Luận án tiến sĩ Chế biến thực phẩm và đồ uống: Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius Hypophthalmus)

Tính cấp thiết của luận ánCollagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bao và mô liên kết [1], [2].Collagen chiếm 30 % tong lượng protein của co thể, đóng vai trò then chốt tr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HO CHI MINHTRUONG DAI HOC BACH KHOA

LE THI THU HUONG

NGHIEN CUU PHUONG PHAP THU NHAN COLLAGEN TU

DA CA TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

LUẬN AN TIEN SĨ KY THUAT

TP HO CHI MINH NAM 2018

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LE THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ

DA CA TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

Chuyên ngành: Chế biến Thực phẩm va Đồ uốngMã số chuyên ngành: 62540201

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Quản Lê HaPhản biện độc lập 2: PGS.TS Đặng Minh Nhật

Phản biện 1: GS.TSKH Nguyễn Minh Tuyến

Phản biện 2: GS.TS Lê Văn Việt MẫnPhản biện 3: TS Lê Thị Minh Thủy

NGƯỜI HƯỚNG DÂN KHOA HỌC1 GS.TS Phan Đình Tuan

2 PGS.TS Nguyễn Hoang Dũng

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quảnghiên cứu và các kết luận trong luận án nảy là trung thực, và không sao chép từ bất kỳmột nguồn nào và dưới bất ky hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã đượcthực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Tác giả luận án

Lê Thị Thu Hương

TÓM TAT LUẬN AN

1 Tính cấp thiết của luận ánCollagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bao và mô liên kết [1], [2].Collagen chiếm 30 % tong lượng protein của co thể, đóng vai trò then chốt trong thànhphan cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chang, Collagen là một loạivật liệu sinh học được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm thựcphẩm và dược phẩm [3] [4]

Trước đây, collagen được tỉnh chế từ các nguồn nguyên liệu da và xương của trâu, bò,lợn Từ năm 2000 đến nay, do sự bùng nô của bệnh bò điên, bệnh lở mồm long móng ởlợn và gia súc; thêm vào đó, vì lý do tôn giáo một số đạo cấm sử dụng sản phẩm CÓnguồn gốc từ bò, lợn nên đa số các nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào nguồnnguyên liệu thay thế có nguồn gốc từ thủy sản

Việt Nam là một trong những quốc gia xuất khẩu thủy sản lớn của thế giới, chủ yếu làmặt hàng phi lê cá tra, cá ba sa Lượng phụ phẩm của hai loại cá này thải ra hàng nămlên tới hàng trăm ngàn tan Tại thời điểm hiện tai, phụ phẩm cá tra, cá ba sa chủ yếuđược chế biến thành thức ăn gia súc và phân bón có giá trị kinh tế thấp Trong khi đó,da cá tra chứa một lượng collagen khá lớn, đây là sản phẩm có gia tri cao, được ưachuộng trên thị trường thé giới, có rất nhiều ứng dung trong công nghiệp thực phẩm, mỹphâm, dược phâm và vật liệu sinh học.

Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra nhăm đa dạng hóa các sản phẩmcó nguồn gốc từ thủy san, nâng cao giá trị kinh tế của loài cá tra, cá ba sa, từ đó nângcao thu nhập cho người nuôi trông và chê biên thủy sản là rât cân thiết.

2 Mục tiêu của luận án

Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasiushypophthalmus)” được thực hiện với mục tiêu:

(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết collagen và xác định các giảipháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen;

(2) Nghiên cứu các yếu tô ảnh hưởng và động học quá trình trích ly collagen nham lựachọn các thông số công nghệ thích hợp và thông qua mô hình hóa vẻ động học trích lyđể dự đoán được hàm lượng collagen theo thời gian trích ly, tăng khả năng chủ độngđiều khién quá trình trích ly.

(3) Xác định một số đặc tính hóa lý của collagen tách chiết từ da cá tra.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định thông số kỹ thuật của ba công đoạn chính trong quy trình công nghệ táchchiết collagen: tách tạp chất, trích ly và tinh sạch collagen

- Tối ưu hóa quá trình trích ly collagen bằng phương pháp bé mặt đáp ứng (ResponseSurface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theophương án quay bậc hai tâm xoay Box — Hunter; đánh giá tính ý nghĩa của các hệ số hồiquy theo chuẩn Student; đánh giá tinh phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩnFisher; Tối ưu hóa giá trị các yếu tổ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằngphương pháp bề mặt đáp ứng; Kiểm tra sự tương thích giữa thực nghiệm và mô hình dựđoán.

- Nghiên cứu động học và cơ chế của quá trình trích ly collagen: với các thông số ảnhhưởng và vùng khảo sát đã xác định được qua nghiên cứu tối ưu hóa ở trên, tiến hànhkhảo sát sự thay đối hàm lượng collagen trích ly theo thời gian và theo sự thay d6i hamlượng của các thông số ảnh hưởng Kết quả thực nghiệm thu được dùng để kiểm chứng,đánh giá sự tương thích của ba mô hình với thực nghiệm để chọn mô hình phù hợp môtả đúng nhất động học quá trình trích ly collagen

- Nghiên cứu đặc tính hóa lý của collagen da cá tra như: thành phan amino acid, cấu tạophân tử, nhiệt độ biến tính Đồng thời kiểm tra một số chỉ tiêu kim loại nặng va vi sinhvật trong collagen thành phẩm

4 Những đóng góp mới của luận án

* Vé mặt học thuật

(1) Đã xây dựng được mô hình toán hoc mô tả quy luật ảnh hưởng của nồng độ aceticacid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dung môi / da cá đến hiệu suất trích ly collagen;(2) Xác định được quá trình trích ly collagen từ da cá tra tuân theo quy luật động hoc

(2) Xây dựng được phương trình hồi quy mô tả quan hệ giữa hiệu suất trích ly collagenvới các yêu tô ảnh hưởng: nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dungmô1/da cá, từ đó xác định được các giá tri tôi ưu.

(3) Xác định được điều kiện tốt nhất dé loại muối ra khỏi collagen bằng phương phápthâm tích với hiệu suất tách muối cao nhất đạt 95,75%

(4) Xác định được điều kiện tốt nhất dé loại lipid ra khỏi collagen thành phẩm băng kỹthuật trích ly lipid bằng dung môi CO; siêu tới hạn

(5) Đánh giá các đặc tính chất lượng của collagen thành phẩm cho thấy sản phẩm phùhợp dé dùng làm vật liệu sinh học hoặc sử dụng trong nuôi cấy tế bào

Fish skin is the byproduct of fishery companies in the Mekong River Delta Basa fish

(Pangasius hypophthalmus) skin contains large amounts of collagen, highly valuable

protein in the food, cosmetics and pharmaceutical industries The aims of this thesis

"Research on methods of extraction collagen from tra fish (Pangasius hypophthalmus)

skin" were as follows: (1) Research on extraction process of collagen from tra fish

(Pangasius hypophthalmus) skin; (2) Optimisation and kinetics studies on the extraction

of collagen from tra fish skin; (3) Studies on the characterizations of collagen from tra

fish skin

The thesis presented an overview of the structure, origin and application of collagen; the

collagen extraction methods and the theoretical basis of kinetic of solid — liquid

extraction.

Statistical optimization of process conditions using the central composite design (CCD)

appeared to be an effective tool for the extraction process of soluble collagen from the

fish skin (Pangasius hypophthalmus) Each of the three independent variables (acetic

acid concentration, liquid to solid ratio, and pepsin content) showed a significant effect

in the yield of extracted collagen The mathematical model gave an R? of 0,993 and a P

value of less than 0,0001, which implied a good agreement between the predicted values

and the actual values of the yield of PSC, thus confirmed a good generalization of the

mathematical model.

The optimal conditions to obtain maximum yield of PSC were identified as follows: 0,47

M of acetic acid concentration, 55 mL/g of liquid to solid ratio and 0,49 % of pepsin

content Under these optimized conditions, the experimental PSC extraction yield

agreed closely with the predicted yield of 92,44 %.

Kinetic models based on the second order rate equation were successfully developed to

describe the extraction process with different processing variables Extraction rate

constant, initial extraction rate and equilibrium concentrations of collagen for different

acetic acid concentrations, pepsin contents and liquid to solid ratios were predicted The

model verification showed that the experimental values agreed with the predicted ones,

with percentage error differences in the range of 0,18 - 4,05 %.

The extraction of collagen from basa fish (Pangasius hypophthalmus) skin mainly

consists of three phases: Phase 1- Removing fat and pigments: basa fish skin was treated

by LASNa 0,5 % to remove fat, during 6 hours and H2O2 1 % to remove pigments,

during 2 hours The compositions of basa fish skin after treatment by LASNa were as

follows: hydroxyproline - 13,8 mg/g; moisture - 79,54 %; organic substance - 20,33 %;

lipid — 0,98 % and ash — 0,13 %; color parameters obtained as follows: L = 73,065 +

0,12; a= -3,64 + 0,11 and b =18,32 + 0,68 Phase 2 - Extraction of collagen from basa

fish skin and fractional precipitation to obtain collagen: Collagen was extracted from

basa fish skin with acetic acid - 0,47 M, pepsin - 0,49 % and L/S - 55 ml/g during 24

hours at a temperature of 4 °C, then NaCl was added to a final concentration of 0,9 M

in order to precipitate collagen Phase 3 - Refining collagen in two main stages

(removing sodium chloride in solution collagen by dialysis and removing lipid by

SCCOz2) After purification, the compositions of collagen were: 0,159 % of NaCl; 0,1467

% of lipid (by dry weight).

