Chiết tách và phân lập hợp chất polyphenol ( annonaceous acetogenin) có trong vỏ mãng cầu ta ( annona squamosa l )

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT POLYPHENOL (ANNONACEOUS ACETOGENIN) CÓ TRONG VỎ QUẢ MÃNG CẦU TA (ANNONA SQUAMOSA L.) Mã số đề tài: 194.TP05 Chủ nhiệm đề tài: LÊ HOÀNG HUY Đơn vị thực hiện: VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2019 LỜI CÁM ƠN Để thực hoàn thành đề tài này, nỗ lực thành viên nhóm, nhận hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện từ nhà trường quý thầy cô Đề tài hoàn thành dựa tham khảo, học hỏi kinh nghiệm từ kết nghiên cứu liên quan, tạp chí chuyên ngành nhiều tác giả nước nước Trước hết, xin chân thành cảm ơn trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện sở vật chất cho suốt q trình thực đề tài Đồng thời chúng tơi xin cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm tận tình giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm thực tiễn quý báu thời gian học tập rèn luyện trường Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Nguyễn Thị Ngần Th.S Nguyễn Thị Trang đồng hướng dẫn, tận tình dạy, giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm cho chúng tơi q trình nghiên cứu Qua đó, chúng tơi học hỏi nhiều kiến thức bổ ích kỹ làm việc tinh thần, thái độ nghiên cứu nghiêm túc, đạt hiệu quả, điều cần thiết cho chặng đường học tập làm việc sau Bên cạnh đó, chúng tơi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô tạo điều kiện thuận lợi phịng thí nghiệm, dụng cụ, hóa chất thiết bị để chúng tơi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường Mặc dù có cố gắng, nỗ lực làm việc nhóm, khơng thể tránh khỏi thiếu sót nghiên cứu lần đầu, chúng tơi kính mong q thầy đóng góp ý kiến để đề tài hồn thiện Chúng tơi xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm 2019 Nhóm đề tài PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Chiết tách phân lập hợp chất polyphenol (annonaceous acetogenin) có vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) 1.2 Mã số: 194.TP05 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Lê Hoàng Huy Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài Huỳnh Minh Nhựt Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài Lý Ngọc Hồng Nhung Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài Nguyễn Thị Trang Trường ĐHCN Cố vấn Nguyễn Thị Ngần Trường ĐHCN Cố vấn 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 01 năm 2019 đến tháng 12 năm 2019 1.5.2 Gia hạn (nếu có): Khơng gia hạn 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 01 năm 2019 đến tháng 12 năm 2019 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Bổ sung quy trình phân tách hợp chất Annonaceous Acetogenin sản phẩm đề tài 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: Năm triệu đồng II Kết nghiên cứu 2.1 Đặt vấn đề Mãng cầu ta có tên khoa học Annona squamosa L., loại trái phổ biến vùng nhiệt đới, có Việt Nam Mãng cầu ta có hương vị thơm ngon, bổ dưỡng thường dùng để ăn, làm sinh tố, yaourt sản phẩm chế biến khác như: rượu vang, nướp ép,… Đa phần vỏ hạt mãng cầu ta thường bỏ số dùng để làm phân bón hữu cho trồng Chính mà lượng phế phụ phẩm thải từ mãng cầu ta lớn gây ô nhiễm môi trường Theo Feras Q Alali, Xiao-Xi Liu, & McLaughlin (1999), thành phần thuộc mãng cầu ta thịt quả, hạt, vỏ thân cây, vỏ có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả chống vi khuẩn, kháng oxy hóa, … có lợi cho sức khỏe người Theo Pandey & Barve(2011), vỏ mãng cầu ta có chứa hợp chất phytochemical alkaloid, tannin, protein, saponin, flavonoid đặc biệt polyphenol Việc nghiên cứu tìm hợp chất tự nhiên có ích cho thể, có hoạt tính kháng oxy hóa từ thực vật, có vai trị quan trọng sức khỏe người ngành y dược học ngày xã hội quan tâm Nhận thức loại nguyên liệu rẻ tiền có giá trị mặt dược liệu nước ta chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu mãng cầu ta thu nhận hợp chất polyphenol từ Vì vậy, thực đề tài “Chiết tách phân lập hợp chất polyphenol (Annonaceous Acetogenin) có vỏ mãng cầu ta ( Annona Squamosa L.)” để thu nhận hợp chất polyphenol mãng cầu ta phục vụ cho nghiên cứu sau Với việc sử dụng vỏ mãng cầu ta, chúng tơi mong muốn góp phần việc tìm kiếm, bổ sung thêm nguồn ngun liệu cho q trình trích ly chất có hoạt tính sinh học, khai thác có hiệu nguồn phụ phế phẩm, góp phần làm giảm ô nhiễm bảo vệ môi trường sống 2.2 Mục tiêu a) Mục tiêu tổng quát Chiết tách phân lập hợp chất Annonaceous Acetogenin có vỏ mãng cầu ta (Annona Squamosa.L) b) Mục tiêu cụ thể: - Chiết xuất cao ethanol từ vỏ mãng cầu ta - Phân lập tinh hợp chất Annonaceous Acetogenin có vỏ mãng cầu ta - Xác định cấu trúc thành phần tách chiết 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Lấy xử lý mẫu Quả mãng cầu ta thu hái tỉnh Tây Ninh vào tháng - Quả rửa bóc lấy vỏ Sau đem vỏ sấy khô nhiệt độ 50-60oCvà nghiền mịn thành bột Mẫu bảo quản điều kiện nhiệt độ thường, để nơi khơ thống mát, tránh ánh nắng trực tiếp 2.3.2 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc chất phân lập 2.3.2.1 Chiết xuất Việc chiết xuất mẫu dựa vào phương pháp chiết ngâm dầm:Ngâm bột vỏ sau nghiền vào bình chứa thủy tinh, có nắp đậy Rót dung mơi tinh khiết vào bình xấp xấp bề mặt lớp bột Giữ yên nhiệt độ phòng, ngâm - 10 ngày, dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật hòa tan hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết lọc qua giấy lọc thu hồi dung môi thiết bị cô quay chân không nhiệt độ 35-40oC, ta thu cao tổng mẫu Việc chiết mẫu lặp lại chiết kiệt mẫu.Để nhận biết kiệt mẫu hay chưa sử dụng phương pháp sắc ký mỏng 2.3.2.2 Phân lập xác định cấu trúc Để phân tích phân tách phân lập hợp chất, sử dụng phương pháp sắc ký như: - Sắc ký mỏng (TLC) - Sắc ký cột thường (CC) Cơ sở để tiến hành tách chiết: dựa vào phương pháp GC-AS để dò phân đoạn giàu hợp chất Annonaceous Acetogenin, sau tiến hành tách chiết phân lập hợp chất cách chuẩn xác tiết kiệm thời gian 2.4 Tổng kết kết nghiên cứu Phương pháp chiết phân đoạn áp dụng để làm giàu acetogenin ASE-1 Hiệu quy trình chiết phân đoạn đánh giá sử dụng phổ 1H-NMR.ASE-1, 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), cho thấy tín hiệu δH 0.85 1,2 đến 1.6, tương ứng với methyl cuối mạch tín hiệu methylene chuỗi dài Tín hiệu vịng α, β- unsaturatedγ-lacton δH 6,96/7,17 (1H, H33/35), 5.09/5.10 (1H, H-34/36) vịng mono-THF với một/ hai tín hiệu hydroxyl nằm bên sườn δH 3.76/3.81 3.37/3.44 phát Những tín hiệu phân biệt tín hiệu đặc trưng acetogenin, phát phổ 1H-NMR ASE Những phát rõ ràng chứng minh hiệu cách thức chiết phân đoạn phát triển để làm giàu acetogenin ASE phân đoạn ASE-3 Hình I.1: Phương pháp GC-AS NMR ASE-1 - Tách xác