CO:
Trong quá trình thực nghiệm, kết quả trích ly các hợp chất polyphenol từ lá cây lược vàng bang lưu chất COz siêu tới hạn - không sử dụng đồng dung môi ethanol không thu được dịch trích Mặt khác, do điều kiện thực tế về thiết bị, khi tiến hành quá trình trích ly lá lược vàng bằng lưu chất CO2 siêu tới han, không sử dụng đồng dung môi, dẫn đến hiện tượng nghẹt đường ống của thiết bị Cho nên, theo yêu cầu của cán bộ quản lý thiết bị của phòng thí nghiệm, các thí nghiệm trích ly lá lược vàng băng lưu chất CO siêu tới hạn tiếp theo đều tiễn hành với đồng dung môi ethanol.
Khảo sát các thông số của các yếu tố vận hành thiết bị trích ly COa siêu tới hạn với đồng dung môi ethanol được trình bày ở Bảng 3-2.
Các dịch trích này được kí hiệu phần đầu DLC.
Bang 3-2: Các thông số khảo sát trong thí nghiệm trích ly bằng CO: siêu tới hạn lưu lượng tổng STT nhiệt độ áp suất ty lệ ethanol (CO: + ethanol)
Xác định thông sô ty lệ ethanol
Xác định thông số lưu lượng tong (CO2 + ethanol)
Xác định thông số nhiệt độ
Xác định thông số áp suất
14 50 100 10 14 15 50 150 10 14 16 50 250 10 14 17 50 200 12 14 a Xác định thông số ty lệ ethanol Khối lượng bột lá LH được dùng trong thí nghiệm lá 15 gam.
Theo thông số kĩ thuật của thiết bị CO> siêu tới hạn trong phòng thí nghiệm trọng điểm thuộc trường CNHH&DK đại học Bách Khoa Tp HCM và dựa theo kết quả tối ưu về lưu lượng ethanol trong trích ly các hợp chất flavonoid từ lá trà, để xác định thông số tỷ lệ ethanol, tỷ lệ ethanol được thay đổi theo các mức: 10%, 12% , 14% , 16% , 18% , 20% (khối lượng) Các thông số còn lại được giữ cố định cũng dựa trên thông số kĩ thuật của thiết bị COa siêu tới hạn và cơ sở thực nghiệm của việc trích ly các hợp chất flavonoid từ lá trà [65]:
Chất lượng cao chiết được đánh giá qua: b Xác định thông số lưu lượng tổng (COa + ethanol) Khối lượng bột lá LH được dùng trong thí nghiệm là 15 gam.
Theo thông số kĩ thuật của thiết bị COa siêu tới han trong phòng thí nghiệm, dé xác định thông số lưu lượng tong (COa + ethanol), lưu lượng tổng (CO? + ethanol) được thay đổi theo các mức: 12 g/ph, 14 g/ph, 16 g/ph, 18 g/ph, 20 g/ph Các thông e Hàm lượng polyphenol tổng.
Hoạt tính kháng oxi hóa (theo ABTS").
Lưu lượng tổng (CO2 + ethanol): 14 gam/phút. Áp suất: 200 bar.
Thời gian trích ly: 60 phút.
35 số còn lại được giữ cô định dựa trên thông số kĩ thuật của thiết bị COz siêu tới hạn và cơ sở thực nghiệm của việc trích ly các hợp chất flavonoid từ lá trà [65]: e Áp suất: 200 bar. e Nhiệt độ: 50°C. e Ty lệ ethanol: 10% (khối lượng). e Thời gian trích ly: 120 phút.
Chất lượng cao chiết được đánh giá qua: e Hàm lượng polyphenol tổng. e Hoat tính kháng oxi hóa (theo ABTS®). c Xác định thông số nhiệt độ Khối lượng bột lá LH được dùng trong thí nghiệm là 15 gam.
Theo thông số kĩ thuật của thiết bị COa siêu tới han trong phòng thí nghiệm, dé xác định thông số nhiệt độ, nhiệt độ được thay đối theo các mức: 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C Các thông số còn lại được giữ cô định dựa trên cơ sở thực nghiệm của việc trích ly các hợp chất flavonoid từ lá trà [65]: e Lưu lượng tổng (COa + ethanol): 14 gam/phit. e Áp suất: 200 bar. e Nông độ ehtanol: 10% (khối lượng). e Thời gian trích ly: 120 phút.