The collagen from basa fish skin is identified as type I collagen The collagen consist of

three chains as follows: the a chain with molecular weight of about 130 kDa, the B chain

with molecular weight of about 250 kDa (as components of two a chain) and the y chain

chain with molecular weight of about 300 kDa (as components of 3 a chain) The

denature temperature of collagen is 39 °C The final product’s compositions were:

hydroxyproline 97,76 mg/g (corresponding collagen content is 927,7 mg/g); organic

compounds 92,8 %; moisture 7,0 %; lipid 0,03 % and ash 0,20 %; without detection of

heavy metals (As, Pb) The product met the microbiological standards of Vietnam

Pharmacopoeia IV-2009.

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bảy tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới: GS.TS Phan Dinh Tuan và PGS.TS NguyễnHoàng Dũng, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quátrình thực hiện luận án này.

Xin cảm ơn dự án RBE (Research Based Education)- JICA, thay PGS.TS NguyễnHoàng Dũng, chủ nhiệm đề tài B1-07 “Fish collagen extraction and application” và côPGS.TS Phan Ngọc Hòa chủ nhiệm dé tài B2-06 “Purification collagen from Pangasiushypophthalmus fish skin and application”, GS Shigeru Morimura - cỗ van dé tài, cùngtoàn thé các thành viên thực hiện dé tai đã hỗ trợ va cho tôi nhiều ý kiến quý báu trongquá trình thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của GS.TS Lê Văn Việt Mẫn, TS TrầnBích Lam, GS.TS Đống Thị Anh Đào, Cô Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS Mai ThanhPhong, PGS.TS Lê Kim Phụng, TS Hoàng Minh Nam, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học,Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hỗ Chí Minh đã tao mọi điều kiện thuận lợi vàgiúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm và dành cho tôi nhiều ý kiến traođối khoa học bồ ích cho luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Thanh phố HồChí Minh, Phòng Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ thuật Hóa Học và Bộ môn CôngNghệ Thực Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiênCứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ giảng viên Khoa Kỹ thuật Hóa học & Môitrường, Ban Giám hiệu Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giupđỡ tôi trong qua trình vừa công tac vừa thực hiện luận an.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suôt thời gian qua.

Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gởi lời chúc tốt đẹp nhất tới quý thầycô, ban bè, đồng nghiệp, các em sinh viên và gia đình đã hỗ trợ, động viên và khuyếnkhích tôi trong suốt thời gian qua

MỤC LỤC

M.958) 1009.408000) 000) 0015 XvDANH MỤC BANG BIÊU 525cc 2t 2x2 2 2.2 re xviiiDANH MỤC CÁC TU VIET TAT cesessessssssessssesneesecenecsnecncenseanecueesnseanecnecneeeneesneenes XX9000 00 |CHƯƠNGI1 — TONG QUAN L1 1111111111 1 1111115111111 111 xe rrree 31.1 Nguồn gốc, cau tạo, tính chất và ứng dung của collagen - 2 + sec xxx: 31.1.1 Ngu6én nguyên liệu tách chiết collagenn ¿c6 6k +EE#E#E#E+ESESEeEEEEvkrkrkrkcees 31.1.1.1 Collagen tách chiết từ da ĐỊ - (+31 E1115E1 515111 31.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợn (+ s31 EEEE1E5E5E 515211 31.1.1.3 Collagen tách chiết từ Cá k9 5E ST 11g11 111111111111 xe 41.1.2 Cau tạo phân tử collagØI - - - E119 9 5E xSSScccTv T111 1g g1 g1 11111 xxx 41.1.2.1 Thành phan amino acid của phân tử collagen - - - 5 + +E+E+E+EsEsEsrrerees 51.1.2.2 Cau trúc của colÏagØenn - c- tk 1111915151 1 111cc HT 00g rrvg 71.1.3 Phan loat nv0 0 na an 10

IIESNN6UIL oi äð on ố 10

1.1.3.2 Collagen khơng ở dạng SỢI -GG SE 202001113112231 11111111111 1v ng v2 10

1.1.4 Tính chất của €olÏaØI - - - - Es+EE SE Skv 1 E1 1191915111111 1 1111 c1nxgrnrrree 121.1.4.1 Tinh hydrate hĩa của colÏaØ€đ - 5 3312061131115 1111 11111111 11111 11g 332 13

1.1.4.2 Độ nhớt của dung dich colÏaØ€đ - 5 5 2222222132631 1111111111111 11v 111 322 14

1.1.5 Ứng dụng của colÏageđ - - - s11 9E ST TH TH HH H101 xxx 151.1.5.1 Ung dụng của collagen trong thực phẩm - - + sex +k+kekeeeeeesree 151.1.5.2 Ung dung cua collagen trong lĩnh vực vat liệu sinh học - - 16

1.1.5.3 Ứng dụng của collagen trong dược phẩm - - + +k+k+E+E+EeEsEsrsrererees 171.2 Đặc điểm của cá tra - tt S1 S110 9818181111818 111 11111111111 E1111 1111111115111 1e Eee 191.3 Các phương pháp tách chiết collagen từ da Cd ccccscscsssscssesssesssscssssssssersvstetseees 191.3.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá trong nước và trên thế giới 191.3.2 Trình tự tách chiết collagen từ đa cá cv S311 E11 EEExrkrkrkekrvio 211.2.2.1 Quá trình tách tap chat dé sản xuất collagen ccccccsscscscsssssssesecessssseeseseeeseeee 221.2.2.2 Quá trình trích ly colÏagØn - - - << << c5 11 131331111311999331 111111111 11v ng v2 26

1.2.2.3 Qua trình tinh sạch colÏaØ€Tn << ccG 110303011 1111159311 111111111 1n ng v2 30

1.4 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly rắn —lỏng - - + + s scscsreresee 321.4.1 Mơ hình hấp phụ Peleg - s19 SE ST HH TH H11 g0 1 xu 331.4.2 Mơ hình khuếch tán EFick - -¿ c++5+++cxt2ExtSExttrktrrrtrrttrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrre 331.4.3 Mơ hình động học bậc ha1 - - << cGG 01 10131111111199931 11111111111 ng ng, 33

1.5 Những van dé tơn tại và định hướng nghiên cứu - 5 + + s+x+E+EsEsrsrererees 341.5.1 Những van để ton tại - - - -kk tt HT 11H11 11111111 nen greg 341.5.2 Dinh 0i ïï50i30) 5:00 01 34

CHUONG 2 NGUYEN VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU 352.1 Nguyên vật liệu, hĩa chấtt «s31 99915151 1111111 1 11111 ng rreg 35s8) ài(0:8i10ì0 na a 352.1.2 nh 352.2 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tFa - - - kk+xsEsESEE St cvekgvgereeree 372.3 Phương pháp nghiÊn CỨU << +11 1111118883311111999933310 11111111 1 ng ng v2 39

2.3.1 Sơ đỗ nghiên €ỨU - - SE E331 E1915E13 111111101 1111111111111 ke 392.3.2 Hoạch định thí nghiệm - - (<< < << c51111113331111311999331311 111111111 ng ng v2 41

2.3.2.1 Khảo sát quá trình tách tạp chat từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) 412.3.2.2 Khảo sát quá trình trích ly collagen từ da cá fra - 5-55 <s+ss++++ssssssss 42

2.3.2.3 Nghiên cứu động học và cơ chế trích ly collagen -¿- - s+s+x+s+xsesescse 452.3.2.4 Phương pháp tinh sạch colÏaØ€T 5 2 2222222211991 111111111 111118 11882 3.2 50

2.3.3 Phương pháp phân tÍchh - - - <1 11111118833111119999333101 111111111 ng v2 53

2.3.3.1 Phương pháp hĩa ly - 001010101101 11111111111118803 1111 1 kg ng v2 53

2.3.3.2 Phương pháp phân tích vi Sinh - c5 5 2223333333333 E4 59

2.3.4 Phương pháp xử lý $6 liệu cee sscesesescseseccecscscscecscsvsvevsvscsesececscscacececssacasasavavens 60CHƯƠNG 3 KET QUA VA BAN LUẬN c1 S121 2121111111111 EEErrkrkd 613.1 Phân tích nguyên liệu da CA tra ccccceeessssssssnsceeeeeeececeeeesesesssnaeeeeaeeeeeeeeeeeeees 61

3.2 Khảo sát quá trình tách tạp chat từ da cá tra ¿6 k+k#E#E#ESEsEeEEerkrkrkeeeeeed 623.2.1 Tach tạp chất từ da cá tra bằng NaOlH «+ St SxSvSv SE EEgErEerererreree 623.2.2 Tach tạp chất từ da cá tra bằng LASÌNa - ch EE E1 1E Exrkrkekekekd 643.2.3 Tach tạp chất từ da cá tra bang ethanol - <6 k+k+E#E#E#ESESEeEEerkrkrkeeeeeed 653.2.4 Xử ly màu da cá tra bằng H22 , - - - + 2S +k‡E9ESEESESEEEEEEEEEEEEEEEEErkrkrkrkee 68

3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly collagen 7]

3.3.1 Ảnh hưởng của nơng độ acetic acid đến hiệu suất trích ly collagen 7]

3.3.2 Ảnh hưởng của ty số dung mơi : da cá (L/S) đến hiệu suất trích ly collagen 73

