Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein từ rong Chaetomorpha sp. bằng enzyme protamex và flavourzyme

Nghiên cứu này được thực hiện để khảo sát quá trình thủy phân protein của rong Chaetomorpha sp. bằng 2 loại chế phẩm protease. Tiến hành thủy phân nhằm đánh giá các ảnh hưởng của nồng độ enzyme cơ chất (0 đến 1U/g đối với Protamex và 0 đến 500U/g đối với Flavourzyme), pH môi trường (từ 5 đến 9), nhiệt độ (từ 40 đến 650C) và thời gian thủy phân (từ 0 đến 4h) đến mức độ thủy phân và hoạt tính sinh học của peptide tạo thành.

Kỷ yếu hội thảo khoa học – Phân ban Công nghệ thực phẩm KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ RONG CHAETOMORPHA SP BẰNG ENZYME PROTAMEX VÀ FLAVOURZYME Thiều Thị Xuân Diệu1,*, Nguyễn Thúy Hồng1, Đào Thị Tuyết Mai1, Trần Chí Hải1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Tp Hồ Chí Minh * Email: xuandieuthieu@gmail.com Ngày nhận bài: 15/6/2017; Ngày chấp nhận đăng: 2/7/2017 TÓM TẮT Nghiên cứu thực để khảo sát trình thủy phân protein rong Chaetomorpha sp loại chế phẩm protease Tiến hành thủy phân nhằm đánh giá ảnh hưởng nồng độ enzyme chất (0 đến 1U/g Protamex đến 500U/g Flavourzyme), pH môi trường (từ đến 9), nhiệt độ (từ 40 đến 650C) thời gian thủy phân (từ đến 4h) đến mức độ thủy phân hoạt tính sinh học peptide tạo thành Nghiên cứu đạt kết sau: điều kiện xử lý phù hợp enzyme Protamex (nồng độ enzyme: chất 0,8U/g protein, pH=6, nhiệt độ 600C, thời gian thủy phân 2h) mức độ thủy phân 27,84%, khả kháng oxihóa 1,16mg VitC/g protein, khả liên kết Calcium 74,64mg CaCl2/g protein) điều kiện xử lý phù hợp enzyme Flavourzyme (nồng độ enzyme: chất 400U/g protein, pH=7, nhiệt độ 500C, thời gian thủy phân 2h) mức độ thủy phân 27,31%, khả kháng oxihóa 0,95mg VitC/g protein, khả liên kết Calcium 79,31mg CaCl2/g protein Việc thủy phân protein hình thành phân tử peptide có hoạt tính kháng oxi hóa cao Từ khóa: Flavourzyme, khả kháng oxi hóa, Protamex, rong Chaetomorpha sp., thủy phân protein MỞ ĐẦU Hiện nay, rong biển Việt Nam có nhiều giá trị, nguồn dinh dưỡng giàu protein khoáng chất Nhiều nghiên cứu gần chứng minh lợi ích peptide có hoạt tính sinh học sinh trình thủy phân protein từ rong enzyme protease Căn vào tính chất cấu trúc, thành phần trình tự chuỗi acid amin, peptide đóng vai trị khác như: khả liên kết với khoáng [1], điều hòa miễn dịch [2], kháng khuẩn [3] chống oxy hóa [4] Tuy nhiên chưa tìm thấy nghiên cứu đề cập đến vấn đề khai thác tối đa nguồn protein rong Chaetomorpha sp Vì mục tiêu nghiên cứu đề tài sử dụng hai loại chế phẩm enzyme khác Protamex Flavourzyme để thủy phân protein 30 Thiều Thị Xuân Diệu, Nguyễn Thúy Hồng, Đào Thị Tuyết Mai, Trần Chí Hải thu nhận từ sinh khối rong Chaetomorpha sp., khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân đánh giá số hoạt tính sinh học peptide thu được, bao gồm khả kháng oxi hóa khả liên kết với Calcium VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Rong mền Cheatomorpha sp thu nhận ao nuôi tôm quảng canh xã Long Điền, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu Rong phơi khô tới độ ẩm 9-10%, xay nhỏ rây qua lưới 0,5mm Sau đó, rong xử lý với enzyme cellulase (nồng độ chất 10%, nồng độ enzyme 117UI/g chất, pH 7-8, nhiệt độ 52-53oC thời gian 73 phút), trích ly dung mơi NaOH 0,75%, tỉ lệ nguyên liệu: dung môi 1:20, nhiệt độ 50oC 60 phút Sau trích ly, hỗn hợp ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút để thu dịch Q trình trích ly thực đến khơng cịn protein bã rong Protein sau kết tủa (NH4)2SO4 điều kiện: nồng độ bão hòa dung dịch