Nghiên cứu một số đặc điểm hóa học và tác dụng sinh học của các hợp chất polyphenol trong lá cây chè camellia sinensis trồng ở tân cương thái nguyên và

MỤC LUC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC THỰC VẬT 1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC HỢP CHẤT ELAVONOTT THỰC VẬT CHƢƠNG 2: Đối TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 37 2.1 ĐỐI TƢỢNG THỰC VẬT 37 22 CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOIT TOÀN PHẦN TỪ NGUYÊN LIỆU 37 THỰC VẬT 2.2.1 Quy trình chiết flavonoit (B.C Talli) 37 2.2.2 Định lƣợng flavonoit toàn phần chè 38 23 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOU 39 2.3 Ì Định tính flavonoit phản ứng hoa học đặc trƣng 39 2.3.2 Phân tích sắc ký lớp mỏng quang phố tử ngoại 40 2.3.3 Phân tách sắc ký lỏng trung áp MPLC 41 2.3.4 Phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC 41 2.3.5 Phân lập chất tinh khiết phƣơng pháp SKLM điều chế 41 2.3.6 Nghiên cứu cấu trúc chất tinh khiết thu đƣợc 42 2.4 42 NGHIÊN CÚƢ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT 2.4.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm thơng qua ảnh hƣởng lên hoạt c Xavron độ peroxydaza máu ngƣời theo phƣơng pháp E 2.4.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua ảnh hƣởng lên q trình peroxy hoa lipid màng tế bào gan chuột 43 2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan chế phẩm chuột bị nhiễm độc CC14 44 2.4.4 Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật 45 2.4.5 Xác định hoạt động cathepsin (proteaza) huyết tƣơng máu ngƣời 2.4.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm động vật thực nghiệm 48 2.4.7 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm phát triển ung thƣ in vitro 49 2.4.8 Nghiên cứu hoạt tính chống ung thƣ chống di ung thƣ động vật thực nghiệm 2.4.9 Xác định độc tính cấp 52 2.4.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 52 CHƢƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 MẪU THỰC VẬT 53 3.2 ĐIỂU CHẾ FLAVONOIT TONG số 54 3.2 Ì Quy trình chiết 54 3.2.2 Định tính flavonoit phản ứng hoa học đặc trƣng 55 3.3 KHẢO SÁT Sơ Bộ THÀNH PHẦN HOA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG 57 OXY HOA CÁC MẨU FT THU ĐƯỢC 3.3.1 Khảo sát thành phần flavonoit FT phƣơng pháp SKLM kết hợp với quang phổ tử ngoại 57 3.3.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hoa (antioxydant) chế phẩm FT thông qua ảnh hƣởng lên hoạt động peroxydaza máu ngƣời phản ứng oxy hoa indigocarmin 59 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN FLAVONOIT CHÊ PHẨM FTC 62 3.4.1 Phân tích thành phần flavonoit FTC4 FTC7 sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3.4.2 Phân lập số chất tinh khiết 65 3.4.3 Xác định cấu trúc chất tinh khiết thu đƣợc 66 3.4.3 1.Xác định cấu trúc FTC4.1 3.4.3.2 Xác định cấu trúc FTC7.J 68 3.5.KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONOIT 71 3.5.1 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa thơng qua ảnh hƣởng lên trình peroxy hoa lipit tế bào gan chuột 71 3.5.