3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme pepsin đến hiệu suất trích ly collagen 74

3.4 Tối ưu hĩa quá trình trích ly collagen băng phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụngphân mềm Design Expert ÌÍ -¿- - - E99 E111 1111111111111 xe 753.4.1 Phân tích thống kê va dự đốn phương trình hồi quy - - 5 sc+s+e+escse 753.4.2 Tối ưu hĩa giá trị các yếu tổ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phươngpháp bé mặt đáp ứng RSM-CCD - - -ks+ESE E111 E101115E 111111111 xe 783.5 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen từ da cá tra bang dung dịchacetic acid kết hợp với enzyme D€pSỈI - - - SE SES SE cvvvg EvgEgEeerrrerrrree 813.5.1 Nghiên cứu động hoc cua quá trình trích ly collagen theo mơ hình Peleg 81

3.5.2 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen theo mô hình khuếch tán Fick

iiỒắầaiầaầầaẳaẳaẳaaaaaad CC 84

3.5.3 Nghiên cứu động hoc của quá trình trích ly collagen theo mô hình động hoc phản00150 o}: (ek 0.) 007 :aa.Ả 873.5.4 Xác định hàm lượng collagen và tốc độ trích ly theo mô hình động học bậc hai 913.5.5 Kiểm tra sự phù hợp của mô hình động học bậc hai với thực nghiệm 933.6 Khao sát quá trình tinh sạch colÏagen 5 2 2222111111111 1 1111111111888 x.2 95

3.6.1 Khảo sát quá trình thấm tích loại muối ra khỏi dung dich collagen bang màngcellulose - RCDMB (Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing) 95

3.6.1.1 Thâm tích lần thứ nat cscs esesscsescssesescsscsescssestssssestsssssestssseensseseeen 953.6.1.2 Tham tích lần thứ hai + - 52 E2 SE£E‡E£EE£E#EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE15 11151200 963.6.2 Tach lipid bang COz siêu tới hạn (SCCO2) c6 k+k*E£E#ESESESEEkEkrkrkeeeeeed 973.6.2.1 Ảnh hưởng của áp suất dòng CO¿ đến hiệu suất tách lipid ¿- - -5¿ 973.6.2.2 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO; đến hiệu suất tach lipid - - 983.6.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO; đến hiệu suất tach lipid - - - 993.6.2.4 Anh hưởng của ham lượng chat trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tach lipidỔ.C 100

3.6.2.5 Khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian ở các điều kiện tối ưu - 1023.7 Xác định đặc tính hóa lý của collagen thành phẩm - 2-5 x+x+E+EeE+esese 1053.7.1 Xác định thành phần hóa hoc của collagen thành phẩm - - 2s +: 1053.7.2 Kết quả điện di collagen thành phẩm trên gel polyacrylamide — SDS 1053.7.3 Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá ra << c5 5S S1 eseeesssssss 1043.7.4 Cấu trúc sợi collagen từ đa cá tra cccccsccccsssssssssssssssscscsesesesesscecscessssvsvevevsvevevens 1053.7.5 Cấu trúc phân tử collagen từ da cá tFa «<1 SE SEEEkEkrkrkrkekeed 1073.7.6 Thanh phần các amino acid trong collagen từ da cá tra - - - +cscscscscse 1083.7.7 Thanh phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra - 5 scscssscse 1103.7.8 Kiếm nghiệm vi sinh trong collagen da cá fra - ¿s6 +k+k+keveeeeseseee 110

3.8 Đặc tính của collagen da Cá Ầra - - << ccc 1110103111111 11 11111 1n ng v2 111

KET LUẬN VA DE XUAT wiecccccccccscsscsesessesescssescscsecscsesscscsesescsesscscsesscacsesecacseecacsesees 112DANH MỤC CONG TRINH DA CONG BO uu.ccccscssssssesesessesesecescsessescsesscscsessescsesees 114TAI LIEU THAM KHAO Wuuecccccccccsceccscssesescscescscseescscseescsescescseseescscsceccsesseacscseeacseseeseas 115

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cau trúc của sợi dây chăng - - x11 SE ST cc cv ngnngegreg 7Hình 1.2 Cau trúc phân tử collagen loại Ì_ 2 2 s+s+E+E+E+E+E+EeEerkrkreereeerees 8Hinh 1.3 (A) Hinh anh vi soi collagen voi chu ki D = 67 nm nhin qua kinh hién vi diéntử truyền qua (TEM) (B) Biéu do thê hiện sự sap xêp hai chiêu cua các phan tử collagentrong vi sợi Chu kì D hình thành từ sự sap xếp so le cua các phan tu collagen trong viSOL QQ n9 000999 vớ 9

Hình 1.4 Ca tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) ccccccceseeesessssseeeeeeeeees 19

Hình 1.5 So đồ trình tự tách chiết collagen c.c.ccccccsscsssesssesecssesessssssssesevsvsescstsseesenees 21Hình 1.6 Giản đồ pha của CO2 wiecceccccscsecscssssesesssesesesscscessesesscscevsesesscavscsvevsesssaeavensen 23Hình 1.7 Cơ chế phá vỡ melanin + 22k E+EEEEE+E+E+ESEEEEEEEEEEeEeEeEkrkrkrrerers 25Hình 1.8 Giai đoạn dau va cuối của quá trình thâm tích << cscscsxcecxe: 32Hình 2.1 Quy trình tách chiết collagen từ da cá fra -¿- - - +x+E+E+E£EeEsEeEsrerererees 38Hình 2.2 Sơ đỗ nghiên €ỨU - - - SE E993 E11E5E513 111111 1 1111 rreg 39Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu - 2 SE k+E+E9EEEESEEEEEEEEEETEEEE 1111111131111 1e 40Hình 2.3 Thiết bị trích ly €ollagren - - + sExSxSkSkSkSESkk#EEEEEEEEESEEEEErEeEererererees 43Hình 2.4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị CO2 siêu tới hạn THAR SFC §N.11419M6 phong tren MAY 051: 077277577 -OO^ 52

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nông độ NaOH đến sự thay doi hàm lượng lipid (a),hydroxyproline (b), tro (c) và hàm âm (d) trong da cá tra theo thời gian 63

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ LASNa đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a),hydroxyproline (b), tro (c) và hàm âm (d) trong da cá tra theo thời gian 64

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến sự thay đối hàm lượng lipid (a),hydroxyproline (b), tro (c) và hàm âm (d) trong da cá tra theo thời gian 66

Hình 3.4 (a) Da cá trước khi xử lý mau bang H2O> và (b) da cá sau khi xử ly màu bằng

Hình 3.5 (a) Hiệu suất trích ly collagen ở các nông độ acetic acid khác nhau đạt đượcsau 24h với ty sô L/S là 60 ml/g và hàm lượng pepsin là 0,5 %; (b) Sự gia tang hiệu suattrích ly collagen theo thời gian ở các nông độ acetic acid khác nhau .- 72

Hình 3.6 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h ở các tỷ số L/S khác nhau; nồng độ aceticacid là 0,55 M và hàm lượng pepsin là 0,5 % << ccccn S111 1111 9 3333111 sx2 73

Hình 3.7 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h ở các hàm lượng pepsin khác nhau; nồngđộ acetic acid là 0,55 M và tỷ sô L/S là 60 mÌ/Ø << 5555 S** +2 74

Hình 3.8a Ảnh hưởng của nông độ acetic acid và hàm lượng pepsin đến hiệu suất tríchv0) .a = -:::-:O 79

Hình 3.8b Ảnh hưởng của nông độ acetic acid va tỷ số L/S đến hiệu suất trích ly collagen

Hình 3.9 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg với sự ảnh hưởng của nông độsI05ãI4:10600 ằe 81

Hình 3.9 (b) Kết quả thực nghiệm (các ky hiệu) va mô hình (đường liền nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg dưới tác động của tỷ sô L/S 82

Hình 3.9 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg dưới tác động của hàm lượngIVA4001910900IRá(( .e 82

Hình 3.10 (a) Kết qua thực nghiệm (các ký hiệu) va mô hình (đường lién nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tac động của nồngđỘ aC€fIC C1CÍ - 2G E012 1000110300 011111 9 84

Hình 3.10 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của tỷ sốTP 85

Hình 3.10 (c) Kết qua thực nghiệm (các ky hiệu) va mô hình (đường liền nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuêch tán Fick dưới tác động của hamTWONMY 32VÀ20ï1503 331) 00007077 85

Hình 3.11 (a) Kết qua thực nghiệm (các ky hiệu) va mô hình (đường liền nét) của quatrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của nôngđỘ aC€fIC C1CÍ - 2G E012 1000110300 011111 9 87

Hình 3.11 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động cua tỷ

Hình 3.11 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quátrình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của hàmTWONMY 32VÀ20ï1503 331) 00007077 88

Hình 3.12 Sự gia tang ham lượng NaCl trong môi trường thâm tích theo thời gian ở cáctỉ sô collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thâm tích lân thứ nhât) - 95

Hình 3.13 Sự gia tang hàm lượng NaCl trong môi trường thấm tích theo thời gian ở cáctỉ sô collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thâm tích lân thứ hat) - 96

Hình 3.14 (a) - Ảnh hưởng của áp suất dòng CO› đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điệndi SDS-PAGE của các mau collagen Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3collagen sau khi trích ly lipid ở áp suât tương ứng 100, 200 va 300 bar, cột 4 - protein