Chất lượng cao chiết được đánh giá qua: e Hàm lượng polyphenol tổng. e Hoạt tính kháng oxi hóa (theo ABTS"). d Xác định thông số dp suất Khối lượng bột lá LH được dùng trong thí nghiệm 15 gam.
Theo thông số kĩ thuật của thiết bị CO> siêu tới hạn trong phòng thí nghiệm,để xác định thông số áp suất, áp suất được thay đổi theo các mức: 100 bar, 150 bar,
200 bar, 250 bar Các thông số còn lại được giữ cô định dựa trên cơ sở thực nghiệm của việc trích ly các hợp chất flavonoid từ lá trà [65]: e Lưu lượng tổng (COa + ethanol): 14 gam/phit. e Nhiệt độ: 50°C. e Ty lệ ethanol: 10% (khối lượng). e Thời gian trích ly: 60 phút.
Chất lượng cao chiết được đánh giá qua: e Hàm lượng polyphenol tổng. e _ Hoạt tính kháng oxi hóa (theo ABTS").
Các dịch trích lần lượt được đem cô quay tại nhiệt độ bề 37°C thu được cao trích, kí hiệu là CLC.
Tại các giá trị của từng thông số cho chất lượng cao chiết tốt nhất trong day khảo sát sơ bộ, thí nghiệm được tiến hành với sự kết hợp các giá trị thông số này nham thu được cao trích CLC Cao trích nay được tiễn hành phân tích hàm lượng polyphenol tổng, hàm lượng flavonoid tổng, hoạt tính kháng oxi hóa và hàm lượng quercetin, kaemferol Kết quả phân tích này được so sánh với kết qua phân tích của cao chiết lá lược vàng băng phương pháp Soxhlet với dung môi ethyl acetate.
3.4.1 Xác định độ ẩm của cao dựa theo độ giảm khối lượng của cao khi sấy dim
Dé xác định khối lượng cao chính xác cần lay dé pha dung dịch mẫu khi thử hoạt tính, ta cần xác định độ âm của cao.
Chuân bị một đĩa nhôm khô và cân đĩa nhôm khô đó.
KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN
4.1 Anh hưởng của tý lệ ethanol đến chất lượng cao trích
Bảng 4-1: Kết quả hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxi hóa theo tỷ lệ ethanol hàm lượng polyphenol tổng hoạt tinh kháng oxi hóa ty lệ ethanol (%) (mg G AE / chất khô trong cao) (uM TE/g So) khô trong
Hình 4-1: Anh hưởng của ty lệ ethanol đến ham lượng polyphenol tổng
— — `S wn S© © © trích (uM TE/g chất khô) ws =œ hoạt tính kháng oxi hóa trong cao
Hình 4-2: Anh hưởng của ty lệ ethanol đến hoạt tinh kháng oxi hóa
Hình 4-1 cho thấy ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng, khi tăng tỷ lệ ethanol từ 10% đến 14%, hàm lượng polyphenol tổng trong cao trích tăng dân từ 35,5433 + 1,9876 lên 37,5644 (mg GAE/g chất khô trong cao) nhưng không có ý nghĩa thống kê Khi tăng tiếp tỷ lệ ethanol từ 14% đến 20%, hàm lượng polyphenol bắt đầu giảm dan từ 37,5644 xuống 30,5842 + 0,2101(mg GAE/g chất khô trong cao) nhưng cũng không có ý nghĩa thống kê. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol đến hoạt tính kháng oxi hóa được trình bày theoHình 4-2 Khi tăng tỷ lệ ethanol từ 10% đến 14%, hoạt tính kháng oxi hóa trong cao trích tăng dan từ 117,6739 + 1.9071 lên 181,5834 + 2,5927 (uM TE/g chất khô trong cao) tăng nhanh với giá trị từ 12% lên 14% và có ý nghĩa thông kê Khi tăng tiếp tỷ lệ ethanol từ 14% đến 20%, hoạt tính kháng oxi hóa bat đầu giảm dan từ 1815834 +2.5927 xuống 88,4167 + 1,1785 (uM TE/g chất khô trong cao), giảm mạnh ở nồng độ từ 14% lên 16%, nồng độ từ 16% đến 20% thì hoạt tính kháng oxi hóa thay đổi không có ý nghĩa thống kê.