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan chế phẩm chuột bị nhiễm độc CC14 73 3.5.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm nhiễm 78 3.5.3.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn 79 3.5.3.2 Khảo sát ảnh hưởng lên hoạt độ cathepsin (proteaia) huyết tương máu người 3.5.3.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm thực nghiệm 3.5.4 84 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm phát triển ung thƣ 86 35.4.1 Nghiên cứu tác dụng kìm hãm sựphát triển ung thư in viĩỉ'0 87 3.5.4.2 Nghiên cứu tác dụng chống ung thư chông di cân 9Í ung thư thực nghiệm (in vivo) 3.5.5 Xác định độc tính cấp chế phẩm FTC hổn hợp FTC 4/7- 5/5 KẾT LUẬN 105 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 PHỤ LỤC 127 DANH MUC KY HIEU CAC CHU VIET TAT Alan in amino transferase ALT AS artate amino iransferase AST Dialdehyt malonic DAM Dang oxy hoat dñng DOHD Epicatechin EC Epicatechin gallat ECG Epigallocatechin EGC Epigall ocatechin gallat EGCG Flavonoit tsng so Growth de lay GD Human Epidermoid Larynx Carcinoma HEp-2 Sac ky lñng cao ñp HPLC Hoat tinh chñng oxy hoa HTCO Hoat tinh gñy dñc té bao ung the HTCU Pho hñng ngoai IR Minimum inhibiting concentration MIC Sac ky lñng trung ap MPLC Phñ khñi lirong MS Phñ cñng hirfig tit hat nhin NMR pq Phan doan POL S $zicome 180 — 180 Sic ky dñ SKD Sac ky lñp mñng SKLM Nonsecreting mouse m yeloma cell Sp -2/0 Axit iricloacetic TCA Toluen/etylaceiat/aceion/axii formic TEAF Pho tit ngoai UV-VIS Peroxy hoa lipil DANH MUC CAC HINH ANH, DH THI Hinh tFang 1.1 So sinh tong hop cac hnp chat phenolic 1.2 Cac hop chat flavonoit va quan phat sinh 2.1 La cay Che - Camellia sinensis Lindl O Kuntze 37 2.2 Quy trinh chiet xuat flavonoit toan phan (theo B.C.Talli) 38 2.3 Dirñng chuan tyrosin 48 3.1 Sae kj dñ cña cac che pham flavonoit tir la che vu xuan 58 3.2 Anh huong cña cac che pham flavonoit che Tan Cirong len hoat 60 perox ydaza o bOn nhom mau ngirñi 3.3 dñ Anh hu0ng cfia cac ché pham flavonoit che Xuan Mai len hoat peroxydaza d bñn nhom mau nguoi 61 3.4 So dñ phan tach FTC bang sae ky lñng trung ap MPLC 62 3.5 Sac ky HPLC ché pham flavonoit FTC4 63 3.6 Sac ky HPLC ché pham flavonoit FTC7 64 3.7 Cñu trñc cua (-) - epicatechin 78 3.8 Cau truc cña quercitrin 70 3.9 Anh hu0ng cua cac ché pham flavonoit FTC, FTC4 va F TC7 len sq peroxy hoa lipit té bao gan chuñt 3.10 So thay doi ham lirpng AST va ALT