Hình 3.15 (a)- Ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO: đến hiệu suất tach lipid; (b)- Hìnhđiện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở lưu lượng dòng CO2 tương ứng 5, 10 và 15 g/phút, cột4 - protein chuân c1 S111 9191515 11111111111 T11 11 111311111111 grkg 99Hình 3.16 (a)- Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hìnhđiện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid, cột1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở nhiệt độ dòng CO2 tương ứng 34, 38 và 42 °C, cột 4- protein chuẩn sex k k9 SESE*k9 9111111511511 111115 1111115111111 1511111111111 0 100Hình 3.17 (a) -Ảnh hưởng của chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tach lipid; (b)-Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid,cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid với hàm lượng ethanol tương ứng 5, 10 và 15 % ,cột 4 - protein chuẫn xxx S9 1118191515151 1111111111111 1111 1E rkg 101Hình 3.18 (a) - Kết qua khảo sát tốc độ tach lipid theo thời gian; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mâu collagen Cột 1-4 collagen sau khi trích ly lipid với thời gian lưutương ứng 10, 20, 30 và 40 phút, cột 5 - protein chuân -<<<<<<++++2 102

Hình 3.19 SDS-PAGE của collagen da cá tra cột 1, 2, 3, 4 và cột Ö - protein chuan.104Hinh 3.20 Duong cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen 0,3 % 105Hình 3.21 Anh SEM chụp cấu trúc collagen tách chiết từ da cá tra - 106Hình 3.22 Anh TEM chụp bó sợi collagen tách chiết từ da cá tra - 106Hình 3.23 Phố FTIR của collagen tách chiết từ da cá tra - + + scecsesrererees 108

DANH MỤC BANG BIEU

Bang 1.1 Thành phan amino acid của collagen tách chiết từ da một số loài cá 6Bang 1.2 Cấu tạo của chuỗi va sự phân bó của các loại collagen trong cơ thể người 12Bang 1.3: Dac tính collagen loại I dạng sợi của Công ty Collagen Solutions 17

Bảng 1.4 Tóm tắt quá trình trích ly collagen từ một số loại da cá băng phương pháp acid¬— 27

Bảng 1.5 Tóm tắt quá trình trích ly collagen từ một sô loại da cá băng phương pháp37A2 28

Bang 2.1 Danh mục hóa chat sử dụng trong quá trình thực hiện luận án 35

Bảng 2.2 Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố khảo sát 44Bảng 3.1 Thanh phan hóa lý của da cá tra - c3 EEEE#ESESESESEEEEEkrkrkrkcees 61Bang 3.2 So sánh hiệu quả tách tap chat và mức độ that thoát hydroxyproline khi xử lyđa cá tra băng NaOH, LASNa và ethanol ở các điêu kiện đã chọn - 68

Bang 3.3 Độ sáng của da cá Tra sau xử lý H2O2 ở các nông độ khác nhau 69Bang 3.4 Thanh phan hóa học của da cá tra sau khi xử lý HzOz 5 71Bang 3.5 Kế hoạch thực nghiệm xác định hiệu suất trích ly collagen theo 76Bang 3.6 Kết qua phân tích ANOVA cho mô hình đáp ứng bậc hai - 77Bảng 3.7 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 78Bảng 3.8 So sánh kết quả thực nghiệm và mô hinh - - 5 + s+E+E+E+EsEeEereree 80Bảng 3.9 Các thông số động học và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích lycollagen từ da cá tra theo mô hình Peleg + 2+2 3232311111 EExSSSSsSsssrssd 83

Bang 3.10 Các thông số mô hình và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích lycollagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tan Fick dưới tác động của nồng độ aceticacid, ty số L/S và hàm lượng enzyme pepSỈH - - xk+ESE#E#ESESESEEEEkrkrkeeeeeed 86

Bang 3.11 Các thông số mô hình và giá trị trong quan thống kê của quá trình trích lycollagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) theo mô hình động học bậc hai dướitác động của nông độ acetic acid, tỷ số L/S và hàm lượng enzyme pepsin 89Bang 3.12 Các hệ số co ban của ba mô hình nghiên CU eeeeeeeeseseeeeeeeeeeeees 91

Bảng 3.13 Hàm lượng collagen xác định từ thực nghiệm và mô hình dự đoán theo thờigian trích ly ở các nông độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin, ty sô L/S khác nhau.

iiỒắầaiầaầầaẳaẳaẳaaaaaad CC 94

Bang 3.14 Nong độ NaCl trong dung dịch collagen sau hai lần thâm tích 97Bang 3.15 Thanh phân hóa lý của collagen thành phẩm - 2 2-2-2 5s+s+Ese£: 105Bang 3.16 Thanh phan amino acid của collagen tách chiết từ da cá tra 109Bảng 3.17 Thanh phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra - - +: 110Bang 3.18 Chỉ tiêu vi sinh trong collagen da cá tra ccccccccccceeseseeeeseeesssnteeeeeees 110

Bang 3.19 Mô tả sản phẩm collagen da cá tra ccccessesssssssesessscsseesesssseseetsesesseseeeeen 111

DANH MUC CAC TU VIET TAT

Acid - Solubilized Collagen

Central Composite Design

Deoxycholate

Dimethyl Sulfoxide

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

Fourier Transformation Infra-red

Sodium Lauryl Benzen Sulfonate

Liquid/ Solid

2- Methyl — 2, 4 — Pentanediol

Polyethylene

Pepsin - Solubilized Collagen

Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing

Root Mean Square Deviation

Response Surface Methodology

Supercritical Carbon Dioxide

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Standard Deviation

Scanning Electron Microscope

Transmission Electron Microscopy

MỞ DAU

Collagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bao và mô liên kết [1], [2].Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein ở cơ thể người, đóng vai trò then chốt trongthành phần cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chăng Collagen làmột loại vật liệu sinh học được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm,thực phẩm va dược phẩm [3] [4]

Trước đây, collagen được tỉnh chế từ các nguồn nguyên liệu da và xương của trâu, bò,lợn Hiện nay, do sự bùng nỗ của bệnh bò điên, bệnh lở mém long móng ở lợn và giasúc; thêm vao đó, vì lý do tôn giáo một số đạo cắm sử dung sản phẩm có nguồn gốc từbò, lợn nên trong những năm gần đây đa số các nghiên cứu tách chiết collagen tập trungvào nguồn nguyên liệu thay thé có nguồn gốc từ thủy sản [5] như: nghiên cứu tinh chếcollagen từ da cá biến dé làm vật liệu nha khoa [6]; nghiên cứu tính chất hóa sinh củadịch chiết collagen từ các loài cá có giá trị kinh tế thấp [7]: tỉnh chế collagen từ da cánóc bạc (Lagocephalus gloveri) [8]; tinh chế collagen từ da cá đuối gai (Raja kenojei)[9]; nghiên cứu tinh chat của collagen trích ly từ da cá nóc (Takifugu rubripes) [10]:nghiên cứu cau tric của collagen trích ly từ da cá [11] Nhìn chung, da số các nghiêncứu tách chiết collagen từ da cá hiện có tập trung vào các loại cá vùng ôn đới, các nghiêncứu tách chiết collagen trên cá nhiệt đới chưa nhiều, mới chỉ có một vài nghiên cứu vềxác định đặc tính của collagen tách chiết từ da và xương cá hồng (bigeye snapper) [12];nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly collagen loại I tách từ da cáđuôi (Pomadasys kaakan) [13]

O nước ta, các nhà máy chê biên cá tra, cá ba sa trên địa bàn Dong băng Sông Cửu Long

hang năm thải ra hàng ngàn tân phê liệu da và xương cá, đây là nguồn nguyên liệu ratphong phú dé tách chiết collagen

Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasiushypophthalmus)” được tiễn hành với mục tiêu:

(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết collagen và xác định các giảipháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen.

(2) Nghiên cứu các yếu tô ảnh hưởng và động học trích ly collagen nhằm lựa chọn cácthông số công nghệ thích hợp và thông qua mô hình hóa về động học trích ly để dự đoánđược hàm lượng collagen theo thời gian trích ly, tăng khả năng chủ động điều khiến quatrình trích ly.

Đề dat được mục tiêu trên, dé tài tập trung vào các nội dung sau:(1) Xác định thông số kỹ thuật của ba công đoạn chính trong quy trình công nghệ táchchiết collagen: tách tạp chất, trích ly và tinh sạch collagen

(2) Tối ưu hóa quá trình trích ly collagen băng phương pháp bé mặt đáp ứng (ResponseSurface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theophương án cấu trúc có tâm (CCD); đánh giá tính ý nghĩa của các hệ số hồi quy theochuẩn Student; đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn Fisher; Tốiưu hóa giá trị các yếu t6 ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương phápbề mặt đáp ứng: Kiểm tra sự tương thích giữa thực nghiệm và mô hình dự đoán

(3) Nghiên cứu động học va cơ chế của quá trình trích ly collagen: với các thông số ảnhhưởng và vùng khảo sát đã xác định được qua nghiên cứu tối ưu hóa ở trên, tiến hànhkhảo sát sự thay đối hàm lượng collagen trích ly theo thời gian và theo sự thay d6i hamlượng của các thông số ảnh hưởng Kết quả thực nghiệm thu được dùng để kiểm chứng,đánh giá sự tương thích của ba mô hình với thực nghiệm để chọn mô hình phù hợp môtả đúng nhất động học quá trình trích ly collagen

(4) Nghiên cứu đặc tính hóa lý của collagen da cá tra và khả năng ứng dụng của collagen

trong công nghiệp.