muối sử dụng 90%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi kết tủa 4:1, thời gian tủa 50 phút nhiệt độ phòng Phần tủa tách cách ly tâm 10.000 vòng/phút 15 phút Kết tủa thu đem thẩm tích màng cellophane có kích thước lỗ màng 14.000A để loại hết (NH4)2SO4 Cuối tiến hành sấy lạnh để thu bột chế phẩm có hàm lượng protein 83% so với chất khô, ẩm 4% Các enzyme protease sử dụng nghiên cứu Flavourzyme 500MG Protamex 1,5MG Novozyme (Công ty Brenntag Việt Nam) Thông số tối ưu theo khuyến cáo loại enzyme sau: Protamex (pHopt = 6, t0opt = 600C), Flavourzyme (pHopt = 7, t0opt = 500C) DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical) hãng Sigma, Đức 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng loại enzyme protease đến trình thủy phân protein từ rong Chaetomorpha sp Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein từ rong Chaetomorpha sp chế phẩm protease, thông qua đánh giá tiêu mức độ thủy phân, khả kháng oxi hóa, hàm lượng phenolic tổng khả liên kết Calcium Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme tương ứng 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 1U/g protein Protamex nồng độ 0, 100, 200, 300, 400 500U/g protein Flavourzyme, tương tự vậy, khảo sát tác động pH 5, 6, 7, 9; nhiệt độ 40, 45, 50, 55, 60, 650C thời gian 0, 1, 2, 3, 4h Tái hòa tan bột protein rong Chaetomorpha sp nước để thu dung dịch có nồng độ protein 5%, tiến hành thủy phân 2.2.2 Xác định mức độ thủy phân Theo He cộng [5], mức độ thủy phân (DH) định nghĩa tỷ lệ phần trăm nhóm amin tự cắt từ protein, tính từ tỷ lệ α amin tổng số nitơ Nito formaldehyde xác định dựa phương pháp chuẩn độ formal Protein thủy phân (5ml) trộn với 20ml nước chuẩn độ đến pH=8,2 với NaOH 0,5M trước bổ sung thêm 10ml dung dịch formalin (37%) Các mẫu sau tiếp tục chuẩn độ đến pH=9,2 với NaOH 0,05M Thể 31 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein từ rong chaetomorpha sp enzyme protamex flavourzyme tích NaOH sử dụng để điều chỉnh pH 8,2 đến 9,2 ghi lại Độ thủy phân tính tốn phương trình sau: Nito formaldehyde DH(%) = × 100 Nito tổng 2.2.3 Khả bắt gốc tự Khả bắt gốc tự dịch protein thủy phân xác định theo Je cộng [6] sau: 100µL dung dịch DPPH 1,5x10-4M trộn với 100µL dịch thủy phân, sau hỗn hợp ủ tối, nhiệt độ phịng 30 phút, sau hỗn hợp đo bước sóng 517nm Mẫu control làm tương tự thay dịch thủy phân nước Khả bắt gốc tự dịch thủy phân tính theo công thức sau: 1,100 − OD % ức chế = 1,100 2.2.4 Xác định hàm lượng phenolic tổng Hàm lượng phenolic dịch thủy phân xác định theo Dewanto cộng [7] sau: 0,125ml mẫu (nước làm mẫu trắng) cho vào ống nghiệm pha lỗng với 0,5ml nước Sau đó, bổ sung thêm 0,125ml Folin để phút Tiếp theo, bổ sung thêm 1,25ml dung dịch Na2CO3 7%, lắc thêm 1ml nước để đạt thể tích tổng 3ml Phản ứng thực 90 phút tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 760nm máy quang phổ so màu UV-Vis 2.2.5 Khả liên kết với Calcium Khả liên kết với Calcium xác định theo Reyes A.I Mendez et al [8], trộn dịch protein thủy phân với 5ml CaCl2 đệm phosphate 0,2M (pH=8) Khuấy 2h 37oC pH trì mức máy đo pH Sau đó, hỗn hợp phản ứng ly tâm 10000 vòng/phút nhiệt độ phòng 10 phút để loại bỏ muối calcium phosphate không tan Hàm lượng Calcium phần dịch xác định phương pháp so màu với thuốc thử orthocresolphthalein complexone, mẫu đo độ hấp thụ 570nm 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm tiến hành lặp lại lần Kết trình bày giá trị trung bình ± sai số Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý thống kê kết thí nghiệm phân tích phương sai ANOVA (P