huyet chuñt ngo dñc CCl, sau 24h diéu tri bang cac che pham thir nghiém 3.11 3.13 75 Su thay doi ham luong MDA huyet chuot ngo doc CCI, sau 24h diéu tri bang cac ché pham the nghiem 3.12 73 76 Sir thay doi ham lirong AST va ALT huyet chuñt ngñ dñc CCI, sau 72h dieu tri bang cac che pham thir nghiém 77 St thay doi hñm luong MDA huyét chuñl ngñ dñc CCI sau 72h 77 dieu tri bang cac ché pham thu nghiem 3.14 Hoat cathepsin ñ llia tuñi I va II 3.15 Anh rig cua cac ché pham flavonoit FTC, FTC4 va FTC7 ñ cac nñng 82 khac Ién hoat dong cathepsin huyet tunng mau nguñi 82 3.1 So sanh anh hu0ng cua cac che pham FTC, FTC4 va FTC7 (ñ nñng dñ 0,15mg9o) hoat dong cathepsin huyet tuong ngtroi 8# 3.17 So sanh kha niing irc che viém cña ché phñm FTC va FTC 4/7 5/5 3.18 Anh hirñng cua che pham FTC, FTC4, FTC7 len sinh tru ng cua ié bao ung thir HEp-2 3.19 91 Anh hirong cua che pham FTC, FTC4, FTC7 len sinh traong cua ié bao ung thir Sp-2/0 3.20 85 92 Anh hirñng cua ché phñm FTC, FTC4, FTC7 fen sinh irirñng cña té bño ung thir S-180 3.21 So sanh anh cña FTC va FTC4/7 — 5/5 thé tich u dui chuñt 97 3.22 So sanh anh huñng cua FTC vñ FTC4/7 5/5 lirpng u dñi chuñt 97 3.23 I-finh 3.23 anh chuñt bi gay u dui boi dong té bao S - 150 va duoc dieu 98 tri bang che pham FTC va FTC4/7 5/5 3.24 Dñi chuot mang u gay boi dong te bao S-180 3.25 So sanh anh hiring cua FTC va FTC4/7 — 5/5 len su di can ung that th diii den gan va phoi (tinh theo sñ not di can) l0C So sanh anh hiring cua FTC va FTC4/7 — 5/5 sir di can ung thir tit dñi den gan vñ phoi (tinh theo so chuot co di ciin) 101 PL1 Phñ '’C NMR cua FTC4.l 128 PL2 Pho '’C NMR , DEPT 90, DEPT 135 cua FTC4.1 128 3.26 99 PL3 Pho HNMR cua FTC4.1 129 PL4 Pho HMBC cña FTC4.1 PL5 Phñ HMQC cña FTC4.1 129 130 PL6 Phñ COSY ctia FTC4.1 l3C PL7 PhS IR cua FTC7.1 131 PL8 Pho ''C NMR cña FTC7.1 131 PL9 Pho '’C NMR , DEPT 90, DEPT 135 cua FTC7.1 132 PL10 Pho 1HNMR cua FTC7.1 132 PL11 Cac té bao en van xirnng binh thuong ñ dñi chuot 133 PL12 Té bao ung thir phat trién mñ lien két dem, lam 13 I thoai hoa, hoai tir cac té bao en cua dñi chuot PL13 Anh di can cña te bdO ung thu S-180 vao gan PL14 134 Anh di can cña te bao ung thu S180 vao i DANH MUC CAC BAN€i SO LIEU Bang tr 1.1 Vi tri cac nhom the cña mot so flavonoit 2.1 SP lieu xay dimg thi chuan tyrosin 3.1 Danh muc ky hiéu cac mñu thirc vat dung cho nghién emu 3.2 Ham lupng flavonoit toan phan o la che 3.3 Két qua the phan ring d|nh tinh flavonoitñ cac che pham la che 3.4 Dac diém siic ky lñp mfing va phñ t0 ngoai cña che pham TCT2 3.5 Ket qufi thir dinh tinh cac nhom phiin doan bang cac phfin iingdac trung cña flavonoit 3.6 Mñt sñ flavonoit co mat FTC4 3.7 Mot so flavonoit co mit FTC7 3.8 Mñt sñ dac diem