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 Nguồn gốc, cau tạo, tính chat và ứng dung của collagen1.1.1 Nguồn nguyên liệu tach chiết collagen

Trước đây, collagen được trích ly từ da và xương của một số loài động vật có xươngsống như lợn và trâu bò Collagen nguyên thể trích ly từ các nguồn này được ứng dụngnhiều trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm [14] Tuy nhiên, collagentừ lợn và trâu bò có một số hạn chế nhất định nên trong những năm gan đây, các nhakhoa học đã tập trung nghiên cứu tách chiết collagen từ những nguồn nguyên liệu thaythé có nguồn gốc từ phế liệu thủy sản như: da, xương, vây, vay của các loài cá nướcngọt và cá biển, da mực, da ếch [5]

1.1.1.1 Collagen tách chiết từ da bòCollagen trích ly từ da bò đã được sử dụng từ rất lâu trong lĩnh vực y khoa, nó cũngđóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sứckhỏe [15] Tuy nhiên, mãi đến năm 1970 nghiên cứu về trích ly collagen từ da bò mớiđược hiểu biết rõ, khi các nhà nghiên cứu phát triển hệ thống tách chiết collagen từ dabò và điều chế nó thành dạng lỏng [16]

1.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợnTừ nhiều năm nay, da lợn là nguồn collagen dùng trong sản xuất các sản phẩm như vỏbao xúc xích và các loại màng Trong lĩnh vực y khoa, màng collagen từ da lợn cho thấyrất hữu ích trong phẫu thuật chỉnh hình Gần đây, các nhà nghiên cứu cho răng collagendạng bột nhão tách chiết từ da lợn phủ lên vết thương rộng không có dấu hiệu đào thảivà không gây ra triệu chứng viêm sưng quá mức, chính vì vậy có thể xem collagen táchchiết từ da lợn là một lựa chọn hiệu quả thay thế cho da trong điều trị vết thương rộng[17Ị.

1.1.1.3 Collagen tách chiết từ cáTương tự như collagen loại I tách chiết từ động vật hữu nhũ, collagen cá gồm ba chuỗipolypeptid, mỗi chuỗi có khoảng 1000 amino acid với trọng lượng khoảng 100 kDa.Collagen cá có hàm lượng hydroxyproline thấp hơn collagen động vật hữu nhũ, do đóchúng có ít liên kết ngang và kém bên hơn so với collagen của động vật có xương songtrên cạn [18].

Nguồn collagen từ động vật hữu nhũ rat phù hợp dé ứng dụng trong sinh học dược, tuynhiên do sự tôn tại của các mối nguy sinh học và tín ngưỡng tôn giáo nên collagen tachchiết từ phế phụ phâm của ngành chế biến thủy hải sản sẽ là nguồn collagen thay thé cóhiệu quả và day triển vọng [14], [19], [20]

1.1.2 Cau tạo phân tử collagenNhững hình anh đặc trưng về thành phan cau tạo và cấu trúc của collagen đã được côngbố vào thập niên 1940 và 1950 Thành phần amino acid của collagen khác với các proteinđã biết, điểm đặc trưng nhất của collagen là có hàm lượng glycine và proline rất cao[21] Những thử nghiệm ban đầu để xác định cấu trúc cơ sở của collagen bằng phươngpháp thủy phân từng phan cho thay: trong chuỗi collagen thông thường, glycine có théchiếm 1/3 tong chiều dài chuỗi [22] Nghiên cứu về collagen ở động vật có xương sốngtrưởng thành cho thấy có một lượng carbohydrate thấp (khoảng dưới 1 %) trongcollagen Năm 1966, người ta xác định được carbohydrate đó là galactose hoặcglucosylgalactose liên kết với nhóm hydroxyl của hydroxylysine [23]

Nghiên cứu nhiễu xa tia X trên sợi collagen cho thấy, collagen có cấu trúc xoắn bộ ba(triple-helices) [24] Quan sát nhiễu xạ trên sợi co collagen từ gân đuôi chuột cho thaymột sự phản xạ mạnh mẽ có tính đối xứng ở 2,9 A° và phan xạ cầu năm trong khoảngII-16A° tùy thuộc vào mức độ hydrate hóa [25] Sự cải tiến hình ảnh nhiễu xạ bangcách kéo căng [26] cho thay sự biến đổi cấu trúc dạng hình que và cấu trúc dang xoănốc Theo Ramachandran và Kartha [24], collagen bao gồm ba sợi bện thành dang dâythừng xoăn theo chiều từ trái qua phải, trong khi đó từng sợi collagen xoăn từ phải quatrái Cầu trúc xoắn của collagen giải thích tính đặc trưng của ảnh nhiễu xạ tia X và cácamino acid đặc trưng của chúng.

1.1.2.1 Thanh phan amino acid của phân tử collagenPhân tử collagen được cau tạo từ 20 loại amino acid Trong đó glycine có hàm lượngcao nhất, chiếm 33 % tong số amino acid, khoảng 12 % proline, alanine vahydroxyproline mỗi loại chiếm 11 %, tong lượng amino acid còn lại khoảng 23 % Hàmlượng hydroxylysine, histidine, phenylalanine, isoleucine, tyrosine va amino acid chứalưu huỳnh vào khoảng 1 % hoặc thấp hon Các amino acid có cực chiếm khoảng 40 %phân tử collagen, trong đó 11 % là amino acid có tính bazơ, 9 % là amino acid có tính

acid và khoảng 17 % là amino acid ở dạng hydroxy, khoảng 5 % acid aspartic vàglutamic còn lại tồn tại ở dang amid Cac amino acid không phân cực chiếm khoảng 40% phân tử collagen [8], [9] [11] [27], [28].

Bang 1.1 Thanh phần amino acid của collagen tách chiết từ da một số loài cá © [9],

1.1.2.2 Cau trúc của collagenCollagen là một protein có câu trúc chặt chẽ với nhiêu mức câu trúc có trật tự từ đơngiản đến phức tạp: phân tử collagen, vi sợi, sợi và bó sợi collagen Hình 1.1 mô tả mỗiliên hệ giữa phan tử collagen, vi sợi, sợi và bó sợi collagen ở dây chẳng [30].

Vi sợi collagenSoi collagenBó sợi

Ạ

Ar

ỦWŠ

› Pi Be So.9~"a ste `

Phân tử collagen được hình thành từ ba chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi polypeptide được

tạo nên bởi một dãy các a- amino acid được sắp xếp theo dạng bộ ba như sau: Y, với Gly = Glycine, X và Y là các amino acid khác, thông thường X là proline (Pro)và Y là hydroxy-proline (Hyp) Ba chuỗi polypeptide cuộn lại xung quanh một trục,

Gly-X-hình thành cau trúc xoăn bộ ba Phân tử collagen có cau trúc Gly-X-hình sợi dai với đường kínhkhoảng 1,5 nm và chiều dai 300 nm, trọng lượng phân tử khoảng 285 kDa [31] Tùythuộc vào từng loại collagen mà cau trúc xoắn bộ ba có thé được hình thành từ ba chuỗipolypeptide giống nhau hoặc khác nhau Collagen loại I (type I) được hình thành từ hai

chuôi ơi và một chuỗi a2, các chuỗi ơi, a2 có một sự khác biệt nhỏ vê thành phân amino

phân tử collagen hiện diện Sự chuyển mô hình Hodge và Petruska từ dạng 2D vốn cósang dạng 3D ở vi sợi collagen đã gây tranh luận trong nhiều năm Dựa vào kết quảnhiễu xạ tia X và kỹ thuật phân tích cau trúc bậc cao như TEM, một số mô hình đã đượcđưa ra để mô tả sự sắp xếp phân tử trong vi sợi collagen Những mô hình này có thể dựatrên hai giả thuyết cơ bản Giả thuyết thứ nhất: năm phân tử collagen tạo thành một cautrúc vi sợi do sự hình thành các liên kết ở vùng telopeptide Giả thuyết thứ hai: các phântử collagen tạo thành mang 3D kết tinh (hoặc giống dạng kết tinh) [31], [33].

ray

Ving :

chồng » Vunglap § trông TT ~

'.'alk

Chu ki D =67nm

Hình 1.3 (A) Hình ảnh vi sợi collagen với chu kì D = 67 nm nhìn qua kính hién viđiện tử truyền qua (TEM) (B) Biểu đồ thé hiện sự sắp xếp hai chiều của các phân tử

collagen trong vi sợi Chu kì D hình thành từ sự sắp xếp so le của các phân tử

collagen trong vi sợi [30].

Theo mô hình vi sợi, các đoạn phân tử collagen gắn chặt với nhau ở vùng chong lắp vàlỏng lẻo hơn ở vùng trống [35] Chu kì D ở mô hình vi sợi hình thành do sự sắp xếp cácphân tử collagen do Smith đưa ra đã được thừa nhận rộng rãi [36] Mô hình phù hợp với

kêt quả quan sát qua kính hiên vi điện tử va nhiêu xạ tia X.

c Soi collagen: sợi collagen được hình thành từ sự sắp xếp một lượng lớn các vi sợicollagen song song với nhau.