định hợp chất acetogenin từ phân đoạn ASE-1 Từ phân đoạn giàu acetogenin ASE3, phương pháp sắc kí, thu hợp chất A chất bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 30-330C Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS) cho pic ion phân tử m/z 622 tương ứng với công thức phân tử C37H66O7 Phổ 1H NMR A, cho thấy tín hiệu δH 0.85 (t) 1,2 đến 1.6, tương ứng với metyl cuối mạch tín hiệu metylen chuỗi dài Tín hiệu vịng lacton vị trí , β δH 7.34 (1H, H-35), 5.06 (1H, H-36) tín hiệu vịng THF với hai tín hiệu hydroxyl nằm bên sườn δH 3.63 3.71 phát Những tín hiệu phân biệt tín hiệu đặc trưng acetogenin Phổ 13 C-NMR DEPT, cho thấy tín hiệu 37 cacbon có cacbonyl (173,3), cacbon olefinic (132,0; 151,2), 24 cacbon metylen, cacbon metyl (13,9; 18,9), cacbon metin Từ số liệu phổ EI-MS, 1H-, 13C-NMR, DEPT so sánh với tài liệu [Qin Y P., Pan X P Chen R Y., Yu D Q (1996), Acta Pharm Sin, 31, 381 – 386 ]cho phép xác định hợp chất A Uvarigrandin A Hợp chất lần phân lập từ rễ loài Uvari grandiflora HO O O HO OH O O Uvarigrandin A 2.5 Đánh giá kết đạt kết luận Qua trình nghiên cứu thực đề tài, chiết tách phân lập hợp chất Annonaceous Acetogenin có vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) phương pháp GC-AS kết hợp với sắc kí mỏng sắc kí cột hở để tìm hợp chất Annonaceous Acetogenin Cuối cùng, sử dụng phương pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC để xác định cấu trúc hợp chất tách Các kết phổ cho phép khẳng định hợp chất Annonaceous Acetogenin Uvarigrandin A 2.6 Tóm tắt kết Tóm tắt Mục đích báo cáo chiết tách hợp chất acetogenin, hợp chất có tính chống oxy hóa ứng dụng bảo quản thực phẩm - Mẫu vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) chiết xuất ethanol (ASE), sử dụng dung môi khác để thu phân đoạn chiết - Phân tích dịch chiết ethanol phân đoạn chiết phương pháp GC-AS xác định phân đoạn giàu Acetogenin ASE-3 ASE-32 xác định Acetogenin phân đoạn - Từ dịch chiết phân đoạn ASE phương pháp sắc ký phân lập hợp chất Annonaceous Acetogenin - Sử dụng phương pháp phổ khối lượng (EI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC để xác định cấu trúc hợp chất tách Các kết phổ cho phép khẳng định Annonaceous Acetogenin Uvarigrandin A - Đây hợp chất có tính chống oxi hóa cao, có khả ứng dụng bảo quản thực phẩm, thuốc diệt côn trùng,… Abstract The purpose of this research is to extract acetogenin, an antioxidant that can be used in food storage - The peel sample of custard apple fruit (Annona squamosa L.) is extracted with ethanol (ASE), using different solvents to collect the extraction fraction - Analysis of ethanol extract and extraction fractions by GC-AS method determined the Acetogenin-rich segment in ASE-3 as ASE-32 and identified the main Acetogenin in this segment - From the extract of ASE fraction by chromatographic methods, a major Annonaceous Acetogenin was isolated - Using mass spectrometry methods (EI-MS), nuclear resonance spectra from 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC to determine the structure of separable compounds The spectroscopic results that have confirmed Annonaceous Acetogenin are Uvarigrandin A - This is a compound with high antioxidant properties, capable of application in food preservation, insecticides, Hình 3.7: Phổ 1H-NMR hợp chất A Hình 3.8: Phổ 13C-NMR hợp chất A 51 Hình 3.9: Phổ 13C-NMR hợp chất A Hình 3.10: Phổ 13C-NMR hợp chất A 52 Hình 3.11: Phổ DEPT hợp chất A Hình 3.12: Phổ DEPT hợp chất A 53 Hình 3.13: Phổ HSQC hợp chất A 54 Hình 3.14: Phổ HSQC hợp chất A 55 Hình 3.15: Phổ HSQC hợp chất A 56 Hình 3.16: Phổ HMBC hợp chất A 57 Hình 3.17: Phổ HMBC hợp chất A 58 Hình 3.18: Phổ HMBC hợp chất A 59 Hình 3.19: Phổ HMBC hợp chất A 60 IV Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận - Mẫu vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) chiết xuất ethanol (ASE), sử dụng dung môi khác để thu phân đoạn chiết - Phân tích dịch chiết ethanol phân đoạn chiết phương pháp GC-AS xác định phân đoạn giàu Acetogenin ASE-3 ASE-32 xác định Acetogenin phân đoạn - Từ dịch chiết phân đoạn ASE phương pháp sắc ký phân lập hợp chất Annonaceous Acetogenin - Sử dụng phương pháp phổ khối lượng (EI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC để xác định cấu trúc hợp chất tách Các kết phổ cho phép khẳng định Annonaceous Acetogenin Uvarigrandin A - Đây hợp chất có tính chống oxi hóa cao, có khả ứng dụng bảo quản thực phẩm, thuốc diệt côn trùng 4.2 Kiến nghị Quá trình nghiên cứu thực quy mơ phịng thí nghiệm nên tồn nhiều khăn vấn đề máy móc, thiết bị thời gian nghiên cứu hạn chế Do đó, chúng tơi xin đưa số kiến nghị sau: - Nghiên cứu thêm số phương pháp tách chiết khác - Đánh giá khả chống oxi hóa hợp chất Annonaceous Acetogenin Uvarigrandin A thu nhận - Nghiên cứu ứng dụng hợp chất Annonaceous Acetogenin Uvarigrandin A việc bảo quản thực phẩm - Ngồi cịn áp dụng quy trình để tách chiết hợp chất khác có vỏ mãng cầu ta để đánh giá khả dược liệu nguồn phế liệu 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Araya, H.,Studies on annonaceous tetrahydrofuranic acetogenins from Annona squamosa L seeds, Bull Nat Inst Agro-Environ Sci 23: 77–149, 2004 [2] Araya, H., M Sahai, S Singh, A.K Singh, M Yoshida, N Hara and Y Fujimoto,Squamocin-O-1 and squamocin-O-2, new adjacent bis-tetrahydrofuran acetogenins from the seeds of Annona squamosa, Phytochemistry 61: 999–1004, 2002 [3] Chen, Y., J.W Chen and X Li,Cytotoxic bistetrahydrofuran annonaceous acetogenins from the seeds of Annona squamosa, J Nat Prod 74: 2477–2481, 2011b [4] Chen, Y., J.W Chen and X Li,Monotetrahydrofuran annonaceous acetogenins from the seeds of Annona squamosa, Phytochem Lett 5: 33–36, 2012a [5] Chen, Y., J.W Chen, J.H Zhai, Y Wang, S.L Wang and X Li,Antitumor activity and toxicity relationship of annonaceous acetogenins, Food Chem Toxicol 58: 394–400, 2013 [6] Dang, Q.L., W.K Kim, C.M Nguyen, Y.H Choi, G.J Choi, K.S Jang, M.S Park, C.H Lim, N.H Luu and J.C Kim,Nematicidal and antifungal activities of annonaceous acetogenins from Annona squamosa against various plant pathogens, J Agric Food Chem 59: 11160–11167, 2011 [7] Hopp, D.C., F.Q Alali, Z.M Gu and J.L McLaughlin,Three new bioactive bisadjacent THF-ring acetogenins from the bark of Annona squamosa, Bioorg Med Chem 6: 569–575, 1998 [8] Jayendra, M and Y Kumar,New compound 6,7-dimethoxy-2-methylisoquinolinium from Indian medicinal plant Annona squamosa L, Int J Chem Anal Sci 4: 161– 168, 2013 [9] Li, X., X.L Chen, J.W Chen and D.D Sun,Annonaceous acetogenins from the seeds of Annona squamosa,Chem Nat Compd 46: 101–105, 2010 62 [10] Liaw, C.C., Y.L Yang, M Chen, F.R Chang, S.L Chen, S.H Wu and Y.C Wu,Mono-tetrahydrofuran annonaceous acetogenins from Annona squamosa as cytotoxic agents and calcium ion chelators, J Nat Prod 71: 764–771, 2008 [11] Mazahery, A.R.F., R.P Dator, G.P Concepcion and S.D Jacinto,Murihexocin C from the leaves of Annona squamosa Linn induces apoptosis in human colon carcinoma Col cell line, Philipp Agric Sci 92: 122–132, 2009 [12] Miao, Y.J., X.F Xu, F Yuan, Y.Y Shi, Y Chen, J.W Chen and X Li,Four cytotoxic annonaceous acetogenins from the seeds of Annona squamosa, Nat Prod Res 30: 1273–1279, 2015 [13] Ndob, I.B.B., P Champy, C Gleye, G Lewin and B Akendengue,Annonaceous acetogenins: Precursors from the seeds of Annona squamos, Phytochem Lett 2: 72–76, 2009 [14] Oberlies, N.H., C.J Chang and J.L McLaughlin,Structure-activity relationships of diverse annonaceous acetogenins against multidrug resistant human mammary adenocarcinoma (Mcf-7/ Adr) cells, J Med Chem 40: 2102–2106, 1997 [15] Rahman, M.M., S Parvin, M.E Haque, M.E Islam and M.A Mosaddik,Antimicrobial and cytotoxic constituents from the seeds of Annona squamosa, Fitoterapia 76: 484–489, 2005 [16] Tormo, J.R., T Gallardo, R Aragón, D Cortes and E Estornell,Specific interactions of monotetrahydrofuranic annonaceous acetogenins as inhibitors of mitochondrial complex I, Chem Biol Interact 122: 171–183, 1999 [17] Xu, S.S., X Li, J.W Chen and Y Chen,Chemical constituents from seeds of Annona squamosa, Chin Trad Herbal Drugs 43: 255–258, 2012 [18] Yang, H.J., X Li, N Zhang, J.W Chen and M.Y Wang,Two new cytotoxic acetogenins from Annona squamosa, Journal of Asian Natural Products Research 11: 250–256, 2009b [19] Yu, J.G., X.Z Luo, L Sun, D.Y Li, W.H Huang and C.Y Liu,Chemical constituents from the seeds of Annona squamosa, Acta Pharm Sin 40: 153–158, 2005 63 [20] Yuan, F., G.G Bai, Y Chen, Y.J Miao, J.W Chen and X Li,Structure-activity relationships of diverse acgs against multidrug resistant human lung cancer cell line A549/Taxol, Bioorg Med Chem Lett 25: 787–790, 2015 [21] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2007, Chương 1, Trang 28 – 33 (lỏng lỏng) [22] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2007, Chương 1, Trang 35 – 36 (ngâm dầm) [23] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2007, Chương 3, Trang 151 – 160.(cột) [24] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2007, Chương 3, Trang 160 – 161.(bản mỏng) [25] Trần Đình Thắng, Hợp chất thiên nhiên, Nhà xuất Đại học Vinh, 2016, Trang – [26] A C de Q Pinto, Annona species, First published by: International Centre for Underutilised Crops, University of Southampton, Southampton, SO17 1BJ, UK, 2005 64 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mơ hình .) 65 ... nhận hợp chất polyphenol từ Vì vậy, chúng tơi thực đề tài ? ?Chiết tách phân lập hợp chất polyphenol (Annonaceous Acetogenin) có vỏ mãng cầu ta ( Annona Squamosa L.)? ?? để thu nhận hợp chất polyphenol. .. cứu thực đề tài, chiết tách phân lập hợp chất Annonaceous Acetogenin có vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) phương pháp GC-AS kết hợp với sắc kí mỏng sắc kí cột hở để tìm hợp chất Annonaceous Acetogenin... tài: Chiết tách phân lập hợp chất polyphenol (annonaceous acetogenin) có vỏ mãng cầu ta (Annona squamosa L.) 1.2 Mã số: 194.TP05 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học