cña FTC4.1 3.9 Dii lieu 'H — NMR vñ ' 'C— NMR cña FTC4.1 3.10 Mot so diic diem cña FTC7.1 3.11 Dii lieu phfi 'H— NMR va '’C— NM R cua FTC7 3.12 hiring cua ché phs flavonoit FTC su peroxy hoa lipit té bao gan chuñi 3.13 hiring cua ché pham flavonoit FTC4 sir peroxy hoa lipit te bao gan chuot 3.14 hu rig cña ché phs flavonoit FTC7 su peroxy hoa lipit te bao gan chuot 3.15 Ket qua dinh tinh khang vi sinh vat cña cac ché pham 3.16 Dinh lirpng khang khuan cña FTC 3.17 Theo dñi sir thay doi thé tich chan chuñt gñy viém khong dieu tri 3.18 19 Anh hirñng cña che pham FTC sir sinh truñng cña té bao ung thir Hep3.20 2; Sp 2/ va S„ t, Anh hiring cua che pham FTC4 len sir sinh trirfirig cña té bao ung thir Hep-2; Sp-2/0 vñ S, „, Anh hirñng cita ché phñm FTC7 su sinh trirong cua te bao ung thu Hep-2; Sp-2/0 va S, „, 3.21 Anh hu0ng cña FTC, FTC4 va FTC7 len sir sinh trirñng cha te’ bao lympho mau ngoai vi ngirñi 95 PL1 Anh hu0ng cua cac ché pham flavonoit che Tan Cirnng hoat peroxydaza o bon nhom mau nguoi PL2 Anh huñng cua cac ché pham flavonoit che Xuan Mai hoat peroxydaza o bñn nhom mau nguñi PL3 Tae dung bao ve té bño gan cua cac che pham 1h(t nghiem sau 24 giñ diéu tri PL4 Tae dung bao ve té bao gan cua cac ché pham the nghiem sau 72 giñ diéu tri PL5 Anh htr rig cua cac che phñm FTC, FTC4 va FTC7 hoat cathepsin huyet tuong mau ngirñi PL6 Kha nang inc che viém cua che phiim flavonoit FTC PL7 Kha nang irc che viém cua ché pham FTC 4/7 — 5/5 PL8 Anh hufing cña ché pham FTC thé tich u dñi chuñt PL9 Anh hiring cña che pham FTC lirnng u dñi chuot PL10 Anh huéng cua che pham FTC 4/7 — 5/5 the tich u dñi chuot PU l Anh hirñng cña ché pham FTC 4/7 5/5 luong u dui chuñt PL12 hu g cua che phâm FTC so di ciin ung thu tu dui den gan va phoi PLl3 hu rig cña ché phâm FTC 4/—7 5/5 ,so di can ung ther tir dñi den gan va phñi Ngay nay, tac dung chGa benh cua cfc hop chat thién nhien la mñi quan tim dac biet cua cac nha hot sinh vâ y diroc hoc Nhirng tuu cua linh vuc di gop phin to lñn viéc bao vé sic khoé ngirñi Viec tim nhimg loai thuñc mii co hieu luc cao de thay the cho cac the he thuoc cii di tfi hi u luc vâ viéc tim kiém nhiing loai biet duqc chira tri cac can U nh nan y nhtr ung thir, AIDS, viem gan B la doi hfii ngiiy cang trs nén cip bach Tii do, viec nghien ciiti khai thac cac hop chat thien nhien ciing cang trs diem nong thu hut sir quan tarn cua nhiéu quoc gia tren the giñi Cay che (Camellia sineiisis L O Kuntze) tii lau da lâ mot uñng quen thufic ciia ngirñi va dirpc sit dung rong rai S nhieu qufic gia tren toan the giñi La mñt loai dfi uong giau chat chfing oxy hoa, che co tac dung chong lio hoa, giñp phñng chong nhiéu benh tat bao gom ca benh tim mach, hen suyen, gan, cac