1.1.3 Phan loại collagen

Collagen được phan thành 27 loại khác nhau dựa vào sự tô hợp của các siêu phân tử[37] Loại collagen phong phú nhất là collagen dang sợi, là thành phan collagen chủ yếucâu tạo nên da, gân, xương, sụn và những loại mô khác.

Hiện tại, đã trích ly được khoảng 13 loại collagen Chúng khác nhau về chiều dài củachuỗi xoăn ốc cũng như cau tạo và kích thước của những phân không xoắn ốc (đầu Ctận cùng và đầu N tận cùng của chuỗi collagen) [38] Collagen trong cơ thể có thể phânthành 2 nhóm chính là collagen có cau trúc sợi và collagen không có cau trúc sợi Mỗiloại collagen có những đặc điểm khác nhau về cau trúc cụ thé là trật tự sắp xếp cácamino acid trong chuỗi polypeptide tạo nên các chuỗi alpha, beta, gama và khác nhauvề vi trí của nó trong cơ thê.

1.1.3.1 Collagen dang sợi

Collagen loại I, I va III là những collagen dang sợi điển hình chiếm đến 80 - 90 % tổnghàm lượng collagen trong cơ thể người Collagen loại V và XI cũng là những collagendạng sợi, có cau trúc tương đồng với collagen loại I - III [39] Nhìn chung các collagendang sợi có cau trúc phân tử tương tự nhau Chúng bao gồm một vùng cấu trúc xoăn bộba với khoảng 1000 amino acid và vùng đầu C tận cùng va đầu N tận cùng không có cautrúc xoăn Với cau trúc có trật tự so le 1⁄4, những collagen này tạo nên độ bền cơ học chủyếu của gân, da, thành mạch máu, dây thần kinh, [40], [41]

1.1.3.2 Collagen không ở dạng sợi

Collagen loại IV, VI-X và XII-XIX không ở dạng sợi, chúng biểu hiện sự không đồngnhất về cau trúc, phân bố ở các mô bào, các tổ chức đại phân tử va các protein chứcnăng Một biểu hiện thường thấy là chúng có một hoặc nhiều đột biến trong chuỗicollagen ở dang xoắn bộ ba, sự đột biến thường xảy ra ở đoạn giữa amino acid 330 và

1530, ngăn nhất là ở collagen loại VI va dài nhất là ở collagen loại VII [40] [42].FACTT là collagen liên kết với sợi cơ, bao gồm các collagen loại IX, XH, XIV, XVI vàXIX Collagen loại IX biéu hiện ở sụn và thường thay ở liên kết cộng hóa trị với collagen

sợi loại II trong cùng một mô bào ở những vùng khác nhau Loại XII và XIV được tìmthay không chi ở những mô giau collagen loại I ma còn hiện diện ở những mô cócollagen loại II Loại XVI và XIX có cấu trúc tương tự FACIT và vì vậy cũng được xếpvào nhóm này Collagen loại XVI phan bố rộng rãi ở các mô, chủ yếu là ở tim, than, cơtrơn, ruột, buông trứng, tinh hoàn, mat, thành động mạch Loại XIX được tìm thay ở tếbào hình que ở người và dạng nguyên bào sợi [39], [40], [42].

MACIT là những dạng collagen liên kết mang, bao gồm các collagen loại XII và XVII[40] Collagen loại XIII được tìm thay ở nhiều mô bào [43] Collagen loại XVII năm ởthé bán liên kết, kết nối tế bảo biểu mô với tế bảo da, giác mạc và phổi [44] [45].Cả hai loại collagen XV và XVIII có cau trúc xoăn bộ ba bị phá vỡ ở mức độ cao cùngvới vùng hình câu lớn ở cả hai đầu N- và C- tận cùng Chúng chứa một vài vị trí liên kếttiềm năng với serine của glycosaminoglycans và liên kết asparagine của oligosaccharide.Hai loại collagen này tham gia cấu tạo các màng cơ bản của hầu hết các mô, tuy nhiêncollagen XVIII được tìm thấy nhiều ở gan [40] [42] Collagen XV là thành phan củachất nền ngoại bào, cần thiết cho tổng hợp các tế bảo cơ xương và vi mạch [46], trongkhi collagen XVIII cần thiết cho sự phát triển bình thường của mat [47] Đầu C tận cùngcủa các đoạn bi phân giải cua collagen XVIII được xem là một chất ức chế nội sinh củasự hình thành mạch và sự phát triển khối u [48]

Hon 90 % collagen trong cơ thé động vật có xương sống là các collagen loại I, IL, IIL, Vvà XI, chúng tạo nên bộ khung và độ bền cơ học cho các mô Trong các collagen dạngsợi này, collagen loại I là loại phố biến nhất ở động vat có xương sống [38]

Bảng 1.2 Câu tao của chuỗi và sự phan bô của các loại collagen trong cơ thê người

[38]Loai collagen Cau tao của chuỗi Phân bố

Da, gân, xương, giác mạc, men răng,| (œi())zœ¿(), trimer (011 (1))3 ;

sun, mach mau

II (ou (ID))3 Sun, dich thủy tinh thé

Mach mau, van tim, ha bì, ruột, nướuIH (œi(HI))a

răng, thành tử cung

IV (œiqV))»ơaz(V) Màng nhay

œi(V) œ¿(V) œa(V) hoặc

V Giac mạc, xương, mạch mau, sụn,

(a1(V))202(V) hoặc nướu răng

(œi(V))

VỊ œ¡(V]) œz(VD o3(VI) Da, cơ tim

VI (œi(VII) Da, phối, sụn, giác mạcVUl Chua xac dinh Tao ra từ tế bao mang trong

IX œ¡(IX) o2(TX) o3(1X) Sun

X (œi(X))» Sụn

Sun, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh

XI œ¡(X]) ơz(XI) œ(X]) ,

thê

XII (œi(XI)): Gan, dây chang

XxIH Chưa xác định Da, xương

1.1.4 Tính chất của collagenTính chất chức năng của collagen phụ thuộc vào những đặc tính hóa lý bên trong nóchắng hạn như thành phần và trình tự amino acid, trọng lượng phân tử, hình dạng và sựphân bố điện tích trong phân tử Trạng thái tự nhiên và mật độ điện tích của phân tử

collagen cho thấy chúng có khả năng kết hợp với các thành phần khác như nước, ion,lipid, cacbohydrate, vitamin, màu và mùi tùy thuộc vào môi trường (pH, độ mạnh củaion, nhiệt độ) trong suốt quá trình chuẩn bị, xử lý và bảo quản.

1.1.4.1 Tính hydrate hóa của collagen

Tương tự như protein, khả năng hydrate hóa là tính chất quan trọng nhất trong các tínhchất chức năng đặc biệt cua collagen như tính hòa tan, tính dẻo, tính hut âm, tính tạonhũ tương, tính kết dính, tính co giãn và tính tạo bọt trong thực phẩm Trong phân tửcollagen, những nhóm chức acid và bazơ của sợi collagen chi phối tinh chất hóa lý cũngnhư quyết định mức độ hydrate hóa của collagen Mức độ hydrate hóa của collagen chịuảnh hưởng của độ pH và hàm lượng muối trong môi trường

Ở pH <3 độ hòa tan, kha năng kết hợp với nước của collagen tăng theo mức độ gia tăngcủa pH; ở pH > 3 khi gia tăng pH các đặc tính trên có xu hướng giảm dan Ở pH rất thấp(pH = 1) một số biến tính protein có thể xảy ra làm giảm tính chất chức năng củacollagen Khi pH xa điểm đăng điện, các amino acid tích điện cùng dau làm gia tang lựcday lẫn nhau trong phân tử protein (thuận lợi cho su hòa tan), dẫn đến sự mở rộng chuỗiprotein (thuận lợi cho khả năng kết hợp với nước) [49], [50] O pH > 4, do gần vùngđăng điện nên điện tích protein rất nhỏ đồng thời xảy ra hiện tượng đối kháng làm chotính chất chức năng của collagen giảm [50] [51] [52] Ở pH = 7 khi gia nhiệt da cá gâyra sự đứt gãy các liên kết cố định va vì thé sự gelatin hóa xảy ra làm gia tăng đáng kểkha nang hydrate hóa [53].

Kha năng hòa tan của collagen trong dung dịch muối phụ thuộc vào tương tác giữa nước,muối và các nhóm ngoại của amino acid trong chuỗi collagen Ở nồng độ muối NaClthấp (0 - 0,1 mol/L) khả năng hòa tan của collagen tăng do tương tác cùng dấu giữa cácion mudi và các nhóm ngoại trên chuỗi collagen giúp mở rộng mạng lưới collagen Tuynhiên khi nông độ muối NaCl cao (0,1 - 0,3 mol/L), tương tac muối — nước chiếm ưuthế làm giảm tương tác muối — collagen làm cho các phân tử collagen có xu hướng kếttụ với nhau dẫn đến khả năng hòa tan của collagen giảm [54] Mức độ tương tác giữacollagen với các ion của các loại mudi khác nhau được sắp xêp theo mức độ tang dân

như sau: F' < SO¿Z < acetate < Cl < Br < NOx <I'<SCN' va K* < Mg’? < Na®* < Cs*

< Lit <CaTM [55].

