Trong phạm vi luận văn của mình, tôi sẽ trình bày về “Thu nhậnglycosaminoglycans GAGs bang xúc tác thủy phân bởi enzyme Protamex vàtỉnh sạch” với mong muốn hoàn thành quy trình thu nhận
CΨ-C
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nguyên liệu 3.1.1 Sụn khí quản gà Nguyên liệu sụn khí quản gà được mua tại Công ty TNHH Phạm Tôn, Quận
Gò Vấp, TP HCM Sụn được xử lý sơ bộ loại bỏ mỡ, da, máu và bụi bắn, sau đó sụn được bảo quản lạnh đông ở —18°C [53].
Protamex” là chế phẩm enzyme thương mại của hãng Novozymes-Dan Mach và được phân phối bởi công ty Brentag Việt Nam, tại địa chỉ số 202 Hoàng Văn Thu, phường 9, quận Phú Nhuận, thành phố Hỗ Chí Minh.
Chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng là 518 U/g protein, dạng rắn, màu nâu.
Enzyme Protamex” được bảo quản mát trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 2 — 8°C và được kiểm tra hoạt tính định kỳ mỗi thang để kiểm tra sự thay đổi hoạt tính của chế phẩm enzyme theo thời gian.
3.1.3 Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu được thể hiện trong bảng sau
Bang 3.1 Hóa chất sử dung trong quá trình nghiên cứu S | Tên hóa chất Nơi sản xuất l Sodium - chondroitin sulphate Sigma-Aldrich, My 2 1,9 — Dimethyl methylene blue Sigma-Aldrich, My
3 (NH.a)2SO4 Trung Quốc 4 HCl Trung Quốc
5 NaCl Merck, Duc 6 Glycine Merck, Đức 7 Ethanol Viet Nam
8 Na;HPOx.I2H›0 Trung Quốc9 NaH;POx.7H;0 Trung Quốc l TCA ( axít trichloacetic) Trung Quốc
3.2 Thiét bi Bên cạnh những dụng cụ thí nghiệm thông thường có xuất xứ từ Trung Quốc như erlen, ống dong, bình định mức, pipette thủy tinh, ống nhỏ giọt, cục bóp cao su, , bảng 3.2 trình bày một số thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.2 Bảng thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu STT Tên dụng cụ, thiết bị
1 Bép dién tir 2 Bê điều nhiệt 3 May lac 4 Tủ say 5 pH ké 6 May quang phô UV-VIS
8 Cân điện tử 2 và 4 số lẻ
9 Tủ đông10 Tu lanhII Micropipette
3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Quy trình thu nhận glycosaminoglycans (GAGs)
Xử lý sụn Fa Ỷ Cat nhỏ Ỷ
Hình 3.1 Quy trình thu nhận GAGs
* Thuyết minh quy trình e Làm sạch
- Mục đích: Loại bỏ đi những tạp chất, mô mỡ, máu còn bám dính trên khí quản.
- Thuc hiện: Nguyên liệu sau khi được mua về, tiễn hành loại bỏ các mạch máu, mỡ bám bên ngoài, rửa nhanh với dung dịch muối 3%, để ráo và bảo quản lạnh đông ở -18°C. e Chan - Mục dich: làm mềm cau trúc sun, các lớp mang, mỡ đông tụ, giúp thuận lợi cho quá trình xử lý nguyên liệu.
- Thực hiện: Gia nhiệt nước, cho nguyên liệu vào với tỉ lệ cố định tiễn hành chân Sau đó làm nguội để chuẩn bị cho quá trình tiếp theo.
- Các điều kiện khảo sát: Nhiệt độ và thời gian quá trình chân. e Xứ lý nguyên liệu
- Mục đích: loại bỏ màng protein, chất béo Chia nhỏ ống sụn gà với các kích thước phù hợp dé thuận lợi cho quá trình khảo sát.
- Thực hiện: Thủ công, dùng dao cat sun ra thành những mẫu có kích thước mong muốn.
- Điều kiện khảo sát: Khảo sát kích thước ống khí quản. e Thúy phân - Mục đích: thu nhận GAGs có trong sụn khí quan gà.
- Thực hiện: Quá trình thủy phân được thực hiện trong bé điều nhiệt có kết hợp lac đảo 120 vòng/phút nhăm tăng khả năng xúc tác giữa enzyme va cơ chat cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn.
- Các điều kiện khảo sát: Tỷ lệ sụn:đệm, pH, nhiệt độ, hàm lượng enzyme/cơ chất, thời gian quá trình thủy phân. e Vô hoạt enzyme
- Mục đích: Kim hãm sự hoạt động của enzyme nhằm tránh các biến đối diễn ra sau thủy phan.