benh ve rang mieng va dac biet la co tac dung phñng tranh, giam nguy co mac cac benh ung thu Mang minh nhiing tac dung chira benh gia tri, tit lau che la dñi tirqng nghien ciiu cua cac nha khoa hoc thuñc linh vpc hoa sinh - y dirpc tren toan the giñi la che hpp chat polyphenol duqc quan tarn dac biet, day IN nhom chat thqc vat thir sinh Ion, co vat trñ ding ké cac qua trinh chuyén how en ban dieu hoa su sinh trrrsng, phat trién va bao ve thirc vit Trong sfi cac polyphenol thién nhién, lñp chat flavonoit cñ y nghia thqc tren lñn vi chung phan bo rong rii thirc vat, it dñc voi cv the song va co nhién hoat tinh sinh hoc gia tri Nghien ciiu vé hoa hoc vi tic dung sinh diroc hoc cua cac polyphenol va flavonoit khai thac tii che Viét Nam vñi muc dich phuc vu y hoc van cñn la mñt huñng nghien emu moi me Vi cho den S nuoc ta viec khai thac ring dung la che xanh 6é chGa tri benh moi chi dimg lai S kinh nghiem dan gian tren dieu hep, cac nghien ctiu ve che mñi chu yeu tap trung S linh vyc dung lam thirc pham, chira co htiong khai thac mot cach co hiéu qua ngufin nguyén lieu phong phu cac hpp chat thien nhien vao muc dich phong va chira benh cho ngttñi Tac dung chGa bénh cua dirpc lieu bat ngufin tit hoat tinh sinh diroc hoc ciia cac hip chat hoa hoc co che Do do, dé co the thiia ke duoc kinh nghiem dan gran vâ khai thac nguon thuoc mñi tii thien nhién, can thiét phat co nhimg hieu biet vé phan hoa hoc va tac dung sinh hoc cña chong Vñi mong muon dong gop them nhimg hieu biet n'ang cao gia tri cua cay ché Viet Nam, chñng tñi da thirc hien de tai: “NGHIEN C ffU MOT SO DAC DIMM HOA HOC VA TAC DU NG SIP H HOC C UA CAC HOP CHAT POLYPHENOL TRONG LA CAY CHE (CAMELLIA SINF.NSIS) TRONG Ci TAN CU€1NG (THAI NG UY IN) VA XUAN MAI (HA TA Y)" Theo hirñng nghién ciiu niy, luin vin co cac nhiém vu sau: Chiét xuit, dinh tinh va d!nh ltrpng flavonoit cac bñ phan la ché (la non, la banh té, la giñ) thu hai tai hai vñng che khac [(Tan Cirnng (Thai Nguyen) va Xuan Mai (Ha Tay)] vao cac thñi diem khac nam (bon miia: xuan, he, thu, dñng) Thong qua hoat tinh chfing oxy hoa de so sanh sang loc va lira chon mau flavonoit uu the nhat, sñ dung cho cac nghien ciiu sau hon ve thñnh phan hoa hoc va hoat tinh sinh hoc Nghien ciiu phin flavonoit la che Oanh gia hoat tfnh sinh hoc cua cac ché pham flavonoit thñng qua cac nghien ctiu hoa sinh hoc sau: • Tac dung chđng oxy hoa thong qua kha nang kim ham qua trinh peoxy hoa lipit mñng te bao gan chuñt va anh hiring cua cac ché pham flavonoit len hoat enzym peroxydaza mau ngirñi phan ring oxy hoa indigocarmin Tac dung chong oxy hoa va bao ve té bao gan thñng qua viéc danh gia tae dung diéu tri cña cac che pham flavonoit chuot gay dñc bang CC *4 • Tac dung chong viem nhiem thñng qua nghien cñu kha nang khang vi sinh vat gay benh, nghien cpu anh cña cac ché pham flavonoit len hoat cathepsin huyet tirong nguñi, hoat tinh chfing viem tren dong vit thirc nghiem • Tae dung gay c te bao tren cac dñng té bao ung thir nuoi cay HEp-2, • Sp-2/0 va S -180 in viti o Xac dinh hoat tinh kim ham sir phat trién khñi u va chñng di can ung th tr trén dñng vat thirc nghiem (iii vivo) • Xac dinh dđc tinh cap cua cac che phim the nghiem PHU LUC 127 Hinh PL2 Pho”•’C FTC4.1 NMR , DEPT 90, DePr Iss c5a Hinh PL3 Phi ’HNMR câa FTC4.1 Hinh PL4 Phi HMBC câa FTC4.1 29 Hinh PL5 Phd HMQC cua FTC4.1 Hinh PL6 PhO COSY c tja FTC4 130 oo , , Hinh PL7 Phâ”IR câa FTC7.1 Hinh PL8 PhO’"C NMR câa 131 FTC7.1 Hinh PL9 Phâ’”C NMR, DEPT 90, DEPT 135 ct/a FTC7.1 Hinh PL10 PhO’ 'HNMR câa FTC7.1 Khi cry td blo ung thu S -180 viio dñi chuot, hinh dang van en dñi va to chirc té bao b! thay dfii so v0i van co dui lanh Tren hinh PU ret sq bién doi 133 Ya PL2 cho phép so sanh rñ Hinh PLI3 Anh di cân cña té bâo ung thu: S-180 vâo gan Minh PL14 Huh di cân cua Ie QUO If Hz the S-180 vaO phâi (chup duñi kinh hien vi vñi dG phong dai 1500 lan) 134 Bang Z'LJ Anh hu:âng cua câc ché phâm flavonoit che Tân Cu:eng hoat dâ peroxydaza â bân nhâm mâu nguai (A, B, O, AB) Nñng d0 che pham guy kim ham hoan toan hoat dong peroxydaza phan ring oxy hoa indigocarmin (mg% Mau TCX1 NMA 4.0 NMB 3.5 NMO TCX2 TCX3 TCH TCH TCH 4.5 3.0 1.5 3.0 2.5 3.5 2.5 4.0 4.0 2.5 5.0 4.5 3.5 5.0 NMAB 4.0 3.0 4.0 4.5 3.0 4.0 Mau TCT1 TCT TCT TCD l TCD TCD NMA 4.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.5 NMB 3.5 2.5 3.5 3.0 2.5 3.5 NMO 4.0 3.5 4.0 4.5 3.5 4.5 NMAB 4.0 3.0 4.0 4.5 40 5.0 2.0 3.0 Bâng PL2 Anh hirâng cua câc ché phâm fiavonoit ché Xuân Mai hoat d peroxydaza â bân nhom mâu ngu:or {A, B, O, AB) Nting dñ che phim giy kim ham hoan toan hoat dong peroxydaza phan ring oxy hoa indigocar- (mg%) Mñu X Mh X MX2 XMX3 X EH l XMH XMH3 NMA 4.5 2.0 3.5 4.5 3.5 6.0 NMB 3.5 z0 2.5 4.5 2.5 5.0 NMO 4.5 3.0 5.5 4.5 3.0 4.5 NMAB 4.0 3.5 5.0 4.5 4.0 5.0 Mfiu XMT1 XMT XMT XMD XMD XMD NMA 4.0 3.0 5.0 4.5 4.0 5.5 4.5 NMB 45 5.5 4.0 5.5 NMO 5.0 4.0 6.5 5.5 NMAB 6.0 5.5 7.0 4.5 135 60 4.5 7.0 4.5 7.5 Bang PL Két quâ thâm dv tâc dung bâO ve té! bâo gan cka ‹ac che phâm the ttghiém sau 24 gif diéu tri Mâu thif AfiT (UII) ALT (Ull) IvlDA (›ilvlll) Lñ l 14.40 z3.58 Lñ 222.4 z 22.1 ' I 83.6 12.41 126.80a 17.42 '’2 122.16 z 8.91 ‘' Lñ Lñ Ln5 146.55z21 60'’2 2.8z0.8 I ' 1.39z0.31 1.7 lz0.25* 134.92z21.36' Lo 0.89+0.33 20.20 + 2.59 124.46a l 8.32 '’ 14.60'’* I I 8.65a 128.92+ 11.26' 117.45+ I 7.44' 12.24+ 10.86' 2 1.4lz0.l 8' Lo I 45+0.41 17.15+ 12.48 ' 1.21+0.33* Lt› 138.80a 14.12 '’2 128.16a 12.16' l TO.l 22 ' p