1.1.4.2 Độ nhớt của dung dich collagen

Độ nhớt của dung dịch collagen phụ thuộc vào nông độ nhiệt độ, trọng lượng phân tửvà vai trò của tương tác nội phân tử trong collagen Đối với chất đa điện phân linh động,sự giảm cường độ ion có thé dẫn đến sự mở xoắn và làm gia tăng độ nhớt của dung dịch[56] Collagen có dạng xoăn ốc bộ ba, khi mức độ thay đôi cầu trúc xoắn của collagentrong dung dich không đáng kể thì tương tác tĩnh điện nội phan tử có thé là yếu tổ duynhất làm gia tăng độ nhớt Collagen là một polymer sinh học lưỡng tính điền hình vì nóchứa cả điện tích âm và dương của các nhóm chức có mặt trong chuỗi collagen Nhìnchung, collagen tích điện dương trong môi trường acetic acid Khi đó, tương tác tinhđiện giữa nhóm amin tích điện dương có vai trò quan trọng đến sự hình thành cau trúcvà sự kết tụ của phân tử collagen Điện trường có thể kích thích sự hình thành sợicollagen trong chất điện phân acid, trong khi các phân tử collagen không kết tụ được ưutiên hấp thu lên bề mặt tích điện của chính nó [57] Khi hàm lượng collagen trong dungdịch không đáng kế < 0,1 mg/ml: ở nồng độ muối < 0,1 M độ nhớt của dung dịch giảmrất nhanh, với nồng độ muối > 0,1 M độ nhớt dung dịch tăng mạnh Khi hàm lượngcollagen trong dung dich > 0,2 mg/ml: độ nhớt dung dich collagen tăng dan theo sự giatăng ham lượng collagen Ở cùng hàm lượng collagen, độ nhớt dung dich giảm dan theosự gia tăng hàm lượng muối Độ nhớt không thay đối ở nồng độ muối 0,1 M khi tăngdần hàm lượng collagen trong dung dịch được giải thích như sau: sự sắp xếp của đạiphân tử collagen trong dung dịch loãng bị tác động dễ dàng bởi tương tác tĩnh điện nộiphân tử Tương tác này được bảo đảm nhờ muối và dung dịch collagen thể hiện tínhnhớt của chất cao phân tử khi nồng độ muối gia tăng đến giá trị nhất định (0,1 M).Nguyên nhân của sự giảm độ nhớt ở nồng độ muối 0,5 M trong khoảng hàm lượngcollagen từ 0,1-0,2 mg/ml thé là do sự kết tủa của các phân tử collagen [56] Tác động

của nhiệt độ đến độ nhớt cho thấy, độ nhớt của dung dịch collagen tăng theo sự gia tăng

nhiệt độ [56], [58] Hiện tượng nay là do phan tử collagen trong dung dịch loãng cókhuynh hướng liên kết với nhau ở nhiệt độ cao dẫn đến sự gia tăng các tương tác ky

nước giữa các phân tử collagen [59], [60] Trong khi đó độ nhớt cua dung dịch gelatin

giảm theo sự gia tăng của nhiệt độ [61], [62].

1.1.5 Ung dung của collagenCollagen được ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và vậtliệu sinh học, phụ thuộc vảo trọng lượng phân tử và tính chất của chúng Trong sản xuấtthực phẩm thường sử dụng collagen thủy phân bổ sung vào các sản phẩm như tra, càphê, nước uống, bánh, kẹo dé nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm; ngoài ra dé tạohình, tạo cấu trúc cho một số sản phẩm xúc xích, bánh, kẹo người ta bổ sung gelatin(dạng collagen biến tính bởi nhiệt) Collagen peptide và gelatin được ứng dụng trongsản xuất dược phẩm với vai trò là chất mang trong các loại thuốc viên, thuốc connhộng Trong công nghệ mỹ phẩm, dạng collagen thủy phân được bổ sung vào các sảnphẩm dầu ĐỘI, sữa tam, mặt nạ, kem dưỡng da nhằm tăng cường khả năng gitr âm, tạođộ mềm mịn cho da, [rong lĩnh vực vật liệu sinh học, collagen nguyên thể (triplehelix) được ứng dụng làm màng phủ vết thương: chế tạo các bộ phân nhân tạo như: sụn,van tim, tai,

1.1.5.1 Ung dụng của collagen trong thực phẩmCollagen tinh sạch có thé được sử dụng trong các sản phẩm thịt chế biến sẵn nhằm cảithiện tính chất chức năng của protein qua việc cố định nước tự do, tăng độ ôn định củathành phẩm [63] Collagen tách chiết từ da lợn được dùng làm phụ gia trong sản xuấtchả bò nhăm gia tăng tính bền của sản phâm Trường hợp sử dụng 10 % thịt heo để phốichế sẽ làm giảm tính kết dính, tính giữ nước ban đầu và do đó làm giảm độ răn chắccủa sản phẩm [64] Collagen được sử dụng trong sản xuất giăm bông nhằm gia tăng khanăng giữ nước va gia tăng các tinh chất chức năng của sản phẩm [65] Việc bố sungcollagen lợn ở hàm lượng trên 1 % làm gia tăng độ bền nhiệt của sản phẩm xúc xíchĐức nhưng không hiệu quả với thịt giăm bông [63] Sử dụng collagen như chất kết dínhvà chất trương nở trong xúc xích và giăm bông nhằm hỗ trợ cho sự hấp thụ và liên kếtâm, do đó sự tốn thất của của quá trình xử lý nhiệt được giảm thiểu [63] Ảnh hưởngcủa nguyên liệu và phụ gia collagen đến tính chất chức năng của lườn gà nướng sản xuấttừ 100 % thịt với lườn gà nướng sản xuất từ thịt bố sung 0 % đến 1,5 % collagen đã

được xác định [66] Việc b6 sung collagen vào lườn gà có hiệu quả trong việc giảm sựmat mát trong quá trình nau và tăng cường liên kết protein — protein Lườn gà sản xuấttừ thịt không bố sung collagen có liên kết protein - protein thấp hơn lườn gà sản xuất từthịt bỗ sung collagen Collagen sử dụng trong sản xuất lườn ga tây giúp cải thiện cautrúc của sản phẩm qua việc gia tăng khả năng liên kết của protein với các thành phankhác trong thịt và giảm sự mất nước trong quá trình nấu và tiệt trùng sản phẩm [67].Tóm lại, việc b6 sung collagen vào các sản phẩm có nguồn góc từ thịt giúp gia tăng khảnăng giữ nước và giúp cải thiện cau trúc và chất lượng của sản phẩm qua việc tăngcường liên kết protein — protein.

Collagen bién tính bởi nhiệt dưới dang gelatin được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp.Ở Mỹ, 65 % tong số gelatin sản xuất hàng năm (khoảng 25 tan) được tiêu thụ trong cácsản phẩm thực phẩm như bánh ngọt, kẹo dẻo, nước dùng, bánh nướng, thịt đông, kemvà các sản phẩm khác, 20 % được sử dụng trong phim ảnh và 10 % trong vỏ bao đượcphẩm, thuốc mỡ, mỹ phẩm, mang bao và nhũ tương [68]

1.1.5.2 Ung dụng của collagen trong lĩnh vực vật liệu sinh họcTiềm năng của collagen trong ứng dụng y sinh là do collagen có thé hình thành dang sợicơ với tính bền vững va độ 6n định cao nhờ khả năng tự tập hợp và tạo liên kết ngang[69] Trong các loại collagen đã nghiên cứu, collagen loại I, III] và V được ứng dung

rộng rãi trong y sinh vì chúng có khả năng thích ứng sinh học cao và khả năng kích thíchsinh ra đáp ứng miễn dịch thấp [70] Collagen được sử dụng làm chỉ khâu phẫu thuật,chất cầm máu và trong kỹ thuật mô (gồm chất nền tế bào, sản phẩm thay thé cho mạchmau và van tim nhân tạo) [69] Collagen là thành phần của mô tự nhiên được sử dụngtrong sản xuất van tim sinh học, màng sinh học phủ vết thương [71] Chất đồng trùnghợp giữa collagen va chondroitin 6- sunfate được xem như một loại polymer sinh họccó chức năng tái tao sụn khớp Collagen kết hợp với glycosaminoglycan có thé thúc daysự tong hợp lớp trung bì trên vết thương rộng ở chuột thí nghiệm [72] Nghiên cứu phủmảng collagen tách chiết từ da bò lên người bị phỏng nặng cho thấy sau thời gian mộtnăm, vùng da bị ton thuong da lién seo, da lang min [73] Nam 2004, Taguchi va congsu đã tao ra mot vật liệu kêt dính mô bào từ collagen loại I và dân xuât cua acid citric.

Chất kết dính sinh học này có thể phân hủy dưới da chuột thí nghiệm trong vòng bảyngày sau khi tiêm dưới da [74] Vật liệu tong hợp dưới dạng màng phủ được sử dungchủ yếu trong điều trị vết thương bề mặt để ngăn cản sự thất thoát nhiệt và âm trên dacũng như để tránh sự xâm nhập của vi trùng từ môi trường [72] Mang collagen khángkhuẩn được sản xuất từ collagen b6 sung povidone - iodine hoặc chlorhexidine glycerinvà đóng gói trong màng nhôm vẫn giữ được tính vô trùng trong thời gian 8 tuần Saukhi cay dưới da chuột, tam phủ không gây viêm sưng Tâm phủ này có thé dùng dé điềutrị vết loét, vết bỏng bề mặt và vết thương kết hạt mãn tính [70].