- Thực hiện: Dun cách thủy các mẫu thủy phân ở nhiệt độ 85°C trong vòng 10 phút. e Kết tủa - Mục đích: Loại bỏ lượng protein hòa tan trong mẫu nguyên liệu, tinh sạch hàm lượng GAGs hơn.
- Thực hiện: Dùng TCA/(NH,4)2SQO, tủa protein hòa tan ở ở 4C, qua đêm - Điều kiện khảo sát: Nông độ TCA/hàm lượng (NHa¿);SO¿,. e Loc
- Mục đích: Loại bỏ bã sau quá trình tua protein.
- Thực hiện: Dùng giấy lọc kích thước 15 — 20 pm, thiết bị lọc chân không với máy hút chân không. e Tham (ích - Mục đích: Tang độ tinh sạch cho chế phẩm GAGs, loại bỏ các chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn 14kDa như axít amin, chất khoáng, muối, TCA có trong mẫu ra ngoài.
- Thực hiện: Cho mẫu vào túi cellophane, đặt vào trong cốc nước cất dé 4 tiếng, mỗi tiếng thay nước một lần Quá trình diễn ra trong điều kiện nhiệt độ 4°C e Tủa côn - Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình sấy tiếp theo.
- Thực hiện: Dùng ethanol (80%) cho vào mẫu theo tỉ lệ khảo sát, để qua đêm ở 5°C, gan dung dịch và ethanol thu được dịch keo. e Say - Mục đích: Thu nhận chế phẩm GAGs dạng bột.
- Thực hiện: Dịch keo được cho vào tủ sây ở 45°C và thu bột GAGs.
Hàm lượng các thành phân hóa học của sụn khí quản gà Độ am
` cố : ơơ Protein Phân tích thành phân của sụn Lipid khí quản gà Tro
Xác định hoạt tinh enzyme ) protamex
Khảo sát quá trình xử lý - nhiệt độ ls nguyên liệu trước thủy phan Kích thước sụn khí quản VE ilé sụn:đệm _J
Hiệu suất thu nhận GAGs cao nhât
Khảo sát điều kiện thủy phân Tối ưu hóa điều kiện thủy phân
- Thời gian thủy phân - Tôi ưu hóa điêu kiện
Khảo sát quá trình kết tủa thay phan
Hiệu suất thu nhận GAGs cao nhât y,
> Hiệu suất thu nhận GAGs ứ cao nhât
Khao sát quá trình thẩm tích Thời gian thâm tích H Hiệu suất thu nhận GAGs cao nhât
Khảo sát quá trình tủa côn Tỉ lệ dung dịch: côn "| Hiệu suất thu nhận GAGs cao nhât
Khao sat thoi gian bao quan nguyén liéu Thời gian cap đông >} Hiệu suất thu nhận GAGs cao nhât
Hình 3.2 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận GAGs
3.3.3 Bo trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khao sát ảnh hưởng nhiệt độ chan khí quản gà đến Họac; % thô
Yếu tố khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Tỉ lệ sụn: đệm Kích thước sụn pH
Hàm lượng enzyme/ cơ chất
Yéu tổ thay doi Nhiệt độ chân (°C) 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 Chỉ tiêu đánh gia Hiệu suất thu hôi % GAGs thô
Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian chan ảnh hưởng đến Hgac, % thô
Yếu tố khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Tỉ lệ sụn: đệm Kích thước sụn pH
Hàm lượng enzyme/ cơ chất
Kết quả từ thí nghiệm 1
Yéu tổ thay doi Thoi gian chan (phut) 3, 5, 10, 15, 20, 30 (phút)Chỉ tiêu đánh giá Hiệu suất thu hồi % GAGs thô
Thí nghiệm 3: Xác định kích thước sụn thích hợp cho quá trình thủy phân
Yếu tố khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Nhiệt độ chan Thời gian chân
Tỉ lệ sụn: đệm pH
Hàm lượng enzyme/cơ chất
Nhiệt độ thủy phân Thời gian thủy phân
Kết quả từ thí nghiệm 1 Kết quả từ thí nghiệm 2
Yéu tổ thay doi Kích thước sụn (mm) < 2,5; 2,5; 5; 10; 20 (mm) Chỉ tiêu đánh giá Hiệu suất thu hôi % GAGs thô
Thí nghiệm 4: Xác định tý lệ sụn : đệm ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Yếu tô khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Nhiệt độ chan Thời gian chân
Hàm lượng enzyme/cơ chất
Kết quả từ thí nghiệm 1 Kết quả từ thí nghiệm 2 Kết quả từ thí nghiệm 3
Yéu tổ thay doi Tỉ lệ sụn:đệm (w/v)
1:10; 1:12Chỉ tiêu đánh gia Hiệu suất thu hôi % GAGs thô
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi GAGs thô.
Yếu tổ khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Nhiệt độ chân Kết quả từ thí nghiệm 1 Thời gian chân Kết quả từ thí nghiệm 2 Kích thước sụn Kết quả từ thí nghiệm 3
Tỉ lệ sụn:đệm Kết quả từ thí nghiệm 4 Yếu tổ cố định ,
Ham lượng enzyme/ co chat | 3,6 U/g
Thời gian thủy phân 180 phút
Thời gian thâm tích 240 phút Yéu tổ thay đối | pH 5,0: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5: 8,0
` Hiệu suat thu hồi % GAGs thô giá
Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs thô.
Yếu tổ khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Nhiệt độ chan Kết quả từ thí nghiệm 1 Thời gian chan Kết quả từ thí nghiệm 2 Kích thước sụn Kết quả từ thí nghiệm 3 ơ Tỉ lệ sụn: đệm Kết quả từ thớ nghiệm 4
Yêu tô cô định „ pH Kêt quả từ thí nghiệm Š
Hàm lượng enzyme/ cơ chất | 3,6 U/g
Thời gian thủy phân 180 phút
Thời gian thắm tích 240 phútYếu tố thay đổi | Nhiệt độ CC) 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70Chỉ tiêu đánh giá | Hiệu suất thu hồi % GAGs thô
Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme trong quá trình thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs thô
Yếu tổ khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Nhiệt độ chân Kết quả từ thí nghiệm 1 Thời gian chan Kết quả từ thí nghiệm 2 Kích thước sụn Kết quả từ thí nghiệm 3 ơ Tỉ lệ sụn: đệm Kết quả từ thớ nghiệm 4
Yêu tô cô định „ pH Kêt quả từ thí nghiệm 5
Nhiệt độ thủy phân Kết quả từ thí nghiệm 6
Thời gian thủy phân 180 phút
Thời gian thắm tích 240 phút Yếu tố thay đối | Hàm lượng enzyme/cơ chất |0; 1,2; 2.4; 3,6; 4,8; 6 (U/g) Chỉ tiêu đánh giá | Hiệu suất thu hồi % GAGs thô
Thí nghiệm 8: Khao sát ảnh hưởng của thời gian trong quá trình thủy phân đến hiệu suất thu hồi GAGs thô
Yếu tổ khảo sát Thí nghiệm trên sụn
Nhiệt độ chân Kết quả từ thí nghiệm 1 Thời gian chan Kết quả từ thí nghiệm 2 Kích thước sụn Kết quả từ thí nghiệm 3 ơ Tỉ lệ sụn: đệm Kết quả từ thớ nghiệm 4
Yêu tô cô định „ pH Kêt quả từ thí nghiệm 5
Nhiệt độ thủy phân Kết quả từ thí nghiệm 6 Hàm lượng enzyme/cơ chất | Kết quả từ thí nghiệm 7 Thời gian thắm tích 240 phút
Yếu tố thay đổi | Thời gian thủy phân (phút) "
Chỉ tiêu đánh giá | Hiệu suất thu hồi % GAGs thô
Thí nghiệm 9: Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân sụn khí quản gà Bốn yếu tổ tối ưu hóa là pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân.
Quá trình tối ưu hóa các yếu tố được thực hiện bằng phương pháp đáp ứng bề mặt và phan mềm modde 5.0 với hàm mục tiêu là % GAGs Giá trị ở tâm và các bước nhảy được chọn như sau:
Bang 3.3 Giá trị tam và bước nhảy trong thí nghiệm toi wu hóa điều kiện thủy phân sụn khí quản gà
Yêu tổ khảo sát Giá trị tâm Bước nhảy pH 6 0,5 Nhiệt độ 50°C 5°C Nong độ enzyme 3,6 U/g 1,2 U/g
Phần mềm Modde 5.0 sẽ cho ra bảng quy hoạch thực nghiệm 4 yếu tổ khảo sát với 7 điểm tâm và bồ trí 31 nghiệm thức như sau:
Bảng 3.4 Bảng quy hoạch thực nghiệm 4 yếu to khảo sát với 7 điểm tâm và 31 nghiệm thức STT ` X¿ X3 Xu
Trong đó: xị, Xa, Xa, Xa là 4 yếu tố khảo sát “0” là gia tri tâm tìm được ở các thí nghiệm, “-1” “+1” là các giá trị biên, “-œ” “+a” được xác định dựa vào quy tac đòn bay. Đề đánh giá mức độ tin cậy của mô hình thi nghiệm, hai giá tri dùng dé đánh giá là R” và Q” Khi R* > 0,8 va QÝ > 0.5 thì các giá trị hồi quy có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy Phương trình hồi quy được biểu diễn như sau:
Hoacs % = ao + A1Xq + ¿X2 + A3X3 + 84Xa + A12X1X¿ + 812XIXs + A14XIXa + A23X2X3 +
424X2Xa + AZ4X3X4+ địi XỊ + 422 Xq + A33 XZ + địa Xã
Các biên Xi, Xa, Xa, Xa tim được trong Modde 5.0 là các biên mã hóa Vì vậy, các biên này cần chuyền sang biên thực theo công thức i=————— i= 1,2,3, ,kyo )
Trong do: max min max min X, — xX, %, + %X,
Z¡: giá trị thực của yếu tố khảo sát
“i: giá trị mã hóa của yếu tô khảo sát
KET QUÁ VA BAN LUẬN
4.1 Xác định thành phan của nguyên liệu sun khí quan gà Sụn khí quản gà sau khi mua từ Công ty TNHH Phạm Tôn có khối lượng trung bình mỗi ống sụn khoảng 1,4 -1,7g Tiến hành xử lý loại bỏ các mô, mỡ, máu và lớp màng bao bọc bên ngoài, thu được ống sụn có khối lượng khoảng 1-14g Vì vậy, Ong sụn sau khi làm sạch có phan trăm khối lượng so với nguyên liệu sụn khí quản ban dau là 68-70% Sau đó, tiến hành phân tích thành phan hóa học ống sụn.
Kết quả phân tích thành phần của nguyên liệu khí quản gà được trình bày trong bảng sau:
Bang 4.1 Thành phan của nguyên liệu khí quan gà
Hàm lượng protein tổng 11,6+0,21 Hàm lượng chat béo thô 0.8+0.34
Hàm lượng tro 0 ,42+0,12 Độ âm 82.4+1,12' Hàm lượng carbohydrate tông” 4;78+0,35
(' Giá trị chính + SD; ˆ 100-(4m+protein+lipid+tro)).
Theo kết quả ở bảng 4.1, nguyên liệu khí quản có độ âm cao 82,4% là điều kiện tốt để vi sinh vật phát triển nên cần chú ý việc bảo quản nguyên liệu trong suốt thời gian thí nghiệm Bên cạnh dé, tuy đã xử lý loại bỏ béo sụn khí quản trước khi tiễn hành thí nghiệm nhưng ham lượng béo thô vẫn còn khá cao 0.8% điều này có thể ảnh hưởng đến việc chất béo nguyên liệu sẽ bị ôi hóa, oxy hóa nguyên liệu trong quá trình xử lý làm ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân sụn khí quản [39| Do đó, nguyên liệu sau khi loại bỏ các màng mỡ, chất béo, phải được bảo quản lạnh đông ở -18°C.
4.2 Khao sát anh hướng thời gian bao quan nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi GAGs thô
Thí nghiệm được thực hiện với nguyên liệu khí quản gà, một phụ phẩm sau quá trình giết m6, đòi hỏi phải được lưu trữ trong điều kiện và thời gian bảo quản hợp lý tránh làm hư hỏng và ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Kết quả khảo sát được biéu diễn trong hình 4.1
Thời gian bảo quản nguyên liệu (ngày) t thu hồi GAGs (%) z A éu sua
Hình 4.1 Anh hưởng thời gian bao quan đến hiệu suất thu hồi GAGs Theo kết quả thu được từ hình 4.1 ta thấy thời gian bảo quản lạnh đông nguyên liệu khí quản càng lâu thì ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi GAGs càng nhiều Cụ thể nếu bảo quản nguyên liệu trong 60 ngày, 90 ngày thì hiệu suất thu hồi GAGs giảm còn 9,21 + 0,09 % và 7,76 + 0,5 % Tuy nhiên, nêu bảo quản trong khoảng thời gian ngăn trong vòng 20 ngày thi thời gian bảo quản ảnh hưởng không đáng kế (20 ngày với hiệu suất 10,74 + 0,08 %).
Trong suốt quá trình lạnh đông, dưới tác dụng của nhiệt độ gây tốn hại đến tế bào, làm mất nước và gây hư hỏng cau trúc của khí quản trong quá trình rã đông [68] Do đó, thời gian bảo quản nguyên liệu càng dài, hiệu suất thu hồi GAGs càng giảm.
Kết luận: Kết quả thí nghiệm trên cho thay thời gian bao quản nguyên liệu lạnh đông tốt nhất trong vòng 20 ngày ở nhiệt độ -18°C.
4.3 Khao sát các yếu tô anh hưởng đến quá trình thủy phân Với mục đích khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân (nhiệt độ chan, nhiệt độ thủy phân, thời gian chan, thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, ) để đạt được hiệu suất thu hồi glycosaminoglycans cao nhất Thực hiện các bước theo quy trình thí nghiệm ở hình 3.1 và kết quả thí nghiệm được trình bày như sau:
Ghi chú: các giá trị biểu diễn là trung bình của ba lần lặp lại + độ lệch chuẩn.
Các giá trị nghiệm thức có cùng kí tự thì không có sự khác biệt có ý nghĩa về thống kê với mức ý nghĩa p