42 Điều này có thể giải thích: Các đồng dung môi cải thiện khả năng trích ly của CO2 siêu tới hạn bằng cách làm tăng sự phân cực của COza Kết quả là, hàm lượng của các hợp chất mong muốn trích ly và hoạt tính của nó đã được cải thiện rất nhiều với sự gia tăng tốc độ dòng chảy của đồng dung môi Vì đồng dung môi phân cực tạo nên những thay đổi trong cấu trúc của chất nên và làm tăng sự thấm thấu va phá vỡ các liên kết trong chất nên băng cách cạnh tranh với các tương tác phân cực giữa các chất nền với nhau; từ đó, lần lượt làm tăng độ tan của các hợp chất được chiết xuất (Bjorklund và cộng sự 1998) [6] Tuy nhiên, hàm lượng các chất cần trích chỉ tăng đến một mức nhất định tương ứng với tỷ lệ ethanol Điều này có thể là do khi tăng nông độ đồng dung môi, trong sản phẩm trích ly có thêm các thành phần không mong muốn Vì thế, khi phân tích cao trích, khối lượng cao tăng nhưng hàm lượng các chất mong muốn và hoạt tính của chúng không tăng nữa, dẫn đến kết quả phân tích được tính toán qui về trên khối lượng gam chất khô của cao trích bị giảm dan như trên hai hình đồ thị
Khi chọn lưu lượng tong (CO2 + ethanol) là 20 g/ph, tỷ lệ ethanol được chon là 14% (khối lượng) thì lưu lượng ethanol tương ứng là 2,8 g/ph Kết qua này gan tương thích với kết quả trích ly các hợp chất flavonoid có hoạt tính sinh học từ lá trà bang lưu chất CO2 siêu tới hạn có sử dụng đồng dung môi ethanol, với lưu lượng ethanol tối ưu là 2,94 g/ph [6].
4.2 Ánh hướng của lưu lượng tổng (CO; + ethanol) đến chất lượng cao trích
Bảng 4-2: Kết quả hàm lượng polyphenol tong và hoạt tinh kháng oxi hóa theo lưu lượng tông (CO2 + ethanol) lưu lượng tổng hàm lượng polyphenol tong (mg | hoạt tính kháng oxi hóa (uM
(CO2 + ethanol) GAE/g chat khô trong cao) TE/g chat khô trong cao)
Lưu lượng tổng (CO, + ethanol) (g/ph)
Hình 4-3: Anh hưởng của lưu lượng tong (CO2 + ethanol) đến hàm lượng polyphenol tông
Luu luong tong (CO, + ethanol) (g/ph)
Hình 4-4: Anh hưởng của lưu lượng tổng (CO2 + ethanol) đến hoạt tính kháng oxi hóa Ảnh hưởng của lưu lượng tổng (COa + ethanol) đến hàm lượng polyphenol tong được trình bay theo Hình 4-3, khi tăng lưu lượng tong (CO2 + ethanol) từ 12 g/ph lên đến 16 g/ph thì ham lượng polyphenol tổng trong cao trích cũng tăng lên
44 nhưng tăng chậm Giữa giá trị 12 g/ph và 14 g/ph sự tăng có sự khác biệt về ý nghĩa thông kê Khi tăng lưu lượng tong (CO> + ethanol) từ 14 g/ph đến 18 g/ph, không có sự khác biệt về hàm lượng polyphenol tổng trích ly được Lưu lượng tổng (COa + ethanol) tăng từ 18 g/ph lên 20 g/ph, hàm lượng polyphenol tăng nhanh và dat giá tri
65,5842 + 3.0805 (mg GAE/g chất khô trong cao).
Hình 4-4 cho thay anh hưởng của lưu lượng tong (COa + ethanol) đến hoạt tính kháng oxi hóa của cao trích thu được Khi tăng lưu lượng tong (CO + ethanol) tăng từ 12 g/ph lên đến 18 g/ph thì hoạt tính kháng oxi hóa trong cao trích tăng chậm (từ 101,75 + 1,1785 đến 117,1667 + 5,3033 uM TE/chat khô trong cao) và không có sự khác biệt về ý nghĩa thông kê Lưu lượng tổng (COa + ethanol) tăng 16 g/ph đến 20 g/ph, hoạt tính kháng oxi hóa trong cao trích tăng nhanh va có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thông kê, nhất là khi lưu lượng tong (CO> + ethanol) đạt đến giá trị 20 g/ph, hoạt tính kháng oxi hóa đạt giá trị 192,5833 + 3,5355 (uM TE/chất khô trong cao). Điều này có thé giải thích, khi tăng lượng dung môi thì khả năng hòa tan các chất tăng lên Mặt khác, trong trường hợp cụ thé này, ngoài dung môi CO› siêu tới hạn, chúng tôi còn sử dụng thêm đồng dung môi ethanol, nồng độ đồng dung môi ethanol được tính theo phần trăm khối lượng so với lưu lượng tong (CO2 + ethanol).
Vì thé, mặc dù ty lệ ethanol có định là 10% (khối lượng) nhưng khi tăng lưu lượng tong (CO2 + ethanol), đồng nghĩa lưu lượng đồng dung môi ethanol đi vào mẫu cũng tăng theo Việc sử dụng đồng dung môi ethanol giúp tăng độ phân cực của hỗn hợp dung môi trích ly, dẫn đến kết quả hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa trong cao trích tăng lên.
4.3 Ánh hướng của nhiệt độ đến chất lượng cao trích
Bang 4-3: Kết quả hàm lượng polyphenol tong và hoạt tính kháng oxi hóa theo nhiệt độ ơ hàm lượng polyphenol tong hoạt tinh khỏng oxi húa „M nhiệt độ | (mg GAE/g chất khô trong cao) (TE/g chất khô trong cao)
Hàm lượng polyphenol tổng trong cao trích (mg GAE/g chat khô) +li 20 oP) S 10
Hình 4-5: Anh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tông
Hoat tinh khang oxi hoa trong cao trich (um TE/g chat khô) Và = 150 = S or
Hình 4-6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxi hóa
Hình 4-5 cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng.
Khi tăng nhiệt độ từ 40°C lên 45°C, hàm lượng polyphenol tổng trong cao trích tăng nhanh từ 20,6832 + 0/7701 lên 43,9505 + 2,3104 (mg GAE/g chất khô trong cao) va có ý nghĩa khác biệt về thống kê Khi tăng nhiệt độ tiếp tục từ 45°C lên từ từ đến 60°C, hàm lượng polyphenol tổng trong cao trích giảm dân và không có ý nghĩa khác biệt thống kê từ 55°C lên 60°C.
Tương tự, ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng oxi hóa được trình bay trên Hình 4-6 Khi tăng nhiệt độ từ 40°C lên 459C, hoạt tính kháng oxi hóa trong cao trích tăng nhanh từ 85,5 + 17678 lên 180.5 + 1,7678 (uM TE/g chất khô trong cao) và có ý nghĩa khác biệt về thống kê Khi tăng nhiệt độ tiếp tục từ 45°C lên từ từ đến 60°C, hoạt tính kháng oxi hóa trong cao trích giảm dần và không có ý nghĩa khác biệt thống kê từ 50°C lên 60°C. Điều này có thể giải thích: khi gia tăng nhiệt độ sẽ dẫn đến kết quả gia tăng áp suất hơi chất tan và độ tan của các hợp chất phenolic sẽ gia tăng cùng với sự gia tăng
47 áp suất hơi Mặc dù, khả năng sonvat hóa của ethanol trong COa giảm khi giảm mật độ, nhưng việc tăng nhiệt độ làm tăng tốc độ trích ly có thể là do ảnh hưởng của áp suất hơi chiễm ưu thế hơn sự ảnh hưởng cua mật độ (Pilavtepe và cộng sự 2012) [6].
Thay vào đó, nhiệt độ tăng lên góp phan phá vỡ màng tế bào hạt, làm tăng tốc độ truyền khối và kết quả là sự trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học tăng (Machmudah và cộng sự 2006) [6] Nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ dẫn đến sự sụt giảm trong việc thu hồi nồng độ các hợp chất có hoạt tính sinh học là do sự bay hơi của các thành phan dé bay hơi hoặc xảy ra sự phân hủy trong quá trình trích ly ở nhiệt độ cao hơn [6].
Kết quả trích ly dat tốt nhất ở nhiệt độ 45°C, gần tương đương với kết quả trích ly các hợp chất flavonoid có hoạt tính sinh học từ lá trà bang dung môi CO2 siêu tới hạn với đồng dung môi ethanol ở nhiệt độ tối ưu 50°C Sự chênh lệch kết quả là do tác giả bài báo khảo sát điều kiện nhiệt độ ở giá tri 40°C, 50°C, 60°C [6].
4.4 Anh hướng của áp suất đến chất lượng cao trích
Bang 4-4: Kết quả hàm lượng polyphenol tong và hoạt tinh kháng oxi hóa theo áp suát áp suất hàm lượng polyphenol tong hoat tinh kháng oxi hóa (uM
(mg GAE/g chat khô trong cao) | TE/g chat khô trong cao) 100 0 0
OE92 SUON Sud} JoueudAIod Suony] wey Hình 4-7: Anh hưởng của áp suất đến ham lượng polyphenol tổng
150 Áp suất (bar) © CC CC CC CC CC |
CoCo HF O FN NAN xw
O9 SUOJ) BOY IXO SuBYyY YU woH
Hình 4-8: Anh hưởng của áp suất đến hoạt tinh kháng oxi hóa
KET LUAN VA KIEN NGHI
Bước đầu sơ bộ nghiên cứu trích ly COa siêu tới hạn các hợp chất polyphenol từ lá lược vàng, kết quả thu được cho thấy: cao lá lược vàng được trích ly bằng lưu chat COa siêu tới hạn với đồng dung moi ethanol tại các thông số vận hành: tỷ lệ ethanol 14% (khói lượng), lưu lượng tong (CO2 + ethanol) 20 g/ph, nhiệt độ 45°C, áp suất 150 bar, có ham lượng polyphenol tổng là 87,4158 + 1,3302 mg GAE/g chất khô trong cao, hàm lượng flavonoid tổng là 85,2494 mg QE/g chat khô trong cao và hoạt tính kháng oxi hóa là 243,8333 + 5,3033 „M TE/g chất khô trong cao Kết quả này đạt được tương đương kết quả hàm lượng polyphenol tổng (85,3366 + 4/2706 mg GAE/g chất khô trong cao), hàm lượng flavonoid tong (84,6039 mg QE/g chất khô trong cao) và hoạt tính kháng oxi hóa (236,3334 + 7,6603 „M TE/g chất khô trong cao) của cao lá lược vàng được trích ly bang Soxhlet với dung môi ethyl acetat Mặt khác, kết quả phân tích thành phần hóa học băng GC — MS và kết quả định lượng querctin và kaemferol băng HPLC của hai mẫu cao lá lược vàng CLC và CLE là tương tự nhau Kết quả khảo sát bước đầu của luận văn cho thay khả năng ứng dụng của việc trích ly các hợp chat polyphenol từ lá lược vàng băng lưu chất COa siêu tới hạn với đồng dung môi ethanol có thể thực hiện Hơn nữa, từ kết quả thu được, đây là một phương pháp tiềm năng với nhiều ưu điểm, nên được ứng dụng để thay thế phương pháp Soxhlet với dung môi hữu cơ trong quá trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá lược vàng.
Quy hoạch thực nghiệm, khảo sát ảnh hưởng lẫn nhau giữa các thông số vận hành, mức độ ảnh hưởng của từng thông số vận hành đến chất lượng cao trích.
Từ đó, tối ưu hóa các điều kiện tiễn hành trích ly CO2 siêu tới hạn các hợp chat polyphenol từ lá lược vàng.
Phân lập và định danh hợp chất flavonoid có trong lá lược vàng được trồng tạiBà Điểm, Hóc Môn, Tp Hồ Chí Minh.