Việc ứng dung collagen làm vật liệu sinh học ngày càng phô biến vì nguồn nguyên liệudé sản xuất collagen khá déi dào, công nghệ sản xuất collagen ngày cảng phát triển vàcó thé sản xuất ra sản phẩm collagen có độ sạch cao, đáp ứng được yêu cau ứng dụngtrong y sinh Collagen có khả năng khôi phục lại cấu trúc để trở thành dạng có độ bềncao, có giá trị trong phẫu thuật [72] Collagen loại I điển hình dùng làm vật liệu sinh họccó đặc điểm trình bay như bảng 1.3

Bảng 1.3: Dac tính collagen loại I dạng sợi của Công ty Collagen Solutions [75]

Chỉ tiêu Đặc điểmHàm lượng collagen 60 -70 mg/mL (6,0 % - 7,0 %)

pH 7,0 -7.6Trạng thái Dung dịch màu trăng — trắng nhạt,

không tách phaMẫu điện di >90% collagen ở dạng chuỗi a, B, y

(SDS-PAGE) <10% collagen có phân tử lượng nhỏ

hơn chuỗi ơ

1.1.5.3 Ủng dụng của collagen trong dược phẩmCollagen có nguồn góc từ bò đã được Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Ky chấpnhận từ năm 1982, khi đó nó được sử dụng chủ yếu dưới dạng chất làm đây trong việcđiều trị sẹo lõm [76] Sự ra đời của collagen có nguồn gốc từ nguyên bào sợi ở ngườilàm phong phú thêm các sản phẩm thuốc tiêm Việc ghép collagen tự thân và một vàiloại collagen khác đã được thử nghiệm lâm sàng ở Mỹ và một số nước khác [76] Những

tiễn bộ trong công nghệ sản xuất collagen có thể cung cấp các sản phẩm có hạn sử dụngđài hơn và tiện lợi hơn Sự phân giải collagen protein hay collagen thủy phân trong cơthể sống tạo ra các peptide hữu ích cho quá trình sinh tổng hợp hữu cơ [77] Vì thế, việcsử dụng thực phẩm giàu collagen có thể có ích cho sự phát triển xương Một số tính chấtchức năng của sản phẩm collagen thủy phân đã được nghiên cứu trong điều trị viêmkhớp mãn tính và được xem là yếu tố kích thích sự gia tăng tổng hợp các đại phân tửchất nền ngoại bao từ chondrocyte [78], [77] Collagen peptide có thé tạo ra tác động cóích cho quá trình chuyển hóa xương ở chuột, đặc biệt ở điều kiện thiếu hụt can- xi vàchưa thay dau hiệu tác động ngoài ý muốn [79] Khi thử nghiệm trên phụ nữ loãng xươngvới chế độ ăn giàu collagen thủy phân (10 g/ngay) cho thay hooc môn tăng can —xi theochế độ ăn này có ảnh hưởng lớn trong việc ức chế sự phân giải collagen trong xươnghon là chế độ ăn không bồ sung collagen [80] Việc sử dụng collagen thủy phân kíchthích sự tăng cường tổng hợp các đại phân tử chất nền ngoại bào từ chondrocyte Kếtquả này giúp ích cho việc điều trị bệnh nhân bị bệnh viêm khớp mãn tính Nguyên lý cơbản về việc sử dụng collagen thủy phân cho bệnh nhân viêm khớp mãn tính đã đượctrình bày trong nhiều tài liệu [78] Dac điểm về sinh hoc tế bào của collagen, gelatin vacollagen thủy phân (< 15.000 Da) đã được nghiên cứu trên chuột [81] Các thí nghiệmnuôi cay tế bào sừng cho thay chỉ có collagen có ảnh hưởng đáng kế đến sự kết dính vàsự tăng trưởng của tế bảo, trong khi thí nghiệm nuôi cấy tế bảo trên gelatin và collagenthủy phân cho thấy tốc độ kết dính và tăng trưởng của tế bào tương tự như nuôi cay trênnhựa làm đối chứng Điều đó cho thấy răng collagen có tác động sinh học tốt hơn gelatinvà collagen thủy phân khi sử dụng làm nguyên liệu sản xuất mỹ phâm chăm sóc da [81].Ngoài ra, collagen được xem là chất mang tuyệt vời trong sản xuất dược phẩm Các ứngdụng chính của collagen trong dược phẩm là tạo màng giác mạc trong nhãn khoa, gạcbăng bó vết thương, vết bỏng, chất mang protein trong các dạng thuốc viên, tạo gel khikết hợp với liposome để hỗ trợ quá trình vận chuyển thuốc trong cơ thể [69].Atelocollagen thu được băng cách khử hai đầu telopeptide trên chuỗi collagen bangenzyme pepsin, nó được sử dụng làm chất mang dược phẩm và chất mang gene [69],[82], [83].

1.2 Đặc điềm của cá tra

Cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) là loài cá nuôi truyền thống trong aođất ở vùng Đồng Băng Sông Cửu Long Cá tra được xếp vào nhóm cá da trơn và đượcphân loại theo hệ thống như sau: giống Pangasiidae, họ Pangasius, bộ Siluriformes, lớpActinopterygii, ngành Chordata, giới Animalia [84].

Về hình thái, Cá tra có thân dài, không có vậy, đầu đẹp lưng bụng và đuôi dẹp bên,

chiều dài thân không kế đuôi gấp 4,5- 5 lần chiều cao thân và chiều dai đầu Răng lá

mia, miệng rộng, có hai đôi râu dai, màu xám tro, lig sam, bụng hơi bac Vay lưng caocó một tia gai cứng, vây ngực cũng có một tia gai cứng, có vây mỡ nhỏ, vây hậu môndai, vây đuôi chẻ sâu nhỏ Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, vẫn có thé sinh trưởng được ởvùng nước lo (10- 14%), có thể chịu dựng ở môi trường nước với pH = 4 (pH< 4 cá bỏăn), giới hạn chịu đựng về nhiệt độ trong khoang15- 39°C [85]

Hinh 1.4 Ca tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878)

O nước ta hiện nay, cá Tra được coi là loại cá nuôi có năng suat cao nhat trong nghề

nuôi trồng thủy sản, năng suất trung bình khoảng 209-212 tan/ha [84].1.3 Các phương pháp tách chiết collagen từ da cá

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá trong nước và trên thé giớiTại Việt Nam, đến nay đã có một số nghiên cứu thu nhận collagen và gelatin từ da cánhư: Nghiên cứu thu nhận collagen từ da cá basa của Lê Thị Hồng Nhan đăng trên tạpchí Khoa hoc và Công nghệ, 2009 [86]; trích ly collagen từ da cá tra băng phương pháphóa học của Trần Thị Huyền, 2012 [87] và nhiễu nghiên cứu tách chiết gelatin ở cấp độluận văn tốt nghiệp của sinh viên Đại học Bách Khoa TP.HCM, Bách Khoa Hà Nội, Đạihọc Cần Thơ, Đại học Nha Trang, Viện Nuôi trồng Thủy sản II, Nhìn chung, các

nghiên cứu thực hiện ở Đại học Cần Thơ và Viện Nuôi trồng Thủy sản II theo hướng

tách chiết gelatin từ da và vảy các loài cá tra, cá mối, cá lau kiếng, cá lóc, ca rô đồng, cá

ngừ hay từ bong bóng cá tra Nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá tra băng phươngpháp hóa học của tác giả Trần Thị Huyền và cộng sự ở Đại học Nha Trang đạt hiệu suấttrích ly 76,9 % Nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá tra bằng phương pháp enzymecủa tác giả Đỗ Cao Cường ở Đại học Bách Khoa Hà Nội trên bốn loại enzyme cho thayenzyme pepsin cho hiệu suất trích ly cao nhất (12,07 %) Về mặt công nghệ san xuất

collagen, trước năm 2015 chưa có doanh nghiệp nào tại Việt Nam sản xuất collagen;

đến năm 2015, công ty Vĩnh Hoàn ở Đồng Tháp đã đầu tư lắp đặt dây chuyên công nghệsản xuất collagen thủy phân và gelatin với công suất 2000 tân/năm và hiện đang tronggiai đoạn chạy thử nghiệm.

Trên thế giới, trước năm 1990 nguồn nguyên liệu chính để tách chiết collagen là da vàxương của trâu, bò, lon; sau năm 1990 mới có một vài nghiên cứu về tách chiết collagentừ các nguồn nguyên liệu khác (da mực, da ếch, da cá, ) Tuy nhiên, kể từ năm 2000đến nay, hướng nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào đối tượng da cá như: nghiêncứu tỉnh chế collagen từ da cá biên để làm vật liệu nha khoa [6]: nghiên cứu tính chấthóa sinh của dịch chiết collagen từ các loài cá có giá trị kinh tế thấp [7]; tinh chế collagentừ da cá nóc bạc (Lagocephalus gloveri) [8]; tỉnh chế collagen từ da cá đuối gai (Rajakenojei) [9]; nghiên cứu tinh chất của collagen trích ly từ da cá nóc (Takifugu rubripes)[10]: nghiên cứu cấu trúc của collagen trích ly từ da cá [11]; nghiên cứu xác định đặctính của collagen tách chiết từ da và xương cá hồng (bigeye snapper) [12]: nghiên cứuảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly collagen loại I tách từ da cá đuối(Pomadasys kaakan) [13]

Các nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá đã có sự phát triển đáng chú ý về quy trìnhcông nghệ, bên cạnh đó một số nghiên cứu cho biết những thông tin có giá trị liên quanđến ban chất va tinh chất của collagen Nhìn chung, các kết quả đạt được có thé tomlược như sau: